DE60121729T2 - Prion Proteindimere für Impfungen - Google Patents
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Prionprotein, wobei das Prionprotein ein Homodimer oder Heterodimer ist. Die Prionproteindimere sind stark immunogen und in der Lage, eine Immunreaktion in einem Säugetier hervorzurufen, was für die prophylaktische oder therapeutische Impfung zum Schutz vor Erkrankungen nützlich ist, die mit den infektiösen Formen von Prionproteinen, PRPsc, d.h. übertragbaren spongiformen Encephalopathien, in Verbindung stehen. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die durch Verwendung der Prionproteindimere als Antigen erzeugt werden, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Prionproteindimere oder gegen diese Dimere gerichtete Antikörper enthalten, sowie DNA Sequenzen, die die Prionproteindimere kodieren.
- Übertragbare spongiforme Encephalopathien sind neurodegenerative Erkrankungen, wie beispielsweise Scrapie bzw. die Traberkrankheit von Schafen, die bovine spongiforme Encephalopathie (BSE) von Rindern und die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) von Menschen. Infektiöse Präparate, die aus infizierten Gehirnen stammen, sind gegenüber ultravioletter und ionisierender Strahlung sowie anderen Verfahren resistent, die normalerweise Nukleinsäuren inaktivieren, was zeigt, dass Nukleinsäuren für die Infektiosität nicht notwendig sind. Die Reinigung von infektiösen Präparaten aus Gehirnen hat das Vorhandensein eines Proteins, das für die Infektiosität erforderlich ist, offenbart. Diese experimentellen Beobachtungen führten zur „Nur-Protein-Hypothese", gemäß der bestimmte proteinhaltige infektiöse Partikel (Prionen) für die Übertragung von übertragbaren spongiformen En cephalopathien verantwortlich sind (Prusiner u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 13363-13383 (1998)). Prionen bestehen hauptsächlich aus einem proteaseresistenten Protein, das als PrPsc (Prionprotein, „Sc": Scrapie) bezeichnet wird, bei dem es sich um eine abnormale Isoform von Proteinase K-empfindlichem PrPc („C": zellulär) handelt. Das Prionprotein PrPc ist ein artspezifisches Protein, das physiologisch in Gehirnzellen und peripheren Blutzellen sowie z.B. in der Milz exprimiert wird. Die biologische Funktion von PrPc ist bisher unbekannt. Transgene Mäuse, die nicht mehr in der Lage sind, PrPC (PrP Knock-out-Mäuse) zu exprimieren, zeigen keine pathologischen Schäden und können mit Prionen nicht infiziert werden (Bueler u.a., Nature 356, 577-582 (1992); Bueler u.a., Cell 73, 1339-1347 (1993)).
- Beide Isoformen, PrPsc und PrPc, teilen dieselbe Aminosäuresequenz, unterscheiden sich aber hinsichtlich ihres sekundären Aufbaus. Circular Dichroismus (CD) und Fourier Transformation Infrarot (FTIR) Spektroskopie zeigten einen deutlich höheren β-Faltblattgehalt für PrPSc im Vergleich zu einem hohen α-Helixgehalt in PrPc. Es ist darauf hingewiesen worden, dass die Prionvermehrung die Umwandlung von α-Helixdomänen in PrPC zu β-Faltblättern in PrPSc umfasst. Die in vitro Umwandlung von PrPc zu einem PrPSc-artigen Molekül wurde unter Anwendung einer Proteinase K-Resistenzuntersuchung gezeigt.
- Es ist darauf hingewiesen worden, dass für die Entwicklung einer übertragbaren spongiformen Encephalopathie die Wechselwirkung von PrPsc und PrPc ein wichtiges Ereignis ist, wobei PrPSc eine Umwandlung von PrPc zur pathologischen Konformation (PrPSc) erzwingt. Demgemäß sind transgene Mäuse, die nicht länger in der Lage sind, PrPc (PrP Knock-out-Mäuse) zu exprimieren, gegenüber Infektionen mit PrPSc resistent. Obwohl sich die Prionproteine von verschiedenen Spezies im Hinblick auf ihre Aminosäuresequenzen unterscheiden, ist die Homologie in der Säugetiergruppe hoch (88 bis 99 %). Offen sichtlich kann aufgrund der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen das Prionprotein zwischen bestimmten Spezies nicht übertragen werden (relative oder absolute Speziesbarriere). Aufgrund der Tatsache, dass das Prionprotein ein physiologisch exprimiertes Protein ist, zeigt jede Spezies eine immunologische Toleranz über ihr eigenes spezifisches Prionprotein. Leider sind übertragbare spongiforme Encephalopathien, z.B. BSE, bisher nicht heilbar. Es gibt keine Therapie, die die Symptome dieser Krankheit lindert, geschweige denn die Krankheit z.B. durch Impfung zum Stillstand bringen.
- Priola S.A. u.a. ((1995) J. Biol. Chem.; Bd. 270, Nr. 7, 3299-3305) offenbart ein 60 kDa Prionprotein von Hamstern, das als Dimer von kovalent gebundenen PrP Monomeren auftrat.
