WO2006000213A2 - Peptide zur inhibition der interaktion von proteinkinase a und proteinkinase a-ankerproteinen - Google Patents

Peptide zur inhibition der interaktion von proteinkinase a und proteinkinase a-ankerproteinen Download PDF

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WO2006000213A2
WO2006000213A2 PCT/DE2005/001181 DE2005001181W WO2006000213A2 WO 2006000213 A2 WO2006000213 A2 WO 2006000213A2 DE 2005001181 W DE2005001181 W DE 2005001181W WO 2006000213 A2 WO2006000213 A2 WO 2006000213A2
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Enno Klussmann
Walter Rosenthal
Christian Hundsrucker
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Forschungsverbund Berlin E.V.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • Peptides for inhibiting the interaction of protein kinase A and protein kinase A anchor proteins Peptides for inhibiting the interaction of protein kinase A and protein kinase A anchor proteins
  • the invention relates to nucleic acid sequences which encode peptides which inhibit the interaction of protein kinase A (PKA) and protein kinase 'A anchor proteins (AKAPs), a host organism which comprises the nucleic acid sequence and peptides of the invention expressed as well as the use of the peptides as well as the host organism in the therapy and experimental study of diseases associated with a modified AKAP-PKA interaction and the use of the peptides as a pharmaceutical agent for the treatment of such diseases, in particular diabetes insipidus, duodenal ulcer, hypertension and diabetes mellitus.
  • PKA protein kinase A
  • AKAPs protein kinase 'A anchor proteins
  • PKA Protein kinase A
  • AKAPs protein kinase anchoring proteins
  • cAMP second messenger cyclic adenosine monophosphate
  • the protein kinase A (PKA) -holoenzyme consists of a dimer of regulatory (R) subunits, to each of which a catalytic (C) subunit is bound. Activation of the kinase by the binding of two molecules of cAMP to each R subunit induces the dissociation of the C subunits that phosphorylate the nearby substrates.
  • the PKA holoenzyme is referred to as type I or type II PKA.
  • Rice and RI / 3 exist in the RI subunits, in the RII subunits RIIa and RII /? and in the C subunits Coi, C ⁇ and C ⁇ .
  • the different PKA subunits are encoded by different genes (Klussmann, 2004, Tasken and Aandahl, 2004).
  • the regulatory subunits • show a different expression patterns. While RIa and RIIa are ubiquitous in the tissues, the regulatory subunit RI is primarily found in the brain.
  • the association of the two R subunits with intracellular compartments is mediated by AKAPs.
  • the anchor proteins are a group functionally related molecules characterized by the interaction with type I or type II regulatory subunits (RI and RII, respectively) of the PKA holoenzyme.
  • the first anchor proteins were isolated in the affinity chromatographic purification of the R subunits via cAMP-Sepharose. These associated proteins also displayed RII binding after transfer to a nitrocellulose membrane. This observation is also based on the most common method (RII overlay) for the detection of AKAPs. It is a modified Western blot that uses radioactively labeled RII subunits instead of a primary antibody as a probe.
  • RIa is mainly localized cytosolic
  • studies show anchoring in vivo.
  • the dynamic anchoring of the Rl ⁇ subunits in contrast to the static anchoring of the RII subunits, seems to be of crucial importance for the cell.
  • the association of the RI subunits with the plasma membrane of erythrocytes and activated T lymphocytes has been described.
  • the localization of the enzyme might also be mediated by AKAPs.
  • the Rl ⁇ subunits bind to a calcium channel-associated AKAP and thus maintain normal, cAMP-dependent channel conductivity through the proper availability of the catalytic subunits of PKA.
  • AKAPs are anchored to structural elements in the cell through protein-protein interactions and to membranes through protein-lipid interactions.
  • the literature describes various AKAPs that associate with different cellular compartments, such as the centrosomes, the mitochondria, the endoplasmic reticulum and Golgi apparatus, the plasma and nuclear membranes, and vesicles.
  • AKAP cardiac muscle-specific anchor protein
  • mAKAP is anchored to the perinuclear membrane of cardiomyocytes by a region with three spectrin-like repeats.
  • Two isoforms of AKAP15 / 18 are anchored to the plasma membrane by lipid modifications (myristoylation and palmitoylation).
  • Three polybasic regions in the targeting domain of AKAP79 are involved in the localization of the protein to the inner postsynaptic membrane (PSD, postsynaptic density).
  • AKAPs were first characterized by the interaction with the PKA. However, some of these proteins may also bind other enzymes involved in signal transduction. By simultaneously anchoring enzymes that catalyze opposing reactions, such as kinases and phosphatases, these AKAPs, also known as scaffolding proteins, can localize entire signal complexes in the vicinity of specific substrates, thus providing specificity and regulation of the cellular response Contribute extracellular signals.
  • AKAP79 was the first AKAP to detect interaction with multiple enzymes. This protein binds protein kinase A, protein kinase C and the protein phosphatase calcineurin (PP2B), each enzyme being inhibited in the bound state.
  • P2B protein phosphatase calcineurin
  • AKAP220 which locates the PKA and protein PPl to the peroxisomes and AKAP yotiao, in addition to PKA, also the protein phosphatase ⁇ PPl binds.
  • the AKAP CG-NAP binds not only the PKA and the protein phosphatase PP1, but also, the Rho-dependent kinase PKN (nerve growth factor (NGF) -activated protein kinase) and the protein phosphatase PP2A.
  • NTF nerve growth factor
  • Ezrin a member of the cytoskeleton-associated ERM family Ezrin / radixin and moesin, identified as AKAP
  • AKAP binds to a protein (EBP50 / NHERF) that is involved in the regulation of sodium Proton transport is involved in the apical membrane of epithelial cells.
  • AKAPs mediate the modulation of ion channel conductance through the localization of protein kinases and phosphatases near specific channel subunits, which are likely to be regulated by phosphorylation and dephosphorylation.
  • the activity of the NMDA receptor is modulated by the AKAP Yotiao, which also binds the protein phosphatase PP1.
  • the bound-state active phosphatase limits the channel conductivity of the NMDA receptor until the PKA is activated by cAMP and phosphorylates the ion channel or an associated protein, thereby rapidly increasing the conductivity. It has also been shown that myristoylated Ht31 peptides, which inhibit the interaction between PKA and ⁇ AKAP, abolish cAMP-dependent inhibition of interleukin 2 transcription in Jurkat T cells, and that S-Ht31 peptides limit sperm motility.
  • AKAPs involved in the important complex biological processes, such as by the hormone GLP-I ⁇ glucagon-like peptide) -ver ⁇ mediated enhancement of insulin secretion in the ß-cells of the pancreas and in RINm5F cells (clonal ß-cell line of the rat) are AKAPs involved.
  • the activation of PKA by GLP-I leads to the phosphorylation of L-type calcium channels and favors the exocytosis of insulin from secretory granules.
  • Ht31 peptide-mediated inhibition of PKA anchoring significantly reduced insulin secretion. Neither the cAMP formation nor the activity of the catalytic subunits of PKA were affected by the peptides.
  • an increase in insulin secretion after GLP-I administration could be detected compared to control cells which did not express AKAP18a.
  • an Ht31 peptide is available for the decoupling of PKA from AKAP proteins.
  • the peptide Ht31 can be coupled to stearate to be present membrane-permeable.
  • the Pepdid Ht31 decouples PKA and AKAP in a way that is inadequate for many studies or even for therapeutic use.
  • the peptide Ht31 is not to selectively interact in a position with the regulatory subunits of PKA RIIa or RIIß, so that the meaning 'of the subunits for selected processes can not be analyzed.
  • the object of the invention is therefore to overcome the disadvantages mentioned and, in particular, to provide new nucleic acid sequences which code for peptides which efficiently and specifically modify, in particular decouple, the interaction of AKAP and PKA and which can furthermore be used as over-expressing substances in host organisms with the help of these host organisms - spielmud of mice - model to analyze diseases that are associated with the AKAP-PKA interaction, preferably diabetes insipidus, but also duodenal ulcer, hypertension and diabetes mellitus.
  • the present invention solves this technical problem by providing an isolated nucleic acid sequence selected from the group comprising
  • nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding at least one amino acid sequence selected from the group comprising SEQ ID Nos. 1 to 39,
  • nucleic acid molecule according to a) under stringent conditions hybridizes with a nucleotide sequence ⁇ ,
  • nucleic acid molecule ⁇ comprising a nucleotide sequence which has sufficient homology to be to a nucleotide sequence according to a) or b) functional analog
  • nucleic acid molecule which is degenerate as a result of the genetic code to a nucleotide sequence according to a) - c) and / or
  • nucleic acid molecule according to a nucleotide sequence according to a) - d) which is modified by deletions, additions, substitutions, translocations, inversions and / or insertions and is functionally analogous to a nucleotide sequence according to a) to d).
  • nucleic acid sequences of the invention can be used to peptides according to Table 1 ⁇ . (SEQ ID NO. 1 - 39) to encode that modify the interaction of AKAP and PKA, preferably inhibit, particularly preferably decouple.
  • the nucleic acid molecules according to the invention are suitable for coding peptides which bind selectively to regulatory subunits of PKA, in particular to RICH or RI1 / 3.
  • the nucleic acid molecules or peptides derived from these '.e with advantage for the production of transgenic organisms, such as mice in which the AKAP-PKA interaction tissue- and / or modified cell-specific.
  • the nucleic acid sequence having sufficient homology to become one.
  • Nucleotide sequence to be functionally analogous at least 40% homologous.
  • the coded homologous structures enable an efficient and selective decoupling of the PKA-AKAP interaction and a high affinity for the binding to RII. Possess subunits of PKA.
  • the nucleic acid molecule at least 60%, preferably 70%, preferably 80%, most preferably 90% homology to the nucleic acid molecules of the invention.
  • the nucleic acid molecule is a genomic DNA and / or an RNA; more preferably, the nucleic acid molecule is a cDNA.
  • the invention also relates to a vector comprising at least one nucleic acid molecule according to the invention. Furthermore, the invention also relates to a host cell comprising the vector. The invention . also concerns one Polypeptide which is encoded by at least one nucleic acid molecule according to the invention.
  • the polypeptide comprises an amino acid sequence according to SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 39, or at least one polypeptide according to these sequences.
  • the present invention 'relates to a polypeptide which is modified by deletion, addition, substitution, translocation, inversion and / or insertion and functionally analogous to a polypeptide of SEQ ID Nos. 1 to 39. and / or a polypeptide comprising a polypeptide having sufficient homology to be functionally analogous to a polypeptide of SEQ ID Nos. 1 to 39 or their mutations (deletion, addition, substitution, translocation, inversion and / or insertions).
  • the peptides of the invention are either (i) derived from AKAP18 (delta) (SEQ ID NOs: 1 to 7) or (ii) proteins not associated with AKAP molecules (SEQ ID NOs: 8 to 39).
  • H-bonding hydrogen bond bonding between the peptide and the RII dimer (see Fig. Hydrogen bonds in dashed lines). Accordingly, the minimum number of (8) amino acids forming H-bonds is common to the peptides.
  • AKPA18 delta
  • RII subunits of the PKA negative controls, if necessary, patenting can be omitted. Common to them is that they no longer bind due to structural (1,2) or due to charge differences (3,4).
  • the peptides of the invention derived from proteins other than AKAPs, have a defined size that surprisingly contributes to the ability of the peptides to modify an interaction between AKAP and PKA, as it enhances the affinity of the peptides for the RII (alpha) subunits the PCA influences.
  • the peptides consist of 25 amino acids and are according to the 25mere. If the peptides are chosen to be shorter or longer (eg, 17mers), their activity will be changed.
  • the common structural feature of the length of the peptides, together with the functional feature of the AKAEP / PKA decoupling, defines the structures of the invention.
  • x represents any amino acid; in particular, in each case one of the 20 biogenic amino acids (represented in the one-letter code) is represented by x each of these are: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, 'R, S, T, V, - W, Y). Claimed is any amino acid described in Alberts et al. (2004) Molecular Biology of the Cell, pp. 8, 73, 79 ff., 150 ff. Or 1717G, in Römpp (1999) Biotechnology and Genetic Engineering, p. 45 ff, and in Römpp (2000) Lexicon Biochemistry and Molecular Biology, p 28 ff, or is disclosed in another standard work of biology.
  • These particularly preferred peptides have either a positively charged amino acid (H, K or R) - in first or second position (position is the number of the amino acid of the N-terminus) or leucine in positions 19, 18 or 14 or serine in position 4th
  • a functionally analogous peptide is a peptide that is capable of modifying, preferably decoupling, the PKA-AKAP interaction.
  • the invention also relates to an organism which overexpresses a nucleic acid molecule according to the invention or comprises a vector according to the invention and / or has a polypeptide according to the invention.
  • This may be, for example, a transgenic mouse or rat or a cow, horse, donkey, sheep, camel, goat, pig, rabbit, guinea pig, hamster, cat, monkey or dog, in the tissue and / or Cell-specific, the PKA-AKAP interaction is disturbed.
  • Such organisms for example mice, may be used in particular 1 to develop drugs that modify, preferably decouple, the PKA-AKAP interaction.
  • metabolic processes can also be investigated in vivo in which the PKA-AKAP interaction plays a role or in which it is to be clarified whether the AKAP-PKA interaction is involved in a particular event.
  • the organism is preferably a transgenic mouse which overexpresses the strongly binding peptide AK ⁇ P185-L304T or AKAP18 ⁇ -L314E specifically in the main cells of collecting tubes of the kidney.
  • the decoupling of the PKA from AKAP proteins results in primary cultured collection tube cells, the vasopressin-induced redistribution of AQP2 is prevented, whereby the animals in particular have diabetes insipidus.
  • This disease is characterized by high water loss (polyuria), try to compensate by 'the absorbing large quantities of liquid, for example, the human patients (polydipsia).
  • transgenic organisms With the aid of the transgenic organisms according to the invention, it can be investigated, for example, how the decoupling of the PKA or of selected subunits of AKAP proteins can be regarded and used as a therapeutic principle.
  • advantageously optimized substances pharmaceuticalals
  • Such optimized substances are preferred as aquaretics and can therefore be used with advantage in patients with edema, for example in heart failure or liver cirrhosis.
  • the invention also relates to a recognition molecule directed against the nucleic acid molecule, the vector, the host cell and / or the polypeptide.
  • Detecting substances in the sense of the invention are molecules which can interact with the structures mentioned, such as nucleic acid molecules or sequences, vectors, host cells and / or polypeptides or their fragments; interact in particular so that a detection or a manipulation of these structures is possible.
  • the recognition substances may be specific nucleic acids which bind to the nucleic acid molecules or polypeptides mentioned, such as antisense constructs, cDNA or mRNA molecules or fragments thereof, but also antibodies, fluorescence markers, labeled carbohydrates or lipids or chelators. It is of course also possible that the recognition substances are not proteins or nucleic acids or antibodies, but antibodies directed against them. In particular, the recognition substances may be secondary antibodies in such a case.
  • the recognition molecule is an antibody, an antibody fragment and / or an antisense construct, in particular an RNA interference molecule.
  • the antibodies according to the invention specifically bind the peptides according to the invention.
  • the antibodies may also be modified antibodies (for example oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies).
  • modified antibodies for example oligomeric, reduced, oxidized and labeled antibodies.
  • the Indian As used herein, antibody includes both intact molecules and antibody fragments, such as Fab, F (ab ') 2, and Fv, which are capable of binding to certain epitope determinants of the polypeptides. In these fragments, the ability of the antibody to selectively bind its antigen or receptor has been partially preserved, the fragments being defined as follows:
  • Fab the fragment containing a monovalent antigen-binding fragment of an antibody molecule can be produced by cleavage of a whole antibody with the enzyme papain to obtain an intact light chain and a part of a heavy chain;
  • the Fab 'fragment of an antibody molecule can be recovered by treatment of a whole antibody with pepsin and subsequent reduction to yield an intact light chain and a portion of the heavy chain; per antibody molecule, two Fab 'fragments are obtained;
  • F (ab ') 2 the fragment of the antibody which can be obtained by treating a whole antibody with the enzyme pepsin without subsequent reduction;
  • F (ab ') 2 is a dimer of two Fab' fragments held together by two disulfide bonds;
  • Fv defined as a genetically engineered fragment containing the light chain variable region and the heavy chain variable region, expressed in the form of two chains
  • SCA Single chain antibody
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition which comprises the nucleic acid molecule according to the invention, the vector according to the invention, the host cell according to the invention, the polypeptide according to the invention and / or the recognition molecule according to the invention, optionally together with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition is an aquaretics.
  • Aquaretics according to the invention modify the interaction between PKA and AKAP proteins, in particular they decouple the interaction between these two.
  • the recognition molecules of the invention as a pharmaceutical composition, in particular those which are directed against the peptide according to the invention or the coding nucleic acid.
  • the peptides according to the invention, the vectors according to the invention or the pharmaceutical compositions comprising the recognition molecules according to the invention may preferably be used in patients with edemas, in particular in heart failure or liver cirrhosis.
  • the vectors or nucleic acid molecules according to the invention can be used according to the invention as a pharmaceutical composition at the nucleic acid level, whereas the Peptides according to the invention, but in part also the recognition molecules according to the invention, can be used on the .Aminoklaebene.
  • the expert can preferably Peptides according to the invention or the recognition molecules according to the invention, which are directed for example against these peptides or other structures, use as a pharmaceutical composition.
  • the erfidnungsdorfen peptides can be used in particular for the decoupling of AKAP / PKA us thus for example in edema.
  • the erfidnungsdorfen recognition molecules eg antibodies
  • the peptides according to the invention comprise conventional adjuvants, preferably carriers, adjuvants and / or vehicles.
  • the carriers may be, for example, fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, dissolution inhibitors, absorption accelerators, wetting agents, adsorbents and / or lubricants.
  • the peptide is referred to in particular as a drug or pharmaceutical agent.
  • the agent according to the invention as gel, powder, powder, tablet, sustained release tablet, premix, emulsion, infusion formulation, drops, concentrate, granules, syrup, pellet, BoIi, capsule, aerosol, spray and or inhalant prepared and / or used in this form.
