DE69738322T2

DE69738322T2 - Apoptose assoziertes protein bbk

Info

Publication number: DE69738322T2
Application number: DE69738322T
Authority: DE
Inventors: Gregory J. Reading GALLO
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 1996-05-29
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2008-10-09
Anticipated expiration: 2017-05-30
Also published as: DE69738322D1; EP0910387B1; EP0910387A4; US5834234A; JP4005636B2; CA2256372A1; JP2000510686A; WO1997045128A1; US6057132A; EP0910387A1; ES2297860T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein das Gebiet der Zellphysiologie und insbesondere der Apoptose. Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung das neuartige Apoptoseassoziierte Protein Bbk, Bbk kodierende Nukleotidsequenzen, Produkte und Verfahren, die an der Klonierung, Präparation und Expression von Genen und Nukleotidsequenzen beteiligt sind, welche Bbk kodieren, Antikörper mit Spezifität für Bbk und diagnostische und therapeutische Anwendungen der obigen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
„Apoptose" bezieht sich auf Zellsuizid, dem ein aktiver physiologischer Prozess vorausgeht (Kerr, J. F., el al., Br. J. Cancer 26: 239–257 (1972); Wyllie, A. H., Nature 284: 555–556 (1980)). Zellen, die durch Apoptose sterben, durchlaufen charakteristische morphologische Veränderungen, einschließlich Zellschrumpfung und Kondensierung und Fragmentierung des Kerns. Apoptose spielt eine wichtige Rolle bei Entwicklungsprozessen, einschließlich der Morphogenese, der Reifung des Immunsystems und der Gewebehomöostase, wobei die Anzahl der Zellen in Geweben, die durch Zellteilung kontinuierlich erneuert werden, beschränkt sind (Ellis, R. E., et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 7: 663–698 (1991); Oppenheim, R. W., et al., Neurosci. 14: 453–501 (1991); Cohen. U., et al., Annu. Rev. Immunol. 10: 267–293 (1992): Raff, M. C., Nature 356: 397–400 (1992)). Apoptose ist ein wichtiger zellulärer Schutzmechanismus gegen Tumorgenese (Williams, G. T., Cell 65: 1097–1098 (1991); Lane, D. P. Nature 362: 786–787 (1993)). Defekte des Apoptosewegs können zum Einsetzen oder zum Fortschreiten von Malignitäten führen. Unter bestimmten Bedingungen durchlaufen Zellen Apoptose als Reaktion auf die erzwungene Expression von Onkogenen oder anderen Genen, welche die Zellproliferation antreiben (Askew, D., et al., Oncogene 6: 195–1922 (1991); Evan, G. I., et al., Cell 69: 119–128 (1992); Ran. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7742–7746 (1992); Smeyne. R. J. et al., Nature 363: 166–169 (1993)). Verschiedene degenerative Erkrankungen können eine irrtümliche Apoptose umfassen, die zu vorzeitigem oder unangebrachtem Zelltod führt (Barr, P. J. et al., Biotechnology 12: 487–493 (1994)). Eine produktive Infektion durch bestimmte Viren kann von der Suppression des Todes der Wirtszelle durch anti-apoptotische virale Genprodukte abhängen (Ran, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7742–7746 (1992); Ray, C. A., et al., Cell 69: 597–604 (1992); White, E., et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2570–2580 (1992); Vaux, D. L., et al., Cell 76: 777–779 (1994), und die Hemmung der Apoptose kann den Verlauf (d. h. lytisch oder latent) einer viralen Infektion verändern (Levine, B., et al., Nature 361: 739–742 (1993)). Eine weit verbreitete Apoptose von T-Lymphozyten, wie sie durch eine HIV-Infektion ausgelöst wird, könnte zumindest teilweise für das mit AIDS assoziierte Versagen des Immunsystems verantwortlich sein (Gougeon, M., et al., Science 260: 1269–1270 (1993)). Ein Überblick über die Aufgaben der Apoptose bei normalen und pathologischen Zellzyklusereignissen wird gegeben in Holbrook, N., et al., Hrsg., Cellular Aging und Cell Death, Wiley-Liss, Inc., Publisher, New York, NY (1996).
Das bcl-2-Genprodukt wurde als starker Suppressor von apoptotischem Zelltod intensiv untersucht. Das bcl-2-Gen wurde ursprünglich am Punkt der t(14:18)-Translokation identifiziert, die häufig bei B-Zellfollikellymphomen des Menschen vorkommt (Bakhshi, A., et al., Cell 41: 899–906 (1985); Cleary, M. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: (1985); Tsujimoto, Y., et al., Science 219: 1390–1393 (1985)). Diese Translokation führt zur konstitutiven Aktivierung der bcl-2-Genexpression aufgrund einer Juxtaposition zum Locus der schweren Kette von Immunglobulin. Bcl-2 fungiert bei dieser Krankheit als Onkogen, indem es die Apoptose, welche die Akkumulierung dieser Zellen normalerweise beschränken würde, unangebracht unterdrückt (McDonnell, T. J., et al., Cell 57: 79–88 (1989); Hockenbery, D., et al., Nature 348: 334–336 (1990)). Infolgedessen reichern sich B-Zellen während des indolenten Stadiums des Lymphoms an, weil sie nicht sterben, und nicht aufgrund unkontrollierter Proliferation.
Die antiapoptotische Aktivität von Bcl2 ist nicht auf B-Zellen beschränkt. Eine große Anzahl von Studien hat gezeigt, dass die ektope Bcl-2-Expression die von diversen Reizen ausgelöste Apoptose bei vielen Zelllinien unterdrücken kann (Vaux, D. L., et al., Nature 335: 440–442 (1988): Sentman, C. L., et al., Cell 67: 879–888 (1991); Strasser, A., et al., Cell 67: 889–899 (1991); Hockenbery, D. M., et al., Cell 75: 241–251 (1993)). Bcl-2 blockiert Zelltod, der durch Entzug von Wachstumsfaktor, DNA-Schädigung, Onkogenexpression, oxidativen Stress und virale Infektion induziert wird. Die Fähigkeit von Bcl-2 zur Blockierung der Apoptose in praktisch jedem System legt nahe, dass Bcl-2 eng mit der Maschinerie verbunden ist, die das Suizidprogramm tatsächlich durchführt. Diese Sichtweise wird durch die artübergreifende Erhaltung der Funktion von Blc-2 gestützt. Das ced9-Gen im Nematoden C. elegans unterdrückt den programmierten Zelltod in bestimmten Zelllinien des sich entwickelnden Wurms (Ellis, H. M., et al., Cell 44: 817–829 (1986)). Ced9 scheint ein funktionelles Homolog von Bcl-2 zu sein, da Bcl-2 in transgenen Würmern ced9 komplementieren kann (Vaux, D. L., et al., Science 258: 1955–1957 (1991)). Bcl-2 kann auch in Insektenzellen wirken, wie sich an der Fähigkeit von Bcl-2 zeigt, die durch Bakulovirusinfektion induzierte Apoptose zu unterdrücken (Alnemri, E. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7295–7299 (1992)). Der molekulare Mechanismus, durch den Bcl-2 wirkt, um den Zelltod zu blockieren, ist weitgehend unklar.
Es sind weitere zelluläre Gene identifiziert worden, die wesentliche Sequenzhomologie mit Bcl-2 aufweisen, und diese Gene scheinen dort, wo sie getestet werden, auch als Regulatoren apoptotischen Zelltods zu fungieren. Ein Verwandter von Bcl-2, Bcl-x, wurde durch DNA-Hybridisierung mit dem Bcl-2-Gen unter Bedingungen niedriger Stringenz isoliert (Boise, L. H., et al., Cell 74: 597–608 (1993)). Die Bcl-x-RNA wird differenziell gesplict, um eine lange Form mit der Bezeichnung Bcl-x_L und eine kürzere Form mit der Bezeichnung Bcl-x_S zu produzieren, die eine kurze interne Deletion aufweist. Bcl-x_L unterdrückt Zelltod, weitgehend wie Bcl-2, während die deletierte Form Bcl-x_S den Schutz durch Bcl-2 hemmen und als „dominant negative" Art wirken kann. Ein zweiter Verwandter von Bcl-2, Bax, wurde biochemisch als Protein identifiziert, das in Co-Immunpräzipitaten mit Bcl-2 gefunden wird (Oltvai, Z. N., et al., Cell 74: 609–619 (1993)). Die Isolierung der entsprechenden cDNA ergab, dass das Bax-Protein wesentliche Sequenzhomologie zu Blc-2 zeigt. Bax bildet Heterodimere mit Bcl-2 und scheint Apoptose zu induzieren und als negativer Regulator der Funktion von Bcl-2 zu fungieren. Es wurde gezeigt, dass die ektopische Expression von Bax den durch die Expression von Bcl-2 vermittelten Schutz vor Apoptose blockiert.
Zwei weitere zelluläre Bcl-2-Verwandte, Mcl-1 und A1 (Kozopas, K. M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3516–3520 (1993): Lin, E. Y., et al., J. Immunol. 151: 1979–1988 (1993)) wurden ursprünglich als mRNAs isoliert, die als Reaktion auf spezifische Stimuli induziert wurde: Phorbolester-induzierte Differenzierung von myeloischen Leukämiezellen (Mcl-1) und GM-CSF-Behandlung muriner Knochenmarkzellen (A1). Es ist noch nicht bekannt, ob Mcl-1 oder A1 Apoptose modulieren können.
Außer diesen zellulären Verwandten von Bcl-2 ist eine Reihe von Bcl-2-Homologen identifiziert worden, die von DNA-Viren kodiert werden. Das BHRF-1-Genprodukt des Epstein-Barr-Virus enthält eine Sequenzhomologie zu Bcl-2 und erwies sich später als Suppressor der Apoptose (Henderson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8479–8488 (1993)). Entsprechend kodiert das LMW5-HL-Gen des afrikanischen Schweinefiebervirus ein Protein mit ähnlicher Struktur wie Bcl-2 (Neilan, J. G., et al. J. Virol. 67: 4391–4394 (1993)). Das E1b-Protein mit 19 kD von Adenovirus scheint funktionell äquivalent zu Bcl-2 zu sein, obgleich die Homologie der Primärsequenz recht limitiert ist (White, E., et al., Mol. Cell. Biol. 12: 2570–2589 (1992)). Diese Gene erfüllen wahrscheinlich die Funktion, die Replikation der viralen DNA sicherzustellen, indem sie die Apoptose der infizierten Zelle verhindern. Die Erkenntnis, dass nicht verwandte DNA-Viren Gene hervorgebracht haben, die scheinbar die Wirkung von Bcl-2 nachahmen, stützt den Schluss, dass Bcl-2 ein wichtiger Apoptoseregulator ist.
Die Isolierung und Charakterisierung eines mit bcl-2 verwandten Gens mit der Bezeichnung bak ist in der gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/321,071, eingereicht am 11. Oktober 1994, beschrieben, welche eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/287,427, eingereicht am 9. August 1994, ist (bak wird darin als bcl-y bezeichnet). Die ektope Expression von bak beschleunigt den Tod einer IL-3-unabhängigen Zelllinie nach Zytokinentzug und wirkt dem durch Bcl-2 verliehenen Schutz gegen Apoptose entgegen. Darüber hinaus ist die erzwungene Expression von Bak ausreichend, um die Apoptose von Fibroblasten nach Serumentzug zu induzieren, was die Möglichkeit eröffnet, dass Bak die Maschinerie des Zelltods direkt aktiviert oder selbst ein Bestandteil davon ist.
Bekannte zelluläre Bcl-2-Gene haben, wenn analysiert, spezielle Expressionsmuster und könnten daher in verschiedenen Geweben wirken. Jedes Gewebe ist mit dem Zelltodprogramm ausgestattet, das von verschiedenen mit Bcl-2 verwandten Genen reguliert sein kann. Während die Expression von Bcl-2 für die Aufrechterhaltung des reifen Immunsystems erforderlich ist, ist es wünschenswert, weitere Gene zu identifizieren, die apoptotischen Zelltod in anderen Abstammungslinien steuern. Aus der Perspektive der pharmazeutischen Entwicklung wäre es wünschenswert, Mittel zu identifizieren bzw. zu entwickeln, die Apoptose je nach den klinischen Umständen aktivieren oder unterdrücken. WO 96/05232 beschreibt das mit Apoptose verwandte Protein Bcl-y und Verfahren und Anwendungen dessen.
WO 96/13614 beschreibt einen BCL-x/BCL-2-assoziierten Zelltodregulator.
Zha, H., et al. (1996) beschreiben ein proapoptotisches Protein, Bax, das mit Bcl-2 Heterodimere bildet und mit Bax über eine neuartige Domäne (BH3), die sich von BH2 und BH unterscheidet, Homodimere bildet (J. Biol. Chem. 271: 7440–7444).
Yang et al. (1995) beschreiben Bad, einen heterodimeren Partner von Bcl-x_L, und Bcl-2, der Bax verdrängt und Zelltod fördert (Cell 80: 285–291).