- Daher ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Impfstoff zur Verhinderung oder Behandlung einer übertragbaren spongiformen Encephalopathie zur Verfügung zu stellen.
- Gemäß der Erfindung wird dies durch die Gegenstände der Ansprüche erzielt.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Prionprotein zur Verfügung, bei dem das Prionprotein ein Homodimer oder ein Heterodimer ist, wobei das Monomer einem Prionprotein gemäß der nachfolgenden Definition entspricht oder dieses umfasst. Im Laufe der Versuche, die zur vorliegenden Erfindung geführt haben, ist überraschenderweise festgestellt worden, dass Prionproteindimere zum Hervorrufen einer verstärkten Immunreaktion gegenüber PrPc und rPSc nützlich sind. Unter Verwendung dieser offensichtlichen bemerkenswerten Immunogenität des Prionproteindimers war es sogar in vivo möglich, Antikörper, die gegen das homologe Prionprotein gerichtet waren (d.h. Mausantikörper, die gegen Maus-PrP gerichtet waren) zu erzeugen, wodurch die bekannte Autotoleranz, die in einer bestimmten Spezies vorhanden ist, aufgehoben oder umgangen wurde. Nach der Inkubation von permanent PrPSc produzierenden Zellen mit den Antikörpern, die durch Immunisierung mit dem Prionproteindimer über einen Zeitraum von 16 Stunden erzeugt wurde, konnte eine drastische Hemmung der de novo Synthese von PrPSc beobachtet werden. Vermutlich beruht dieses Ergebnis auf der Erzeugung eines funktionellen PrPc Knock-out-Zustands, bei dem das an der Oberfläche angeordnete PrPc Substrat, das für die kontinuierliche zelluläre Umwandlung in PrPSc benötigt wird, in seiner Funktion beeinträchtigt wird, was schließlich die Erzeugung von PrPSc hemmt. Es ist aus der Literatur bekannt, dass die Oberflächenanordnung von PrPc eine Voraussetzung für die zelluläre Prionumwandlung ist (Taraboulos u.a., J. Cell Biol. 129, 121-132 (1995)). Außerdem haben Untersuchungen mit transgenen Mäusen gezeigt, dass die periphere Expression von PrPc für eine Replikation und den Transport von PrPsc von den peripheren Stellen des Körpers zum zentralen Nervensystem absolut notwendig sind (Blättler u.a., Nature 389, 69-73 (1997)). In diesem Zusammenhang ist von den Erfindern festgestellt worden, dass nach der Verabreichung des Prionproteindimers der vorliegenden Anmeldung an einen Probanden die induzierte Immunreaktion zu einer Herunterregulation der Oberflächenexpression von PrPc führt. Demgemäß kann die Umwandlungsrate (PrPc ⇒ PrPsc) drastisch reduziert werden und so den Beginn und das Fortschreiten der Erkrankung stoppen. Daher sind die Prionproteindimere der vorliegenden Erfindung als Impfstoff zur Verhinderung oder Behandlung einer übertragbaren spongiformen Encephalopathie von Nutzen.
- Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Prionprotein, wobei das Prionprotein ein Homodimer oder ein Heterodimer ist, das eine Immunreaktion auf PrPc oder PrPsc hervorrufen kann, vorzugsweise eine Immunreaktion, die im Vergleich zur Immunreaktion, die erhalten wird, wenn das entsprechende Monomer für die Impfung verwen det wird, stärker ist. Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Prionprotein" das native (mit voller Länge und/oder reife) Protein sowie Varianten davon, z.B. verkürzte Versionen, die noch zum Hervorrufen einer verstärkten Immunreaktion nützlich sind, d.h. noch für eine Impfung brauchbar sind. In diesem Zusammenhang umfasst der Begriff „Protein" auch Peptide oder Polypeptide mit einer Länge von mindestens 8, vorzugsweise mindestens 15 und besonders bevorzugt mindestens 20 Aminosäuren. Der Fachmann kennt Quellen für die Prionproteinmonomere bzw. DNA-Sequenzen, die die Prionproteinmonomere kodieren (Schätzl u.a., J. Mol. Biol. 245, 362-374 (1995); Wopfner u.a., J. Mol. Biol. 289, 1163-1178 (1999); Sequenzen hinterlegt bei Genbank, die über die Public Medline Datenbank zugänglich ist). Weiterhin kennt der Fachmann Verfahren zum Verbinden der Monomeren, um das Dimer zu erhalten. Die Monomere sind kovalent verbunden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Homodimer oder Heterodimer ein Fusionsprotein, das die monomeren Prionproteineinheiten umfasst. Ein solches Fusionsprotein kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erzeugt werden. Die Auswahl eines bestimmten Verfahrens hängt hauptsächlich von der Länge der Monomere ab, d.h. sehr kurze Fusionsproteine werden vorzugsweise chemisch synthetisiert, z.B. durch standardmäßige Festphasensynthese, während längere Fusionsproteine vorzugsweise durch Expression der entsprechenden DNA Sequenzen in einem geeigneten Wirt und durch Isolation/Reinigung des Fusionsproteins aus dem Wirt und dem Kulturmedium erzeugt werden.