  • the tablets, dragees, capsules, pills and granules can be mixed with the usual optionally containing opacifying, coatings and shells be provided and also be composed so that they deliver the active ingredient or only optionally delayed in a • certain part of the intestinal tract, where used as embedding masses, for example, polymeric substances and waxes.
  • the pharmaceutical compositions of this invention may be used for oral administration in any orally acceptable dosage form including, but not limited to, capsules, tablets, and aqueous suspensions and solutions.
  • carriers that are commonly used include lactose and corn starch.
  • Lubricants such as magnesium stearate, are also typically added.
  • useful diluents include lactose and dried corn starch.
  • the active substance (s) may optionally also be present in microencapsulated form with one or more of the excipients specified above.
  • Suppositories may beside the active compound or compounds, the customary water-soluble or water-insoluble Sustants, for example polyethylene glycols, fats, for example cocoa fat and higher esters (for example Ci-C4 alcohol with C 6 fatty acid) or mixtures of these substances).
  • the customary water-soluble or water-insoluble Sus for example polyethylene glycols, fats, for example cocoa fat and higher esters (for example Ci-C4 alcohol with C 6 fatty acid) or mixtures of these substances).
  • Ointments, pastes, creams and gels may contain, in addition to the active substance (s), the usual excipients, for example animal and vegetable fats, waxes, paraffins, Starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide or mixtures of these substances.
  • active substance s
  • the usual excipients for example animal and vegetable fats, waxes, paraffins, Starch, tragacanth, cellulose derivatives, polyethylene glycols, silicones, bentonites, silicic acid, talc and zinc oxide or mixtures of these substances.
  • Powders and sprays may contain, in addition to the active substance (s), the usual excipients, for example lactose, talc, silicic acid, aluminum hydroxide, calcium silicate and polyamide powder or mixtures of these substances.
  • Sprays may additionally contain the customary propellants, for example hydrochlorofluorocarbons.
  • Solutions and emulsions can, in addition to the active ingredients CHP and gemcitabine, the customary carriers such as solvents, solubilizers and emulsifiers, for example water, ethyl alcohol, isopropyl alcohol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, dimethylformamide, oils, in particular cottonseed oil, peanut oil, corn oil, olive oil, ricinus oil and sesame oil, glycerol, glycerol formal, tetrahydofurfuryl alcohol, polyethylene glycols and fatty acid esters of sorbitan or mixtures thereof.
  • the solutions and emulsions may also be present in sterile and blood isotonic form.
  • Suspensions may, in addition to the active ingredients, the usual carriers such as liquid diluents, for example water, ethyl alcohol, propylene glycol, suspending agents, for example ethoxylated Isostearylalkohole, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth or mixtures contain these substances.
  • liquid diluents for example water, ethyl alcohol, propylene glycol
  • suspending agents for example ethoxylated Isostearylalkohole, polyoxyethylene sorbitol and sorbitan esters, microcrystalline cellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar-agar and tragacanth or mixtures contain these substances.
  • the medicaments may be in the form of a sterile injectable preparation, for example as a sterile injectable aqueous or oily suspension.
  • This suspension can also be formulated by methods known in the art using suitable dispersing or wetting agents (such as Tween 80) and suspending agents.
  • the sterile injectable preparation may also be a sterile injectable solution or suspension in a non-toxic parenterally-acceptable diluent or solvent, for example as a solution in 1,3-butanediol.
  • Compatible vehicles and solvents that may be used include mannitol, water, Ringer's solution and isotonic sodium chloride solution.
  • sterile, non-volatile oils are usually used as solvent or suspending medium.
  • Any mild non-volatile oil including synthetic mono- or diglycerides, may be used for this purpose.
  • Fatty acids such as oleic acid and its glyceride derivatives are useful in the preparation of injectables, as are natural pharmaceutically acceptable oils such as olive oil or castor oil, especially in their polyoxyethylated forms.
  • These oil solutions or suspensions may also contain a long-chain alcohol or similar alcohol as a diluent or dispersant.
  • the formulation forms mentioned may also contain colorants, preservatives and odour- and taste-improved additives, for example peppermint oil and eucalyptus oil and sweeteners, for example saccharin.
  • the peptides according to the invention should preferably be present in the listed pharmaceutical preparations in a concentration of from about 0.01 to 99.9, preferably from about 0.05 to 99,% by weight of the total mixture.
  • the preparations mentioned can 'in humans and animals ent either orally, rectally, parenterally (intravenous, intramuscular, subcutaneous), intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local (powders, ointments, drops) and used for the treatment of these diseases.
  • Suitable preparations are injection solutions, solutions and suspensions for oral therapy, gels, infusion formulations, emulsions, ointments or drops.
  • ophthalmic and dermatological formulations, silver and other salts, ear drops, eye ointments, powders or solutions may be used.
  • animals' can also be via the feed or drinking water in suitable formulations, the • micrograph.
  • the drugs or the combination agents can be incorporated into other carrier materials such as plastics, (plastic chains for local therapy), collagen or bone cement.
  • the peptides are introduced in a concentration of from 0.1 to 99.5, preferably from 0.5 to 95, particularly preferably from 20 to 80,% by weight in a pharmaceutical preparation. That is, the peptides are present in the pharmaceutical compositions listed above, for example, tablets, pills, granules and others, preferably in a concentration of 0.1 to 99.5 wt .-% of the total mixture in a certain ratio.
  • the amount of active ingredient that is to say the amount of a compound of the invention combined with the carrier materials to produce a single dosage form, will be appreciated by those skilled in the art Depending on the patient to be treated and the particular mode of administration may vary.
  • the proportion of active compound in the preparation may be changed to provide a maintenance dose that arrests the disease. Thereafter, the dose or frequency of administration, or both as a function of the symptoms, may be reduced to a level at which the improved condition is maintained.
  • treatment should cease.
  • patients may require long-term discontinued treatment after any recurrence of disease symptoms. Accordingly, the proportion of the compounds, that is to say their concentration, in the overall mixture of the pharmaceutical preparation as well as their composition or combination is variable and can be modified and adapted by the person skilled in the art on the basis of his specialist knowledge.
  • peptides of the invention with an organism, preferably ⁇ a human or an animal, can be placed on various routes.
  • the pharmaceutical agents can be administered in various dosages.
  • the application should be carried out so that the disease is combated as effectively as possible or the outbreak of such disease is prevented in a prophylactic administration.
  • concentration and the type of application can be determined by the skilled person through routine experimentation.
  • Preferred applications of the compounds according to the invention are oral administration in the form of powders, tablets, juice, drops, capsules or the like, rectal administration in the form of suppositories, solutions and the like, parenterally in Forms of injections, infusions and solutions as well as locally in the form of salves, patches, envelopes, rinses and the like.
  • the bringing into contact of the compounds according to the invention preferably takes place prophylactically or therapeutically.
  • the suitability of the selected application forms as well as the dose, application regimen, selection of adjuvant and the same der ⁇ example, by taking serum aliquots from the patient, human or animal, and testing for ⁇ ie the presence of disease indicators in the course of Treatment protocol can be determined.
  • the condition of the kidney, as well as the amount of T cells or other cells of the immune system can be determined concomitantly in a conventional manner to obtain an overall view of the immunological constitution of the patient and in particular the constitution of metabolically important organs ,
  • the patient's clinical condition can be monitored for the desired effect. If insufficient therapeutic efficacy is achieved,. If necessary, the patient may be further treated with agents according to the invention modified with other known medicaments, from which an improvement of the overall constitution can be expected.
  • injections for example intramuscularly or subcutaneously or into the blood vessels, are another preferred route for the therapeutic administration of the compounds according to the invention.
  • the delivery via catheters or surgical tubes can be used become; For example, via catheters that lead directly to specific organs such as the kidneys.
  • the compounds according to the invention can be used in a preferred embodiment in a total amount of preferably 0.05 to 500 mg / kg body weight per 24 hours, preferably from 5 to 100 mg / kg body weight. This is advantageously a therapeutic amount used to prevent or ameliorate the symptoms of a disorder or respon- sive, pathological, physiological condition.
  • the dose will depend on the age, health and weight of the recipient, the degree of the disease, the nature of a necessary concomitant treatment, the frequency of treatment, and the nature of the desired effects and side effects.
  • the daily dose of 0.05 to 500 mg / kg body weight can be used once or several times to obtain the desired results.
  • pharmaceutical agents are used for about 1 to 10 times daily administration or, alternatively or additionally, as continuous infusion. Such administrations can be used as a chronic or acute therapy.
  • the amounts of drug combined with the carrier materials to produce a single dosage form may vary depending on the host to be treated and the particular mode of administration.
  • the target dose it is preferable to distribute the target dose to 2 to 5 applications, with 1 to 2 tablets having an active ingredient content of 0.05 to 500 mg / kg of body weight being administered for each application.
  • the active ingredient content it is possible to choose the active ingredient content also higher, spielmud up to a concentration of up to 5000 mg / kg.
  • the tablets may also be retarded, resulting in the Number of applications per day reduced to 1 to 3.
  • the active ingredient content of the sustained-release tablets can be 3 to 3000 mg. If the active ingredient is administered by injection as described above, it is preferred that the host is treated with the compounds according to the invention 1 to 10 times per day or by continuous infusion. To bring, with amounts of 1 to 4000 mg per day are preferred. The preferred total amounts per day have proven beneficial in human and veterinary medicine.
  • the pharmaceutical agent is used in an individual from 1 to 100, in particular from 2 to 50 mg / kg Kör permay.
  • the amount of single dose per application can be varied by the skilled person on the basis of his expertise.
  • the compounds used according to the invention can also be used in veterinary medicine in the named individual concentrations and preparations together with the feed or with feed preparations or with the drinking water.
  • a single dose preferably contains the amount of active ingredient administered in one application and the usual corresponds to a whole, half a daily dose or a third or a quarter of a daily dose.
  • the dosage units may accordingly preferably contain 1, 2, 3 or 4 or more single doses or 0.5, 0.3 or 0.25 of a single dose.
  • the daily dose of the compounds according to the invention is preferably distributed over 2 to 10 applications, preferably 2 to 7, more preferably 3 to 5 applications. Of course, a continuous infusion of the compositions of the invention is possible.
  • 1 to 2 tablets are administered for each oral application of the compounds according to the invention.
  • the tablets of the invention may be provided with the skilled person be ⁇ known coatings and shells and ⁇ also be composed so that they preferred the active compound or compounds only, release of the host in a certain part.
  • the peptide segments are optionally associated with one another or bound to liposomes in a carrier, wherein the inclusion in liposomes in the sense of the invention need not necessarily mean that the peptides in the An inclusion in the context of the invention may also mean that the peptides are associated with the membrane of the liposomes, for example, such that they are anchored to the outer membrane.
  • Such a representation of the peptides according to the invention in or on the liposomes is advantageous if the person skilled in the art selects the liposomes in such a way that they have an immunostimulating action.
  • DE 198 51 282 discloses various possibilities for the skilled person to modify the im-stimulating action of liposomes.
  • the lipids may be simple lipids, such as for example, esters and amides or complex lipids such as, for example, glycolipids such as cerebrosides or ganglionides, sphingolipids or phospholipids.
  • peptides, peptide fragments or structures which comprise peptides which are generated by the abovementioned methods-starting from the peptides according to the invention are also lead structures for the development of peptide mimetics.
  • amino acids have analogous physicochemical properties which advantageously lead to these amino acids being interchangeable.
  • these include, for example, the group of amino acids (a) glycine, alanine, valine, leucine and / or isoleucine; or the amino acids (b) serine and threonine, the amino acids (c) asparagine and Glutamine, the amino acids (d) aspartic acid and glutamic acid; the amino acids (e) lysine and, arginine and the group of aromatic amino acids (f) phenylalanine, tyrosine and / or tryptophan.
  • Amino acids within the same group (af) can be replaced 'with each other.
  • amino acids are exchanged by modified amino acids or specific enantiomers. Further modifications to the teaching of WO 99/62933 or WO 02/38592 are possible in accordance with the 'of the inventive teaching in the disclosure are included.
  • the peptide comprises a linker and / or a spacer which is selected from the group comprising: ⁇ -aminocarboxylic acids and their homo- and hetero-oligomers, ⁇ , ⁇ -aminocarboxylic acids and their branched homo- or hetero-oligomers, other amino acids and the linear and branched homo- or hetero-oligomers (peptides); Amino-oligoalkoxy-alkylamines; Maleimidocarboxylic acid derivatives; Oligomers of alkylamines; 4-alkylphenyl derivatives; 4-Oligoalkoxyphenyl- or 4-Oligo- alkoxyphenoxy derivatives; 4-oligoalkylmercaptophenyl or 4-oligoalkylmercaptophenoxy derivatives; 4-oligoalkylamine phenyl or 4-oligoalkylaminophenoxy derivatives; (Oligo- alkylbenzyl) phenyl or 4-01igoalkylbenz
  • synthetic peptides or fragments thereof can be multimerized by chemical crosslinkers or coupled to a carrier molecule such as BSA, dextran, KLH or others.
  • a carrier molecule such as BSA, dextran, KLH or others.
  • the chemical crosslinkers used for this purpose are listed in "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996, which are included in the disclosure content of the teaching according to the invention.
  • Preferred crosslinkers are homobifunctional crosslinkers, preferably: NHS esters, such as DSP, DTSSP, DSS, BS, DST, sulfo-DST, BSOCOES, sulfo-BSOCOES, EGS, sulfo-EGS, DSG or DSC, homobifunctional imidoesters, such as DMA, DMP , DMS or DTBP, homobifunctional sulfhydryl-reactive crosslinkers such as DPDPB, BMH or BMOE, difluorobenzene derivatives such as DFDNB or DFDNPS, homobifunctional photoreactive crosslinkers such as BASED, homobifunctional aldehydes such as formaldehyde or glutaraldehyde, bis-epoxides such as 1,4 Butanediol diglycidyl ethers, homobifunctional hydrazides such as adipic dihydrazides or carbohydrazides,
  • heterobifunctional crosslinkers in particular amine-reactive and sulfhydryl-reactive crosslinkers, such as SPDP, LC-SPDP, sulfo-LC-SPDP, SMPT, sulfo-LC-SMPT, SMCC, sulfo-SMCC, MBS, sulfo-MBS, SIAB, sulfo -SIAB, SMPB, sulfo-SMBP, GMBS, sulfo-GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX or NPIA, carbonyl reactive and sulfhydryl reactive crosslinkers such as MPBH, M 2 C 2 H or PDPH, amine reactive and photoreactive crosslinkers such as NHS-ASA , Sulfo-NHS-ASA, sulfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSAB, sulfo-HSAB, SANPAH, sulfo-
  • the peptides according to the invention and recombinantly produced structures are linked by peptide bridges with a length of 0 to 50 amino acids.
  • This also includes recombinant proteins consisting of two N-terminal and one C-terminal sequence or hexamers consisting of three N-terminal sequences and three C-terminal sequences, or multimers of the recombinant structures listed above, wherein between the N and the C-terminal sequences depending on a peptide bridge of 0 to 50 amino acids may be present.
  • the peptides may be provided for the purpose of ⁇ purification, solubilization, and the conformational change with specific proportions fusion either at the N- or at the 'C-terminal', as for example, CBP (calmodulin-binding protein), His-tag and / or others. Similar constructs can also be encoded by DNA used for therapy.
  • the invention also relates to a kit comprising a nucleic acid molecule according to the invention, a " vector " according to the invention, a host cell according to the invention, a polypeptide according to the invention, a recognition molecule according to the invention and / or a pharmaceutical composition, optionally together with information - for example an instruction leaflet or an internet address which on homepages with further information, etc. - about the handling resp. about the combination of the contents of the kit.
  • the information for handling the contents of the kit may include, for example, a treatment regimen for edema, heart failure, liver cirrhosis ⁇ , hyperinsulinemia, hypertension, duodenal ulcer.
  • the information may also include information on how to use the substances and products according to the invention within a diagnosis of diseases associated with the AKAP-PKA interaction or its decoupling.
  • the kit according to the invention can also be used in basic research. Within basic research, the kit is preferably used to detect whether a metabolic phenomenon is associated with the interaction or non-existent interaction of AKAP and PKA. In particular, it is possible with the aid of the kit according to the invention to determine which subunits of AKAP and / or PKA are responsible for the interaction of these two molecules or for the non-occurrence of the interaction between them.
  • the ⁇ products according to the invention such as peptides, vectors, nucleic acid molecules, other advantageous nucleic acids, amino acids, carbohydrates and lipids can include.
  • the peptides are modified with a fatty residue, such as a stearate, such that they are well membrane permeable. With such peptides attempts can 'be carried out on cell cultures.
  • Such peptides can be used as tools to decouple PKA most efficiently from AKAP proteins in cells, cell cultures, tissue cultures, organ cultures or organisms.
  • the peptides in the sense of the invention can be used in cell cultures, in particular to answer the question whether a particular process of anchorage of PKA to AKAP proteins.
  • kits of the invention may be used to study this course of the physiological process. It is advantageous here that the peptides according to the invention which bind the RII subunits of the PKA more strongly than the typical PKA binding domains of AKAPl ⁇ . Because the .
  • peptides according to the invention are advantageously RIIa or RII / 3-specific, for example, with the kit, particularly detailed knowledge about the interaction can be obtained.
  • the decoupling of one or the other regulatory subunits of the PKA of AKAP proteins can in particular shed light on which PKA, Typll ⁇ or type II / 3, is involved in the particular process to be investigated.
  • the peptide Al ⁇ RII ⁇ Rnl selectively binds RU ⁇ subunits of PKA.
  • the invention also relates to a method for modification, in particular an inhibition, preferably a decoupling, an AKAP-PKA interaction or the interaction of AKAP or PKA subunits comprising the steps:
  • the interaction is analyzed or modified on a regulatory R subunit, particularly preferably on a RII ⁇ and / or RII / 3 subunit.
  • the invention also relates to the use of a nucleic molecule according to the invention, a host cell according to the invention, an organism according to the invention, a polypeptide according to the invention, a recognition molecule according to the invention, a pharmaceutical composition according to the invention and / or a kit according to the invention for the modification, in particular an inhibition, of an AKAP-PKA interaction ,
  • the invention also relates to the use of fragments or subregions. the peptides or nucleic acids according to the invention. Furthermore, it can 'be provided to enhance the peptides or nucleic acids of the present invention to more amino acids or nucleotides. Of course, it is also possible to modify the peptides with lipid or carbohydrate structures.