Boyd et al. (1995) beschreiben Bik, ein neuartiges zelltodinduzierendes Protein, das ein spezielles Sequenzmotiv mit Proteinen aus der Bcl-2-Familie teilt und mit viralen und zellulären überlebensfördernden Proteinen interagiert (Oncogene 11: 1921–1928).
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegenden Erfinder haben überraschenderweise eine neuartige Zusammensetzung von Materie entdeckt, die isoliert und charakterisiert worden ist und die in einer Reihe von Ausführungsformen hierin beschrieben ist. Hierin als „Bbk" bezeichnet, scheint sie ein Mitglied der Bcl-2-Familie zu sein und kann unter anderem Apoptose in Zellen induzieren und der Funktion von Bcl-2 und verwandten Zelltodsuppressoren in Zellen entgegen wirken. Die Isolierung einer humanen Bbk-cDNA in Volllänge ergab, dass die abgeleitete Bbk-Aminosäuresequenz Homologie mit Bcl-2 teilt. Bbk-mRNA scheint in einem breiten Spektrum primärer Humangewebe exprimiert zu sein. Bbk ist ein wichtiger Regulator der Apoptose in Humangeweben und/oder Tumorzellen.
Bei Expression in normalen Rattenfibroblasten (Rat 1) und in Humanzelllinien einschließlich HeLa und BT549-Zellen beschleunigt die Expression von Bbk die Apoptose. Die Coexpression von Bak und Bbk in Rat-1-Zellen blockiert nicht die Induktion der Apoptose, was darauf hinweist, dass ihre Fähigkeit zur gegenseitigen Bindung nicht ihre Fähigkeit zur Förderung der Apoptose hemmt. Ihre Coexpression kann zu einer kooperativen Induktion des Zelltods führen. Die apoptotische Funktion von Bbk lässt sich durch Coexpression der bekannten Überlebensproteine Bcl-2, Bcl-x_L, und Epstein-Darr-Virus-BHRF1 umkehren. Eine Erhöhung des Verhältnisses von Bbk relativ zu den Überlebensproteinen kann die Apoptose wiederherstellen, wie bereits mit dem Apoptose fördernden Protein Bik gezeigt wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Apoptoseassoziiertes Protein Bbk, Produkte und Prozesse, die an der Klonierung, Präparation und Expression von Genen für Bbk beteiligt sind, Antikörper mit Spezifität für Bbk und Nukleotidsonden, die der Bbk-Nukleotidsequenz oder Anteilen davon entsprechen. Das Bbk-Polypeptid ist für die Produktion von dagegen gerichteten Antikörpern nützlich. Die Antikörper und Sonden sind für die Feststellung und Isolierung von Bbk in Histologiepräparaten geeignet, einschließlich beispielsweise Zellen von allen menschlichen Geweben, einschließlich Herzgewebe, Lungengewebe, Tumorzellen, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Spezieshomologe und virale Homologe von Bbk.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung, Charakterisierung und Sequenzierung von cDNAs und genomischen Fragmenten, die Bbk, das in menschlichen Zellen vorhanden ist, kodieren.
Nach der vorliegenden Erfindung sind genetische Sequenzen bereit gestellt, die Bbk kodieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch Expressionsvektoren bereit, die solche genetischen Sequenzen enthalten, Wirte, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert sind, und Verfahren zum Produzieren des gentechnisch hergestellten oder rekombinanten Bbk.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Antikörper bereit, die Bbk spezifisch erkennen.
Die Bbk-cDNA und das rekombinante Bbk-Protein sind für die Herstellung von Antikörpern geeignet, die Bbk spezifisch erkennen. Solche Antikörper sind für die Feststellung und Isolierung von Bbk in biologischen Präparaten geeignet. Das vorliegende Bbk-Protein ist auch als Regulator der Apoptose von Nutzen.
Es ist eine kleine cDNA aus einer EBV-transformierten B-Zelllinie isoliert worden. Die Aminosäuresequenz des Bbk-Proteins teilt Sequenzhomologie mit Bcl-2-Domänen.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zum Isolieren von partiellen Bbk-Klonen mithilfe von PCR-Klonierung (Klonierung mithilfe der Polymerasekettenreaktion) aus verschiedenen humanen Tumorzelllinien.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zum Induzieren oder Unterdrücken von Apoptose bei Individuen, die an degenerativen Erkrankungen leiden, welche respektive durch unangebrachte Zellproliferation oder unangebrachten Zelltod gekennzeichnet sind. Degenerative Erkrankungen, die durch unangebrachte Zellproliferation gekennzeichnet sind, umfassen beispielsweise Entzündungszustände, Krebs, einschließlich Lymphome, genotypische Tumoren, etc. Degenerative Erkrankungen, die durch unangebrachten Zelltod gekennzeichnet sind, umfassen beispielsweise Autoimmunkrankheiten, erlangten Immundefizienzkrankheit (AIDS), Zelltod aufgrund von Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie, etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins von Bbk-Protein sowie Verfahren zur Diagnose degenerativer Erkrankungen, die im Vergleich zum erwarteten Bbk-Expressionsgrad in der normalen Zellpopulation mit einem erhöhten oder verminderten Grad der Expression von Mutationen von Bbk assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zum Überwachen des Fortschritts degenerativer Erkrankungen in Verbindung mit einem erhöhten oder verminderten Grad der Expression von Bbk durch Überwachen der Bbk-Expression.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Bestimmen, ob eine Krankheit/degenerative Erkrankung mit einer anomalen Bbk-Expression verknüpft ist, sowie Verfahren, um den Effekt einer Überexpression oder des Verlustes der Expression von Bbk in Tiermodellen wie beispielsweise transgenen Mäusen und/oder homozygoten Null-Mäusen zu erfassen. Verfahren zur Feststellung, ob eine Krankheit/degenerative Erkrankung mit einer anomalen Bbk-Expression verknüpft ist, umfassen die Analyse der Bbk-Expression in erkranktem Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe beispielsweise durch Northern- und/oder Western-Blots, sowie durch andere Testverfahren, die von einem Fachmann leicht gewählt und angewandt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Hybride von Bbk für den therapeutischen Gebrauch.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Modulieren apoptotischer Effekte durch Verabreichen des vorliegenden Bbk-Proteins, mutanten Proteins oder von Hybriden an ein Individuum, das an einer degenerativen Erkrankung leidet, die durch unangebrachte Zellproliferation oder unangebrachten Zelltod gekennzeichnet ist, um die unangebrachte Zellproliferation zu stabilisieren (d. h. Apoptose zu induzieren) bzw. den unangebrachten Zelltod zu stabilisieren (d. h. Apoptose zu unterdrücken), und/oder in jedem Fall das normale Zellverhalten wiederherzustellen. 3 veranschaulicht die in verschiedenen gesunden fetalen und adulten Geweben exprimierte Menge an Bbk-mRNA.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Funktionsäquivalente, einschließlich funktionaler Fragmente von Bbk, einschließlich beispielsweise Peptide von Bbk wie beispielsweise BH1 und BH2, und andere Homologieregionen, die von dem vorliegenden Erfinder zwischen Bbk und anderen Apoptosebezogenen Proteinen, einschließlich Bcl-2 und Bax, erkannt wurden.
In einem bestimmten Aspekt betrifft die Erfindung eine neuartige Proteindomäne, die auf einer kurzen Untersequenz im mittleren Teil des Bbk-Moleküls identifiziert und kartiert wurde. Diese neuartige Proteindomäne, welcher der Erfinder als „Bbk-BH3-Domäne" bezeichnet hat, ist sowohl für die Interaktion von Bbk mit Bak als auch für die Zelltötungsfunktion von Bbk entscheidend. Trunkierte Bbk-Arten, welche die Bbk-BH3-Domäne umfassen, sind an sich ausreichend, um Zellen in Transfektionsassays zu töten.
Die Bbk-BH3-Domäne teilt weniger als fünfundzwanzig Prozent Identität mit der GD-Domäne, die in der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/440,391, beantragt am 12. Mai 1999, erstmals in Bak beschrieben wurde (BH3 wird darin als GD-Domäne bezeichnet). Wie jedoch im Hinblick auf die GD-Domäne in Bak beobachtet wurde, schwächt eine Mutation der Bbk-BH3-Domänenelemente die Zelltötungs- und Proteinbindungsfunktion ab. Die Bbk-BH3-Domäne ist somit dafür verantwortlich, zentrale Protein/Protein-Wechselwirkungen zu vermitteln, die für die Aktionen vieler Zelltod-regulierender Moleküle signifikant sind.
In einem Aspekt betrifft dann die Erfindung gereinigte und isolierte Peptide, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, und Moleküle, die deren Struktur und/oder Funktion nachahmen, die für die Induktion oder Modulierung des apoptotischen Zustands einer Zelle geeignet sind. Chemische Verbindungen, welche die Funktion der Bbk-BH3-Domäne stören, sind als Apoptosemodulierende Mittel geeignet. Entsprechend betrifft die Erfindung in einem anderen Aspekt Mittel, die die Funktion der Bbk-BH3-Domäne stören können. Solche Mittel umfassen unter anderem Moleküle, die an die Bbk-BH3-Domäne binden, Moleküle, die in die Interaktion der Bbk-BH3-Domäne mit einem Protein oder mehreren Proteinen eingreifen und Moleküle, welche die auf eine bestimmte Weise veränderte Bbk-BH3-Domäne aufweisen. Die Erfindung stellt Verfahren bereit, um Moleküle zu identifizieren, die Apoptose durch Stören der Funktion der Bbk-BH3-Domäne modulieren, welche entsprechend weitere in Betracht gezogene Ausführungsformen umfassen.
In weiteren Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung Produkte und Verfahren, die an der Klonierung, Präparation und Expression von Peptiden, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, involviert sind; Antikörper mit Spezifität für die Bbk-BH3-Domäne und Nukleotidsequenzen, welche die Bbk-BH3-Domäne oder Anteile davon kodieren. Die Bbk-BH3-Domäne aufweisende Peptide sind für die Erzeugung von gegen sie gerichteten Antikörpern geeignet. Solche Antikörper sind für die Feststellung und die Isolierung von die Bbk-BH3-Domäne aufweisenden Proteinen in biologischen Präparaten geeignet, einschließlich beispielsweise in Zellen aus allen menschlichen Geweben, einschließlich Herzgewebe, Lungengewebe, Tumorzellen, Gehirngewebe, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse, sowie zum Modulieren der apoptotischen Aktivität von die Bbk-BH3-Domäne aufweisenden Proteinen in und aus solchen biologischen Präparaten und stellen zusätzliche Aspekte der Erfindung dar.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Expressionsvektoren bereit, welche genetische Sequenzen enthalten, Wirte, die mit solchen Expressionsvektoren transformiert sind, und Verfahren zum Produzieren der rekombinanten Bbk-BH3-Domänen-Peptide der Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zum Induzieren oder Unterdrücken der Apoptose in Zellen und/oder Geweben von Individuen, die an degenerativen Erkrankungen leiden, welche respektive durch unangebrachte Zellproliferation oder unangebrachten Zelltod gekennzeichnet sind. Degenerative Erkrankungen, die von einer unangebrachten Zellproliferation gekennzeichnet sind, umfassen beispielsweise Entzündungszustände, Krebs, einschließlich Lymphome, wie beispielsweise Prostatahyperplasie, genotypische Tumoren, etc. Degenerative Erkrankungen, die von unangebrachtem Zelltod gekennzeichnet sind, umfassen beispielsweise Autoimmunkrankheiten, erlangte Immundefizienzkrankheit (AIDS), Zelltod aufgrund einer Bestrahlungstherapie oder Chemotherapie, neurodegenerative Krankheiten wie die Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit, etc.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum Feststellen des Vorhandenseins des Bbk-BH3-Domänen-Peptids sowie Verfahren zur Diagnose degenerativer Erkrankungen, wobei die Erkrankungen im Vergleich zu dem erwarteten Expressionsgrad von die Bbk-BH3-Domäne aufweisenden Proteinen in der normalen Zellpopulation mit einem erhöhten oder verringerten Grad der Expression solcher Proteine assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft den therapeutischen Gebrauch von die Bbk-BH3-Domäne aufweisenden Peptiden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Verfahren zum Modulieren des apoptotischen Status einer Zelle durch Verabreichung von Peptiden, welche das Bbk-BH3-Domänen-Peptid aufweisen, oder von Mutanten davon an ein Individuum, das an einer degenerativen Erkrankung leidet, die durch unangebrachte Zellproliferation oder unangebrachten Zelltod gekennzeichnet ist, um die unangebrachte Zellproliferation zu stabilisieren (d. h. Apoptose zu induzieren) bzw. den unangebrachten Zelltod zu stabilisieren (d. h. Apoptose zu unterdrücken), und/oder in jedem Fall das normale Zellverhalten wiederherzustellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Nukleotidsonden, die verwendet werden können, um das Vorhandensein von Bbk zu erfassen und Homologe, einschließlich Spezieshomologe und virale Homologe, zu identifizieren und zu isolieren.
Diese und andere Gegenstände und Aspekte der Erfindung sind einem Fachmann aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1. Merkmale des Two-Hybrid-Systems in Hefen (angepasst aus dem Handbuch von Clontech).