- Im Allgemeinen ist es mittels herkömmlicher molekularer biologischer Verfahren (siehe z.B. Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) nicht nur möglich, eine DNA Sequenz zu erzeugen, die das gewünschte Fusionsprotein kodiert, sondern dar über hinaus auch möglich, unterschiedliche Mutationen in die DNA Sequenz einzuführen. Eine Möglichkeit ist das Erzeugen von Deletionsmutanten, bei denen DNA Moleküle durch kontinuierliche Deletionen von den 5'- oder 3'-Termini der kodierenden DNA Sequenz erzeugt wurden und die zur Synthese von Proteinen führen, die entsprechend verkürzt sind. Der Fachmann kann leicht prüfen, ob solche Prionproteindimere, die verkürzte monomere Einheiten enthalten, noch als Impfstoff von Nutzen sind, z.B. indem er die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen Verfahren verwendet. Zur Manipulation in prokaryontischen Zellen mittels der Gentechnik können die DNA Sequenzen in Plasmide eingeführt werden, was eine Mutagenese oder eine Modifikation einer Sequenz durch Rekombination von DNA Sequenzen ermöglicht. Mittels herkömmlicher Verfahren (siehe Sambrook u.a., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA) können Basen ausgetauscht und natürliche oder synthetische Sequenzen hinzugefügt werden. Weiterhin können durch Manipulationen geeignete Spaltstellen vorgesehen oder überflüssige DNA oder Spaltstellen entfernt werden. Wenn Insertionen, Deletionen oder Substitutionen möglich sind, kann eine in vitro Mutagenese, eine Primer Reparatur, eine Restriktion oder Ligation durchgeführt werden. Als Analyseverfahren werden gewöhnlich die Sequenzanalyse, die Restriktionsanalyse und andere biochemische oder molekulare biologische Verfahren verwendet.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden die Monomere des Fusionsproteins über einen Peptid-Spacer bzw. -Abstandshalter verbunden. Geeignete Peptid-Spacer, die vorzugsweise aus nicht polaren und nicht voluminösen Aminosäuren bestehen, haben eine Länge von weniger als 20 Resten, sorgen für eine gewisse Flexibilität, wodurch z.B. Cystein- oder Prolinreste vermieden werden, die eine Steifigkeit hervorrufen können (oder umgekehrt in den Fällen, in denen eine Steifigkeit oder das Hervorrufen einer Orientierung/von Wendungen erwünscht ist). Diese Spacer sind dem Fachmann bekannt und umfassen zum Beispiel AGAIGGA [HIV1- Protease; Kräusslich u.a., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 3212-3217 (1991)], SGGRGG [HIV gp41; Tan u.a., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 94, 12303-12308 (1991)], GSGGGGSGGGGSGGSGA [einkettiger T-Zellrezeptor; Khandekar u.a., J. Biol. Chem. 272, 32190-32197 (1997)] oder (GGGGS)n=1-3 [einkettige Antikörper; Kortt u.a., Eur. J. Biochem. 221, 151-157 (1994)]. Beispiele für bevorzugte Spacer sind (a) Spacer mit einer Länge von 2 bis 3 Aminosäuren, wobei die DNA Sequenz, die den Spacer kodiert, eine Restriktions-Schnittstelle enthält, (b) Oligomere, die aus kleinen neutralen Aminosäuren zusammengesetzt sind (z.B. Ala-Gly-Ala-Ile-Gly-Gly-Ala), oder c) ein Oligomer mit einer Aminosäuresequenz, die ein Epitop definiert, z.B. flag-tag, HA-Epitop usw.
- Zur Erzeugung der DNA Sequenzen kodierenden Prionproteindimere und zur Konstruktion der Expressionsvektoren, die die DNA Sequenzen enthalten, ist es möglich, allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zu verwenden. Diese Verfahren umfassen z.B. in vitro Rekombinationsverfahren, synthetische Verfahren und in vivo Rekombinationsverfahren, wie zum Beispiel in Sambrook u.a., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben.
- Für die rekombinante Herstellung des dimeren Prionproteins der Erfindung, werden die DNA Sequenzen, die das Protein kodieren, in einen geeigneten Expressionsvektor eingeführt. Vorzugsweise handelt es sich dabei um Plasmide, Kosmide, Viren, Bakteriophagen und andere Expressionsvektoren, die gewöhnlich auf dem Gebiet der Gentechnik verwendet werden. Expressionsvektoren, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen z.B. pGEMEX, pUC Derivate, pGEX-2T, pET3b, auf T7 basierende Expressionsvektoren und pQE und pTrcHis (für die Expression in E. coli), sind aber nicht darauf beschränkt. Für die Expression in Hefe sind zum Beispiel pY100 und Ycpad1 zu erwähnen, während für die Expression in Tierzellen z.B. pcDNA3.1, pKCR, pEFBOS, cDM8, pMSCND und pCEV4 anzugeben sind. Der Baculovirus Expressionsvektor pAcSGHisNT-A ist besonders zur Expression in Insektenzellen geeignet. DNA-Sequenzen können auch in einem rekombinanten Virus mit geeigneten Expressionskassetten enthalten sein. Geeignete Viren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen Baculovirus, SFV, Vaccinia, Sindbis Virus, SV40, Sendai Virus, Adenovirus, ein AAV-Virus oder ein Parvovirus, wie beispielsweise MVM oder H-1. Der Vektor kann auch ein Retrovirus, wie beispielsweise MoMULV, MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV sein. Vorzugsweise ist die DNA Sequenz wirksam mit den regulatorischen Elementen im rekombinanten Vektor verbunden, wodurch die Transkription und die Synthese einer RNA in prokaryontischen and/oder eukaryontischen Zellen, die translatiert werden können, garantiert wird. Die zu transkribierende Nukleotidsequenz kann wirksam mit einem Promotor, wie einem T7, Metallothionein I oder Polyhedrin Promotor, transkribiert werden. Für die Expression in Säugetieren sind die DNA Sequenzen wirksam mit einem geeigneten Promotor, wie z.B. einem humanen Cytomegalovirus „immediate early promoter" (pCMV) verbunden.