  • the Zelle for example, as cell culture - used PKA interaction or the organism as a model for tissue and / or cell-specific AKAP, in particular as a model for diabetes insipidus.
  • Further preferred models are cell cultures or tissues which comprise nucleic acid molecules or peptides according to the invention.
  • the vasopressin-induced redistribution of AQP2 is modified, in particular prevented, by the AKAP-PKA modification.
  • the polypeptide and / or the pharmaceutical composition be used as a water loss-causing agent, in particular as aquaretic.
  • the interaction of the Rllce or RIIß subunit of the PKA with AKAP is modified, in particular inhibited.
  • Peptides for inhibiting the interaction of protein kinase A and protein kinase A anchor proteins Peptides for inhibiting the interaction of protein kinase A and protein kinase A anchor proteins
  • spots (about 50 nmol peptide per spot) were excised from the cellulosic membrane, from . the membrane removed by treatment with 0.05 M NaOH and ⁇ TOF-MALDI mass spectrometry and analyzed by HPLC.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • Tris-buffered saline with Tween 20 Tris-HCl 10mM NaCl 150mM Tween 20 0, 05% pH 7.5
  • RIIa or RII / 3 15 ⁇ g 7 ⁇ g / ⁇ l 5, 6 ⁇ l Catalytic 2 ⁇ g 0, 9 ⁇ g / ⁇ l 2 ⁇ l subunit of PKA.
  • Potassium phosphate buffer, 25 mM 1 M 12.5 ⁇ l pH 7.0 cAMP 10 ⁇ M 1 mM 5 ⁇ l MgCl 2 10 mM 0.5 M 10 ⁇ l DTT 0.5 mM 50 mM 5 ⁇ l [ ⁇ 32 P] ATP / ATP 0, 1 uM radioactively: 3.3 x 10 ö cpm / ml 75 uCi 5 uCi / ul 15 ul nonradioactive: 10 .mu.M 5 ul H 2 O 434.9 ul of 10 min incubation at 0 0 C (on ice). 2. Setting the ATP concentration
  • the concentration of ATP ' was prepared by addition of non-radioactive ATP set at 10 uM (addition of 5 ul of a 1 mM solution). The batch was incubated on ice for a further 50 min.
  • the reaction was stopped by addition of dextran ⁇ and separation of free nucleotides.
  • the free ATP was separated on a Sephadex G50 column.
  • Sources of Sephadex G50 material 20 g were swollen in 400 ml PBS overnight at room temperature. Untreated material was subsequently removed with a Pasteur pipette. The swollen material was aliquotted in 50 ml Falcon tube and stored at 4 0 C. For preservation, sodium azide was added at a final concentration of 0.01%.
  • the fractions of the first peak containing the probe were pooled. The incorporation rate was calculated in% and the specific activity (cpm / ⁇ g protein) was determined.
  • Proteins (40 ⁇ g) were separated by SDS-PAGE and transferred to a PVDF membrane (PVDF, polyvinylidene fluoride) by the semi-dry electroblotting method.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the membrane-associated proteins were stained with Ponceau S to identify the marker proteins on the membrane. Decolorized with TBS.
  • the membrane was dried in Blotto / BSA for 16 at 4 0 C incubated: 10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4 0.15 M NaCl 8.766 g / l 5% (w / v) skimmed milk powder 50 g / l 0.1% ( w / v) BSA 1 g / l (0.01% antifoam (Sigma)) 0.02% NaN 3 0.2 g / l
  • the membrane was washed 4 x 15 min in Blotto / BSA and 2 x 10 min in 10 mM potassium phosphate buffer, pH 7.4, 0.15 M NaCl.
  • RII-binding proteins were detected by exposure to a phosphoimage plate.
  • FIG. 1 shows the detection of the peptides by means of the RII overlay method.
  • radioactive PKA Rllce and RII / 3 subunits were used simultaneously.
  • either RIIa or RII / 3 subunits were used as probes. The result shows significant differences in the binding ability of the individual peptides to the R subunits (different signal intensities).
  • FIG. 2 shows a repetition of the experiment with selected peptides (AKAP18 ⁇ -L304T, AKAP18 ⁇ -L308D, AKAP18 ⁇ -L314E) whose binding ability to RICH or RII / 3 subunits, however, was tested separately in different RII overlay experiments.
  • the peptides Ht31, Ht31-P, AKAP18 ⁇ -RI and AKAP18 ⁇ -wt wild-type sequence
  • the signals were densitometrically evaluated and related to the signal obtained for AKAP18 ⁇ -wt.
  • the quantification suggests a stronger binding of AKAP18 ⁇ -L304T and AKAP18 ⁇ -L314E to both RIICÜ and RII / 3 subunits, whereas AKAP18 ⁇ -RI and AKAP18 ⁇ -L308D are weaker.
  • the well-known peptide Ht31 binds both regulatory. Subunits about 5-fold weaker than the AKAP18 ⁇ -wt and about 5-6-fold. weaker than AKAP18 ⁇ -L304T and AKAP18 ⁇ -L314E.
  • the binding of the Ht31 used herein, regulatory RIIa- RII and / 3-subunits is only slightly stronger than binding of the subunits' to Ht31-P, which.
  • AKAP-PKA interaction does not inhibit (Klussmann et al., 1999, Alto et al., 2003).
  • the peptides AKAP18 ⁇ -wt, AKAP18 ⁇ -L304T and and AKAP18 ⁇ -L314E are much more efficient inhibitors of AKAP-PKA interaction than Ht.31.
  • FIG. 4 shows that some peptides bind RII ⁇ but not RII ⁇ subunits (e.g. Peptides 10/11 and 10/12) and vice versa (for example, peptide 21/4).
  • some peptides have a stronger binding to Rllce subunits than to RII / 3 subunits. For others it is the other way round. They bind RII ⁇ subunits weaker than they do. RII / 3 subunits.
  • results show that we have found the first blockers with the mentioned peptides Al ⁇ RII ⁇ Hsl ⁇ and 2 and A18 ⁇ RII / 3Rnl, which selectively inhibit the interaction of RIIa and RII / 3 subunits of PKA. identified with AKAP proteins.
  • a ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY no. B ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY No. C ASDAQLVRLSKRLVENAVLK ⁇ VQQY No D ASDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY No E ARDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY No F ARDAQLVRLSKRLVENAVLK ⁇ VQQY No. G ANDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY No. H ASDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY No I ASDAKTVRLSKRLVENAVLKAVQQY No J CHANGE CRLVENAVLKAVQQY No. K ANDAKTERLSQRLVENAVLKAVQQY No.
  • Figure 5 shows the identification of peptides that inhibit AKAP-PKA interactions.
  • Candidate peptides were synthesized on a membrane and incubated with radioactively labeled PKA regulatory RIID subunits (RII overlay experiment). All black dots represent peptides that have bound regulatory PKA subunits (detected with a phosphoimager). The peptide sequences are listed in the attached list (Table 3):
  • 0S9 HUMAN 560 KR ⁇ NPQLKQIEGLVKELL ⁇ REGLTA.
  • OS9 HUMAN 561 KRVAYARVPSKDLLFSIVEEETGKD OTOF HUMAN 562
  • TVPVFFNQAERRAVLQAARMAGLKV OXRP HUMAN 563 VGGATRVPRVQ ⁇ VLLKAVGKE ⁇ LGK OXRP HUMAN 564 DQKAYKEGKLQKAL ⁇ DAFLAIDAKL P2CG HUMAN 565 TKYKMGGD IANRVLRSLV ⁇ ASSSGV P2G4 HUMAN 566
  • HRHMRTIREVRTLVTRVITDVYYVD P531 HUMAN 569 AEQFAPPDIAPPLLIKLVEAIEKKG P85A HUMAN
  • FIG. 1 Identification of peptides that inhibit the interaction of AKAP proteins with PKA.
  • a library of proteins derived from. derived from the PKA binding domain of AKAP18 ⁇ was synthesized on a membrane. The membrane was incubated with radioactively labeled RIIa regulatory and RII ⁇ subunits of PKA (RII overlay experiment). Each black dot represents a peptide to which the RII subunits have bound ( ⁇ detected using a phosphoimager).
  • the amino acid sequences of the peptides can be read off with the given abbreviations (single-letter coding).
  • FIG. 2 Identification of peptides derived from AKAPl ⁇ which inhibit the interaction of AKAP proteins with the regulatory RIICK and RII / 3 subunits of PKA.
  • A Peptides derived from the PKA binding domain of AKAP185 were synthesized on two membranes. The membranes were incubated with radioactively labeled RIICK (top row) or RII / ⁇ (lower row) subunits of PKA (RII overlay experiment). Each black dot represents a peptide to which the RII subunits have bound (detected with a phosphoimager). For quantification, the signals became densitometrically and related to the signal obtained for AK ⁇ P18 ⁇ -wt.
  • B The amino acid sequences of the peptides (single letter coding) given in A.
  • FIG. 3A shows peptides derived from AKAPl ⁇ which bind the RIIa and RII / 3 subunits of the PKA to different degrees.
  • A. Peptides 1-19 derived from the PKA binding domain of AKAPl ⁇ were synthesized on two membranes. Membranes were incubated with radioactively labeled RIIa regulatory (upper panel) or RIIjS (lower panel) subunits of PKA (RII overlay experiment). Each black dot represents a peptide to which the RII subunits have bound (detected with a phosphoimager). For quantification, the signals were densitometrically evaluated and related to the signal obtained for AKAP18 ⁇ -wt. The peptide 7 is highlighted by red writing due to the large difference in the binding to the two RII subunits.
  • FIG 4 Different peptides, derived from AKAPl ⁇ , bind RIIa and RII / 3 subunits of PKA to different degrees.
  • Two libraries of peptides derived from peptide 7 of Figure 3 were synthesized on two membranes. The membranes were incubated with radioactively labeled RIIa regulatory (left side) or RIIjS subunits of PKA (right side) (RII overlay experiment). Each black dot represents one Peptide to which the RII subunits have bound (detected with a phosphoimager).
  • the amino acid sequences "of peptides may be using the specified code (Einbuchstabenkodtechnik) off.
  • Figure 5 Identification of peptides that inhibit AKAP-PKA interactions.
  • Candidate peptides were synthesized on a membrane and probed with. radioactively labeled RIID regulatory subunits of PKA incubated (RII overlay experiment). All black dots represent peptides that have bound regulatory PKA subunits (detected with a phosphoimager).
  • FIG. 6 Influence of hydrogen bonding on binding between peptides and RII (alpha) subunits of PKA.
  • A, B Comparative schematic representation of the interaction between RII (alpha) and the peptides AKAP18 (delta) -wt or AKAP18 (delta) -L314E and between RII (alpha), Ht31 or AKAi 3 .
  • Rllalpha is shown as a rectangle and through selected amino acids, the peptides are represented by their amino acid sequence. Amino acids as a partner of a hydrogen bond are connected by a broken line. Amino acids of peptides that are in positions for hydrophobic Molecular contacts are highlighted in green (Pos.
  • Beta-adrenergic regulation requires direct anchoring of PKA to cardiac CaVl.2 channels via a leucine zipper interaction with A kinase anchoring protein 15. Proc. Natl. Acad. Be. USA 100, 13093-13098, 2003.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die für Peptide kodiert, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA)und Proteinkinase A-Ankerproteinen (AKAP) inhibiert, einen Wirtsorganismus, der die Nukleinsäuresequenz umfasst und gegebenenfalls die Peptide exprimiert sowie die Verwendung der Peptide sowie des Wirtsorganismus bei der Untersuchung von Krankheiten, die mit der AKAP PKA Interaktion assoziiert sind sowie die Verwendung der Peptide als pharmazeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten.

Description

Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen
Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die für Peptide kodieren, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase' A-Ankerproteinen (AKAP) inhibieren, einen Wirtsorganismus, der die Nukleinsäuresequenz umfasst und die erfindungsgemäßen Peptide exprimiert sowie die Verwendung der Peptide sowie des Wirtsorganismus bei der Therapie und experimentellen Untersuchung von Krankheiten, die mit einer modifizierten AKAP-PKA-Interaktion assoziiert sind sowie die Verwendung der Peptide als pharmazeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten, insbesondere Diabetes insipidus, Ulcus duodeni, Hypertonie und Diabetes mellitus.
Die biologische Wirkung von Hormonen und Neurotransmittern wird über die Aktivierung von Signalkaskaden, welche den Phosphorylierungsstatus von Effektorproteinen verändern, vermittelt. An diesem reversiblen Prozess sind zwei Klassen von Enzymen' beteiligt: Proteinkinasen und Phosphoproteinphosphatasen. Die Phosphorylierung erfolgt durch Kinasen, welche die Übertragung der endständigen Phosphatgruppe von ATP auf spezifische Serin- oder Threoninreste katalysieren, die Dephosphorylierung wird durch Phosphoproteinphosphatasen vermittelt. Ein Mechanismus zur Kontrolle und Regulation dieser Enzymaktivitäten ist die Kompartimentierung dieser Enzyme durch die Assoziation mit Ankerproteinen, die in der Nähe ihrer Substrate lokalisiert sind. Die Proteinkinase A (PKA) ist eine der multifunktionellen Kinasen mit einer breiten Substratspezifität, welche durch die so genannten protein kinase A anchoring proteins (AKAPs) an subzellulären Strukturen verankert wird.
Bei vielen wichtigen zellulären Prozessen wie Kontraktion, Sekretion, Stoffwechsel, Gentranskription, Zellwachstum und -teilung erfolgt die Weiterleitung extrazellulärer Signale über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, das G-Protein Gs, Aktivierung einer Adenylylzyklase und Bildung des secondmessenger zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) . Die Effekte von cAMP werden durch die cAMP-abhängige PKA vermittelt.
Das Proteinkinase A (PKA) -Holoenzym besteht aus einem Dimer regulatorischer (R) Untereinheiten, an die jeweils eine katalytische (C) Untereinheit gebunden ist. Die Aktivierung der Kinase durch die Bindung von zwei Molekülen cAMP an jede R-Untereinheit induziert die Dissoziation der C-Untereinheiten, die die in ihrer Nähe befindlichen Substrate phosphorylieren. Entsprechend dem Vorhandensein von Typ I (RI) oder Typ II (RII) regulatorischen Untereinheiten wird das PKA-Holoenzym als Typ I- oder Typ II-PKA bezeichnet. Bei den RI-Untereinheiten existieren Rice und RI/3, bei den RII-Untereinheiten RIIa und RII/? und bei den C-Untereinheiten Coi, Cß und Cγ. Die unterschiedlichen PKA-Untereinheiten werden von verschiedenen Genen kodiert (Klussmann, 2004; Tasken und Aandahl, 2004) .
Die regulatorischen • Untereinheiten zeigen ein unterschiedliches Expressionsmuster. Während RIa und RIIa ubiquitär in den Geweben vorkommen, ist die regulatorische Untereinheit RIß in erster Linie im Gehirn zu finden.
Die Assoziation der beiden R-Untereinheiten mit intrazellulären Kompartimenten wird durch AKAPs vermittelt. Bei den Ankerproteinen handelt es sich um eine Gruppe funktionell verwandter Moleküle, die durch die Interaktion mit Typ I bzw. Typ II der regulatorischen Untereinheiten (RI bzw. RII) des PKA-Holoenzyms charakterisiert sind. Die ersten Ankerproteine wurden bei der affinitätschromatographischen Reinigung der R- Untereinheiten über cAMP-Sepharose isoliert. Diese assoziierten Proteine zeigten auch nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembran eine RII-Bindung. Auf dieser Beobachtung beruht auch die gebräuchlichste Methode (RII-overlay) zur Detektion von AKAPs. Es handelt sich hierbei um einen modifizierten Western Blot, bei dem statt eines primären Antikörpers radioaktiv markierte RII-Untereinheiten als Sonde eingesetzt werden.
Zur funktionellen Bedeutung der RI-AKAP-Interaktion ist noch wenig bekannt. Auch wenn RIa hauptsächlich zytosolisch lokalisiert ist, zeigen verschiedene Studien eine Verankerung in vivo. Dabei scheint die dynamische Verankerung der Rlα-Untereinheiten im Gegensatz zur statischen Verankerung der RII-Untereinheiten von entscheidender Bedeutung für die Zelle zu sein. So wurde die Assoziation der RI-Untereinheiten mit der Plasmamembran von Erythrozyten und aktivierten T-Lymphozyten beschrieben. Bei der cAMP-vermittelten Inhibition der T-ZeIl- Proliferation durch die PKA Typ I könnte die Lokalisation des Enzyms möglicherweise auch durch AKAPs vermittelt werden. In knockout-Mäusen, die im Skelettmuskelgewebe keine regulatorischen Untereinheiten Typ II exprimieren, binden die Rlα-Untereinheiten an ein mit Kalziumkanälen assoziiertes AKAP und erhalten so die normale, cAMP- abhängige Kanalleitfähigkeit durch die korrekte Verfügbarkeit der katalytischen Untereinheiten der PKA.
In vivo konnte weiterhin gezeigt werden, dass die katalytischen Untereinheiten in der Zelle bevorzugt mit den RII-Untereinheiten assoziieren und Typ I-PKA-Holoenzym gebildet wird, wenn die Menge der freien katalytisehen Untereinheiten die Menge der freien RII-Untereinheiten übersteigt.
Die Spezifität in der PKA-Verankerung wird durch die targeting-Domäne erreicht, ein Strukturmotiv, das im Gegensatz zu der anchoring-Oomäne weder in der Sequenz noch in der Struktur der AKAPs konserviert ist. So werden AKAPs durch Protein-Protein-Interaktionen an strukturelle Elemente in der Zelle und durch Protein-Lipid-Interaktionen an Membranen verankert.
In der Literatur sind verschiedene AKAPs beschrieben, die mit unterschiedlichen zellulären Kompartimenten assoziieren, so zum Beispiel mit den Zentrosomen, den Mito- chondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat, der Plasma- und Kernmembran und mit Vesikeln.