1(A). Eine schematische Darstellung des GAL4-Hefeproteins, welche die DNA-Bindungsdomäne (bd) zeigt, die mit der stromaufwärts (upstream) liegenden Aktivierungssequenz (UAS) von GAL1 und der die Transkription stimulierenden Transkriptionsaktivierungsdomäne (ad) interagiert.
1(B). GAL4-bg in Fusion mit Protein X kann an die UAS von GAL1 binden, die Transkription aufgrund des Mangels einer Aktivierungsdomäne jedoch nicht stimulieren. GAL4-ad in Fusion mit Protein Y kann die Transkription ebenfalls nicht stimulieren, weil der Promotor nicht lokalisiert werden kann.
1(C). Die Interaktion der Fusion aus GAL4-bd/Protein X mit der UAS von GAL1 und seine zusätzliche Interaktion mit der Fusion aus GAL4-ad/Protein Y ermöglichen die Rekonstitution der Funktion von Gal4 und die Stimulierung der Transkription.
2. Die Nukleotidsequenz und das putative offene Leseraster (ORF) von Klon Bbk. [SEQ ID Nr.: 9–11] Pfeile weisen auf die Startpunkte mehrerer verwandter Klone, die ebenfalls mithilfe der Two-Hybrid-Analyse isoliert wurden. Die Position eines in mehreren Klonen identifizierten AAG-Inserts ist ebenfalls angezeigt.
3. Northern-Blot-Analyse von menschlichen fetalen und adulten Geweben (Clontech). Die Blots wurden mit 32P-markierter Bbk-DNA (obere Tafel) und β-Aktin-DNA als Kontrolle hybridisiert. Größenmarker sind wie vom Hersteller definiert.
4. Expression des Bbk-Proteins.
4(A). In-vitro-Translation von ³⁵S-markiertem Bbk in Kaninchen-Retikulozytenlysat. Kontrollen umfassend die Translation von Luziferaseprotein wurden durch SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt und durch Autoradiographie visualisiert. Es sind die Gelmobilitäten vorgefärbter Protein-Molekulargewichtsmarker (Amersham) gezeigt.
4(B). Expression von Bbk in transfizierten Zellen. Plasmide, welche das Hämagglutinin(HA)-Epitop-markierte Bax oder Bbk exprimieren, wurden in COS7-Zellen transfiziert. Achtundvierzig (48) Stunden nach der Transfektion wurden Lysate hergestellt. Lysate transfizierter COS7-Zellen wurden als Negativkontrolle verwendet. Die Proteine wurden durch SDS-Gelelektrophorese und Western-Blotting von Zelllysaten mit dem monoklonalen Anti-HA-Antikörper 12CA5 (Boehringer Mannheim) erfasst. Die Proteine Bax und Bbk sind mit Pfeilen angezeigt.
5. Effekt der Bbk-Expression auf die Vitalität von Rat1-Zellen. Die Zellen wurden, wie angezeigt, mit einem Plasmid transfiziert, das β-Galaktosidase (pRcCMV/βgal, 0,16 μg) exprimiert. Die Zellen wurden 24 Stunden nach der Transfektion gefärbt, um lebende und tote β-Galaktosidase exprimierende Zellen zu identifizieren. Werte aus Dreifachexperimenten wurden gemittelt und mit Fehlerbalken aufgetragen, die den SEM (Standardfehler des Mittelwerts) wiedergeben.
5(A). Effekt der transienten Expression von Vektor (0,42 g pRcCMV), Bak (0,21 μg pcDNA1/HABak + 0,21 μg pRcCMV), Bbk (0,21 μg pcDNA3/HABbk + 0,21 μg pRcCMV) oder Bak + Bbk (0,21 μg pcDNA3/HABak + 0,21 μg pcDNA3/HABbk) in Rat1-Zellen.
5(B). Effekt der Überlebensproteine Bcl-2 (0,21 μg pcDNA3/HABbk + 0,21 μg pRcCMV/Bcl-2), Bcl-x_L (0,21 μg pcDNA3/HABbk + 0,21 μg pRcCMV/Bcl-x_L) oder Epstein-Barr-Virus BHRF1 (0,21 μg pcDNA3/HABbk + 0,21 μg pRcCMV/BHRF1) nach Bbk-Induktion der Apoptose in Rati-Zellen.
6. Effekt der Bbk-Expression auf die Vitalität von HeLa-Zellen und BT549-Zellen.
6(A). HeLa-Zellen wurden mit pRcCMV/βgal (0,16 μg) plus Vektor (0,42 μg pRcCMV), Bak (0,21 μg pcDNA1/HABak + 0,21 μg pRcCMV) oder Bbk (0,21 μg pcDNA3/HABbk + 0,21 μg pRcCMV). Gefärbte Zellen wurden gezählt und wie in 5 beschrieben aufgetragen.
6(B). BT549-Zellen wurden wie in Tafel (A) beschrieben transfiziert.
7. Interaktion von Bbk mit Bcl-2-Familienmitgliedern. Ein Glutathion-S-Transferase(GST)-Fusionsprotein von Bbk wurde in E. coli produziert und auf Glutathion-Agarose gereinigt. Gereinigtes Bbk oder GST-Kontrollprotein wurde mit ³⁵S-markiertem, in vitro translatiertem (IVT), HA-markiertem Bak, Bax, Bik oder Flag-markiertem Bcl-x_L inkubiert. Die Komplexe wurden auf Glutathion-Agarosekügelchen eingefangen, einer SDS-Gelelektrophorese unterzogen und durch Autoradiographie visualisiert. Eingefangene Komplexe werden mit einem Aliquot des eingetragenen IVT-Materials verglichen.
8. Sequenzausrichtung (Alignment) von Bbk mit BH2- und BH3-Domänen von Bcl-2-Familienmitgliedern.
8(A). Die BH2-Domänensequenzen von Bak [SEQ ID Nr. 13], Bax [SEQ ID Nr. 14], Bik [SEQ ID Nr. 15], Bcl-2 [SEQ ID Nr. 16] und Bcl-x_L (SEQ ID Nr. 17] sind zu den homologen Regionen von Bbk [SEQ ID Nr. 12] ausgerichtet. Reste, die identisch oder in mindestens drei der Proteine konservativ sind, sind mit einem Kasten versehen. Schwarze Kästen zeigen identische Reste an, während graue Kästen konservative Reste anzeigen. Die Nummerierung gibt die Position des für jede Sequenz angezeigten ersten Aminosäurerestes an.
8(B). Die BH3-Domänensequenzen von Bak [SEQ ID Nr. 19], Bax [SEQ ID Nr. 20], Bik [SEQ ID Nr. 21], Bcl-2 [SEQ ID Nr. 22] und Bcl-x_L [SEQ ID Nr. 23] sind zu den homologen Regionen von Bbk ausgerichtet. Schraffierung und Nummerierung sind wie in Tafel (A) beschrieben.
9. Analyse von Deletions- und Punktmutationen von Bbk [SEQ ID Nr. 1] in Rat1-Zellen.
9(A). Rat1-Zellen wurden mit pRcCMV/βgal (0,16 μg) plus Vektor (0,42 μg pRcCMV), Volllängen-Bbk (0,42 μg pcDNA3/HABbk) oder Deletionsmutanten von Bbk (0,42 μg pcDNA3/HAΔ1–105 oder 0,42 μg pcDNA3/HAΔ142–249) transfiziert. Gefärbte Zellen wurden gezählt und wie in 5 beschrieben aufgetragen.
9(B). Alaninpunktmutanten der Bbk-BH3-Domäne (PM-LVLEE [SEQ ID Nr. 25]. PM-V [SEQ ID Nr. 2], PM-L [SEQ ID Nr. 3], PM-EE [SEQ ID N9. 4] werden mit der Wildtyp-Bbk-BH3-Domäne [SEQ ID Nr. 1] verglichen. Die Schraffierung ist wie in 8 beschrieben, wobei Alaninsubstitutionen als umrandete Kästen angezeigt sind.
9(C). Die in Tafel (B) gezeigten Alaninpunktmutationen (jeweils 0,42 μg pcDNA3/HAPM-LVLEE, pcDNA3/HAPM-V, pcDNA3/HAPM-L, pcDNA3/HAPM-EE plus 0,16 μg pRcCMV/βgal) wurden in Rat1-Zellen transfiziert und mit Zellen verglichen, die mit Vektorkontrollplasmid oder Wildtyp-Bbk, wie beschrieben in Tafel (A), transfiziert wurden. Gefärbte Zellen wurden gezählt und wie in 5 beschrieben aufgetragen.
10. Effekt der Expression der Bbk-BH3-Domäne auf die Vitalität von Rat1-Zellen. Rat1-zellen wurden mit pRcCMV/bβgal (0,16 mg) plus Vektor (0,42 mg pRcCMV), Volllängen-Bbk (0,42 mg pRcCMV/HABbk) oder der Bbk-BH3-Domäne (0,42 mg pRcCMV/HABbkBH3) transfiziert. Gefärbte Zellen wurden gezählt und wie in 5 beschrieben aufgetragen.
11. Wechselwirkung von Bbk-Punktmutanten mit Bak, analysiert mit dem Two-Hybrid-Hefesystem. Bak-Köderplasmid (pAS2/BakΔC) wurde mit Plasmiden, welche die Gal4-Aktivierungsdomänenfusionen von Alaninpunktmutationen von Bbk (pACT/PM-LVLEE, pACT/pM-V, pACT/PM-L und pACT/PM-EE) exprimieren, und mit Wildtyp Bbk (pACT/Bbk) cotransformiert. Als Positivkontrolle wurden Plasmide vom Hersteller (Clontech), die p53-Köder (pVA3) und SV40-T-Antigen (pTD1) exprimierten, wie oben cotransfiziert. Als Negativkontrolle wurde pACT/Bbk mit pAS2, das nur die Gal4-Aktivierungsdomäne exprimiert, als Köder cotransformiert. Von jeder Transformation wurden drei Einzelkolonien in dreifacher Ausführung mithilfe des vom Hersteller (Clontech) beschriebenen Flüssigkulturassays auf β-Galaktosidaseaktivität analysiert. Anschließend wurde der Mittelwert der Dreifachbestimmungen jeder der drei Kolonien gemittelt, um einen Einzelwert für jedes Paar an interagierenden Proteinen zu erhalten. Die Daten werden als β-Galaktosidase-Einheiten (Miller, J. H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York (1972)) aufgetragen, wobei die Fehlerbalken den SEM wiedergeben.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Hierin beschriebene technische und wissenschaftliche Begriffe haben, sofern nicht anders definiert, die Bedeutung, die von einem durchschnittlichen Fachmann, an den sich die vorliegende Erfindung wendet, üblicherweise verstanden wird. Es wird hierin auf verschiedene Verfahren Bezug genommen, die einem Fachmann bekannt sind. Veröffentlichungen und anderes Material, die solche bekannten Verfahren ausführen, auf die hierin Bezug genommen wird, sind hierin in ihrer Gänze durch Bezugnahme enthalten, so als ob sie in voller Länge aufgeführt wären. Standardbezugsarbeiten, welche die allgemeinen Prinzipien der DNA-Rekombinationstechnologie ausführen, umfassen Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York (1989); McPherson, M. J., Hrsg., Directed Mutagenesis: A Practical Approach. IRL Press, Oxford (1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis. Oxford Science Publications. Oxford (1992); Austen, B. M. and Westwood, O. M. R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press. Oxford (1991). Zur Ausführung der vorliegenden Erfindung kann jedes geeignete Material und/oder jedes Verfahren verwendet werden, das einem Fachmann bekannt ist, aber es sind bevorzugte Materialien und/oder Verfahren beschrieben. Materialien, Reagenzien und dergleichen, auf die in der folgenden Beschreibung und in den folgenden Beispielen Bezug genommen wird, sind im Handel erhältlich, sofern nicht anders angemerkt.
Diese Erfindung betrifft ganz allgemein ein neuartiges Protein mit der Bezeichnung „Bak Einding Killer"-Protein bzw. „Bbk", was auf seiner Fähigkeit beruht, spezifisch an das Protein Bak zu binden und immortalisierte menschliche Tumorzellen zu töten. Entsprechend umfasst diese Erfindung Aminosäuresequenzen von Bbk oder Bbk-Mutanten, genetische Sequenzen, die solche Aminosäuresequenzen kodieren, Expressionsvehikel, welche die genetischen Sequenzen enthalten, damit transformierte Wirte und rekombinantes Bbk und Antisense-RNA, die durch Expression in einem solchen transformierten Wirt produziert werden. Die Erfindung umfasst des Weiteren Antikörper, die gegen Bbk und/oder Fragmente davon oder gegen Bbk-Mutanten gerichtet sind.