- Geeignete Wirtszellen umfassen Bakterien, Hefe, Insekten- und Tierzellen, vorzugsweise Säugetierzeller. Die E. coli Stämme HB101, DH1, x1776, JM101, JM109, BL21, XL1Blue und SG 13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae, die Insektenzellen sf9 und die Tierzellen L, A9, 3T3, FM3A, BHK, humanes SW13, CHO, COS, Vero und HeLa sind bevorzugt. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Auswahl der Transformanten und zur Expression der DNA gemäß der Erfindung mittels der oben beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zur rekombinanten Herstellung des dimeren Prionproteins der Erfindung wird die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, die die Synthese des Proteins ermöglichen, und das Protein wird anschließend aus den kultivierten Zellen und/oder dem Kulturmedium isoliert. Die Isolation und Reinigung der rekombinant erzeugten Proteine kann mit herkömmlichen Mitteln, einschließlich präparativer Chromatographie und immunologischen Abtrennungen, umfassend Affinitätschromatographie mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern, z.B. mit dem Antikörper A7 und 3F4, wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, durchgeführt werden.
- In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform sind die Monomere des dimeren Prionproteins der Erfindung kovalent über geeignete Verbindungen verbunden, z.B. auf eine solche Weise, dass die Monomere kovalent über die C-Termini oder N-Termini oder über den C-Terminus des einen Monomers und den N-Terminus des anderen Monomers verbunden sind. Es ist darauf zu achten, dass eine Dimerisation derart durchgeführt wird, dass ein Hervorrufen einer Immunreaktion durch das dimere Protein nicht negativ beeinflusst wird. Geeignete Verbindungen für die Dimerisation sind dem Fachmann bekannt, vorzugsweise ist eine solche Verbindung ein Polyethylenglycol, aktiviertes Benzodiazepin, Oxazolon, Aminimid- Azalakton, Diketopiperazin oder ein Monosaccharid. Die entsprechenden chemischen Reaktionen sind dem Fachmann auch bekannt.
- Die Monomere des dimeren Prionproteins der vorliegenden Erfindung können identisch (Homodimer: die Monomere stammen von derselben Spezies) oder unterschiedlich (Heterodimer: die Monomere stammen von unterschiedlichen Spezies) sein. Im Fall des Heterodimers kann davon ausgegangen werden, dass eine Immunreaktion auf das eigene PrPc sowie auf fremdes PrPc hervorgerufen wird.
- Wie bereits oben beschrieben, umfasst das dimere Prionprotein der vorliegenden Erfindung auch Monomere, die Varianten der nativen Prionproteinmonomere sind. Besonders bevorzugt sind Varianten, die N-terminal und/oder C-terminal verkürzte Proteine (Monomere) sind.
- Ein bevorzugtes dimeres Prionprotein (und seine entsprechende Nukleotidsequenz) ist in der
5 gezeigt. - Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines dimeren Prionproteins der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern sowie einen Antikörper, vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper, der an das dimere Prionprotein der vorliegenden Erfindung bindet. Solche Antikörper sind für die passive Immunisierung nützlich und können gemäß bekannten Verfahren erzeugt werden. Der Begriff „Antikörper" betrifft vorzugsweise Antikörper, die im Wesentlichen aus gepoolten monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen epitopen Spezifitäten bestehen, sowie ausgeprägte monoklonale Antikörperpräparate. Monoklonale Antikörper werden unter Verwendung des dimeren Prionproteins der Erfindung als Antigen durch Verfahren hergestellt, die dem Fachmann bekannt sind (siehe z.B. Köhler u.a., Nature 256 (1975), 495). Wie hier verwendet, soll der Begriff „Antikörper" (Ab) oder „monoklonaler Antikörper" (Mab) intakte Moleküle sowie Antikörperfragmente (wie beispielsweise Fab und F(ab')2 Fragmente) umfassen, die spezifisch an Protein binden können. Fab und F(ab')2 Fragmente haben kein Fc Fragment des intakten Antikörpers, werden schneller aus dem Blutkreislauf entfernt und können eine geringere nicht spezifische Gewebebindung als ein intakter Antikörper aufweisen. (Wahl u.a., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Daher sind diese Fragmente sowie die Produkte einer FAB oder anderen Immunglobulin Expressionsbibliothek bevorzugt. Darüber hinaus umfassen die Antikörper der vorliegenden Erfindung chimäre, einkettige (scFv) und humanisierte Antikörper.
- Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung auch DNA Sequenzen, die die dimeren Prionproteine der vorliegenden Erfindung sowie einen Expressionsvektor kodieren, der eine solche DNA Sequenz enthält. Beispiele für solche DNA Sequenzen und geeignete Expressionsvektoren sind bereits oben beschrieben. Solche DNA Sequenzen oder Expressionsvektoren sind nicht nur für die rekombinante Herstellung des dimeren Prionproteins der vorliegenden Erfindung sondern auch als „genetischer Impfstoff" nützlich. Für die Herstellung eines genetischen Impfstoffs werden die DNA Sequenzen der Erfindung in einen geeigneten Vektor unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors eingeführt, z.B. eines Vektors oder Promotors wie oben beschrieben. Zusätzliche geeignete Vektoren sind zum Beispiel Herpes simplex Virus Typ 1 Amplicon oder rekombinante Semliki Forest Virusvektoren, Plus-Strang RNA Virusvektoren (lentivirale Vektoren, Minus-Strang RNA Virusvektoren (z.B. Rabies-Virus, RSV). In diesem Zusammenhang sind auch Genkanonen-Anwendungen geeignet. Ein Impfstoff gemäß der vorliegenden Erfindung kann dazu verwendet werden, die humorale und/oder zelluläre Immunreaktion bei Personen zu stimulieren, die von solchen Reaktionen durch Schutz vor oder Behandlung einer übertragbaren spongiformen Encephalopathie profitieren.
- Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein dimeres Prionprotein, einen Antikörper, eine DNA Sequenz oder einen Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst. Nach der Verabreichung an den Proband sollte die hervorgerufene Immunreaktion zu einer Herunterregulation der Oberflächenexpression von PrPc führen. Demgemäß sollten der Transport von infektiösen Prionen aus den peripheren Inokulationsstellen (z.B. oral oder i.v.) zum zentralen Nervensystem sowie die anfängliche periphere Replikation signifikant beeinträchtigt sein. Darüber hinaus kann die Umwandiungsrate (PrPc ⇒ PrPSc) drastisch reduziert werden und so ein Fortschreiten der Krankheit gestoppt werden. Daher sind die Verbindungen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Impfstoffs zum Verhindern oder zur Behandlung einer übertragbaren spongiformen Encephalopathie von Nutzen (prophylaktische oder therapeutische Impfung). Zur Herstellung des Impfstoffs können die oben beschriebenen gereinigten Verbindungen mit jedem geeigneten Hilfsstoff, wie beispielsweise IS-COMS, Alaun, Freunds inkomplettes oder komplettes Adjuvans, Quil A und andere Saponine oder jeden anderen Hilfsstoff, wie in der Literatur beschrieben, kombiniert werden. Geeignete Dosen und Verabreichungswege hängen von der bestimmten Verbindung ab und sind dem Fachmann bekannt.
- Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 : PrP Dimer - Coomassie-Blau Färbung nach der Reinigung zeigt eine Reinheit von > 90 %. M: Molekulargewichtsstandards.
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2 : Charakterisierung des PrP Dimers mittels CD - Die Ergebnisse zeigen, dass das PrP Monomer und das PrP Dimer einen ähnlichen oder sogar einen identischen sekundären Aufbau besitzen.
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3 - (a) Immunologische Reaktionen bei verschiedenen Mäusen
- Immunisierung mit dem PrP Monomer bzw. PrP Dimer. Rekombinantes Maus-PrP wurde auf einem SDS PAGE Gel aufgetrennt, anschließend auf eine PVDF Membran übertragen und die Immunoblots wurden mit fallenden Konzentrationen auf Mäuse-Antiseren sondiert. Die Immunisierung mit dem PrP Dimer führte zu einer erhöhten Antikörperproduktion
- (b) Immunologische Reaktionen bei verschiedenen Kaninchen
- Immunisierung mit dem PrP Monomer bzw. PrP Dimer. Rekombinantes PrP Monomer (PrPM) bzw. PrP Dimer (PrPD) wurden auf einem SDS PAGE Gel aufgetrennt, anschließend auf eine PVDF Membran übertragen und die Immunoblots wurden mit anti-PrPMonomer bzw. anti-PrPDimer sondiert. Die Immunisierung mit dem PrP Dimer führte zu einer erhöhten Antikörperproduktion.
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4 : In vitro Experimente unter Verwendung von mit PrPSc infizierten Zellen - Während der Inkubation mit Antikörpern über 16 Stunden wurden Proteine metabolisch mittels 35S-Methionin markiert und anschließend immunpräzipitiert (RIPA). Vor dem RIPA wurden die Zelllysate in zwei Fraktionen zur Verdauung mit Proteinase K (+/–) getrennt und in lösliche und unlösliche Fraktionen mittels Ultrazentrifugation getrennt (1 Stunde, 100.000 × g, 1 % Sarcoyl); die Daten sind nur für die unlösliche Fraktion gezeigt. Ein drastisches Abfallen der de novo Synthese von PrRSc kann nur nach einer Inkubation mit A7 beobachtet werden. A, B: nach der Deglycosylierung mittels PNGase F; K: ohne Inkubation mit Antikörpern; P: Präimmunserum; 3F4: monoklonaler Antikörper, der gegen das EF4 Epitop des Prionproteins gerichtet ist; A7: Antikörper, der von mit dem PrP Dimer immunisierten Kaninchen erhalten wurde.