Die genauen Mechanismen der Verankerung sind bisher nur für einige AKAPs bekannt. So wird das herzmuskelspezifische Ankerprotein mAKAP durch eine Region mit drei spektrinartigen Wiederholungssequenzen an der perinukleären Membran der Kardiomyozyten verankert. Zwei Isoformen der AKAP15/18 werden durch Lipidmodifikationen (Myristoylierung und Palmitoylierung) an der Plasmamembran verankert. Drei polybasische Regionen in der targeting-Domäne des AKAP79 sind an der Lokalisation des Proteins an der inneren postsynaptischen Membran (PSD, postsynaptic density) beteiligt.
Die AKAPs wurden zuerst durch die Interaktion mit der PKA charakterisiert. Einige dieser Proteine können jedoch auch andere an der Signaltransduktion beteiligte Enzyme binden. Durch die gleichzeitige Verankerung von Enzymen, die gegensätzliche ' Reaktionen katalysieren, wie zum Beispiel Kinasen und Phosphatasen, können diese, auch als scaffolding (gerüstbildende) Proteine bezeichneten AKAPs ganze Signalkomplexe in der Nähe bestimmter Substrate lokalisieren und so zur Spezifität und Regulation der zellulären Antwort auf extrazelluläre Signale beitragen. AKAP79 war das erste AKAP, für das die Interaktion mit mehreren Enzymen nachgewiesen werden konnte. Dieses Protein bindet die Proteinkinase A, die Proteinkinase C und die Proteinphosphatase Calcineurin (PP2B) , wobei jedes Enzym in gebundenem Zustand inhibiert ist. Da unterschiedliche Signale für die Aktivierung jedes einzelnen Enzyms notwendig sind, können an dieser Stelle verschiedene second messenger wie cAMP, Kalzium und Phospholipide zusammentreffen. Weitere Beispiele sind das AKAP220, welches die PKA und die Proteinphosphatase PPl an den Peroxisomen lokalisiert und das AKAP Yotiao, das neben der PKA ebenfalls die Proteinphosphatase ■ PPl bindet. Das AKAP CG-NAP bindet nicht nur die PKA und die Proteinphosphatase PPl, sondern auch noch, die Rho-abhängige Kinase PKN (NGF (nerve growth factor) -aktivierte Proteinkinase) und die Proteinphosphatase PP2A.
Auch andere Proteine können mit AKAPs assoziieren, so bindet Ezrin, ein Mitglied der zytoskelett-assoziierten ERM-Familie Ezrin/ Radixin und Moesin, das als AKAP identi¬ fiziert wurde, an ein Protein (EBP50/NHERF) , welches an der Regulation des Natrium-Protonen-Transportes in der apikalen Membran von Epithelzellen beteiligt ist. AKAPs vermitteln die Modulation der Leitfähigkeit der Ionenkanäle durch die Lokalisation der Proteinkinasen und -Phosphatasen in der Nähe bestimmter Kanaluntereinheiten, die wahrscheinlich durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert werden. Die Aktivität des NMDA-Rezeptors wird durch das AKAP Yotiao, welches auch die Proteinphosphatase PPl bindet, moduliert. Die in gebundenem Zustand aktive Phosphatase limitiert die Kanalleitfähigkeit des NMDA-Rezeptors, bis die PKA durch cAMP aktiviert wird und den Ionenkanal oder ein assoziiertes Protein phosphoryliert, wodurch die Leitfähigkeit rapide ansteigt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass myristoylierte Ht31-Peptide, die die Interaktion zwischen PKA und ■ AKAP inhibieren, die cAMP- abhängige Inhibition der Interleukin 2-Transkription in Jurkat-T-Zellen aufheben und dass S-Ht31-Peptide die Spermienmotilität einschränken.
Auch bei den wichtigen komplexen biologischen Prozessen, wie die durch das Hormon GLP-I {glucagon-like peptide) -ver¬ mittelte Verstärkung der Insulinsekretion in den ß-Zellen des Pankreas und in RINm5F-Zellen (klonale ß-Zelllinie der Ratte) sind AKAPs beteiligt. Die Aktivierung der PKA durch GLP-I führt zur Phosphorylierung von L-Typ-Kalziumkanälen und begünstigt die Exozytose von Insulin aus sekretorischen Granula. Die Ht31-Peptid-vermittelte Inhibition der PKA-Verankerung führte zu einer deutlichen Verringerung der Insulinsekretion. Dabei wurden weder die cAMP-Bildung noch die Aktivität der katalytischen Untereinheiten der PKA durch die Peptide beeinflusst. Weiterhin konnte nach Expression des wildtypischen AKAPISCK in RINm5F-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, welche AKAP18a nicht exprimierten, eine Erhöhung der Insulinsektretion nach GLP-I-Applikation nachgewiesen werden..
Die vom antidiuiretischen Hormon Arginin-Vasopressin (AVP) - abhängige Umverteilung des Wasserkanals Aquaporin-2 aus intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran von HauptZeilen des renalen Sammelrohres, die molekulare Basis der Vasopressin-vermittelten Wasserrückresorption, ist ein weiteres Beispiel für einen Prozess, der die Interaktion der PKA ■ mit AKAP-Proteinen erfordert (Klussmann et al. , 1999) . Wird die Interaktion, unterbunden, kann die Umverteilung nicht stattfinden. Die Interaktion spielt jedoch auch bei zahlreichen "anderen Vorgängen in einer Vielzahl unterschiedlicher. Zelltypen eine wichtige Rolle, zum Beispiel erhöht die Interaktion die Herzmuskelkontraktilitat (Hulme et al . , 2003) .
Um die Wirkung der PKA-AKAP-Interaktion zu analysieren, ist es erforderlich, die Interaktion effizient und selektiv zu modifizieren, insbesondere zu inhibieren bzw. zu entkoppeln. Derzeit steht für die Entkopplung der PKA von AKAP-Proteinen ein Ht31 Peptid zur Verfügung.' Das Peptid Ht31 kann an Stearat gekoppelt werden, um membranpermeabel vorzuliegen. Das Pepdid Ht31 entkoppelt PKA und AKAP jedoch in einer Weise, die für viele Untersuchungen oder gar für eine therapeutische Verwendung nicht ausreichend ist. Vor allem ist das Peptid Ht31 nicht in der Lage, selektiv mit den regulatorischen Untereinheiten RIIa oder RIIß der PKA zu interagieren, so dass die Bedeutung' der Untereinheiten für ausgewählte Prozesse nicht analysiert werden kann.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, die genannten Nachteile zu überwinden und insbesondere neue Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, die für Peptide kodieren, die die Interaktion von AKAP und PKA effizient und spezifisch modifizieren, insbesondere entkoppeln und die weiterhin als überexpremierende Stoffe in Wirtsorganismen eingesetzt werden können, um mit Hilfe dieser Wirtsorganismen - bei¬ spielsweise von Mäusen - modellhaft Krankheiten zu analysieren, die mit der AKAP-PKA-Interaktion assoziiert sind, vorzugsweise Diabetes insipidus, aber auch Ulcus duodeni, Hypertonie und Diabetes mellitus. Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend
a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid- sequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1 - 39,
b) ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter stringenten ■Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nukleinsäuremolekül, ■ umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nukleinsäuremolekül, das infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und/oder
e) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis d) ist.
Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden können, um Peptide gemäß Tab. 1 ■ (SEQ ID Nr. 1 - 39) zu kodieren, die die Wechselwirkung von AKAP und PKA modifizieren, vorzugsweise inhibieren, besonders bevorzugt entkoppeln. Mit Vorteil eignen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Kodierung von Peptiden, die selektiv an regulatorische Untereinheiten der PKA binden, insbesondere an RIICH bzw. RI1/3. Weiterhin ermöglichen es die - durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten - Peptide, eine Modifizierung, Inhibition bzw. Entkopplung von AKAP und PKA in Abhängigkeit der verwendeten Spezies vorzunehmen. Die Nukleinsäuremoleküle bzw. die aus diesen abgeleiteten Peptide '.eignen sich mit Vorteil zur Herstellung transgener Organismen, beispielsweise von Mäusen, in denen die AKAP-PKA-Interaktion gewebs- und/oder zellspezifisch modifiziert ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer. Nukleotidsequenz funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40 % homolog. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten Nukleinsäuresequenzen bzw. den mit diesen Nukleinsäuresequenzen hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die kodierten homologen Strukturen eine effiziente und selektive Entkoppelung der PKA-AKAP-Interaktion ermöglichen und eine hohe Affinität für die Bindung an RII-Untereinheiten von PKA besitzen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül. mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 % Homologie zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen auf.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine genomische DNA und/oder eine RNA; besonders bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA.
Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor umfasst. Die Erfindung . betrifft auch ein Polypeptid, das durch mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid eine Aminosäures.equenz nach SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 39, bzw. mindestens ein Polypeptid gemäß dieser Sequenzen. Die Erfindung ' betrifft auch ein Polypeptid, welches durch Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder Insertion modifiziert ist und funktionsanalog zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 39. ist und/oder ein Polypeptid, welches ein Polypeptid umfasst, das eine auseichende Homologie aufweist,um zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 39 oder deren Mutationen (Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder Insertionen) funktionsanalog zu sein.
Folgende erfindungsgemäße Peptide sind besonders bevorzugt:
SEQ ID Nr. 1 PEDAELVRLSKRLYENAVLKAVQQY (Akapl8δ-wt) SEQ ID Nr. 2 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L304T) SEQ ID Nr. 3 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L308D) SEQ ID Nr. 4 PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY • (AKAP18Ö-L314E) SEQ ID Nr. 5 PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAP185-P) SEQ ID Nr. 6 PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18Ö-PP) SEQ ID Nr. 7 PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPl8δ-phos) SEQ ID Nr. 8 EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (Akapl8δ-RI) SEQ ID Nr. 9 NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA SEQ ID Nr. 10 VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL SEQ ID Nr. 11 NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF SEQ ID Nr. 12 TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA SEQ ID Nr. 13 LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ SEQ ID Nr. 14 QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL SEQ ID Nr. 15 LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA SEQ ID Nr. 16 EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA SEQ ID Nr. 17 ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH SEQ ID Nr. 18 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 19 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr..20 TDRGFPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 21 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP SEQ ID Nr. 22 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV SEQ ID Nr. 23 EKESLTEEEATEFLKQILNGVYYLH SEQ ID Nr. 24 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH SEQ ID Nr. 25 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP SEQ ID Nr. 26 LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF SEQ ID Nr. 27 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVDLYL SEQ ID Nr. 28 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS SEQ ID Nr. 29 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ SEQ ID Nr. 30 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE SEQ ID Nr. 31 QMKAKRTKEAVEVLKKALDAISHSD SEQ ID Nr. 32 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS SEQ ID Nr. 33 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF SEQ ID Nr. 34 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY SEQ ID Nr. 35 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE SEQ ID Nr. 36 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL SEQ ID Nr. 37 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA SEQ ID Nr. 38 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA , SEQ ID Nr. 39 DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT.
Die erfindungsgemäßen Peptide sind entweder (i) von AKAP18 (delta) abgeleitet (SEQ ID Nr. 1 bis 7) oder aber (ii) von Proteinen, die nicht mit AKAP-Molekülen assoziiert sind (SEQ ID Nr.. 8 bis 39) .
Gemeinsam ist den Peptiden gemäß (i) :
Akapl8δ-wt AKAP185-L304T AKAP18Ö-L314E Akapl8δ-RI
dass sie die RIIalpha Untereinheiten der PKA so stark wie kein anderes, von natürlichen AKAPs abgeleitetes Peptid binden. Dies wird von uns durch die Bindung über Wasserstoffbrücken (H-Brücken) zwischen Peptid und RII- dimer erklärt (s. Abb. Wasserstoffbrücken durch gestrichelte Linien dargestellt) . Entsprechend ist den Peptiden die Mindestanzahl (8) an H-Brücken bildenden Aminosäuren gemein.
Die folgenden Peptide sind ebenfalls von AKPA18 (delta) abgeleitet, zeichnen sich jedoch dadurch aus, daß sie trotz hoher Aminosäureähnlichkeit keine RII-Untereinheiten der PKA binden (Negativkontrollen; notfalls kann auf eine Patentierung verzichtet werden) . Gemein ist ihnen, daß sie aufgrund struktureller (1,2) oder aufgrund von Ladungsunterschieden (3,4) nicht mehr binden.
1 AKAP18δ-P 2 AKAP185-PP 3 AKAP185-L308D 4 AKAP18δ-phos
Die erfindungsgemäßen Peptide, die von anderen Proteinen als AKAPs abgeleitet sind, besitzen eine definierte Größe, die überraschenderweise zu der Fähigkeit der Peptide, eine Interaktion zwischen AKAP und PKA zu modifizieren, beiträgt, da sie die Affinität der Peptide zu den RII (alpha) Untereinheiten der PKA beeinflusst . Die Peptide bestehen aus 25 Aminosäuren und sind dem gemäß 25mere. Werden die Peptide so ausgewählt, dass die kürzer oder länger sind (z.B. 17mere) , wird ihre Aktivität hierdurch geändert. Das gemeinsame strukturelle Merkmal der Länge der Peptide definiert zusammen mit dem funktionellen Merkmal der AKÄP/PKA-Entkopplung die erfindungsgemäßen Strukturen. Diese erfindungsgemäßen Peptide sind charakterisiert durch die allgemeine Formel:
xxxxxxxxx[AVLISE]xx[AVLIFJ [AVLI]xx[AVLI] [AVLIF]xx[AVLISE]xx XX
wobei x eine beliebige Aminosäure repräsentiert; insbesondere ist durch- x dabei repräsentiert jeweils eine beliebige der 20 biogenen Aminosäuren (im Ein-Buchstaben- Code dargestellt • sind dies: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, ' R, S, T, V,- W, Y) . Beansprucht ist jede Aminosäure, die im Alberts et al . (2004) Molekularbiologie der Zelle, S. 8, 73, 79 ff., 150 ff. oder 1717G, im Römpp (1999) Biotechnologie und Gentechnik, S. 45 ff, bzw. im Römpp (2000) Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, S. 28 ff, oder in einem anderen Standardwerk der Biologie offenbart ist. Diese besonders bevorzugten Peptide besitzen entweder eine positiv geladene Aminosäure (H, K oder R)- in erster oder zweiter Position (Position ist die Nummer . der Aminosäure vom N-terminus) oder Leucin in den Positionen 19, 18 oder 14 oder Serin in Position 4.
Ein funktionsanaloges Peptid ist ein Peptid, das in der Lage ist, die PKA-AKAP-Interaktion zu modifizieren, bevorzugt zu entkoppeln.
Die Erfindung betrifft auch einen Organismus, der ein erfάndungsgemäßes Nukleinsäuremolekül überexprimiert bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst und/oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid aufweist . Hierbei kann es sich zum Beispiel um eine transgene Maus oder Ratte bzw. um ein Rind, Pferd, Esel, Schaf, Kamel, Ziege, Schwein, Kaninchen, Meerschwein, Hamster, Katze, Affe oder Hund handeln, in der gewebs- und/oder zellspezifisch die PKA-AKAP-Interaktion gestört ist. Derartige Organismen, beispielsweise Mäuse, können insbesondere verwendet werden1, um Pharmaka zu entwickeln, die die PKA-AKAP-Interaktion modifizieren, bevorzugt entkoppeln.
Mittels der erfindungsgemäßen Organismen können auch in vivo Stoffwechselprozesse untersucht werden, bei denen die PKA-AKAP-Interaktion eine Rolle spielt oder bei denen geklärt werden soll, ob bei einem bestimmten Ereignis die AKAP-PKA-Interaktion involviert ist..
Bevorzugt handelt es sich bei dem Organismus um eine transgene Maus, die das stark bindende Peptid AKΑP185-L304T oder AKAP18δ-L314E spezifisch in den Hauptzellen von Sammelrohren der Niere überexprimiert.. Vorteilhafterweise führt die Entkoppelung der PKA von AKAP-Proteinen dazu, dass in primär kultivierten Sammelrohrzellen die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQP2 verhindert wird, wodurch die Tiere insbesondere einen Diabetes insipidus aufweisen. Diese Erkrankung zeichnet sich durch großen Wasserverlust (Polyurie) aus, den beispielsweise humane Patienten durch ' die Aufnahme größerer Mengen Flüssigkeit zu kompensieren versuchen (Polydipsie) .
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen transgenen Organismen kann beispielsweise untersucht werden, wie die Entkoppelung der PKA bzw. von ausgewählten Untereinheiten von AKAP-Proteinen als therapeutisches Prinzip angesehen und genutzt werden kann. In der Folge derartiger Untersuchungen können dann vorteilhafterweise optimierte Substanzen (Pharmaka) analysiert werden, die ebenso wirken. Derart optimierte Substanzen wirken bevorzugt als Aquaretika und können daher mit Vorteil bei Patienten mit Ödemen, beispielsweise bei Herzinsuffizienz oder bei Lebercirrhose, eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist. Erkennungssubstanzen im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen wie Nukleinsäuremolekülen oder -Sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren Fragmenten wechselwirken können; insbesondere so wechselwirken, dass eine Detektion bzw. eine Manipulation dieser Strukturen möglich ist. Die Erkennungssubstanzen können insbesondere spezifische Nukleinsäuren sein, die an die genannten Nukleinsäuremoleküle oder Polypeptide binden, wie zum Beispiel Antisense-Konstrukte, cDNA oder mRNA- Moleküle bzw. deren Fragmente, aber auch Antikörper, Fluoreszenzmarker, markierte Kohlenhydrate oder Lipide bzw. Chelatoren. Es ist selbstverständlich auch möglich, dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nukleinsäuren bzw. Antikörper sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper. Die Erkennungssubstanzen können in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisensekonstrukt, insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül .
Die Antikörper im Sinne der Erfindung binden die erfin¬ dungsgemäßen Peptide spezifisch. Die Antikörper können auch modifizierte Antikörper sein (zum Beispiel oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper) . Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Antikörper- Fragmente, wie Fab, F(ab')2 und Fv, die bestimmte Epitop- Determinanten der Polypeptide binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:
(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigen- bindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;
(2) das Fab' -Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab' -Fragmente erhalten;
(3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist ein Dimer von zwei Fab' -Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und (5) Einzelketten-Antikörper ("SCA") , definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.
Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, den erfindungsgemäßen Vektor, die erfindungsgemäße Wirtszelle, das errfindungsgemäße Polypeptid und/oder das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Aquaretika. Aquaretika im Sinne der Erfindung modifizieren die Wechselwirkung zwischen PKA und AKAP-Proteinen, insbesondere entkoppeln sie die Wechselwirkung zwischen diesen beiden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die erfindungsemäßen Erkennungsmoleküle als pharmazeutische Zusammensetzung einzusetzen, insbesondere die, die gegen das erfindungsgemäße Peptid oder die kodierende Nukleinsäure gerichtet sind.
Insbesondere die die erfindungsgemäßen Peptide, die erfindungsgemäßen Vektoren oder die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können bevorzugt bei Patienten mit Ödemen, insbesondere bei Herzinsuffizienz oder Leberzirrhose eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Nukleinsäuremoleküle können im Sinne der Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung auf der Nukleinsäureebene eingesetzt werden, wohingegen die erfindungsgemäßen Peptide, aber zum Teil auch die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, auf der .Aminosäureebene eingesetzt werden können. Je nachdem, ob die Therapie in der Entkoppelung von AKAP und PKA - z.B. mittels der erfindungsgemäßen Peptide - bzw. ' in der Verhinderung der Entkoppelung zwischen AKAP und PKA - z.B. mittels der erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet gegen die Peptide - besteht, kann der Fachmann bevorzugt die erfindungsgemäßen Peptide bzw. die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, die zum Beispiel gegen diese Peptide oder andere Strukturen gerichtet sind, als pharmazeutische Zusammensetzung verwenden. Die erfidnungsgemäßen Peptide sind insbesondere für die Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar uns somit beispielsweise bei Ödemen. Die erfidnungsgemäßen Erkennungsmoleküle (z.B. Antikörper) sind insbesondere bei der Verhinderung der Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar z.B. bei Diabetes insipidus.
Selbstverständlich ist es möglich, dass die erfindungs¬ gemäßen Peptide übliche Hilfsstoffe, bevorzugt Träger, Adjuvantien und/oder Vehikel umfassen. Bei den Trägern kann es sich beispielsweise um Füllmittel, Streckmittel, Binde¬ mittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel, Adsorptionsmittel .und/oder Gleitmittel handeln. In diesem Fall wird das Peptid insbesondere als Arzneimittel oder pharmazeutisches Mittel bezeichnet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Mittel als Gel, Puder, Pulver, Tablette, Retard-Tablette, Premix, Emulsion, Aufguss- formulierung, Tropfen, Konzentrat, Granulat, Sirup, Pellet, BoIi, Kapsel, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet. Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen, gegebenenfalls Opakisierungsmitteln enthaltenden, Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, dass sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem • bestimmten Teil des Intestinaltraktes gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen zum Beispiel Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.
Die Arzneimittel dieser Erfindung können beispielsweise zur oralen Verabreichung in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verwendet werden, die Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, die häufig verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesium- stearat, werden auch typischerweise zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform schließen verwendbare Verdün¬ nungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen oral verabreicht werden, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süßmittel und/oder Ge¬ schmacksstoffe und/oder Farbmittel zugesetzt werden.
Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.
Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Träger¬ stoffe enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel Kakaofett und höhere Ester (zum Beispiel Ci4-Alkohol mit Ci6-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe) .
Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Bei¬ spiel tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.
Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, zum Beispiel Chlor¬ fluorkohlenwasserstoffe, enthalten.
Lösungen und Emulsionen können neben den Wirkstoffen CHP und Gemcitabin die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylen- glykol, Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusδl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydofurfurylalkohol, Poly¬ ethylenglycole und Fettsäureester des Sorbitans oder Ge¬ mische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen Appli¬ kation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.
Suspensionen können neben den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, zum Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylen- sorbit- und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.
Die Arzneimittel können in Form einer sterilen injizier¬ baren Zubereitung, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspension, vorliegen. Diese Suspension kann auch mit im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Netzmittel (wie zum Beispiel Tween 80) und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel als Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Mannit, Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden üblicher¬ weise sterile, nichtflüchtige Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein belie¬ biges mildes nichtflüchtiges Öl einschließlich syntheti¬ scher Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate sind bei der Her¬ stellung von Injektionsmitteln verwendbar, wie es natür¬ liche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Formen sind. Diese Öllösungen oder Suspensionen können auch einen langkettigen Alkohol oder einen ähnlichen Alkohol enthalten als Verdünnungs- oder Dispergiermittel.
Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbes¬ serte Zusätze, zum Beispiel Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, zum Beispiel Saccharin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Peptide sollen in den aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Kon¬ zentration von etwa 0,01 bis 99,9, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 99 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.
Die aufgeführten pharmazeutischen' Zubereitungen können außer dem Peptid oder Strukturhomologen - z.B. Peptiden mit D-Aminosäuren - .oder Funktiohsanalogen - z.B. Peptidmimetika - weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten. Die Herstellung der oben aufgeführten pharma¬ zeutischen. Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.
Die genannten Zubereitungen können' bei Mensch und Tier ent¬ weder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan) , intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal (Puder, Salbe, Tropfen) und zur Therapie der genannten Krankheiten angewendet werden. Als geeignete Zubereitung kommen Injektionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen in Frage. Zur lokalen Therapie können ophtalmologische und dermatologische Formulierungen, Silber- und andere Salze, Ohrentropfen, Augensalben, Puder oder Lösungen verwendet werden. Bei Tieren' kann die• Aufnähme auch über das Futter oder Trinkwasser in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können die Arzneimittel oder die Kombinationsmittel in andere Trägermaterialien wie zum Beispiel Kunststoffe, (Kunststoffketten zur lokalen Therapie) , Kollagen oder Knochenzement eingearbeitet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Peptide in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5, bevorzugt von 0,5 bis 95, besonders bevorzugt von 20 bis 80 Gew.-% in einer pharmazeutischen Zubereitung eingebracht. Das heißt, die Peptide sind in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen, zum Beispiel Tabletten, Pillen, Granulaten und anderen, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-% der Gesamtmischung in einem bestimmten Verhältnis vorhanden. Die Wirkstoffmenge, das heißt die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die mit den Trägermaterialien kombiniert wird, um eine einzige Dosierungsform zu erzeugen, wird von dem Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten und der besonderen Verabreichungsart variieren können. Nach Besserung des Zustandes des Patienten kann der Anteil der wirksamen Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis vorliegt, die die Krankheit zum Stillstand bringt. Anschließend kann die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf eine Höhe verringert werden, bei der der verbesserte Zustand beibehalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch eine Behandlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach beliebigem Wiederauftreten von ErkrankungsSymptomen benötigen. Demgemäß ist der Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre Zusammen¬ setzung oder Kombination variabel und kann vom Fachmann aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst wer¬ den.
Dem Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Peptide mit einem Organismus, bevorzugt ■ einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen in Kontakt gebracht werden können. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen Mittel in verschiedenen Dosierungen appliziert werden können. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Erkrankung möglichst effektiv bekämpft wird bzw. der Ausbruch einer solchen Krankheit in einer prophylaktischen Gabe verhindert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation können vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die orale Applikation in Form von Pulver, Tabletten, Saft, Tropfen, Kapseln oder ähnlichem, die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form von Injektionen, Infusionen und Lösungen sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen der er¬ findungsgemäßen Verbindungen prophylaktisch oder therapeu¬ tisch.
Die Eignung der gewählten Applikationsformen wie auch der Dosis, des Applikationsschemas, der Adjuvantswahl und der¬ gleichen kann beispielsweise durch Entnahme von Serum-Alliquoten aus dem Patienten, d.h. dem Mensch oder dem Tier, und dem Testen auf ■ das Vorhandensein von Krankheitsindikatoren im Verlauf des Behandlungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ und begleitend hierzu kann der Zustand der Niere, aber auch die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems, auf herkömmliche Weise begleitend bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die immunologische Konstitution des Patienten und insbesondere die Konstitution von stoffwechselwichtigen Organen, zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet werden. Wenn eine unzureichende therapeutische Effektivität erzielt wird, . kann der Patient mit erfindungsgemäßen Mitteln ggf. mit anderen bekannten Medikamenten modifiziert weiterbehandelt werden, von denen eine Verbesserung der Gesamtkonstitution erwartet werden kann. Selbstverständlich ist es auch' möglich, die Träger oder Vehikeln des pharmazeutischen Mittels zu modifizieren oder den Verabreichungsweg zu variieren.
Neben der oralen Aufnahme kann es dann zum Beispiel vor¬ gesehen sein, dass Injektionen beispielsweise intramuskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße ein weiterer bevor¬ zugter Weg für die therapeutische Verabreichung der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen sind. Zeitgleich kann auch die Zufuhr über Katheter oder chirurgische Schläuche angewendet werden; beispielsweise über Katheter, die direkt zu bestimmten Organen wie den Nieren führen.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer bevorzugten Ausführungsform in einer Gesamtmenge von bevorzugt 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische Menge, die verwendet wird, um die Symptome einer Störung oder respon-siven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern oder zu verbessern.
Selbstverständlich wird die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wir¬ kungen und der Nebenwirkungen abhängen. Die tägliche Dosis von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Typischerweise werden insbesondere pharmazeu¬ tischen Mittel zur etwa 1- bis 10-maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ oder zusätzlich als kontinuierliche In¬ fusion verwendet. Solche Verabreichungen können als chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart selbstverständlich variieren. Bevorzugt ist es, die Targetsdosis auf 2 bis 5 Appli¬ kationen zu verteilen, wobei bei jeder Applikation 1 bis 2 Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Selbstverständlich ist es möglich, den Wirkstoffgehalt auch höher zu wählen, bei¬ spielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000 mg/kg. Die Tabletten können auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen pro Tag auf 1 bis 3 vermindert. Der Wirkstoffgehalt der retardierten Tabletten kann 3 bis 3000 mg betragen. Wenn der Wirkstoff - wie ausgeführt - durch eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1- bis 10-mal pro< Tag bzw. durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in . Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 1 bis 4000 mg pro Tag bevorzugt sind. Die bevorzugten Gesamtmengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen. Es kann erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen in Kontakt zu bringen, während in anderen Fällen die angegebene Wirkstoffmenge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das pharmazeutische Mittel in einer Einzel- gäbe von 1 bis 100, insbesondere von 2 bis 50 mg/kg Kör¬ pergewicht eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag kann auch die Menge der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können in den ge¬ nannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zusammen mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser auch in der Veterinärmedizin gegeben werden. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird, und die gewöhn- lieh einer ganzen, einer halben Tagesdosis oder einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht. Die Dosierungseinheiten können demgemäß bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 oder mehrere Einzeldosen oder 0,5, 0,3 oder 0,25 einer Einzeldosis enthalten. Bevorzugt wird die Tagesdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen auf 2 bis 10 Applikationen verteilt, bevorzugt auf 2 bis 7, besonders bevorzugt auf 3 bis 5 Applikationen. Selbstverständlich ist auch eine Dauerinfusion der erfindungsgemäßen Mittel möglich.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfin¬ dung werden bei jeder oralen Applikation der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen 1 bis 2 Tabletten gegeben. Die erfindungsgemäßen Tabletten können mit dem Fachmann be¬ kannten Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt ■ werden, dass sie den oder die Wirkstoffe nur bei bevorzugten, in einem bestimmten Teil des Wirts freigeben.
Bevorzugt ist es in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, dass die Peptidabschnitte gegebenenfalls mitein¬ ander assoziiert oder mit einem Träger verbunden in Lipo¬ somen eingeschlossen sind, wobei der Einschluss in Lipo¬ somen im Sinne der Erfindung nicht zwingend bedeuten muss, dass die Peptide im Inneren der Liposomen vorliegen, ein Einschluss im Sinne der Erfindung kann auch bedeuten, dass die Peptide mit der Membran der Liposomen assoziiert sind, beispielsweise so, dass diese auf der äußeren Membran ver¬ ankert sind. Eine solche Darstellung der erfindungsgemäßen Peptide in oder auf den Liposomen ist vorteilhaft, wenn der Fachmann die Liposomen so auswählt, dass sie eine immun¬ stimulierende Wirkung haben. Dem Fachmann sind aus der DE 198 51 282 verschiedene Möglichkeiten bekannt, die im¬ munstimulierende Wirkung von Liposomen zu modifizieren. Bei den Lipiden kann es sich um einfache Lipide handeln, wie beispielsweise Ester und Amide oder um komplexe Lipide wie zum Beispiel um Glycolipide wie Cerebroside oder Ganglio- side, um Sphingolipide oder um Phospholipide.
Beispielsweise ist es möglich, einzelne oder Gruppen von Aminosäuren in den Peptiden auszutauschen, ohne dass die Aktivität der Peptide in Bezug auf die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe nachteilig beeinflusst wird. Für den Austausch . derartiger Aminosäuren sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Genetik verwiesen.
Im Stand der Technik sind verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung von Peptiden offenbart. Peptide, die von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend mit solchen Verfahren entwickelt werden, sind von der erfindungemäßen Lehre mit erfasst. Eine Möglichkeit des Generierens von funktions¬ analogen Peptiden ist beispielsweise in PNAS USA 1998, Oct . 13; 9521:12179-84, WO 99/6293 und/oder WO 02/38592 be¬ schrieben; diese Lehren sind in den Offenbarungsgehalt der Erfindung ' mit aufgenommen. Das heißt, sämtliche Peptide, Peptidfragmente oder Strukturen, die Peptide umfassen, die mit den genannten Verfahren - von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend - generiert werden, sind Peptide im Sin¬ ne der Erfindung, sofern sie die erfindungsgemäße Aufgabe lösen. Die erfidnungsgemäßen Peptide sind auch Leitstrukturen für die Entwicklung von Peptidmimetika.
Dem Fachmann ist weiterhin bekannt, dass einzelne Amino¬ säuren analoge physikochemische Eigenschaften aufweisen, die mit Vorteil dazu führen, dass diese Aminosäuren unter¬ einander ausgetauscht werden können. Hierzu gehören bei¬ spielsweise die Gruppe der Aminosäuren (a) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin; bzw. die Aminosäuren (b) Serin und Threonin, die Aminosäuren (c) Asparagin und Glutamin, die Aminosäuren (d) Asparaginsäure und Glutamin¬ säure; die Aminosäuren (e) Lysin und, Arginin sowie die Gruppe der aromatischen Aminosäuren (f) Phenylalanin, Tyrosin und/oder Tryptophan. Aminosäuren innerhalb ein und derselben Gruppe (a-f) können ' untereinander ausgetauscht werden. Weiterhin ist es möglich, dass Aminosäuren durch modifizierte Aminosäuren oder spezifische Enantiomere aus¬ getauscht werden. Weitere Modifikationen sind gemäß der Lehre nach der WO 99/62933 oder WO 02/38592 möglich, die in den Offenbarungsgehalt ' der erfindungsgemäßen Lehre mit aufgenommen sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid einen Linker und/oder einen Spacer, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: ά-Aminocarbonsäuren sowie deren Homo- und Heterooligomere, α,ω-Aminocarbonsäuren sowie deren verzweigte Homo- oder Heterooligomere, sonstige Aminosäuren sowie die linearen und verzweigten Homo- oder Heterooligomere (Peptide) ; Amino-oligoalkoxy-alkylamine; Maleinimidocarbonsäure-Derivate; Oligomere von Alkylaminen; 4-Alkylphenyl-Derivate; 4-Oligoalkoxyphenyl- oder 4-Oligo- alkoxyphenoxy-Derivate; 4-Oligoalkylmercaptophenyl- oder 4-Oligoalkylmercaptophenoxy-Derivate; 4-0ligoalkylamin- phenyl- oder 4-Oligoalkylaminyphenoxy-Derivate; (Oligo- alkylbenzyl) -phenyl- oder 4-01igoalkylbenzyl) -phenoxy- Derivate sowie 4-Oligoalkoxybenzyl) -phenyl- oder 4-Oligo- alkoxybenzyl) -phenoxy-Derivate; Trityl-Derivate; Benzyl- oxyaryl- oder Benzylöxyalkyl-Derivate; Xanthen-3-yl-oxyal- kyl-Derivate; (4-Alkylphenyl)- oder ω- (4-Alkylphenoxy) - alkansäure-Derivate; Oligoalkyl-Phenoxyalkyl- oder Oligo- alkoxy-phenoxyalkyl-Derivate; Carbamat-Derivate; Amine; Trialkylsilyl- oder Dialkyl-alkoxysilyl-Derivate; Alkyl- oder Aryl-Derivate und/oder Kombinationen davon; weitere mögliche Strukturen werden in der EP 1 214 350 beschrieben, die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen sind.
Bevorzugt können synthetische Peptide oder Fragmente hiervon durch chemische Crosslinker multimerisiert werden oder an ein Trägermolekül wie BSA, Dextran, KLH oder andere gekoppelt werden. Die hierzu verwendeten chemischen Cross¬ linker sind in "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996 aufgelistet, die in den Offenbarungsgehalt der erfindungsgemäßen Lehre mit aufge¬ nommen sind. Bevorzugte Crosslinker sind homobifunktionale Crosslinker, bevorzugt: NHS-Ester, wie DSP, DTSSP, DSS, BS, DST, Sulfo-DST, BSOCOES, SuIfo-BSOCOES, EGS, Sulfo-EGS, DSG oder DSC, homobifunktionale Imidoester, wie DMA, DMP, DMS oder DTBP, homobifunktionale SuIfhydryl-reaktive Cross¬ linker, wie DPDPB, BMH oder BMOE, Difuorobenzenderivate, wie DFDNB oder DFDNPS, homobifunktionale photoreaktive Crosslinker, wie BASED, homobifunktionale Aldehyde, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, Bis-Epoxide, wie 1,4-Butan- dioldiglycidylether, homobifunktionale Hydrazide, wie Adipinsäuredihydrazide oder Carbohydrazide, Bis-diazonium- derivate, wie o-Tolidin, bisdiazotisiertes Benzidin oder Bisallkylhaloid.