Der Prozess zur gentechnischen Herstellung solcher Proteinsequenzen wird erfindungsgemäß durch die Klonierung genetischer Sequenzen ermöglicht, die das Peptid kodieren können, und durch die Expression solcher genetischer Sequenzen. Wie hierin verwendet, soll sich der Begriff „genetische Sequenzen" auf ein Nukleinsäuremolekül (vorzugsweise DNA) beziehen. Genetische Sequenzen, die die Proteine kodieren können, stammen aus verschiedenen Quellen. Diese Quellen umfassen genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und Kombinationen davon. Die bevorzugte Quelle der genomischen DNA oder mRNA ist menschliches Gewebe, einschließlich Herz, Lunge, Tumorzellen, Plazenta, Leber, Skelettmuskel und Bauchspeicheldrüse. Die mRNA kann dann verwendet werden, um durch Techniken, die einem Fachmann bekannt sind, cDNA zu erhalten. Basierend auf der Nukleotidsequenz von Bbk können mithilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren Sonden synthetisiert werden.
Die genomische DNA des Bbk-Proteins oder -Fragments der Erfindung kann natürlich vorkommende Introns enthalten oder nicht. Darüber hinaus kann eine solche genomische DNA in Verbindung mit der 5'-Promotorregion der Bbk-Proteingensequenzen und/oder mit der 3'-Transkriptionsterminationsregion erhalten werden. Solche genomische DNA kann des Weiteren in Verbindung mit den genetischen Sequenzen, welche die 5'-untranslatierte Region der Bbk-Protein-mRNA kodieren, und/oder mit den genetischen Sequenzen, welche die 3'-untranslatierte Region kodieren, erhalten werden. Soweit eine Wirtszelle die transkriptionellen und/oder translationellen regulatorischen Signale in Verbindung mit der Expression der mRNA und des Proteins erkennen kann, können die 5'- und/oder die 3'-untranskribierten Regionen des nativen Gens und/oder die 5'- und/oder 3'-untranslatierten Regionen der mRNA behalten und für die transkriptionelle und translationelle Regulation angewandt werden. Die genomische DNA des Bbk-Proteins kann anhand von aus dem Stand der Technik bekannten Mitteln aus menschlichem Gewebe extrahiert und gereinigt werden (siehe beispielsweise Berger, S. L., et al., Hrsg., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press (1987)).
Alternativ kann mRNA aus jeder Zelle isoliert werden, die das Protein produziert bzw. exprimiert, und verwendet werden, um anhand von aus dem Stand der Technik bekannten Mitteln cDNA zu produzieren (siehe beispielsweise Berger, S. L., et al., Hrsg., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press (1987)). Vorzugsweise ist die verwendete mRNA-Präparation mit mRNA angereichert, die solche Bbk-Proteine kodiert, entweder natürlicherweise durch Isolierung von Zellen, die große Mengen des Proteins herstellen, oder in vitro durch Techniken, die gängigerweise zur Anreicherung spezifischer Sequenzen in mRNA-Präparationen angewandt werden, einschließlich beispielsweise Saccharosegradientenzentrifugation oder PCR. cDNA kann beispielsweise durch reverse Transkription hergestellt werden. Die cDNA kann dann durch PCR durch Verwendung geeigneter Primer amplifiziert werden.
Zum Klonieren in einen Vektor werden solche geeigneten DNA-Präparationen (entweder menschliche genomische DNA oder cDNA) an zufälliger Stelle geschert bzw. enzymatisch gespalten und in geeignete Vektoren ligiert, um eine rekombinante Genbibliothek (entweder eine genomische oder eine cDNA-Bibliothek) zu bilden. Eine DNA-Sequenz, die das Bbk-Protein oder seine funktionellen Aquivalente kodiert, kann nach herkömmlichen Techniken, einschließlich dem Herstellen stumpfer (blunt) oder gestaffelter (staggered) Enden zur Ligation, Verdau mit Restriktionsenzymen zur Bereitstellung geeigneter Enden, Auffüllen kohäsiver Enden nach Bedarf, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung unerwünschter Zusammenschlüsse und Ligation mit geeigneten Ligasen, in einen DNA-Vektor eingesetzt werden. Techniken für solche Manipulationen sind beispielsweise von Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Planview, New York (1989) beschrieben und aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Mit einem beliebigen Mittel, das spezifisch Bbk-Protein-DNA selektieren kann, beispielsweise (a) durch Hybridisierung mit einer oder mehreren geeigneten Nukleinsäuresonden, die eine für die DNA dieses Proteins spezifische Sequenz enthalten, oder (b) mittels einer durch Hybridisierung selektierte Translationsanalyse, bei der native mRNA, die mit dem fraglichen Klon hybridisiert, in vitro translatiert wird und die Translationsprodukte weiter charakterisiert werden, oder (c) durch Immunpräzipitation eines translatierten Bbk- oder Fragmentproduktes, das von dem den Klon enthaltenden Wirt produziert wird, wenn die klonierten genetischen Sequenzen selbst mRNA exprimieren können, können Bibliotheken, welche die Bbk-Proteinklone enthalten, durchsucht werden, und es kann ein Bbk-Klon identifiziert werden.
Für das Protein spezifische Oligonukleotidsonden, die verwendet werden können, um Klone für dieses Protein zu identifizieren, können durch Kenntnis der Aminosäuresequenz des Bbk-Proteins entworfen werden. Die Sequenz der Aminosäurereste in einem Peptid wird hierin entweder durch Verwendung ihrer üblicherweise verwendeten Drei-Buchstaben-Bezeichnungen oder durch ihre Ein-Buchstaben-Bezeichnungen benannt. Eine Liste dieser Drei-Buchstaben- und Ein-Buchstaben-Bezeichnungen ist in Lehrbüchern wie beispielsweise in Biochemistry. 2. Auflage, Lehninger. A., Worth Publishers, New York, NY (1975), zu finden. Wird die Aminosäuresequenz waagrecht aufgeführt, befindet sich der Aminoterminus am linken Ende und der Carboxyterminus am rechten Ende. Die Reste der Aminosäuren in einem Peptid können durch Bindestriche getrennt werden. Solche Bindestriche sind ausschließlich dazu bestimmt, die Darstellung einer Sequenz zu vereinfachen.
Aufgrund der Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon verwendet werden, um eine bestimmte Aminosäure zu kodieren (Watson, J. D., In: Molecular Biology of the Gene, 3. Auflage, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), S. 356–357). Die Peptidfragmente werden analysiert, um Sequenzen von Aminosäuren zu identifizieren, die von Oligonukleotiden mit dem geringsten Degenerationsgrad kodiert werden. Dies wird vorzugsweise erreicht, indem Sequenzen identifiziert werden, die Aminosäuren enthalten, die nur von einem einzigen Codon kodiert werden.
Obgleich eine Aminosäuresequenz gelegentlich von nur einer einzigen Oligonukleotidsequenz kodiert sein kann, kann die Aminosäuresequenz häufig von einer Beliebigen aus einem Satz ähnlicher Oligonukleotide kodiert sein. Bedeutenderweise enthält nur ein Mitglied des Satzes die Nukleotidsequenz, die identisch mit der exonkodierenden Sequenz des Gens ist, wobei alle Mitglieder dieses Satzes Oligonukleotidsequenzen enthalten, die dasselbe Peptidfragment kodieren können und somit potenziell dieselbe Oligonukleotidsequenz wie das Gen enthalten, welches das Peptidfragment kodiert. Weil dieses Mitglied innerhalb des Satzes vorhanden ist und auch in Gegenwart der anderen Mitglieder des Satzes mit DNA hybridisieren kann, ist es möglich, den unfraktionierten Satz an Oligonukleotiden auf dieselbe Weise einzusetzen, in der ein einzelnes Oligonukleotid eingesetzt werden würde, um das das Peptid kodierende Gen zu klonieren.
Es können unter Verwendung des genetischen Codes (Watson, J. D., In: Molecular Biology of The Gene. 3. Auflage, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)) eines oder mehrere verschiedene Oligonukleotide aus der Aminosäuresequenz identifiziert werden, von denen jedes das vorliegende Bbk- oder Fragmentprotein kodieren könnte. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein bestimmtes Oligonukleotid tatsächlich die eigentliche Proteinkodierungssequenz darstellt, lässt sich abschätzen, indem die anomalen Basenpaarungsbeziehungen und die Häufigkeit, mit der ein bestimmtes Codon in eukaryotischen Zellen tatsächlich verwendet wird (um eine bestimmte Aminosäure zu kodieren), berücksichtigt werden. Solche „Codonverwendungsregeln" sind von Lathe, et al., J. Molec. Biol. 183: 1–12 (1985) beschrieben. Unter Verwendung der „Codonverwendungsregeln" von Lathe wird eine einzelne Oligonukleotidsequenz oder ein Satz von Oligonukleotidsequenzen identifiziert, die eine theoretische „wahrscheinlichste" Nukleotidsequenz enthalten, welche die Bbk-Proteinsequenzen kodieren kann.
Das geeignete Oligonukleotid bzw. der Satz von Oligonukleotiden, die ein Fragment des Bbk-Proteingens kodieren können (oder die komplementär zu einem solchen Oligonukleotid bzw. dem Satz von Oligonukleotiden sind), können durch aus dem Stand der Technik gut bekannte Mittel synthetisiert (siehe beispielsweise S. A. Narang, Hrsg., Synthesis and Application of DNA and RNA. Academic Press, San Diego, CA, USA) und als Sonde verwendet werden, um das klonierte Bbk-Protein durch aus dem Stand der Technik bekannte Techniken zu identifizieren und zu isolieren. Techniken der Nukleinsäurehybridisierung und Klonidentifizierung sind beschrieben von Maniatis, et al., Hrsg., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, (1982); Berger, et al., Hrsg., Guide to Molecular Cloning Techniques. Academic Press, San Diego, CA (1988); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Planview, New York (1989); und von Hames, et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization. A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985), die hierin durch Bezugnahme enthalten sind. Anschließend werden solche Mitglieder der oben beschriebenen Genbibliothek analysiert, die sich als fähig für eine solche Hybridisierung erwiesen haben, um den Umfang und die Art der das Bbk-Protein kodierenden Sequenzen zu bestimmen, die sie enthalten.
Um die Erfassung der gewünschten Bbk- oder Fragmentprotein-DNA-kodierenden Sequenz zu erleichtern, wird die oben beschriebene DNA-Sonde mit einer erfassbaren Gruppe oder einem erfassbaren Marker markiert. Eine solche erfassbare Gruppe bzw. ein solcher erfassbarer Marker kann jedes Material mit einer erfassbaren physikalischen oder chemischen Eigenschaft sein. Solche Materialien sind auf dem Gebiet der Nukleinsäurehybridisierung hinreichend entwickelt worden, und allgemein kann fast jeder Marker auf die vorliegende Erfindung angewandt werden, der für solche Verfahren geeignet ist. Besonders geeignet sind radioaktive Marker wie ³²P, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ¹²⁵I oder dergleichen. Es kann jeder radioaktive Marker verwendet werden, der ein adäquates Signal liefert und ausreichende Halbwertszeit aufweist. Das Oligonukleotid kann mithilfe gut bekannter Mittel radioaktiv markiert werden, beispielsweise durch „Nick-Translation", wie beispielsweise beschrieben in Rigby, et al., J. Mol. Biol. 113: 237 (1977) und durch T4-DNA-Polymerase-Austausch(Replacement)-Synthese, wie beispielsweise beschrieben in Deen et al., Anal. Biochem. 135: 456 (1983).
Alternativ sind Polynukleotide auch als Nukleinsäurehybridisierungssonden geeignet, wenn sie mit einem nicht-radioaktiven Marker wie Biotin, einem Enzym oder einer fluoreszierenden oder chemilumineszierenden Gruppe markiert sind. Siehe beispielsweise Leary, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4045 (1983); Renz, et al., Nucl. Acids Res. 12: 3435 (1984); und Renz, M., EMBO J. 6: 817 (1983).
Die eigentliche Identifizierung der Bbk-Proteinsequenzen erlaubt somit die Identifizierung einer theoretischen „wahrscheinlichsten" DNA-Sequenz oder eines Satzes solcher Sequenzen, die solch ein Peptid kodieren können. Durch Konstruktion eines Oligonukleotids, das zu dieser theoretischen Sequenz komplementär ist (oder durch Konstruktion eines Satzes von Oligonukleotiden, die zu dem Satz an „wahrscheinlichsten" Oligonukleotiden komplementär sind) erhält man ein DNA-Molekül (oder einen Satz an DNA-Molekülen), die als Sonde(n) zur Identifizierung und Isolierung von Klonen fungieren können, welche das Bbk-Proteingen enthalten.
Bei einem alternativen Weg zur Klonierung des Bbk-Proteingens wird mithilfe eines Expressionsvektors eine Bibliothek hergestellt, indem DNA oder vorzugsweise cDNA, die aus einer Zelle präpariert sind, die das Bbk-Protein exprimieren kann, in einen Expressionsvektor kloniert wird. Die Bibliothek wird anschließend auf Elemente durchsucht, die das Bbk-Protein exprimieren, beispielsweise indem die Bibliothek mit Antikörpern gegen das Bbk-Protein durchsucht wird.