-
5 : Translation von hisPrPDPcr (1-1320) -
- Unterstrichen in der ersten Reihe: His-Tag
- Unterstrichen in der Mitte: Linker
- Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.
- Beispiel 1
- Erzeugung eines Fusionsproteins (Dimer), das zwei Prionproteinmonomere umfasst, die mittels eines Peptidlinkers kovalent gebunden sind
- Genomische Maus-DNA, die das Prionprotein kodiert (Maus-PrP-A, das von der Maus-N2a-Neuroblastomzelllinie stammt; wegen der Sequenz siehe Schätzl u.a., 1995, supra; Wopfner u.a., 1999, supra), wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung der folgenden Primerpaare amplifiziert, die einen Peptidlinker (Ala-Gly-Ala-Ile-Gly-Gly-Ala) einführen, der die eine PvuI-Restriktionsstelle enthaltende Sequenz kodiert; Primerpaar I: 5'-GCG GAT CCG TCG CCA CCA TGG CGA ACC TTG GCT A-3' (prPB + 1) und 5'-ACC GAT CGC TCC AGC GCT GGA TCT TCT CCC GTC GTA AT-3' (231 + L neu); Primerpaar II: 5'-AGC GAT CGG TGG AGC TAA AAA GCG GCC AAA GCC TGG AG-3' (23 +L neu); 5'-ATC TAG ATC ATC ATC ATC CCA CGA TCA GGA AGA-3' (254 PX) (die DNA Sequenz, die die PvuI-Restriktionsstelle kodiert, ist unterstrichen). Für die Einführung eines N-terminalen His-tag, die Entfernung der N-terminalen und C-terminalen Signalpeptide und die Einführung von zusätzlichen Restriktionsstellen wurde eine zweite PCR mittels der folgenden Primer durchgeführt: 5'-GAT GTT GGA TCC TGC AAG AAG CGG CCA AAG-3' (5' Primer, die BamHI Stelle ist unterstrichen.); 5'-GGA GGA GAT CCA GCA GCT AGA AGC TTT TC-3' (3' Pri mer, die HindIII Stelle ist unterstrichen). Das erhaltene PCR Fragment (siehe
5 ). wurde in den pQE30 Expressionswektor (Qiagen, Hilden, DE) eingeführt. Um höhere Ausbeuten des rekombinant erzeugten Proteins zu erhalten, wurden proteinasedefiziente Bakterien (BL21, Stratagene Europe, Amsterdam, Niederlande) für die Expression verwendet. Vier Stunden nach dem Hervorrufen der Expression mittels 2 mM IPTG wurden Bakterien in 6 M Guanidinhydrochlorid (6 M Guanidinhydrochlorid, 20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,8) lysiert. Zelltrümmer wurden mittels Zentrifugieren (20 min, 10.000 × g) pelletiert, der Überstand wurde auf eine mit Ni2+ beladene SP-HiTrap Säule geladen (Amersham Pharmacia, Uppsala, Schweden), die zuvor mit einem Bindungspuffer äquilibriert worden war (8 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,8), und inkubiert. Die Säule wurde mehrere Male gewaschen (8 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, 80 mM Imidazol, pH 6,3) und anschließend wurde das His-tag enthaltende Fusionsprotein mittels 8 M Harnstoff, 20 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, 500 mM Imidazol, pH 6,3, eluiert. Die Fraktionen des Eluats wurden gesammelt. Die Fraktionen, die die höchste Proteinkonzentration zeigten, wurden gepoolt und zum Entfernen von Harnstoff gegen reinem Wasser dialysiert (Slide-A-Lyzer, Pierce, Bonn, DE). Wie in der1 gezeigt ist, konnte das Protein mit einer sehr hohen Reinheit erhalten werden. Wie in der2 gezeigt, ist der sekundäre Aufbau des gereinigten renaturierten Dimers ähnlich (oder sogar identisch) dem sekundären Aufbau des Prionproteinmonomers. - Beispiel 2
- Immunisierung von Mäusen und Kaninchen
- Zehn weibliche B6D2F1 (B57BL/6 × DBA) Mäuse (durch Inzucht erhaltener Stamm, der im Institut für Molekulare Tier zucht/Genzentrum München, DE, erzeugt wurde; sechs Wochen alt) wurden durch subkutane Injektionen von 50 μg von im Beispiel 1 beschriebenem Proteindimer bzw. Kontrollmonomer immunisiert (Monomer: Maus PrP23-231 gegenüber Dimer: Maus PrP23-231=23-231 [über die Linkersequenz verbunden], beide mit dem 3F4 Epitop und einem N-terminalen Poly-Histidin-tag). Am Tag 0 wurden die Proteine mit Freunds kompletten Adjuvans kombiniert, zum Boostern (am Tag 21 bzw. Tag 42) wurden die Proteine mit Freunds inkompletten Adjuvans kombiniert. Zehn Tage nach der letzten Immunisierung wurden Blutproben für die Antikörperbewertung genommen. Es konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zur Applikation des Prionproteindimers die Applikation des Prionproteinmonomers (Kontrolle) zur Erzeugung einer geringeren Menge an spezifischen Antikörpern führte. Nach der Applikation des Dimers zeigten etwa 50 % der Mäuse eine ausgeprägte Anhäufung von spezifischen Antikörpern (