Bevorzugt sind auch heterobifunktionale Crosslinker, ins¬ besondere aminreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie SPDP, LC-SPDP, SuIfo-LC-SPDP, SMPT, Sulfo-LC-SMPT, SMCC, Sulfo- SMCC, MBS, Sulfo-MBS, SIAB, Sulfo-SIAB, SMPB, Sulfo-SMBP, GMBS, Sulfo-GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX oder NPIA, carbonylreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie MPBH, M2C2H oder PDPH, aminreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie NHS-ASA, Sulfo-NHS-ASA, Sulfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSAB, Sulfo-HSAB, SANPAH, SuIfO-SANPAH, ANB-NOS, SAND, SADP, Sulfo-SADP, Sulfo-SAPB, SAED, Sulfo-SAMCA, p-Nitrophenyldiazopyruvat oder PNP-DTP, Sulfhydryl und photoreaktive Crosslinker, wie ASIB, APDP, Benzophenon-4- iodoacetamid oder Benzophenon-4-maleimid, carbonylreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ABH, carboxylatreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ASBA, argininreaktive Crosslinker, .wie APG, trifunktionale Crosslinker, wie 4- Azido-2-nitrophenylbiozytin-4-nitrophenylester, SuIfo-SEBD, TSAT und/oder TMEA. • •
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide und rekombinant hergestellte Strukturen, durch Peptidbrücken mit einer Länge- von 0 bis 50 Aminosäuren verbunden. Dies beinhaltet auch rekombinante Proteine, die aus zwei N-terminalen und einer C-terminalen Sequenz bestehen oder Hexamere bestehend aus drei N-terminalen Sequenzen und drei C-terminalen Sequenzen, oder Multimere der zuvor aufgeführten rekombinanten Strukturen, wobei zwischen den N- und den C- terminalen Sequenzen je eine Peptidbrücke von 0 bis 50 Aminosäuren vorhanden sein kann. Die Peptide können zum Zwecke der ■ Aufreinigung, Solubilisierung bzw. der Konformationsveränderung mit spezifischen Fusionsanteilen entweder am N- oder am ' C-Terminus' versehen sein, wie zum Beispiel CBP (Calmodulin-Bindungsprotein) , His-Tag und/oder andere. Ähnliche Konstrukte können auch von DNA, die zum therapieren verwendet wird, kodiert werden.
Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, einen erfindungsgemäßen' Vektor,' eine erfindungsgemäße Wirtszelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, ein erfindungsgemäßes Erkennungsmolekül und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gegebenenfalls zusammen mit einer Information - zum Beispiel einem Beipackzettel oder eine Internetadresse, die auf Homepages mit weiteren Informationen verweist, etc. - über die Handhabung bzw. über die Kombination der Inhalte des Kits umfasst. Die Information zur Handhabung der Inhalte des Kits kann beispielsweise ein Therapieschema für Ödeme, Herzinsuffizienz, ■ Leberzirrhose, Hyperinsulinismus, Hypertonie, Ulcus duodeni umfassen. Die Information kann jedoch auch Angaben darüber umfassen, wie die erfindungsgemäßen Stoffe und Erzeugnisse innerhalb einer Diagnose von Krankheiten, die mit der AKAP-PKA-Interaktion oder deren- Entkoppelung assoziiert sind, einzusetzen sind. Der erfindungsgemäße Kit kann auch in der Grundlagenforschung verwendet werden. Innerhalb der Grundlagenforschung ist der Kit bevorzugt einsetzbar, um zu detektieren, ob ein Stoffwechselphänomen mit der Wechselwirkung bzw. mit der nicht vorhandenen Wechselwirkung von AKAP und PKA assoziiert ist . Insbesondere ist es möglich, mit Hilfe des erfindunggemäßen Kits zu bestimmen, welche Untereinheiten von AKAP und/oder PKA für die Interaktion dieser beiden Moleküle oder für das NichtZustandekommen der Interaktion zwischen diesen verantwortlich sind.
Die erfindungsgemäßen ■ Erzeugnisse, wie beispielsweise Peptide, Vektoren, Nukleinsäuremoleküle, können andere vorteilhafte Nukleinsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate bzw. Lipide umfassen. Es kann beispielsweise bevorzugt sein, dass die Peptide mit einem Fettrest, wie zum Beispiel einem Stearat, so modifiziert werden, dass diese gut membranpermeabel sind. Mit derartigen Peptiden können an Zellkulturen Versuche durchgeführt' werden. Solche Peptide können als Werkzeuge eingesetzt werden, um die PKA besonders effizient von AKAP-Proteinen in Zellen, Zellkulturen, Gewebekulturen, Organkulturen oder Organismen zu entkoppeln. Die Peptide im Sinne der Erfindung werden in Zellkulturen insbesondere zur Beantwortung der Frage herangezogen werden können, ob ein bestimmter Prozess von der Verankerung der PKA an AKAP-Proteine abhängt. Aufgrund der vorteilhaften hohen Affinität für die humanen RIIa- Untereinheiten der PKA eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide insbesondere ' für Untersuchungen an humanen Systemen. Durch den Vergleich mit Peptiden, die die PKA mit anderer Affinität binden, werden weiterhin quantitative Aussagen möglich sein, die definieren, bis zu welchem Grad eine PKA-AKAP-Interaktion notwendig ist, um den Ablauf eines physiologischen Prozesses zu gewährleisten. Insbesondere die erfindungsgemäßen Kits können verwendet werden, um diesen Ablauf des physiologischen Prozesses zu studieren. Von Vorteil ist es hierbei, dass die erfindungsgemäßen Peptide, die die RII-Untereinheiten der PKA stärker binden als die typischen PKA-Bindungsdomänen von AKAPlδδ. Da die . erfindungsgemäßen Peptide vorteilhafterweise RIIa- bzw. RII/3-spezifisch sind, können zum Beispiel mit dem Kit , besonders detaillierte Erkenntnisse über die Interaktion gewonnen werden. Die Entkoppelung der einen oder der anderen regulatorischen Untereinheiten der PKA von AKAP-Proteinen kann insbesondere Aufschluss darüber geben, welche PKA, Typllα oder TypII/3, an dem jeweiligen zu untersuchenden Prozess beteiligt ist. Insbesondere- das Peptid AlδδRIIßRnl bindet selektiv RUß Untereinheiten der PKA.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Modifikation, insbesondere eine Inhibition, bevorzugt eine Entkoppelung, einer AKAP-PKA-Interaktion bzw. der Interaktion von AKAP bzw. PKA-Untereinheiten umfassend die Schritte:
a) Bereitstellung eines ■ erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, eines erfindungsgemäßen Vektors, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle und/oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids und b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.
Bevorzugt ist es, dass die Interaktion an einer regulatorischen R-Untereinheit analysiert bzw. modifiziert wird, besonders bevorzugt an einer Rllα- und/oder RII/3- Untereinheit.
Die Erfindung betrifft auch ' die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinmbleküls, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, eines erfindungsgemäßen Organismus, eines erfindungsgemäßen Polypeptids, eines erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküls, einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder eines erfindungsgemäßen Kits zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Bruchstücken oder Teilbereichen . der erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren. Weiterhin kann' es vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren um weitere Aminosäuren oder Nukleotide zu erweitern. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Peptide mit Lipid- oder Kohlenhydrat-Strukturen zu modifizieren.
In . einer bevorzugten 'Ausführungsform der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Zelle.- beispielsweise als Zellkultur - oder der Organismus als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP- PKA-Interaktion verwendet, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus. ■ Weitere bevorzugte Modelle sind Zellkulturen, oder Gewebe, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder Peptide umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch die AKAP-PKA-Modifikation die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQP2 modifiziert, insbesondere verhindert.
In einer weiteren besonders' bevorzugten Ausführungsform werden das Polypeptid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung als Wasserverlust-verursachende Mittel verwendet, insbesondere als Aquaretika.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Interaktion der Rllce- oder RIIß-Untereinheit des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert.
In einer weiteren bevorzugten. Verwendung sind die Untereinheiten humanem oder' murinem Ursprungs.
Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf dieses beschränkt zu sein.
Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen
Material und Methoden
Herstellung von Peptidbibliotheken, die von der Sequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP185 abgeleitet sind, auf Membranen
Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden bei Fluka (Steinheim) oder Sigma Aldrich (München) gekauft und ohne weitere Reinigungsschritte benutzt. Fmoc-geschützte Aminosäurepentafluorophehylester wurden bei Novabiochem Merck Biosciences GmbH (Darmstadt) gekauft. Peptidbibliotheken wurden durch automatische SPOT-Synthese auf Whatman 50 Zellulosemembranen gemäß Standardprotokollen mittels Fmoc-Chemie und AutoSpot-Robot ASS 222 (Intavis Bioanalytical Instruments AG, Köln) synthetisiert. Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten wurden durch eine Mischung aus Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) abgespalten (Frank, 1992; Kramer und Schneider- Mergener, 1998) . Zur Kontrolle wurden Spots (ca. 50 nmol Peptid pro Spot) aus der Zellulosemembran herausgeschnitten, von .der Membran durch Behandlung mit 0,05m NaOH ■ abgespalten und mit HPLC und MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert .
Detektion membranassoziierter Peptide im RII-overlay-Experiment mit regulatorischen RIIa- und RII/3- Untereinheiten der PKA als Sonde
Material
1. Regulatorische RIIα>- (human) und RII/3- (Ratte) Untereinheiten der PKA erhalten von Prof. Dr. Friedrich W. Herberg, Universität Kassel
2. Katalytische Untereinheiten, der PKA, Promega, Mannheim, Bestellnr. : V5161
3. Dy32P]ATP 5000 Ci/mmol Amersham Biosciences, Braunschweig, Bestellnr. : AA0018
4. Sephadex G 50, medium Pharmacia, Bestellnr. : 17-0043-01
5. Phosphat-gepufferte Saline (PBS) NaCl 8 g KCl 0, 2 g Na2HPO4 ■ 1,44 g KH2PO4 0, 24 g in 800 ml H2O lösen, auf pH 7,4 einstellen und mit H2O auf 1 1 auffüllen.
6. Tris-gepufferter Saline mit Tween 20 Tris-HCl 10 mM NaCl 150 mM Tween 20 0, 05% pH 7,5
Radioakive Markierung der regulatorischen Untereinheit von PKA .N C
1. Reaktionsansatz
Endkonzentration Stammlsg. im Ansatz
RIIa oder RII/3 15 μg 7 μg/μl 5, 6 μl Katalytische 2 μg 0, 9 μg/μl 2 μl Untereinheit der PKA. Kaliumphosphatpuffer, 25 mM 1 M 12,5 μl pH 7,0 cAMP 10 μM 1 mM 5 μl MgCl2 10 mM 0, 5 M 10 μl DTT 0,5 mM 50 mM 5 μl [γ32P]ATP/ATP 0,1 μM radioaktiv: 3,3 x 10ö cpm/ml = 75 μCi 5 μCi/μl 15 μl nicht radioaktiv: 10 μM 5 μl H2O 434,9 μl 10 min Inkubation bei 0 0C (auf Eis) . 2. Einstellung der■ATP-Konzentration
Die ATP-Konzentration ' wurde durch Zugabe von nicht radioaktivem ATP auf 10 μM eingestellt (Zugabe von 5 μl einer 1 mM Lösung) . Der Ansatz wurde weitere 50 min auf Eis inkubiert .
3. Stoppen der Reaktion und Überprüfung der Reaktion
Die Reaktion wurde ■ durch Zugabe von Dextranblau und Abtrennung freier Nukleotide gestoppt. Das freie ATP wurde über eine Sephadex G50-Säule abgetrennt .
Abtrennung der markierten RII-Untereinheit der PKA , von freien Nukleotiden über Sephadex G50-Säulen
Nicht eingebaute Nukleotide wurden von den RII-Untereinheiten durch die Fraktionierung über Sephadex G 50-Säulen getrennt.
1. Quellen des Sephadex G 50-Materials: 20 g wurden in 400 ml PBS über Nacht bei Raumtemperatur gequollen. Nicht abgesetztes Material wurde anschließend mit einer Pasteurpipette entfernt. Das gequollene Material wurde in 50 ml Falcon Röhrchen aliquottiert und bei 4 0C gelagert. Zur- Konservierung wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt.
2. Das Material wurde in eine mit- einer Glaskugel verschlossene ■ 10 ml sterile Einmalpipette gegossen. Zum Setzen des Säulenbettes liefen etwa 50 ml PBS, das 1 mg/ml BSA (bovines Serumalbumin) enthielt, durch. Bis zur Benutzung' der Säule wurde sie oben mit Parafilm verschlossen.
3. Die markierten RII-Untereinheiten (500 μl) wurden mit Dextranblau (70 μl einer 20 mg/ml Lösung) auf die Säule aufgetragen (Gesamtvolumen = 570 μl) .
4. Nachdem die Probe in die Matrix eingewandert war, wurde mit PBS aufgefüllt .
5. Kurz bevor das Dextranblau eluierte, wurde begonnen Fraktionen zu sammeln (2 Fraktionen je 1,5 ml, die weiteren Fraktionen je 1 ml) .
6. Zur Bestimmung der Inkorporation von 32P wurde 1 % (5,7 μl) der Probe vor der Säule (das entspricht 1 % der eingesetzten Radioaktivität) und 3 μl jeder Fraktion eingesetzt.'
7.. Die Fraktionen des ersten Peaks, welcher die Sonde enthielt, wurden vereinigt. Die Einbaurate wurde in % errechnet und die spezifische Aktivität (cpm/μg Protein) bestimmt.
RII-overlay
1. Proteine (40 μg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt und durch das semi dry-Elektroblotverfahren auf eine PVDF-Membran (PVDF, Polyvinylidenfluorid) übertragen. Die membranassoziierten Proteine wurde mit Ponceau S gefärbt, um die Markerproteine auf der Membran zu identifizieren. Entfärbt wurde mit TBS. 2. Die Membran wurde in Blotto/BSA für 16 h bei 4 0C inkubiert : 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.4 0,15 M NaCl 8,766 g/l 5 % (w/v) Magermilchpulver 50 g/l 0,1 % (w/v) BSA 1 g/l (0,01 % antifoam (Sigma) ) 0,02 % NaN3 0,2 g/l
3. Das Blotto/BSA wurde durch frisches ersetzt und 32P markierte RII-Untereinheiten dazugegeben (105 cpm/ml) . Es wurde für 4-6 h bei Raumtemperatur inkubiert.
4. Die Membran wurde 4 x 15 min in Blotto/BSA und 2 x 10 min in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl gewaschen.
5. . RII-bindende Proteine wurden durch Exposition auf eine Phosphoimagerplatte detektiert.
Ergebnisse
Es wurde eine Peptidbibliothek, abgeleitet von der wildtypischen Aminosäuresequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP18δ (PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY; Henn et al . , 2004) auf einer Membran synthestisiert. Dazu wurde jede Aminosäure der wildtypischen Sequenz mit den 20 möglichen Aminosäuren substituiert. Figur 1 zeigt die Detektion der Peptide mittels der RII-overlay-Methode. Als Sonde wurden in diesem Fall radioaktive PKA Rllce- und RII/3-Untereinheiten gleichzeitig eingesetzt. In allen späteren Experimenten wurden entweder RIIa- oder RII/3-Untereinheiten als Sonde eingesetzt. Das Ergebnis zeigt deutliche Unterschiede in der Bindungsfähigkeit der einzelnen Peptide an die R-Untereinheiten (unterschiedliche Signalintensitäten) .
Figur 2 zeigt eine Wiederholung des Experiments mit ausgewählten Peptiden (AKAP18δ-L304T, AKAP18δ-L308D, AKAP18δ-L314E) deren Bindungsfähigkeit an RIICH- bzw. RII/3-Untereinheiten aber separat in unterschiedlichen RII-overlay-Experimenten getestet wurde. Als Kontrollen wurden die Peptide Ht31, Ht31-P, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-wt (wildtypische Sequenz) auf den gleichen Membranen synthetisiert und dem RII-overlay-Experiment unterzogen. Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. Die Quantifizierung spricht für eine stärkere Bindung von AKAP18δ-L304T und AKAP18δ-L314E sowohl an RIICÜ- als auch an RII/3-Untereinheiten, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-L308D dagegen schwächer. Das bekannte Peptid Ht31 bindet beide regulatorische. Untereinheiten etwa 5fach schwächer als das AKAP18δ-wt und etwa 5-6fach. schwächer als AKAP18δ-L304T und AKAP18δ-L314E. Die Bindung von Ht31 an die hier verwendeten regulatorischen RIIa- und RII/3-Unter- einheiten ist nur unwesentlich stärker als die Bindung der Untereinheiten' an Ht31-P, das. die AKAP-PKA-Interaktion nicht hemmt (Klussmann et al . , 1999; Alto et al . , 2003) . Damit sind die Peptide AKAP18δ-wt, AKAP18δ-L304T und und AKAP18δ-L314E wesentlich effizientere Inhibitoren einer AKAP-PKA-Interaktion als- Ht.31.
Alto et al . (2003) entwickelten ein Peptid, AKAP13, das die Interaktion zwischen der murinen Rllα-Untereinheit der PKA mit Ξfach höherer Affinität bindet (KD = 0,45 nM) als das Peptid Ht31 (KD = 2,2 nM) . In unseren RII-overlay-Experimenten binden die Peptide AKAPis und Ht31 sowohl die humane RIIa- als auch die RII/3-Untereinheit der PKA. aus der Ratte kaum, die von uns identifizierten Peptide AKAP18δ-wt und AKAP18δ-L304T und und AKAP185-L314E dagegen stark. Dieses Ergebnis spricht für Speziesunterschiede zwischen den murinen und humanen Rllα-Untereinheiten, die zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für die gleichen Peptide führen.
Identifizierung von Peptiden, die spezifisch RII/3-Unter- einheiten der PKA binden
Um Peptide zu finden, die entweder RIIa- oder RII/3-Untereinheiten der PKA binden und damit spezifisch die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der Typ IIa bzw. der Typ Iljß PKA hemmen, wurden anhand von dreidimensionalen Strukturmodellen der PKA-Untereinheiten aus der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAPlδδ Peptide abgeleitet, die die AKAP-Bindungstasche blockieren könnten. Die Peptide (1-19) wurden parallel auf zwei Membranen synthetisiert und anschließend in RII-overlay-Experimenten auf ihre Bindungsfähigkeit an RIIa- oder RI1/3- Untereinheiten der PKA getestet (Figur 3A) . Die quantitative Auswertung zeigte u. a. einen deutlichen Unterschied der Bindung der beiden PKA-Untereinheiten an das Peptid 7, dessen Sequenz neben derer der anderen Peptide in der Figur 3B aufgelistet ist.