Die oben erläuterten Verfahren können daher genetische Sequenzen identifizieren, die Bbk-Proteine oder Fragmente davon kodieren können. Zur näheren Charakterisierung solcher genetischer Sequenzen und zur Produktion des rekombinanten Proteins ist es wünschenswert, die Proteine, die solche Sequenzen kodieren, zu exprimieren. Eine solche Expression identifiziert solche Klone, die Proteine exprimieren, welche Kennzeichen der Bbk-Proteine besitzen. Solche Kennzeichen können die Fähigkeit umfassen, Antikörper gegen das Bbk-Protein spezifisch zu binden, und die Fähigkeit, die Produktion eines Antikörpers bzw. von Antikörpern hervorzurufen, die an das Bbk-Protein binden können.
Zur Expression des Bbk-Proteins oder eines funktionellen Äquivalents oder einer Mutante davon sind Transkriptions- und Translationssignale erforderlich, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden können. Die beispielsweise durch die oben beschriebenen Verfahren und vorzugsweise in doppelsträngiger Form erhaltenen, klonierten, Bbk kodierenden Sequenzen können funktionell mit Sequenzen verknüpft werden, welche die transkriptionelle Expression in einem Expressionsvektor steuern, und in eine Wirtszelle, entweder prokaryotisch oder eukaryotisch, eingeführt werden, um rekombinantes Bbk-Protein oder ein funktionelles Äquivalent davon zu produzieren. Je nachdem, welcher Strang der Bbk kodierenden Sequenz funktionell mit den die transkriptionelle Expression steuernden Sequenzen verknüpft ist, ist es auch möglich, Bbk-Antisense-RNA oder ein funktionelles Äquivalent davon zu exprimieren.
Die Expression von Bbk in verschiedenen Wirten kann zu verschiedenen posttranslationalen Modifikationen führen, welche die Eigenschaften von Bbk verändern können. Die vorliegende Erfindung umfasst die Expression des Bbk-Proteins oder funktioneller Äquivalente davon oder einer Bbk-Mutante in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, und die eukaryotische Expression ist besonders bevorzugt.
Bevorzugte prokaryotische Wirte umfassen Bakterien wie beispielsweise E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, etc. Der am meisten bevorzugte prokaryotische Wirt ist E. coli. Es können auch andere Enterobakterien wie beispielsweise Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Arten verwendet werden. Unter solchen Bedingungen wird das Protein möglicherweise nicht glykosyliert. Der prokaryotische Wirt muss mit den Replikon- und Kontrollsequenzen in dem Expressionsplasmid kompatibel sein.
Zur Expression des Bbk-Proteins (oder eines funktionellen Äquivalentes davon) oder einer Bbk-Mutante in einer prokaryotischen Zelle (wie beispielsweise E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomyces, etc.) ist es notwendig, die Bbk kodierende Sequenz mit einem funktionellen prokaryotischen Promotor zu verknüpfen. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder, mehr bevorzugt, regulierbar (d. h. induzierbar oder dereprimierbar) sein. Beispiele konstitutiver Promotoren umfassen den int-Promotor des Bakteriophagen Lambda, den bla-Promotor des β-Lactamasegens von pBR322 und den CAT-Promotor des Chloramphenicolacetyltransferasegens von pBR325, etc. Beispiele induzierbarer prokayotischer Promotoren umfassen den rechten und linken Hauptpromotor (Major Right und Left Promotor) des Bakteriophagen Lambda (P_L und P_R), die Promotoren trp, recA, lacZ, ladI und gal von E. coli, den α-Amylase- (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162: 176–182 (1985)) und den sigma-28-spezifischen Promotor von B. subtilis (Gilman, M. Z., et al., Gene 32: 11–20 (1984)), die Promotoren der Bakteriophagen von Bacillus (Gryczan, T. J., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)) und Streptomyces-Promotoren (Ward, J. M., et al., Mol. Gen. Genet. 203: 468–478 (1986)). Glick, B. R., (J. Ind. Microbiol. 1: 277–282 (1987); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68: 505–516 (1986) und Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18: 415–442 (1984) geben einen Überblick über prokaryotische Promotoren.
Die korrekte Expression in einer prokaryotischen Zelle erfordert auch das Vorhandensein einer Ribosomenbindungsstelle stromaufwärts (upstream) der genkodierenden Sequenz. Solche Ribosomenbindungsstellen sind beispielsweise von Gold, L., et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365–404 (1981)) beschrieben.
Besonders bevorzugte eukaryotische Wirte umfassen Säugetierzellen, entweder in vivo, in Tieren oder in Gewebekultur. Allgemeine Prinzipien der Säugetierzellkultur sind aus dem Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Butler, M. and Dawson, M. Hrsg., Cell Culture LabFax. Bios Scientific Publishers Ltd., Oxford, GB und Academic Press, Inc., San Diego, CA, Publishers (1992) und in hierin zitierten Bezugsverweisen.
Die Expression von Bbk in eukaryotischen Wirten erfordert die Verwendung regulatorischer Regionen, die in solchen Wirten funktionsfähig sind, und vorzugsweise regulatorische Systeme. Je nach der Art des eukaryotischen Wirts kann ein breites Spektrum an transkriptionellen und translationellen regulatorischen Sequenzen verwendet werden. Die transkriptionellen und translationellen regulatorischen Signale können auch aus den genomischen Sequenzen von Viren stammen, die eukaryotische Zellen infizieren, wie beispielsweise Adenovirus, das Rinderpapillomavirus, Simianvirus, Herpesvirus oder derglei chen. Vorzugsweise sind diese regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert, das zu einem hohen Maß an Expression in der Wirtszelle fähig ist.
In Eukaryoten, bei denen die Transkription nicht mit der Translation verknüpft ist, können solche Kontrollregionen ein Methionin(AUG)-Initiatorcodon bereitstellen oder nicht, je nachdem, ob die klonierte Sequenz ein solches Methionin enthält. Solche Regionen weisen im Allgemeinen eine Promotorregion auf, die ausreichend ist, um die Initiation der RNA-Synthese in der Wirtszelle zu steuern. Promotoren heterologer Säugetiergene, die ein mRNA-Produkt kodieren, das translatierbar ist, sind bevorzugt, und insbesondere können starke Promotoren wie der Promotor für Aktin, Collagen, Myosin, etc. verwendet werden, vorausgesetzt, sie fungieren auch in der Wirtszelle als Promotor. Bevorzugte eukaryotische Promotoren umfassen den Promotor des Mausmetallothionein-I-Gens (Hamer, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288 (1982)), den TK-Promotor von Herpesvirus (McKnight, S., Cell 31: 355–365 (1982)), den SV40-Early-Promotor (Benoist, et al., Nature (London) 290: 304–310 (1981)) und den HCMV-Promotor (Boshart, et al., Cell 41: 521 (1985); in Hefe können der Promotor des gal4-Gens der Hefe (Johnston, et al., Prot. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6971–6975 (1982); Silver, et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 81: 5951-5955 (1984)) oder der Promotor eines glykolytischen Gens verwendet werden.
Wie gemeinhin bekannt ist, wird die Translation eukaryotischer mRNA an dem Codon gestartet, welches das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grund ist es bevorzugt, sicherzustellen, dass die Verknüpfung zwischen einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, die das Bbk-Protein oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert, keine störenden Codons enthält, die ein Methionin kodieren könnten. Das Vorhandensein solcher Codons führt entweder zur Bildung eines Fusionsproteins (wenn sich das AUG-Codon im selben Leseraster wie die Bbk kodierende DNA-Sequenz befindet) oder zu einer Frame-Shift-Mutation (wenn sich das AUG-Codon nicht im selben Leseraster wie die Bbk kodierende DNA-Sequenz befindet).
Falls gewünscht, kann ein Fusionsprodukt von Bbk konstruiert werden. Beispielsweise kann die Sequenzkodierung für Bbk oder ein Fragment davon mit einer Signalsequenz verknüpft werden, welche die Sekretion des Proteins aus oder die Kompartimentalisierung des Proteins in einem bestimmten Wirt gestattet. Solche Signalsequenzen können mit oder ohne spezifische Proteaseschnittstellen entworfen werden, so dass die Signalpeptidsequenz für eine anschließende Entfernung zugänglich ist.
Es können transkriptionelle Initiationsregulationssignale ausgewählt werden, welche eine Repression oder Aktivierung erlauben, so dass die Expression der funktionell verknüpften Gene moduliert werden kann. Relevant sind regulatorische Signale, die temperaturempfindlich sind, so dass beispielsweise durch Variieren der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder die einer chemischen Regulierung unterworfen sind, z. B. durch einen Metaboliten. Relevant sind auch Konstrukte, bei denen die Bbk-mRNA und Antisense-RNA in transkribierbarer Form bereit gestellt sind, aber mit anderen Promotoren oder anderen transkriptionellen regulatorischen Elementen, so dass die Induktion der Expression der Bbk-mRNA von einer Repression der Expression von Antisense-RNA und/oder die Repression der Expression der Bbk-mRNA von einer Induktion der Expression von Antisense-RNA begleitet ist.
Translationelle Signale sind nicht erforderlich, wenn es wünschenswert ist, Bbk-Antisense-RNA-Sequenzen zu exprimieren.
Falls gewünscht, können mit den oben beschriebenen Klonierungsverfahren die nicht-transkribierten und/oder nicht-translatierten Regionen 3' von der Sequenz erhalten werden, welche das Bbk-Protein kodiert. Die nicht-transkribierte 3'- Region kann wegen ihrer regulatorischen Sequenz zur Terminierung der Transkription behalten werden, die nicht-translatierte 3'-Region kann wegen ihrer regulatorischen Sequenz zur Terminierung der Translation behalten werden, oder wegen solcher Elemente, die die Polyadenylierung in eukaryotischen Zellen steuern. Wenn die nativen Sequenzsignale zur Expressionskontrolle in der Wirtszelle nicht zufrieden stellend funktionieren, können stattdessen Sequenzen verwendet werden, die in der Wirtszelle funktionell sind.
Die Vektoren der Erfindung können des Weiteren andere funktionell verknüpfte regulatorische Elemente wie beispielsweise Enhancersequenzen oder DNA-Elemente aufweisen, welche eine gewebe- oder zelltypspezifische Expression eines funktionell verknüpften Gens verleihen.
Zur Transformation einer Säugetierzelle mit den DNA-Konstrukten der Erfindung stehen viele Vektorsysteme zur Verfügung, je nachdem, ob gewünscht wird, das Bbk-DNA-Konstrukt in die chromosomale DNA der Wirtszelle einzufügen, oder ihr zu erlauben, in extrachromosomaler Form vorzuliegen.
Wenn die bbk-DNA kodierende Sequenz und ein funktionell verknüpfter Promotor in eine eukaryotische Empfängerzelle als nicht replizierendes DNA-(oder RNA-)Molekül eingeführt werden, bei dem es sich entweder um ein lineares Molekül oder ein geschlossenes kovalentes zirkuläres Molekül handelt und das nicht zu autonomer Replikation fähig ist, kann die Expression des Bbk-Proteins über die transiente Expression der eingeführten Sequenz stattfinden.
Mit Vektorsystemen oder Transformationssystemen können genetisch stabile Transformanden konstruiert werden, bei denen bak-DNA in das Wirtschromosom integriert wird. Eine solche Integration kann de novo in der Zelle stattfinden, oder kann in einer bevorzugten Ausführungsform durch Transformation mit einem Vektor unterstützt werden, der sich selbst funktionell in das Wirtschromosom einfügt, beispielsweise durch retrovirale Vektoren, Transposons oder andere DNA-Elemente, welche die Integration von DNA-Sequenzen in Chromosome begünstigen. Es wird ein Vektor verwendet, der die gewünschten Gensequenzen in ein Chromosom einer Säugetierwirtszelle integrieren kann.
Zellen, die die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, werden selektiert, indem außerdem mindestens ein Marker eingeführt wird, der die Selektion von Wirtszellen ermöglicht, welche den Expressionsvektor im Chromosom enthalten, beispielsweise kann der Marker Biozidresistenz verleihen, z. B. Resistenz gegenüber Antibiotika oder Schwermetallen wie Kupfer, oder dergleichen. Der selektierbare Marker kann direkt in die zu exprimierenden DNA-Gensequenzen oder durch Cotransfektion in dieselbe Zelle eingeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform wird die eingeführte Sequenz in ein Plasmid oder in einen viralen Vektor eingebaut, der in dem Empfängerwirt zu autonomer Replikation fähig ist. Für diesen Zweck kann jeder aus einem breiten Spektrum an Vektoren angewandt werden, wie unten ausgeführt ist.
Zu den Faktoren, welche bei der Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors wichtig sind, gehören: Die Einfachheit, mit der die Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und unter solchen Empfängerzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Anzahl der Kopien des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht ist, und ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten hin und her zu transportieren.
Bevorzugte eukaryotische Plasmide umfassen solche, die vom Rinderpapillomavirus, Vakziniavirus, SV40 abstammen, und bei Hefen Plasmide, die den 2-Mikron-Kreis, etc. enthalten, oder ihre Derivate. Solche Plasmide sind aus dem Stand gut bekannt (Rotstein, et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274 (1982); Broach, J. R., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445–470 (1981); Broach, J. R., Cell 28: 203–204 (1982); Bollon, et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48 (1980): Maniatis, T., „Gene Expression", In: Cell Biology: A Comprehensive Treatise. Vol. 3, Academic Press, NY, S. 563–608 (1980)) und im Handel erhältlich. Es sind Säugetierexpressionsvektorsysteme beschrieben worden, welche den MSV-LTR-Promotor zum Antrieb der Expression des klonierten Gens nutzen und bei denen es möglich ist, mit einem Helfervirus zu cotransfizieren, um die Plasmidkopienzahl zu vervielfältigen und das Plasmid in die Chromosome von Wirtszellen zu integrieren (Perkins, et al., Mol. Cell Biol. 1: 1123 (1983): Clontech, Palo Alto, Kalifornien).
Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, die das Konstrukt bzw. die Konstrukte enthalten, für die Expression präpariert worden sind, werden das DNA-Konstrukt bzw. die DNA-Konstrukte durch eines aus einer Vielzahl geeigneter Mittel, einschließlich Transfektion, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt. Nach dem Einführen des Vektors werden die Empfängerzellen in einem selektiven Medium gezüchtet, welches hinsichtlich des Wachstums vektorhaltiger Zellen selektiert. Die Expression klonierter Gensequenzen führt zur Produktion des Bbk-Proteins bzw. zur Produktion eines Fragments dieses Proteins. Diese Expression kann auf kontinuierliche Weise in den transformierten Zellen oder auf kontrollierte Weise stattfinden, beispielsweise eine Expression nach Induktion oder Differenzierung der transformierten Zellen (beispielsweise durch Verabreichung von Bromdesoxyuracil an Neuroblastomzellen oder dergleichen).
Das exprimierte Plasmid wird nach herkömmlichen Bedingungen wie beispielsweise Extraktion, Präzipitation, Chromatographie, Affinitätschromatographie, Elektrophorese oder dergleichen isoliert und gereinigt.
Bbk kann gereinigt werden, indem die transformierten Wirtszellen unter geeigneten Bedingungen, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, gezüchtet werden, die Zellen können geerntet und aufgebrochen werden, um das gesamte zelluläre Protein zu extrahieren. Das Protein kann anschließend beispielsweise auf einer Größenauftrennungssäule wie beispielsweise Sepharose oder Agarosekügelchen platziert werden, und Proteine des korrekten Molekulargewichts können aufgefangen werden. Das prognostizierte Molekulargewicht von Bbk ist 26,7 kD und läuft auf SDS-Polyacrylamidgelen mit einem scheinbaren Molekulargewicht von etwa 37 kD.
Durch Verwendung eines Anti-Bbk-Antikörpers kann eine weitere Reinigung durchgeführt werden. Ein solcher Antikörper kann verwendet werden, um Bbk-Proteine aus dem Satz zellulärer Proteine des korrekten ungefähren Molekulargewichts zu immunpräzipitieren. Solche Antikörper können beispielsweise gegen Polypeptide erzeugt werden, die nach der Sequenz bzw. Untersequenzen der in 2 gezeigten Sequenz synthetisiert wurden. Alternativ können die Antikörper gegen Fusionsproteine erzeugt werden, welche Bbk-Sequenzen sowie die anderer Proteine enthalten. Nach der Immunpräzipitation können die Bbk-Proteine von den Antikörpern gelöst werden, um eine im Wesentlichen reine Präparation von Bbk-Protein zu erhalten.
Die bbk-DNA-Kodierungssequenzen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Bbk-Antisense-RNA-Gensequenzen zu erhalten, insofern als die Antisense-RNA-Sequenz der auf dem gegenüber liegenden Strang des die mRNA des Peptidkerns transkribierenden Strangs entspricht. Die Antisense-DNA-Strang kann auch mit einem Promotor in einem Expressionsvektor funktionell verknüpft sein, so dass eine Transformation mit diesem Vektor einen Wirt ergibt, der eine Bbk-Antisense-RNA in der transformierten Zelle exprimieren kann. Antisense-RNA und ihre Expression können verwendet werden, um mit einer endogenen bbk-DNA oder -RNA auf eine Weise zu interagieren, welche die Transkription oder Translation der bbk-Gene auf hochspezifische Weise hemmt oder reprimiert. Die Verwendung von Antisense-RNA-Sonden zur Blockierung der Genexpression ist beispielsweise beschrieben in Lichtenstein, C., Nature 333: 801–802 (1988).
Identifizierung, Charakterisierung und Verwendung von Bbk-Fragmentzusammensetzungen umfassend die Bbk-BH3-Domäne Es wurde eine neuartige Domäne in dem Bbk-Molekül identifiziert, die sowohl notwendig als auch ausreichend für die bekannten biologischen Aktivitäten von Bbk zu sein scheint. Diese Domäne, hierin als die „Bbk-BH3-Domäne" bezeichnet, ist ausreichend, um die Zelltötungsfunktion zu vermitteln und könnte für die physikalische Interaktion mit Bak ausreichend sein. Es wurde gezeigt, dass Mutationen von Sequenzen der Bbk-BH3-Domäne die apoptotische Aktivität des Bbk-Proteins in Rat1-Fibroblastenzellen verringern. Diese Experimente belegen, dass die Bbk-BH3-Domäne für die Zelltötung und die Bak-Bindungsaktivitäten des Bbk-Proteins erforderlich ist. Diese Beobachtungen legen nahe, dass Bbk die Apoptose durch einen Mechanismus, der die Bbk-BH3-Domäne beinhaltet, moduliert bzw. reguliert. Wie ein mit der vorliegenden Erfindung vertrauter Fachmann zu schätzen weiß, sind Sequenzen, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, für die Modulierung von Apoptose in Zellen geeignet sind. Entsprechend sind Verbindungen und Zusammensetzungen, die an die Bbk-BH3-Domäne binden können, als Mittel für die Modulierung apoptotischer Aktivität in Zellen geeignet.
Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „Bbk-BH3-Domäne" eine Proteindomäne, die erstmals in Bbk identifiziert wurde, die sich hierin als für die Interaktion von Bbk mit Bak und für die Zelltötungsfunktion von Bbk entscheidend erwiesen hat, und Peptide und/oder Moleküle, die ihre Struktur und/oder Funktion nachahmen können. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Peptid mit der folgenden Aminosäuresequenz:
welche den Aminosäureresten 125–137 von Bbk entspricht, sowie funktionelle Äquivalente davon. Mit „funktionelles Äquivalent" ist ein Peptid gemeint, das eine biologische Aktivität oder ein immunologisches Kennzeichen besitzt, welches im Wesentlichen denen der Bbk-BH3-Domäne entspricht, und soll „Fragmente", „Varianten", „Analoge", „Homologe" oder „chemische Derivate" umfassen, die solche Aktivität oder Kennzeichen besitzen. Funktionelle Äquivalente der Bbk-BH3-Domäne können dann eine nicht-identische Aminosäuresequenz teilen, und es sind konservative oder nicht-konservative Aminosäuresubstitutionen konventioneller oder unkonventioneller Aminosäuren möglich.
Wenn hierin auf eine „konservative" Aminosäuresubstitution Bezug genommen wird, ist damit die Austauschbarkeit von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten gemeint. Beispielsweise bilden Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin eine Gruppe von Aminosäuren mit aliphatischen Seitenketten: Serin und Threonin sind Aminosäuren mit aliphatisch-hydroxylischen Seitenketten; Asparagin und Glutamin sind Aminosäuren mit amidhaltigen Seitenketten; Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan sind Aminosäuren mit aromatischen Seitenketten; Lysin, Arginin und Histidin sind Aminosäuren mit basischen Seitenketten, Asparagin- und Glutaminsäure sind Aminosäuren mit sauren Seitenketten und Cystein und Methionin sind Aminosäuren mit schwefelhaltigen Seitenketten. Der Austausch einer Aminosäure aus einer bestimmten Gruppe durch eine Aminosäure aus derselben Gruppe würde als konservative Substitution gelten. Bevorzugte konservative Substitutionsgruppen umfassen Asparagin-Glutamin, Alanin-Valin, Lysin-Arginin, Phenylalanin-Tyrosin und Valin-Leucin-Isoleucin.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung sind Peptide mit folgender Aminosäuresequenz bereitgestellt:
die Alaninpunktmutationen wie in 9 gezeigt entsprechen und ebenfalls signifikante Bbk-Zelltötungsfunktion aufweisen. Nur die hierin beschriebene Bbk-BH3-Domäne ist sowohl an der Zelltötung durch als auch an der Bak-Bindungsaktivität von Bbk beteiligt.
Die funktionelle Bedeutung der Bbk-BH3-Domäne steht wahrscheinlich in Zusammenhang mit ihrer Fähigkeit, mindestens eine Protein/Protein-Interaktion mit anderen Bcl-2-Familienmitgliedern oder mit mindestens einem, noch unidentifizierten zellulären Protein zu vermitteln. Die vorliegenden Erfinder möchten nicht an eine bestimmte Theorie gebunden sein; unabhängig von ihrem/ihren Wirkmechanismus/mechanismen ist die Bbk-BH3-Domäne von Bbk jedoch von zentraler Bedeutung für die Vermittlung dieser Protein/Protein-Interaktionen.
Mittel, die die von der Bbk-BH3-Domäne vermittelten Protein/Protein-Interaktionen modulieren können, können Peptide umfassen, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, sowie Mutanten der Bbk-BH3-Domäne oder von Proteinen, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen. Eine „Mutante", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz, die sich von der des natürlich vorkommenden Peptids oder Proteins um mindestens eine Aminosäure unterscheidet. Mutanten können dieselbe biologische und immunologische Aktivität wie das natürliche vorkommende Peptid mit der Bbk-BH3-Domäne oder das natürlich vorkommende Protein aufweisen. Mutanten können jedoch eine andere oder keine biologische oder immunologische Aktivität aufweisen. Beispielsweise kann eine Mutante der Bbk-BH3-Domäne die biologische Aktivität, welche das natürlich vorkommende Peptid mit der Bbk-BH3-Domäne kennzeichnet, nicht aufweisen, aber als Antigen zur Erzeugung von Antikörpern gegen die Bbk-BH3-Domäne oder für die Feststellung oder Reinigung von Antikörpern gegen die Bbk-BH3-Domäne oder als Agonist (kompetitiv oder nicht-kompetitiv), Antagonist oder partieller Agonist der Funktion des natürlich vorkommenden Peptids mit der Bbk-BH3-Domäne geeignet sein.
Die Modulierung von durch die Bbk-BH3-Domäne vermittelten Protein/Protein-Interaktionen kann auch durch Agonisten oder Antagonisten von Peptiden mit der Bbk-BH3-Domäne ausgeübt werden. Das Durchsuchen von Peptidbibliotheken, Verbindungsbibliotheken und anderen Datenbanken zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten der Funktion von Proteinen, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, wird anhand von Assays zur Feststellung der Fähigkeit potenzieller Agonisten oder Antagonisten zur Hemmung oder Unterstützung der Bindung der Bbk-BH3-Domäne, z. B. einer Homodimerisierung oder Heterodimerisierung der Bbk-BH3-Domäne, erreicht.
Beispielsweise können Screeningassays mit hohem Durchsatz verwendet werden, um Verbindungen zu identifizieren, die die Proteinbindungsfunktion der Bbk-BH3-Domäne modulieren. Solche Screeningassays ermöglichen die Identifizierung von Verbindungen, welche die Apoptose beschleunigen oder hemmen, indem sie die von der Bbk-BH3-Domäne vermittelten Protein/Protein-Interaktionen beeinflussen. Ein In-vitro-Screeningassay auf Verbindungen, welche die Interaktion der Bbk-BH3-Domäne mit Bak stören, umfasst beispielsweise Platten mit mehreren Vertiefungen, die mit Bak beschichtet sind und mit einer markierten Peptidsonde mit Bbk-BH3-Domäne in Gegenwart mindestens einer zu testenden Verbindung inkubiert werden. Moleküle, welche die Interaktion spezifisch stören, könnten prinzipiell entweder die „Liganden-" oder die „Rezeptor"-Domäne für die Bbk-BH3-Domäne in Bak binden. Beide Verbindungsklassen wären ein Kandidatenmittel zur Modulierung von Apoptose.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Screening hinsichtlich eines Apoptose-modulierenden Mittels bereit, welches das Beschichten einer Platte mit mehreren Vertiefungen mit Bak und das Inkubieren der beschichteten Platte mit mehreren Vertiefungen mit einer markierten Peptidsonde mit Bbk-BH3-Domäne in Gegenwart eines zu testenden Mittels bereitstellt, wobei die Störung der Interaktion der Bbk-BH3-Domäne mit Bak anzeigt, dass das Mittel zur Modulierung der Apoptose fähig ist. Mittel, die anhand dieses Verfahrens identifiziert werden, werden gleichfalls als Ausführungsformen der Erfindung in Betracht gezogen.
Geeignete Marker umfassen einen erfassbaren Marker wie beispielsweise ein Enzym, ein radioaktives Isotop, eine Fluoreszenzverbindung, eine Chemilumineszenzverbindung oder eine Biolumineszenzverbindung. Ein durchschnittlicher Fachmann kennt weitere geeignete Marker bzw. ist in der Lage, solche mithilfe einer Routineversuchsaufstellung zu bestimmen. Darüber hinaus wird die Bindung dieser Marker an die Peptid mithilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Standardtechniken erreicht.