3a ). Die hervorgerufene spezifische polyklonale Immunreaktion wurde im Immunoblot gemessen. Rekombinantes Maus PrP23-231 wurde auf SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF Membranen übertragen und in einer Immunoblotanalyse mit seriellen Verdünnungen von Seren von immunisierten Mäusen (primärer Antikörper) inkubiert. Die Präimmunseren wurden dazu verwendet, um Hintergrundsignale auszuschalten. Ein Färben wurde mit Hilfe von konjugierten sekundären Antikörpern (Antimaus) und dem verstärkten Chemilumineszenzkit (ECL plus, Amersham Corp., Buckinghamshire, UK) durchgeführt. Die mit dem PrP Dimer immunisierten Mäuse zeigten höhere Antikörpertiter. Verdünnungen über 1:3000 hinaus führten noch immer zu erfassbaren Signalen. Dieser Befund zeigt an, dass das verwendete Immunogen in der Lage war, das Autotoleranzphänomen, das für artidentische Prionproteine bekannt ist, zu überwinden. Weitere Daten haben gezeigt, dass die induzierten Antikörper nicht gegen die N-terminale Funsionsdomäne oder die Linker-Sequenz gerichtet waren, die gegen authentisches Maus PrP23-231 reaktiv war. - Ein ähnliches Ergebnis konnte mittels Kaninchen erzielt werden, d.h. die Kaninchen, die mit dem Prionproteindimer immunisiert waren, zeigten eine stärkere Immunreaktion i m Vergleich zu den Kaninchen, die mit dem Prionproteinmonomer immunisiert waren (
3b ). Rekombinante monomere und dimere Prionproteine (PrPM bzw. PrPD, die auch als Immunogene bei der Immunisierung verwendet wurden) wurden auf SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF Membranen übertragen und in einem Immunoblot analysiert. Das linke Bild zeigt eine Inkubation mit dem Serum vom mit dem PrP Monomer immunisierten Kaninchen und das rechte Bild von dem Kaninchen, das mit dem PrP Dimer immunisiert war. Ein Färben wurde mit Hilfe von konjugierten sekundären Anti-Kaninchen Antikörpern und ECL plus Kit erzielt. Während das linke Bild hauptsächlich eine Reaktion auf das monomere PrP zeigt, veranschaulicht das rechte Bild eine viel stärkere Immunreaktivität, die auf das monomere und dimere Prionprotein gerichtet ist. - Beispiel 3
- Die Applikation von durch Immunisierung mit einem Prionproteindimer erzeugten Antikörpern führt zur Hemmung der de novo Synthese von PrPSc in vitro
- Die biologische Relevanz der in der
2 beschriebenen Immunisierungsversuche konnte durch das folgende in vitro Experiment verifiziert werden. ScMHM2 Zellen [kultivierte Maus-Neuroblastomzellen (ATCC CCL 131); die mit RML Prionen hartnäckig infiziert und mit einem 3F4-markierten PrP stabil transfiziert waren; siehe Schätzl u.a., J. Virol. 71, 8821-8831, (1997)], die mit der infektiösen Version des Prionproteins (PrPSc) infiziert werden und permanent PrPSc erzeugen, wurden mit unterschiedlichen Antikörperarten inkubiert. Die Inkubation wurde mit Hilfe von (a) im Handel erhältlichen monoklonalen Antikörpern (3F4) (Signet Pathology Systems, Dedham, MA, USA), die auf ein Epitop des Prionproteins gerichtet sind, das in ScMHM2 Zellen erzeugt wird, und (b) von Antiserum, das von mit dem im Beispiel 1 beschriebenen Prionproteindimer immunisierten Kaninchen erhalten wurde, durchgeführt. Während der Inkubation mit Antikörpern über 16 Stunden wurden die Proteine metabolisch mittels 35S-Methionin markiert und anschließend immunpräzipitiert (RIPA). Vor der RIPA wurden die Zelllysate in zwei Fraktionen zum Verdau mit Proteinase K (+/–) getrennt und in lösliche und nicht lösliche Fraktionen mittels Ultrazentrifugation getrennt (1 Stunde, 100.000 × g, 1 % Sarcosyl). Wie in der4 gezeigt, konnte nach der Inkubation mit den Antikörpern 16 Stunden lang eine drastische Hemmung der de novo Synthese von PrPSc beobachtet werden. Die mit dem 3FA Antikörper beobachteten Ergebnisse sind weniger ausgeprägt. Es kann daraus geschlossen werden, dass dieses Ergebnis von der Erzeugung eines funktionellen PrPc Knock-out-Zustands an der Zelloberfläche und demgemäß einer Hemmung der Erzeugung von PrPSc herrührt. Diese Ergebnisse zeigen in lebenden Zellen, dass die induzierten anti-PrP Antikörper in der Lage sind, unter nativen Bedingungen an auf Oberflächen gefundenes, authentisches PrPc zu binden (Beweis des Prinzips für die Wechselwirkung mit dem an der Oberfläche gefundenen PrP unter nativen Bedingungen). Außerdem