Ausgehend von der Sequenz des Peptids 7 wurden zwei Peptidbibliotheken auf Membranen synthetisiert und RII- overlay-Experimenten mit RIIα- bzw. RII/3-Untereinheiten als Sonden unterzogen. Figur 4 zeigt, dass einige Peptide RIIa- binden, aber nicht RIIß-Untereinheiten (zum Beispiel die Peptide 10/11 und 10/12) und umgekehrt (zum Beispiel Peptid 21/4) . Darüber hinaus weisen einige Peptide eine stärkere Bindung an Rllce-Untereinheiten als an RII/3-Untereinheiten auf. Bei anderen ist es umgekehrt. Sie binden Rllα-Unter- einheiten schwächer als an . RII/3-Untereinheiten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass wir mit den genannten Peptiden AlδδRIIαHsl ■ und 2 und A18δRII/3Rnl die ersten Blocker gefunden haben, die selektiv die Interaktion von RIIa- bzw. RII/3-Untereinheiten der PKA. mit AKAP- Proteinen identifiziert haben.
Tab . 1 A
Nr . A ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . B ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . C ASDAQLVRLSKRLVENAVLKΆVQQY Nr . D ASDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . E ARDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . F ARDAQLVRLSKRLVENAVLKΆVQQY Nr . G ANDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . H ASDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . I ASDAKTVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . J ÄNDAKTERLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . K ANDAKTERLSQRLVENAVLKAVQQY Nr . L ANDAKTQRLSQRLVENAVLKAVQQY Nr . M PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . N PEDAELVRLSKRLVENAVLQAVQQY Nr . O PEDAELVRLSKRLVENAVLNGVQQY' Nr . P PEDAELVRLSKRLVENAVLNGQQQY Nr . ■ Q PEDAELVRLSKRLVENAVLNGNQQY Nr . R - PEDAELVRLSKRLVENAVKNGNQQY Nr . S PEDAELVRLSKRLVENAVKNGAQDY Nr . T PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (Akapl8δ-wt) Nr . U PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18Ö-L304T) Nr . V PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-L308D) Nr . W PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18Ö-L314E) Nr . X •PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-P) Nr . Y PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18δ-PP) Nr . Z PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPlδδ-phos) Nr . AA EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (Akapl8δ-RI) Nr . BB ANDARLVRLSKRLRENAVLKAVQQY (AlδδRIIαHsl (14/14)) Nr . CC ANDARLVRLSKRLYENAVLKAVQQY (A18δRIIαHs2 (14/19)) Nr . DD ANDARLVRLSKRLVENAVLKFVQQY (AlδδRIIßRnl (21/4)) Nr . EE ANDARLVRLNKRLVENAVLKAVQQY (A18δRIIcxRn2 (10/11)) Nr . FF ANDARLVRLPKRLVENAVLKAVQQY (A18δRIIαRn3 (10/12)) Nr . GG ANDARLVRLSKRDVENAVLKAVQQY (A18δRIIαRn4 (13/02)) Nr . HH YQEQLEEEVAKVIVSMSIAFAQQTE (AKAP450_JL) Nr . I I NLQKIVEEKVAAALVSQIQLEAVQE (AKAP450 2)
Tab. 1
SEQ ID Nr. 1 PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-wt) SEQ ID Nr. 2 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L304T) SEQ ID Nr. 3 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L308D) SEQ ID Nr. 4 PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18Ö-L314E) SEQ ID Nr. 5 PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAP18Ö-P) SEQ ID Nr. 6 PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18δ-PP) SEQ ID Nr. 7 PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPl8δ-phos) SEQ ID Nr. 8 EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (AKAP18δ-RI) SEQ ID Nr. 9 NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA SEQ ID Nr. 10 VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL SEQ ID Nr. 11 NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF SEQ ID Nr. 12 TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA SEQ ID Nr. 13 LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ SEQ ID Nr. 14 QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL SEQ ID Nr. 15 LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA SEQ ID Nr. 16 EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA SEQ ID Nr. 17 ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH SEQ ID Nr. 18 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 19 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 20 TDRGFPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 21 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP SEQ ID Nr. 22 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV SEQ ID Nr. 23 EKESLTEEEATEFLKQILNGVYYLH SEQ ID Nr. 24 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH SEQ ID Nr. 25 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP SEQ ID Nr. 26 LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF SEQ ID Nr. 27 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVOLYL SEQ ID Nr. 28 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS SEQ ID Nr. 29 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ SEQ ID Nr. 30 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE SEQ ID Nr. 31 QMKAKRTKEAVEVLKKALDAISHSD SEQ ID Nr. 32 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS SEQ ID. Nr. 33 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF SEQ ID Nr. 34 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY SEQ ID Nr. 35 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE SEQ ID Nr. 36 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL SEQ ID Nr. 37 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA SEQ ID Nr. 38 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA SEQ ID Nr. 39 DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT. Tab. 2
Rllα-Bindung Rllß-Bindung Peptid KD [nM] KD [nM]
AKAP18δwt 0,4 - 1 ,5 1 - 6
AKAP185L304T 0,3 - 0,9 35
AKAP186L314E 0,2 - 1 ,3 22
AKAP185L308D keine Bindung keine Bindung
AKAP186-P keine Bindung keine Bindung
AKAP186-PP keine Bindung keine Bindung
Ht31 15 35
Ht31-P keine Bindung keine Bindung
AKAPis keine Bindung keine Bindung
AKAPis-P keine Bindung keine Bindung
Tabelle 2. Bindungskonstanten für die Interaktion von humanen RIIa- und Rllß-Untereinheiten aus der Ratte mit den angegebenen Peptiden, die aus der wildtypischen RII- Bindungsdomäne von AKAPlδδ (AKAP18δwt) abgeleitet wurden. Die Werte wurden durch surface plasmon resoπaπce-Messungen erhalten. L, Leuzin, T,. Threonin, D, Aspartat, P, Prolin, IS, in silico. 304, 308 und 314 bezeichnen die Position der entsprechenden Aminosäuren in AKAP188. Weitere Peptide, die AKAP-PKA-Interaktionen hemmen
Neben den in den Abbildungen 1-4 beschriebenen Peptiden konnten weitere identifizieren werden, die als Hemmer von AKAP-PKA-Interaktionen wirken. Zum Nachweis dieser Eigenschaft wurden die unten aufgeführten Peptide auf einer Zellulosemembran synthetisiert (SPOT-Syntheseverfahren) und einem RII-overlay unterzogen (Abb. 5) ., Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, , die regulatorische PKA- Untereinheiten gebunden haben. Die Peptide wurden in sechs Blöcken synthetisiert. Die Peptide der Reihe A Positionen 1-17 sind Positivkontrollen und in allen Blöcken identisch. Die Namen der unten aufgeführten Peptide sind aus ihren Koordinaten in den Blöcken 1-6 abgeleitet, beispielsweise ist das Peptid 1.B13. (Sequenz: YIALNEDLRSWTAADTAAQISQRKL) im Block 1 in der Reihe B an der Position 13 zu finden.
Die Abb. 5. zeigt die Identifizierung von Peptiden, die AKAP-PKA-Interaktionen hemmen. Kandidatenpeptide wurden auf einer Membran synthetisiert und mit radioaktiv markierten regulatorischen RIID-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Peptidsequenzen sind in der beigefügten Liste (Tab. 3) aufgeführt:
Tab. 3. Sequenz der Peptide
No Sequence Name/ID-Nr. YIALWEDLRSWTAADTAAQISQRKL 1C17 HUMAN 2ISKEHWNPTIVALVYNVLKTLMEMN 2A5A HUMAN 3DAPEFHSRYITTVIQRIFYTVNRSW 2ACA HUMAN 4GSTFQNTYNLKDIAGEAISFASGKI 2ACA HUMAN LSRYNDQASSSRIIERIFSGAVTRG 2ACA HUMAN EASEFHSRYITTVIQRIFYAVNRSW 2ACC HUMAN QSEYSWRKMLSGIAAFLLGLIFLLV 2DOB HUMAN LLLLFWLGWLGMLAGAWI IVRAPR 4F2 HUMAN LYFHLAPKAEVGVIAKALVRLLRSH A3B2 HUMAN VKQNVKMSESQAALPSALKTLQQKL A4E1 HUMAN DPGALGRLGAWALLFFLVTTLLASA AAAT HUMAN 3QEVEGMNILGLWFAIVFGVALRK AAAT HUMAN EPTTGMDPKARRFLWMLILDLIKTG ABC2 HUMAN RLRGI SWKDEARWKWALEKLELTK ABC2 HUMAN LIQSLESNPLTKIAWRAAKPLLMGK ABCR HUMAN AYTTQSLASVAYLINTLANNVLQML ABI2 HUMAN TLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPΞI ABM2 HUMAN RYGAAΞPHTIAAFLGGAAAQEVIKI ABP1 HUMAN NKDDDESPGLYGFLHVIVHSAKGFK ABR HUMAN PTTHAMSPRLRHVLLELLPRLLGSP ACHE HUMAN PGSAQEKSIERRFLNGLFSKLQPRD AD13 HUMAN HFDPTTAFRAPDVARALLRQIQVSR AGRN HUMAN HYKETWKALEALVAKGLVQALGLSN AKA1 HUMAN QKLYLDRNLIAAVAPGAFLGLKALR ALS HUMAN KEIKSYLKRIFQLVRFLFPELPEEG ALS2 HUMAN AISPWKTYQLVYFLDKILQKSPLPP AMPB HUMAN GGAAGDEAREAAAVRALVARLLGPG ANAG HUMAN GARSGHEQWEMLLDRAAPILSKTK ANK3 HUMAN SRTSSPVKSSLFLAPSALKLSTPSS ANK3 HUMAN TSYPWSWARVGPAVELALAQVKARP ANPA HUMAN TIDRETSGNLEQLLLAWKSIRSIP ANX5 HUMAN AVQNRFHGDAQVALLGLASVIKNTP ANX9 HUMAN PFRIYQTTTERPFIQKLFRPVAADG APG5 HUMAN RDRAS YEARERHVAΞRLLMHLEEMQ ARH 1 HUMAN EKLKSRPAHLGVFLRYIFSQADPSP ARHB HUMAN NNTEKTVKKIKAFVEQVANWLYSS ARRS HUMAN ΞINVERDEKLIKVLDKLLLYLRIVH ARS2 HUMAN ΞLLQSETDKWRAVAIALRNLSLDR ARVC HUMAN LVASSQSVREAKAASHVLQTVWSYK ARVC HUMAN EFKTLSEEEIEKVLKNIFNISLQRK ARY1 HUMAN EFKTLTΞEEVEΞVLKNIFKISLGRN ARY2 HUMAN VINLIGQTPISRLVALLVRGLGTEK ASB8 HUMAN JSAAMAAS SVSWLSSLFLKLYRKP AT7A HUMAN PRSVRDTILSRALILKILMSAAIII ATC4 HUMAN EWTGYTAFFVGILVQQIADLI IRKT ATHL HUMAN ADDQGQHPLLKMLLHLLAFSSAATG ATIP HUMAN ΪLGGAWAFVLRD VI YTL IHYINQRP ATM HUMAN STDEYYYYALAIWMSIVSIVSSLY ATY3 HUMAN APQRKTTNPLDLAVMRLAALΞQNVE BA2A HUMAN MGALARALLLPLLAQWLLRAAPELA BAE2 HUMAN TTLLRLPQKVPDAWEAVARASL I P BAE2 HUMAN DASYSLILEVQTAIDNVLIQSDVPI BBS7 HUMAN ΞKΞΞVPEGMEEAAVAS WLPARELQ BC13 HUMAN SHΞLRSKILSLQLLLSILQNAGPIF BIG1 HUMAN SHREAWTNLLLLFLTKVLKI SDNRF BIG1 HUMAN HQSNKGYSLASLLAKVAAGKEKS SN BIR6 HUMAN LIQTSSTΞQLRTIIRYLLDTLLSLL BIR6 HUMAN RGNLPTSGNISGFIRRLFLQLMLΞD BIR6 HUMAN VTFHLPHHVLKSIASAIVNELKKIN BIR6 HUMAN GAVYKGSLDERPVAVKVFSFANRQN BMR2 HUMAN LTKISLKNNLDHLLASLLFEΞYISY BP28 HUMAN LVQLVDTLGAEKFLWILLILLFEQY BP28 HUMAN RLTSLKKTLATTLAPRVLLPAIKKT BP28 HUMAN PISGQTYSVEDAVLKGWDPΞFRIR BPA1 HUMAN WAKQHQQRLASALAGLIAKQELLEA BPEA HUMAN HKAELKPLRADYLIARWTVLEKLI BPL1 HUMAN ASTLILTPTSKDVLSNLVMISRGKE BRC2 HUMAN ENREKVNDQAKLIVGIWGLLLAAL C166 HUMAN YRNGKVLHPLEGAWI IFKKEMDPV C166 HUMAN NITDLGAYKLΆEALPSLΆΆSLLRLS C2TA HUMAN DFRKKARQS IQGILEAAFSEΞLTRS C3AR HUMAN SIGLQNFEIAKDFWKVIDRLSRDE CA16 HUMAN VKPSSTRGGVLFAITDAFQKVIYLG CA1 E HUMAN RLGΞQNFHKARRFVEQVARRLTLAR CA26 HUMAN S IGYTNFTLEKNFVINWNRLGAIA CA26 HUMAN IYDERGARQLGLALGPALGLLGDPF CA35 HUMAN ΪS FAWHMNRS I VLLLKVLAQLRDHS CABI HUMAN YKTSTVSADLANLLKRIATIVPRTE CABI HUMAN HSGFIETEELKNFLKDLLΞKANKTV CABV HUMAN TNTQVEGDDEAAFLERLARREERRQ CALD HUMAN FQLQRPPQNLLRLLRKAVERS SLMG CANB HUMAN LYLRQNSMGLFSALRHALAKESLVG CANC HUMAN DKVTQKQFQLKEIVLELVAQVLEHK CAQ2 HUMAN EGFHLLGQPLSHLARRLLDTVWNKG CARF HUMAN ELYLRKRHHEPGVADRLIRLLQETS CARF HUMAN LIRSLYEMQEERLARKAARGLNVGH CARF HUMAN RLLDLATVKANGLAAFLLQHVQELP CARF HUMAN EGFSFNPLKIEVFVQTLLHLAAKSF CB80 HUMAN RITQDAQLKSSKWHKAVLQLNEEG CBG HUMAN VKKAPDAEELDKVARLAAKALASVS CBP4 HUMAN MEQVAHQTIVMQFILELAKSLKVDP CC37 HUMAN FKITRYWNSLSNLVASLLNSVRSIA CCAC HUMAN HIPTPGAALSWQAAIDAARQAKLMG CCAC HUMAN NWLTEVQDTANKALLALFTAEMLLK CCAC HUMAN 95 PNSSKQTVLSWQAAIDAARQAKAAQ CCAD HUMAN 96 RTLLWTFIKSFQALPYVALLIAMIF CCAF HUMAN 97 VRHKYKrFDNLGQALMSLFVLASKDG CCAG HUMAN 98 LRVISRAPGLKLWETLISSLKPIG CCAI HUMAN 99 NYMFTTVFVLEAVLKLVAFGLRRFF CCAI HUMAN 100 VGNLGLLFMLLFFIYAALGVELFGK CCAI HUMAN 101 VHHKYNFDNLGQALMSLFVLASKDG CCAI HUMAN 102 FKITKYWTSLSNLVASLLNSIRSIA CCAS HUMAN 103 HNQPLWLTRLQDIANRVLLSLFTTE CCAS HUMAN 104 VKS KEEAQHVQRVLAQLLRREAALT CD93 HUMAN 105 RVAQDLGLELAELVPRLFRVASKTH CDA1 HUMAN 106 VFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEV CDA1 HUMAN 107 RIAQDLGLELEELVPRLFRVASKRH CDA2 HUMAN 108 RRGRGAWTRLLSLLLLAAWEVGSGQ CDA2 HUMAN 109 RIAQDLGLELAELVPRLFRVASKRH CDAD HUMAN 1 10 RIAQDLGLELAELVPRLFRVASKGR CDA5 HUMAN 111 RIAQDLGLELAELVPRLFRMASKDR CDA6 HUMAN 1 12 PTSNQQVKPLGLVLRKLLDREETPE CDA9 HUMAN 1 13 RIAQDLGLELAELVQRLFRVAS KRH CDAA HUMAN 1 14 ALLATQAGSAGGAVNKLVPRSVGAG CDAB HUMAN 1 15 RIAQDLGLELAELVQRLFRVASKTH CDAB HUMAN 1 16 VIIGPRGPGSQRLLLSLLLLAAWΞV CDAC HUMAN 1 17 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDB2 HUMAN 1 18 HYSVAEETESGSFVANLLKDLGLEI CDB2 HUMAN 1 19 TDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDBE HUMAN 120 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDB9 HUMAN 121TDHGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDBC HUMAN 122 SDHGSPALSSEALVRVWLDANDNS ' CDBD HUMAN 123TDRGFPALSSΞALVRVLVLDANDNS CDBF HUMAN 124 PPQRHPQRSEQVLLLTLLGTLWGAA CDG6 HUMAN 125 TPRFLKEELEVKILENAAPSSRFPL CDG6 HUMAN 126 RGPAGQRRMLFLFLLSLLDQVLSEP CDGF HUMAN 127 SGGGSDEGLASAAARGLVEKVRQLL CDN5 HUMAN 128 TRMAAESRRVLLLAGRLAAQSLDTS CENB HUMAN 129 MGSΞDHLGVIPRAIHDIFQKIKKFP CENE HUMAN 130 KRGPLLTALSAEAVASALHKLHQDL CEP2 HUMAN 131 ΞYHYVQEKASKLAAASLLLALYMKK CGB3 HUMAN 132 YIDENQDRYIKKLAKWVAIQSVSAW CGL1 HUMAN 133 ANPVEIRRGVMLAVDAVIAELKKQS CH60 HUMAN 134 PVAVRLQMSERNILSRLANRAPEPT CHD4 HUMAN 135 ARΞRERLAHSRRAAARAVAAATAAV CIK4 HUMAN 136 LKTISVIPGLKTIVGALIQSVKKLS CIN9 HUMAN 137 LSRFEGMRWVNALLGAIPSIMNVL CIN4 HUMAN 138 LYILTPFNPLRKIAIKILVHSLFSM CIN1 HUMAN 139 LYILTPFNPIRKLAIKILVHSLFNM CIN2 HUMAN 140 LSRFΞGMRWVNAL VGAIPS IMNVL CIN5 HUMAN 141LYILTPLNPVRKIAIKILVHSLFSM CIN3 HUMAN 142 LKTITVIPGLKTTVGALIQSVKKLS C1N4 HUMAN 143LKTISVISGLKTIVGALIQSVKKLA C1N5 HUMAN 144LYVLSPFHPVRRAAVKILVHSLFNM CIN5 HUMAN 145LYILSPFNLIRRIAIKILIHSVFSM CIN8 HUMAN 146EEQLRLRERELTALKGALKEEVASR GING HUMAN 147 NYGKFEKGYL I FWRFLFGL VNQER CIS1 HUMAN 148RGALLAGALAAYAAYLVLGALLVAR CIW6 HUMAN 149AQKVTRQEREEALVRGVFMKWKPK CJ11 HUMAN 150MLRYDVYGGENEVIPEVLRKSHSHF CJ24 HUMAN 151ERQSAEVQGSLALVSRALEAAERAL CK13 HUMAN 152 RSGYIEANELKGFLSDLLKKANRPY CLB2 HUMAN 153VRRKLGEDWIFLVLLGLLMALVSWS CLC1 HUMAN 154AYIVNYFMYVLWALLFAFLAVSLVK CLC5 HUMAN 155LIHSVSDAFSGWLLMLLIGLLSGSL CLC5 HUMAN 156YFPLKTLWRSFFAALVAAFTLRSIN CLC5 HUMAN 157RKKGRESYIETΞLIFALAKTSRVSE CLH2 HUMAN 158FAGSWRSGLAFLAVIKAIDPSLVDM CLMN HUMAN 