Für die schnelle Suche nach Mitteln, welche direkt an die Bbk-BH3-Domäne binden, können immobilisierte oder „markierte" (tagged) kombinatorische Bibliotheken verwendet werden. Mittel, die spezifisch an solche Bibliotheken binden, sind Kandidaten, die hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Blockierung von Bbk/Bak-Interaktionen zu testen sind. Wie oben erläutert, können solche Mittel als Suppressoren der Apoptose fungieren, indem sie entweder die Funktion von Bbk (und/oder von Bbk/Bak) direkt hemmen oder die effektive Aktivität von endogenem Bcl-2 (oder einem anderen Mitglied der Bcl-2-Familie) erhöhen. Solche Mittel wären zur Unterdrückung einer fälschlicherweise stattfindenden Apoptose bei degenerativen Erkrankungen oder nach ischämischer Verletzung geeignet.
Antikörper gegen die erfindungsgemäßen Peptide mit Bbk-BH3-Domäne können zum Durchsuchen von cDNA-Expressionsbibliotheken verwendet werden, um Klone zu identifizieren, die cDNA-Inserts enthalten, welche strukturell verwandte immunologisch kreuzreagierende Proteine kodieren, die Mitglieder der Familie von Proteinen mit Bbk-BH3-Domäne sein könnten. Das Screening von cDNA- und mRNA-Expressionsbibliotheken ist aus dem Stand der Technik bekannt. Entsprechend werden Antikörper gegen Peptide mit der Bbk-BH3-Domäne verwendet, um mit dieser Domäne verwandte immunologisch kreuzreagierende Proteine zu identifizieren oder zu reinigen oder um die Anzahl an Proteinen, welche die Bbk-BH3-Domäne enthalten, in einer Zelle oder in einer Zellpopulation zu bestimmen, beispielsweise in aus einem Patienten erhaltenem Gewebe oder Zellen, wie beispielsweise Lymphozyten. Bekannte Verfahren für solche Messungen umfassen die Immunpräzipitation von Zellextrakten, gefolgt von PAGE, In-situ-Detektion durch immunhistochemische Verfahren und ELISA-Verfahren, die alle aus dem Stand der Technik bekannt sind.
Die erfindungsgemäße Modulierung der Apoptose umfasst Verfahren, die spezifische Antisense-Polynukleotide anwenden, welche gegen alle oder einen Teil der Nukleotidsequenzen komplementär sind, welche Proteine kodieren, die die hierin beschriebene Bbk-BH3-Domäne aufweisen. Solche komplementären Antisense-Polynukleotide können Nukleotidadditionen, -deletionen, -substitutionen und -transpositionen aufweisen, vorausgesetzt, dass eine spezifische Hybridisierung mit der Zielsequenz vorliegt. Als erfindungsgemäße komplementäre Antisense-Polynukleotide werden lösliche Antisense-RNA oder DNA-Oligonukleotide in Betracht gezogen, die spezifisch mit mRNA-Arten hybridisieren können, die Proteine kodieren, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen und die die Transkription der mRNA-Spezies und/oder die Translation des kodierten Polypeptids verhindern. Die Produktion von Proteinen, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, wird durch die erfindungsgemäßen Antisense-Polynukleotide gehemmt, und solche Antisense- Polynukleotide können Apoptose, Alterung und dergleichen hemmen und/oder den transformierten Phänotyp von Zellen umkehren. Zur Produktion von Antisense-Polynukleotiden in einer transfizierten oder transgenen Zelle kann eine heterologe Expressionskassette verwendet werden. Antisense-Polynukleotide können auch als lösliche Oligonukleotide der äußeren Umgebung der Zielzelle, beispielsweise dem Kulturmedium von Zellen in vitro oder der Interstitialflüssigkeit (z. B. über den Blutkreislauf) in vivo, zugegeben werden. Antisense-Polynukleotide und deren Gebrauch sind einem Fachmann bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Melton, D. A., Hrsg., Antisense RNA and DNA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988).
Die vorhergesagte biologische Aktivität von Mittel, die erfindungsgemäß identifiziert werden, variiert je nach den Annahmen, die in Bezug auf den Mechanismus der Bbk/Bak-Funktion gemacht werden. Ein Mittel, das eng an die Bbk-BH3-Domäne bindet, würde beispielsweise voraussichtlich die Funktion von Bbk (und vielleicht von Bbk/Bak) hemmen. Angenommen, Bbk (und/oder Bbk/Bak) ist das aktive Zelltodregulierende Molekül, könnte ein Mittel, das eng an die Bbk-BH3-Domäne bindet, die Bbk-Funktion hemmen. Solche Mittel könnten daher unter Bedingungen, bei denen Bbk apoptotische Wirkung gezeigt hat, anti-apoptotische Aktivität aufweisen. Mittel in dieser Klasse könnten zur Behandlung von Krankheiten geeignet sein, die durch übermäßigen oder unangebrachten Zelltod gekennzeichnet sind, einschließlich beispielsweise bei neurodegenerativen Krankheiten und Verletzungen infolge einer Ischämie.
Peptidomimetika von Peptiden mit Bbk-BH3-Domäne werden von der vorliegenden Erfindung ebenfalls bereitgestellt und können als Wirkstoffe für die Modulierung von Apoptose wirken, indem sie beispielsweise die Funktion von Proteinen blockieren, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, oder in Interaktionen eingreifen, die von der Bbk-BH3-Domäne vermittelt werden. Zu den Peptidomimetika gehören in der pharmazeutischen Industrie gemeinhin Nicht-Peptid-Wirkstoffe mit Eigenschaften, die analog zu denen der nachgeahmten Peptide sind. Die Prinzipien und Praktiken des Designs von Peptidomimetika sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise beschrieben in Fauchere, J., Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); und Evans et al., J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Peptidomimetika mit ähnlicher Struktur wie therapeutisch nützliche Peptide können verwendet werden, um einen äquivalenten therapeutischen oder prophylaktischen Effekt zu produzieren. Bei solchen Peptidomimetika ist typischerweise mindestens eine Peptidverknüpfung gegebenenfalls durch eine Verknüpfung ersetzt, die wünschenswerte Eigenschaften, wie beispielsweise Resistenz gegenüber chemischem Abbau in vivo, verleiht. Solche Verknüpfungen umfassen -CH₂NH-, -CH₂S-, -CH₂-CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO-. Peptidomimetika können erweiterte pharmakologische Eigenschaften aufweisen (längere biologische Halbwertszeit, höhere Absorptionsraten, etc.), unterschiedliche Spezifität, erhöhte Stabilität, Produktionswirtschaftlichkeit, geringere Antigenität und dergleichen, was ihre Verwendung als Therapeutika besonders wünschenswert macht.
Die Immunisierung von Tieren mit Peptiden, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, allein oder in Verbindung mit Adjuvanzien durch bekannte Verfahren kann Antikörper hervorbringen, die für das Peptid mit Bbk-BH3-Domäne spezifisch sind. Für diesen Zweck kann Antiserum verwendet werden, das durch konventionelle Verfahren erhalten wird. Beispielsweise kann ein Säugetier, beispielsweise ein Kaninchen, mit einem Peptid immunisiert werden, welches die Bbk-BH3-Domäne aufweist, wodurch die Bildung polyklonaler Antikörper dagegen induziert wird. Anhand bekannter Verfahren können auch monoklonale Antikörper erzeugt werden. Solche Antikörper können erfindungsgemäß verwendet werden, um das Vorhandensein und die Menge an Peptiden festzustellen, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Peptide mit Bbk-BH3-Domäne können für die Feststellung von Bbk und anderen Proteinen mithilfe von Standardassays einschließlich Radioimmunassays und Enzymimmunassays verwendet werden.
Ein Fachmann weiß zu schätzen, dass die präzise chemische Struktur von Peptiden, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, in Abhängigkeit von einer Reihe von Faktoren variiert. Beispielsweise kann ein bestimmtes Protein als saures oder basisches Salz oder in neutraler Form erhalten werden, da in dem Molekül Carboxyl- und Aminogruppen vorhanden sind. Für den Zweck der Erfindung soll deshalb jede Form der Peptide, welche die Bbk-BH3-Domäne aufweisen, welche die therapeutische oder diagnostische Aktivität des natürlich vorkommenden Peptids beibehält, im Umfang der vorliegenden Erfindung liegen.
Der Begriff „im Wesentlichen homolog" wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit einer ersten Bbk kodierenden DNA-Sequenz, mit einer zweiten das Vorgenannte kodierenden DNA-Sequenz unter stringenten Bedingungen, beispielsweise bei etwa 0,1 × Natriumcitrat-Natriumchlorid-Puffer (SSC) bei einer Temperatur von etwa 65°C, zu hybridisieren. Der Begriff „im Wesentlichen rein" bedeutet, dass das Protein bzw. relevante Molekül im Wesentlichen frei von etwaigen anderen erfassbaren biologischen Bestandteilen ist. Ein „Fragment" eines Moleküls wie Bbk soll sich auf jede Variante des Moleküls beziehen, welche die biologische Aktivität des Bbk-Proteins besitzt. Eine „Variante" eines Moleküls soll sich auf ein Molekül beziehen, dessen Struktur und biologische Aktivität oder immunologischen Kennzeichen im Wesentlichen denen des gesamten Moleküls oder eines Fragments davon gleichen. Vorausgesetzt, dass zwei Moleküle eine ähnliche Aktivität besitzen, gelten sie demnach als Variante, da dieser Begriff hierin verwendet wird, selbst wenn die Zusammensetzung oder die sekundäre, tertiäre oder quaternäre Struktur eines der Moleküle nicht identisch zu der des anderen Moleküls ist oder wenn die Sequenz von Aminosäureresten nicht identisch ist. Ein „Analog" eines Moleküls soll sich auf ein Molekül beziehen, das eine im Wesentlichen ähnliche Funktion wie das gesamte Molekül oder ein Fragment davon aufweist. Wie hierin verwendet, gilt ein Molekül als „chemisches Derivat" eines anderen Moleküls, wenn es weitere chemische Einheiten enthält, die normalerweise kein Teil des Moleküls sind. Solche Einheiten können die Löslichkeit, Absorption, biologische Halbwertszeit, etc. des Moleküls verbessern. Die Einheiten können alternativ die Toxizität des Moleküls vermindern, etwaige unerwünschte Nebenwirkungen des Moleküls beseitigen oder abschwächen, etc. Einheiten, die solche Effekte vermitteln können, sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) beschrieben. Verfahren zum Koppeln solcher Einheiten an ein Molekül sind aus dem Stand der Technik bekannt. Mit dem Begriff „modulieren" sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung die Induktion von Apoptose durch die Verabreichung des erfindungsgemäßen Bbk-Proteins, eines aktiven Fragmentes davon, eines funktionellen Äquivalentes davon und/oder die Suppression oder Induktion von Apoptose durch die Verabreichung eines Bbk-Hybrids oder einer Bbk-Mutante oder die Verabreichung eines Vektors, der eine cDNA enthält, welcher eines der vorgenannten kodiert, an die jeweiligen Zellen eines Individuums gemeint, das an einer degenerativen Erkrankung leidet, welche zu unangebrachtem Zellwachstum führt, einschließlich beispielsweise Lymphome, genotypische Tumoren, Krebs oder Erkrankungen, die durch unangebrachten Zelltod gekennzeichnet sind, einschließlich beispielsweise AIDS, welches zum Tod von T-Zellen führt, um unangebrachte Zellproliferation oder unangebrachten Zelltod zu stabilisieren und vorzugsweise das normale Zellverhalten wiederherzustellen.
Mit dem Begriff „Verabreichung" soll jede Art von Verabreichung gemeint sein, die zur Abgabe des therapeutischen Mittels durch die Zellmembran und in die gewünschte Zelle führt. Der Verabreichungsort und die Zellen werden von einem durchschnittlichen Fachmann auf Basis eines Verständnisses der jeweils behandelten degenerativen Erkrankung ausgewählt.