sind gebundene Antikörper offensichtlich mit PrPc internalisiert, was eine starke Bindungsaffinität zeigt (die zu einem nicht löslichen PrP voller Länge führt, das für PK empfindlich ist, siehe Signal voller Länge in4A , Spuren 5-8). Schließlich wurde die endogene PrPSc Biogenese stark beeinträchtigt, was zu einem nicht mehr de novo erzeugten, PK resistenten PrPsc Führte (4B , Spuren 7 und 8). Die biologische Wirkung auf die PrPsc Biogenese wird daher auch gezeigt (Beweis des Prinzips für eine Beeinträchtigung der Prionbiogenese). Die Wirksamkeit dieses Prinzips konnte auch durch Verwendung von bestimmten chemischen Verbindungen gezeigt werden:
Das funktionelle Entfernen von Oberflächen-PrPc führte zu einer Verringerung der Prionproteinproduktion. - Sequenzprotokoll
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Claims (13)
- Prionprotein, wobei das Prionprotein ist: (a) ein Heterodimer, umfassend kovalent gebundene Prionprotein(PrP)-Monomere von unterschiedlichen Spezies; oder (b) ein Fusionsprotein, wobei das Fusionsprotein ein Homodimer, die Prionprotein(PrP)-Monomere von derselben Spezies umfasst, oder ein Heterodimer ist, das Prionprotein(PrP)-Monomere von unterschiedlichen Spezies umfasst; oder (c) ein Homodimer, umfassend Prionprotein(PrP)-Monomere von derselben Spezies, oder ein Heterodimer, umfassend Prionprotein(PrP)-Monomere von unterschiedlichen Spezies, wobei die Prionprotein(PrP)-Monomere kovalent über Polyethylenglycol, aktiviertes Benzodiazepin, Oxazolon, Azalacton, Diketopiperazin oder Monosaccharid gebunden sind.
- Prionprotein nach Anspruch 1(b), wobei die Prionprotein(PrP)-Monomere des Fusionsproteins über einen Peptid-Spacer gebunden sind.
- Prionprotein nach Anspruch 2, wobei der Peptid-Spacer (a) ein Spacer mit einer Länge von 2 bis 3 Aminosäuren, wobei die DNA-Sequenz, die den Spacer kodiert, eine Restriktions-Schnittstelle enthält, oder (b) ein Oligomer, das aus kleinen neutralen Aminosäuren aufgebaut wird, oder c) ein Oligomer mit einer ein Epitop definierenden Aminosäuresequenz ist.
- Prionprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Monomere des Prionprotein(PrP)-Dimeren das native Prionprotein oder eine Variante davon umfassen, wobei die Variante des nativen Prionproteins eine Länge von mindestens 8 Aminosäuren hat und das Prionproteindimer zum Hervorrufen einer Immunreaktion gegenüber PrPc oder PrPsc nützlich ist, die höher als die Immunreaktion ist, die mittels des entsprechenden Monomers zur Impfung erhalten wird.
- Prionprotein nach Anspruch 4, wobei die Variante ein N-terminal und/oder C-terminal verkürztes Prionprotein ist.
- Verwendung des Prionproteins nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Herstellung eines polyklonalen oder monoklonalen Antikörpers.
- Antikörper der spezifisch an ein Prionprotein derselben Art nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bindet.
- Antikörper nach Anspruch 7, bei dem es sich um einen monoklonalen Antikörper handelt.
- DNA-Sequenz, die für ein Fusionsprotein des Prionproteins nach einem der Ansprüche 1 b) und 2 bis 5 kodiert.
- Expressionsvektor, enthaltend eine DNA-Sequenz nach Anspruch 9.
- Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Prionprotein, wobei das Prionprotein ein Homodimer, umfassend kovalent gebundene Prionprotein(PrP)-Monomere von derselben Spezies, oder ein Heterodimer ist, umfassend kovalent gebundene Prionprotein(PrP)-Monomere von unterschiedlichen Spezies, einen Antikörper nach Anspruch 7 oder 8, eine DNA-Sequenz nach Anspruch 9 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 10.
- Verwendung eines Prionproteins, wobei das Prionprotein ein Homodimer, umfassend kovalent gebundene Prionprotein(PrP)-Monomere von derselben Spezies, oder ein Heterodimer ist, umfassend kovalent gebundene Prionprotein(PrP)-Monomere von unterschiedlichen Spezies, eines Antikörpers nach Anspruch 7 oder 8, einer DNA-Sequenz nach Anspruch 9 oder eines Expressionsvektors nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verhinderung oder Behandlung einer übertragbaren spongiformen Enzephalopathie.
- Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Prionprotein ein Prionprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
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