159GYFGSDVKVAYQLATRLLAHESTQR CLR2 HUMAN 160SPERFLSPLLGLFIQAVAATLATPP CLR2 HUMAN 161LQEQLYVRRAALAARSLLDVLPFDD CLR3 HUMAN 162WQERFLSPLLGRFLEGVAAVLATPA CLR3 HUMAN 163YFSQDVRVTARLLAHLLAFESHQQG CLR3 HUMAN 164LGSVIDISGLQRAVKΞALSAVLPRV CN2A HUMAN 165SFMΞHIAMPIYKLLQDLFPKAAELY CN2A HUMAN 166WVSFTSLGSLPSALRPLLSGLVGGA CN3B HUMAN 167HVIYQRVDKAVGLAEAALGLARANN CN93 HUMAN 168TDMKDMRLEAEAWNDVLFAVNNMF CNC9 HUMAN 169PKIVGRTKDVKEAVRKLAYQVLAEK CND3 HUMAN 170YGPTNFAPIINHVARFAAQAAHQGT CNE1 HUMAN 171 LAHLRARLKELAALEAAAKHEELVΞ CNG4 HUMAN 172ΞEGGTPEQGVHRALQRLAHLLQADR CNRC HUMAN 173 WKGGSASTWLTAFALRVLGQVNKYV C05 HUMAN 174DVLPNFFYHSNQWRMAALEVYVRR COA1 HUMAN 175RQVQAEVPGSPIFVMRLAKQSRHLE COA1 HUMAN 176 SSQFHMATNSSMFLKQAFEGEYPKL COG5 HUMAN 177VRRLERKYSSIPVIQGIVNΞVRQSM COG8 HUMAN 178TDPDLPPGYVQSLIRRWNNVNIVI C0H1 HUMAN 179GDVKSKTEALKKVIIMILNGEKLPG COPB HUMAN 180TFTLSTIKTLEΞAVGNIVKFLGMHP COPG HUMAN 181LLFGAWAGVLGTALSLLIRAELGQP C0X1 HUMAN 182RFIFNRWLENEAVRAAAVSALAKF CPG2 HUMAN 183RREEATRQGELPLVKΞVLLVALGSR CPSA HUMAN 184NATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKAL CSE1 HUMAN 185 S VNWKHKD AAIYL VTSLASKAQTQK CSE1 HUMAN 186 QRREGGGRN-IGGIVGGIVNPISEAA CSS2 HUMAN 187 IEKESQRKSIDPALSMLIKSIKTKT CT06 HUMAN 188 LDVIYWFRQIIAWLGVIWGVLPLR CT24 HUMAN 189 HRLLSTΞWGLPSIVKSLIGAARTKT CT45 HUMAN 190 NKSGNRSEKEVRAAAL VLQTIWGYK CTD1 HUMAN 191 RHLTQQDPLSEAIVEKLIQSIQKVF CTDB HUMAN 192 RFVKLAVMGLTVALGAAALAWKSA CTEO HUMAN 193 SVKRGNMVRAARALLSAVTRLLILA CTN 1 HUMAN 194 SVKRGTMVRAARALLSAVTRLLILA CTN2 HUMAN 195ARENAGPAIVISFLIAALASVLAGL CTR1 HUMAN 196 VSSSAPSVYSVQALSLLAEVLASLL CU05 HUMAN 197 VYRSDEKEKAVPLISRLLYYVFPYL CU05 HUMAN 198 RGPHGQLSPALPLASSVLMLLMSTL CV03 HUMAN 199 TLRFLHASALLALASGLLAVLLAGL CV03 HUMAN 200 FPNPRRRLRLQDLADRWDASEDEH CYA3 HUMAN 201 LHYYSEREGLQDIVIGIIKTVAQQI CYG1 HUMAN 202WKGAPTTSLISVAVTKIIAKVLEDN D7A1 HUMAN 203 YVASAFTLAVNI lAKKIVLKEQTGS DCOR HUMAN 204 LLRILTDALVPYLVGQWAGAQALQ DCUP HUMAN 205 AEKTDEEΞKEDRAAQSLLNKLIRSN DD19 HUMAN 206 DEERRQLIQLRDILKSALQVEQKED DDF2 HUMAN 207 LGHPAAFGRATHAVVRALPESLGQH DDH1 HUMAN 208 ASFQRKWFEVAFVAEΞLVHSEIPAF DEP5 HUMAN 209 KVAFTGSTEVGKLIKEAAGKSNLKR DHA1 HUMAN 210 KIAFTGSTΞVGKLIQΞAAGRSNLKR DHA2 HUMAN 211 EAIKFINRQEKPLALYAFSNSRQW. DHA8 HUMAN 212 PRALLAALWALEAAGTAALRIGAFN DHP1 HUMAN 213 RLVSSPPSGVPGLALLALLALLALR DIAC HUMAN 214 RWLKGDVSLKDI IDPAFRASWIAQ DIAC HUMAN 215 FQLPSRQP ALSSFLGHLAAQVQAAL D1S1 HUMAN 216 RSLTSEREGLEGLLSKLLVLSSRNV DIS1 HUMAN 217 LIGPKVRITLMKFLPSVFMDAMRDN DJCD HUMAN 218 QRPRAPRSALWLLAPPLLRWAPPLL DLG4 HUMAN 219 RQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYF DM3A HUMAN 220 KRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQ DMD HUMAN 221 LPARVPRPGLSEALSLLLFAWLSR DMK HUMAN 222 QRΞLQEALGARAALEALLGRLQAER DMN HUMAN 223 SARLRMVETLSNLLRSWALSPPDL DNL1 HUMAN 224 ELAΞHLNASLAFFLSDLLSLVDRGF D0C6 HUMAN 225 SPFRQQHFLAGLLLTELALALEPEA D0C6 HUMAN 226 LRAHGTHPAISTLARSAIFSVTYPS D0C6 HUMAN 227 IYEPPRYMSVNQAAQQLLEIVQNQR DPH5 HUMAN 228 HIYLYHHAQAHKALFGIFIPSQRRA . 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WD10 HUMAN 790 IPADPEAGGIGRWNGAFMVLKGHR WD22 HUMAN 791 RQNKDΞRYSIKDLLNHAFFQEETGV WNK1 HUMAN 792 RKTSKSKLKAGKLLNPLVRQLKWA WNK2 HUMAN 793 RTDKNERFTIQDLLAHAFFREΞRGV WNK4 HUMAN 794 TAFGADTEGSQWIIGYLLQKVISNL XP04 HUMAN 795 LGLNDETMVLSVFIGKIITNLKYWG XP07 HUMAN 796 LNYLATRPKLATFVTQALIQLYARI XP07 HUMAN 797 AMFVEYRKQLKLLLDRLAQVSPELL XPOT HUMAN 798 QNWQTTRFMEVΞVAIRLL YMLAEAL XPOT HUMAN 799 FPAATSGRMVEAFARRALWDAGLNY XPP2 HUMAN 800 LLKASHVRDAVAVIRYLVWLEKNVP XPP2 HUMAN 801 SILTQPHLYSPVLISQLVQMASQLR Y310 HUMAN 802 ISIGTIYFRAHKLVLAAASLLFKTL Y478 HUMAN 803 RDVLRVQGVSLTALRLLLADAYSGR Y711 HUMAN 804QLEGLENATARNLLGKLINILLAVM Y779 HUMAN 805 PPLIVDRERLKKLLDLLVDKSNNLA YC40 HUMAN 806EDTKEKRTIIHQAIKSLFPGLETKT YI97 HUMAN 807 DQKTNLPEYLQTLLNTLAPLLLFRA Z294 HUMAN 808 RSREHGTLWSLIIAKLILSRSISSD • Z294 HUMAN 809VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS- Z297 HUMAN 810 ΪRNKMDPPRSSIFLQEVITTVYGYK ZAN HUMAN 811 VDLAYSNYHVKQFLEALLRNSAAPS ZBT8 HUMAN 812 LKLRSLRVNVGQLLAMI VPDLDLQQ ZCW3 HUMAN 813ELQKQAELMEFEIALKALSVLRYIT ZM10 HUMAN 814 DALHMLTDLSAIILTLLALWLSSKS ZNT4 HUMAN 8151MD C; EENYSAAS,KΆVRQVLHQLKRLG ZW10 HUMAN
Bildlegenden
Figur 1 . Identifizierung von Peptiden, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der PKA hemmen. Eine Bibliothek von Pep¬ tiden, die von . der PKA-Bindungsdomäne des AKAP18δ abgeleitet wurden, wurde auf einer Membran synthetisiert. Die Membran wurde mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- und RIIß-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert ■ mit einem Phosphoimager) . Die Aminosäuresequenzen der Peptide lassen sich anhand der angegebenen Kürzel (Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAP185; horizontal: die 20. Aminosäuren, die für die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden.
Figur 2 Identifizierung von Peptiden, abgeleitet von AKAPlδδ, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit den regulatorischen RIICK- und RII/3-Untereinheiten der PKA hemmen. A. Peptide, die von der- PKA-Bindungsdomäne des AKAP185 abgeleitet wurden, wurden auf zwei- Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIICK- (obere Reihe) oder RII/?-Untereinheiten (untere Reihe) der PKA inkubiert (RII-overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII- Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKΑP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. B: Die Aminosäuresequenzen der Peptide (Einbuchstabenkodierung) , die in A angegeben sind.
Figur 3A Peptide, abgeleitet von AKAPlδδ, die RIIa- und RII/3-Unter- einheiten der PKA unterschiedlich stark binden. A. Die Peptide 1-19, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAPlδδ abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (obere Reihe) oder RIIjS- Untereinheiten (untere Reihe) der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. Das Peptid 7 ist aufgrund des großen Unterschieds in der Bindung an die beiden RII-Unterein¬ heiten durch rote Schrift hervorgehoben. B: Die Aminosäuresequenzen der Peptide (Einbuchstabenkodierung) , die in A mit 1-19 bezeichnet sind.
Figur 4 Unterschiedliche Peptide, abgeleitet von AKAPlδδ, binden RIIa- und RII/3-Untereinheiten der PKA unterschiedlich stark. Zwei Bibliotheken von Peptiden, die von dem Peptid 7 aus Figur 3 abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (linke Seite) oder RIIjS- Untereinheiten der PKA (rechte Seite) inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Aminosäuresequenzen' der Peptide lassen sich anhand der angegebenen Kürzel (Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz des Peptids 7; horizontal: die 20 Aminosäuren, die für die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden. Horizontale und vertikale Reihen sind zusätzlich durch arabische Zahlen beschriftet. Diese Koordinaten erleichtern die Zuordnung, so bedeutet zum Beispiel 10/11: Reihe 10 Peptid 11. Die unten aufgelisteten Peptide werden entsprechend ihrer Bindung an RIIa mit AlδδRIIαHsl und 2 bzw. entsprechend ihrer Bindung an RUß mit A18δRII/?Rnl bezeichnet.'
Fig. 5: Identifizierung von Peptiden, die AKAP-PKA- Interaktionen hemmen. Kandidatenpeptide wurden auf einer Membran synthetisiert und mit . radioaktiv markierten regulatorischen RIID-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) .
Fig. 6. Einfluß von Wasserstoffbrücken auf die Bindung zwischen Peptiden und RII (alpha) -Untereinheiten der PKA. (A,B) Vergleichende schematische Darstellung der Interaktion zwischen RII (alpha) und den Peptiden AKAP18 (delta) -wt oder AKAP18 (delta) -L314E sowie zwischen RII (alpha) , Ht31 oder AKAi3. Rllalpha ist als Rechteck und durch ausgewählte Aminosäuren, die Peptide sind anhand ihrer Aminosäure-Sequenz dargestellt. Aminosäuren als Partner einer Wasserstoffbrückenbindung, sind durch eine unterbrochene Linie miteinander verbunden. Aminosäuren der Peptide, die sich in Positionen für hydrophobe Molekülkontakte befinden sind grün unterlegt (Pos. der Aminosäuren von AKAP18 (delta) -wt im Vergleich zum Protein sind angegeben) . (C,D) Um den Einfluß der Aminosäuren für die Bindungsstärke zu untersuchen, wurden Alanin- substituierte Peptide auf Membranen synthetisiert, mittels RII overlay auf RII (alpha) -Bindung überprüft und densitometrisch quantifiziert. Die Peptide, ausgehend von AKAP18 (delta) -L314E, wurden in allen möglichen Kombinationen für die Aminosäuren, die Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können (vgl. A) substitutiert . Die Quantifizierung für alle Peptide, sortiert nach der Affinität ist in C dargestellt. Die Quantifizierung für alle Einzelsubstitutionen (wie angegeben) , sowie representative „Spots" aus einem RII Overlay (darüber) sind in D dargestellt. Referenzen
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Claims

Patentansprüche
1. Proteinkinase A/Proteinkinase A-Ankerprotein- Entkoppler, dadurch gekennzeichnet, dass die Entkoppler entweder (i) von einem AKAP185 oder (ii) von einem von AKAPl8δ verschiedenem Protein abgeleitet sind und gemäß (i) mindestens 8 H-Brücken bildende Aminosäuren oder gemäß (ii) die allgemeine Formel (1) aufweisen XXXXXXXXX[AVLISΞ]XX[AVLIF] [AVLI]XX[AVLI] [AVLIF]xx[AVLISE]XXXX (1) , wobei X eine beliebige der 20 biogenen Aminosäuren sein kann.
2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend
a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid- sequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 1 - 39,
b) ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid¬ sequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nukleinsäuremolekül,' das infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und/oder
d) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer■Nukleotidsequenz gemäß ä)' bis d) ist.
3. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nukleotidsequenz mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 % homolog zu einer der unter a) angegebenen Nukleotidsequenz ist .
4. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA ist.
5. Vektor umfassend, ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
6. Wirtszelle umfassend den Vektor gemäß Anspruch 5.
7. Organismus umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5 und/oder' eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6.
8. Organismus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus eine transgene Maus oder Ratte ist, wobei die Maus oder Ratte ■ vorzugsweise durch das Vorhandensein des Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 2 bis■ 4, des Vektors gemäß Anspruch 5 und/oder der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 Diabetes insipidus entwickelt.
9. Polypeptid, kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
10. Polypeptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Polypeptid eine Aminosäureseguenz nach SEQ ID 1 bis 39 umfasst, b) das Polypeptid nach a) durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu- einem Polypeptid nach a) ist und/oder c) das Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einem Polypeptid nach a)oder b) funktionsanalog zu sein.
11. Erkennungsmolekül ' gerichtet gegen . ein • Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10.
12. Erkennungsmolekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisense-Konstrukt ist, insbesondere ein RNA-Inter- ferenzmolekül.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, ein Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10 und/oder ein Erkennungsmolekül gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Aquaretika ist.
15. Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, ein Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10, ein .Erkennungsmolekül gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14 umfasst.
16. Verfahren' zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition einer AKAP.-PKA-Interaktion umfassend die Schritte a) Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Vektors nach Anspruch 5, einer Wirtszelle nach Anspruch 6 und/oder eines Polypeptids nach Anspruch 1, 9 oder 10 und b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation an einer regulatorischen RII-Untereinheit der' PKA erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die RII-Untereinheiten RIIa- und/oder Rllß-Untereinheiten sind.
19.. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der .Ansprüche 2 bis 4, eines Vektors nach Anspruch 5, einer Wirtszelle nach Anspruch 6, eines . Organismus nach Anspruch 7 oder 8, eines Polypeptids nach Anspruch 1, 9 oder 10, eines Erkennungsmoleküls nach Anspruch 11 oder 12, einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 und/oder eines Kits- nach Anspruch 15 zur Modifikation, insbesondere- einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion.
20. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,' dass die Interaktion in einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus durchgeführt wird.
21. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus nach Anspruch 7 oder 8 als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP-PKA-Inter¬ aktion verwendet wird, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus.
22. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Modifikation die Vasopressin-induzierte ' Umverteilung von AQPII modifiziert wird, insbesondere verhindert wird.
23. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10 und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14 als Wasserverlust-verursachende Mittel eingesetzt werden, insbesondere' als Aquaretika.
24. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion der RIIa- oder RII/3-Untereinheiten des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert wird.
25. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Untereinheiten humanem oder murinem Ursprungs sind.
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