Darüber hinaus lassen sich Dosierung, Dosishäufigkeit und Länge der Behandlungsdauer bestimmen und von einem durchschnittlichen Fachmann je nach der jeweils behandelten degenerativen Erkrankung optimieren. Auch die jeweilige Verabreichungsart kann von einem durchschnittlichen Fachmann leicht ausgewählt werden und umfasst beispielsweise eine orale, intravenöse, subkutane, intramuskuläre, etc. Verabreichung, wobei eine Voraussetzung ist, dass das therapeutische Mittel die Zellmembran durchquert. Das therapeutische Mittel der vorliegenden Erfindung können das Bbk-Protein und/oder funktionelle Äquivalente davon und/oder Bbk-Hybride oder Bbk-Mutanten und/oder ein Vektor sein, der cDNA enthält, welche das vorgenannte kodiert. Mit dem Begriff „therapeutisches Mittel" sollen das vorliegende Bbk-Protein, Fragmente, funktionelle Äquivalente und/oder Hybride oder Mutanten sowie Vektoren gemeint sein, die cDNA enthalten, welche das vorgenannte kodiert. Das vorliegende therapeutische Mittel kann allein oder in Kombination mit und/oder gleichzeitig mit anderen geeigneten Wirkstoffen und/oder Therapiezyklen verabreicht werden. Mit dem Begriff „degenerative Erkrankung" ist für die Zwecke dieser Erfindung jede Erkrankung gemeint, die durch eine unangebrachte Zellproliferation oder unangebrachten Zelltod oder in manchen Fällen beides gekennzeichnet ist. Mit dem Begriff „unangebrachte Zellproliferation" soll ein statistisch signifikanter Anstieg der Zellzahl im Vergleich zur Proliferation des jeweiligen Zelltyps in der normalen Population gemeint sein. Eingeschlossen sind auch Erkrankungen, bei denen eine Zelle an einem unangebrachten Ort vorhanden ist und/oder persistiert, z. B. das Vorhandensein von Fibroblasten in Lungengewebe nach einer akuten Lungenverletzung. Solche Zellen umfassen beispielsweise Krebszellen, welche die Eigenschaften einer Invasion und Metastasierung aufweisen und sehr anaplastisch sind. Solche Zellen umfassen unter anderem Krebszellen, einschließlich beispielsweise Tumorzellen. Mit dem Begriff „unangebrachter Zelltod" soll ein statistisch signifikanter Rückgang der Zellzahl im Vergleich zum Vorhandensein des jeweiligen Zelltyps in der Normalpopulation gemeint sein. Eine solche Unterrepräsentation kann auf eine bestimmte degenerative Erkrankung zurückführbar sein, beispielsweise AIDS (HIV), welches zu einem unangebrachten Tod von T-Zellen führt, Autoimmunkrankheiten, die durch unangebrachtem Zelltod gekennzeichnet sind. Mit dem Begriff „Autoimmunkrankheiten" soll eine Erkrankung gemeint sein, die von einer gegen Selbstantigene gerichteten Immunreaktion verursacht wird. Solche Krankheiten sind vom Vorhandensein zirkulierender Autoantikörper oder zellvermittelter Immunität gegen Autoantigene in Verbindung mit von immunologisch kompetenten Zellen oder Immunkomplexen in die Autoantigene enthaltenden Geweben gekennzeichnet. Systemischer Lupus erythematodes (SLE), rheumatoide Arthritis gehören zu solchen Krankheiten.
Mit dem Begriff „Suppression" soll für die Zwecke dieser Erfindung das Ergebnis gemeint sein, das durch Verabreichung einer Menge eines therapeutischen Mittels, das Bbk-Hybride oder Bbk-Mutanten davon enthält und wirksam ist, um die Apoptose in einem Individuum zu unterdrücken, das an einer von unangebrachtem Zelltod gekennzeichneten degenerativen Erkrankung leidet, erzielt wird. Eine Suppression der Apoptose wird erreicht, wenn die Zahl des jeweils betroffenen Zelltyps stabil bleibt oder sich die Zahl auf ein Niveau innerhalb des in der normalen Zellpopulation beobachteten Bereichs erhöht. Mit dem Begriff „stabil" ist der Zustand gemeint, wenn in dem behandelten Individuum im Vergleich zu der Zellzahl zu Beginn des Behandlungszyklus keine statistisch signifikante Verringerung der Zellnummer mehr beobachtet wird. Mit dem Begriff „Induktion" ist für die Zwecke der Erfindung das Ergebnis gemeint, welches erreicht wird durch Verabreichung einer Menge eines das erfindungsgemäße Bbk enthaltenden, therapeutischen Agens, die wirksam ist, um in Zellen eines Individuums, das an einer degenerativen Krankheit leidet, welche durch unangebrachte Zellproliferation gekennzeichnet ist, Apoptose zu induzieren. Die Induktion von Apoptose ist erreicht, wenn die Zellzahl stabil bleibt oder sich auf ein Niveau innerhalb des in der normalen Zellpopulation beobachteten Bereichs verringert. Ein durchschnittlicher Fachmann kann leicht bestimmen, ob die Induktion der Apoptose erreicht worden ist.
Mit dem Begriff „Bbk-Hybrid" sind für die Zwecke der Erfindung Proteine gemeint, bei denen es sich um Hybridproteine der vorliegenden Bbk-Proteine, Fragmente davon und/oder funktioneller Äquivalente und Mutanten davon mit anderen Apoptoseassoziierten Proteinen, die von Genen wie beispielsweise einschließlich Bcl-2, Bax, c-myc, LMW5-HL, Bbk, Bcl-x_L, Bcl-x_S, BHRF-1, Mcl-1, A1 und ced9 kodiert werden, Fragmenten davon und/oder funktionellen Äquivalenten davon handelt, um ein Protein zu produzieren, welches eine verstärkte, verminderte oder mittelmäßige Apoptoseinduktions- oder -suppressionsaktivität im Vergleich zu der Aktivität von Bbk alleine aufweist. Solche Hybride können beispielsweise durch Fusionieren der ersten Hälfte der Kodierungsregion der bbk-cDNA mit der zweiten Hälfte der Kodierungsregion der cDNA für blc-2 oder bax oder bcl-x_L oder bcl-x_S oder umgekehrt hergestellt werden. Darüber hinaus können durch Hinzufügen oder Ersetzen von Segmenten von bcl-2, bax, bcl-x_L oder bcl-x_S zu der bbk-cDNA chimäre Genprodukte von therapeutischem Wert hergestellt werden. Ein durchschnittlicher Fachmann kann solche Hybride anhand von aus dem Stand der Technik bekannten Techniken leicht herstellen und anwenden. Ein durchschnittlicher Fachmann kann unter Verwendung von bekannten Screening-Verfahren und wie hierin beschrieben leicht feststellen, ob ein bestimmtes Hybrid verstärkte, verminderte oder mittelmäßige Apoptoseinduktions- oder -suppressionsaktivität aufweist. Mit dem Begriff „normales Zellverhalten" sollen für die Zwecke dieser Erfindung Zellen gemeint sein, deren Apoptose normal abläuft. Normales Zellverhalten wird in einem Organismus beobachtet, der alte, geschädigte oder anomale Zellen entfernen kann, welche die Organfunktion beeinträchtigen oder sich zu Tumoren entwickeln könnten. Eine normal ablaufende Apoptose gibt eine koordinierte zelluläre Reaktion auf schädliche Reize wieder, die nicht unmittelbar letal sind.
Mit dem Begriff „Patient" oder „Individuum" sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung Tiere, einschließlich Menschen und Säugetiere, gemeint, die an einer degenerativen Krankheit leiden. Mit dem Begriff „Bbk-Mutante" ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung eine Mutante von Bbk gemeint, welche aufgrund der Substitution mindestens einer Aminosäure oder korrespondierender Nukleotide die umgekehrte Aktivität (Suppression der Apoptose) des erfindungsgemäßen Bbk-Proteins aufweist. Mit dem Begriff „Apoptose-assoziiertes Bbk-Protein" sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sowohl das isolierte, natürlich vorkommende als auch das isolierte, rekombinante, hergestellte Protein (d. h. synthetisches Bbk) gemeint, die unter anderem die Apoptose von menschlichem Gewebe induzieren, beispielsweise von Tumorzellen und etablierten menschlichen Zelllinien, und von Geweben anderer Tiere, einschließlich von Säugetieren. Dieser Begriff umfasst jedes Analog, Homolog, jede Mutante oder jedes Derivat von isoliertem, natürlich vorkommendem Bbk, einschließlich Fragmenten mit weniger als der natürlich vorkommenden Anzahl von Aminosäuren, wie beispielsweise partielle Fragmente von natürlichem oder synthetischem Bbk, welche die biologischen oder immunologischen Kennzeichen des in dieser Anmeldung beschriebenen Polypeptids behalten. Dieser Begriff umfasst auch jedes Peptid, das die Sequenz eines isolierten, natürlich vorkommenden Bbk-Proteins enthält, oder ein Analog oder Homolog davon, zusammen mit mindestens einer flankierenden Aminosäure, welche die biologischen oder immunologischen Kennzeichen des erfindungsgemäßen Bbk-Proteins behalten.
Konstruktion und Identifikation von Antikörpern, die gegen Bbk, funktionelle Äquivalente, Fragmente, Hybride oder Mutanten davon erzeugt werden
In der folgenden Beschreibung wird auf verschiedene Methoden Bezug genommen, die einem Fachmann aus dem Fachgebiet Immunologie gut bekannt sind. Zu den Standardbezugsarbeiten, welche die allgemeinen Prinzipien der Immunologie ausführen, gehören die Arbeit von Catty, D., Antibodies. A Practical Approach, Vol. I, IRL Press, Washington, DC (1988); Klein, J., Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, New York (1982); Kennett, et al., Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses. Plenum Press, New York (1980); Campbell, A., Monoclonal Antibody Technology" in: Burdon, R., et al., Hrsg., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13. Elsevier, Amsterdam (1984); und Eisen, H. N., In: Davis, B. D., et al., Hrsg., Microbiology, 3. Auflage, Harper & Row, Philadelphia (1980).
Ein Antikörper gilt als „fähig zur Bindung" eines Moleküls, wenn er mit dem Molekül spezifisch reagiert, um dadurch das Molekül an den Antikörper zu binden. Der Begriff „Epitop" soll sich auf den Anteil eines Haptens beziehen, der von einem Antikörper erkannt und gebunden werden kann. Ein Antigen kann ein Epitop oder mehr als ein Epitop aufweisen. Ein „Antigen" kann in einem Tier die Produktion eines Antikörpers induzieren, der an ein Epitop dieses Antigens binden kann. Die spezifische Reaktion, auf die oben Bezug genommen wird, soll anzeigen, dass das Antigen auf hoch selektive Art mit seinem entsprechenden Antikörper und nicht mit der Vielzahl anderer Antikörper, die von anderen Antigenen hervorgerufen werden können, reagiert.
Der Begriff „Antikörper" (Ab) oder „monoklonaler Antikörper" (Mab), wie hierin verwendet, soll intakte Moleküle sowie Fragmente davon (wie beispielsweise Fab- und F(ab)2-Fragmente, einschließen, die ein Antigen binden können. Fab- und F(ab)₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment eines intakten Antikörpers, sie werden schneller aus der Zirkulation entfernt und weisen unter Umständen eine weniger unspezifische Gewebebindung als der intakte Antikörper auf (Wahl, et al., J. Nucl. Med. 24: 16–325 (1983)).
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung weisen Spezifität für mindestens ein Epitop auf dem Bbk-Peptid oder einen Idiotyp auf dem vorliegenden Bbk auf. Die erfindungsgemäßen Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, vorausgesetzt, dass sie mit dem vorliegenden Bbk-Polypeptid oder Fragment davon als das Immunogen erzeugt sind. Beide dieser Arten von Antikörpern können in den hierin beschriebenen Anwendungen verwendet werden.
Die vorliegenden Antikörper können verwendet werden, um das Vorhandensein des Bbk-Proteins in einer menschlichen Gewebeprobe zu erfassen. Das vorliegende Bbk-Protein lässt sich durch Kontaktierung der Probe mit einer für die Bildgebung effektiven Menge des vorliegenden, erfassbar markierten, geeigneten Antikörpers und Erfassung der Markierung feststellen, wodurch das Vorhandensein des Bbk-Proteins in der Probe ermittelt wird. Die Erfassung lässt sich durch In-vivo-Bildgebung durchführen. Das Bbk-Protein kann auch durch bekannte Immunassaytechniken unter Verwendung geeigneter Antikörper nach der Erfindung erfasst werden, einschließlich beispielsweise RIA, ELISA, etc.
Die Antikörper der vorliegenden Erfindung werden durch ein Beliebiges aus verschiedenen bekannten Verfahren hergestellt. Beispielsweise können Zellen, die das Bbk-Protein exprimieren, an ein Tier verabreicht werden, um die Produktion von Serum zu induzieren, das polyklonale Antikörper enthält, die das Bbk-Protein binden können. Beispielsweise werden das Bbk-Protein oder ein Fragment davon chemisch synthetisiert und durch HPLC gereinigt, um sie im Wesentlichen von Verunreinigungen zu befreien. Eine solche Präparation wird dann in ein Tier eingeführt, um polyklonale Antiseren hoher spezifischer Aktivität zu erzeugen.
Polyklonale Antikörper können in jedem geeigneten Tier erzeugt werden, einschließlich beispielsweise in Mäusen, Kaninchen oder Ziegen. Das immunogene Bbk-Peptid oder ein Fragment davon können selbst oder mit geeigneten immunaktivierenden Trägerstoffen wie beispielsweise Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) verabreicht werden. Siehe Catty, D., Hrsg. Antibodies. A Practical Handbook, Band I und II, IRL Press, Washington, DC (1988).
Monoklonale Antikörper können auf verschiedene Weise unter Anwendung von Techniken hergestellt werden, die einem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können monoklonale Antikörper mithilfe der Hybridomatechnologie hergestellt werden (Koehler, et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hämmerling, et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier, N. Y., S. 563–681 (1981)); Roger H. Kennett, et al., Hrsg. Monoclonal Antibodies – Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis. Plenum Press (1980). Im Allgemeinen umfassen solche Verfahren das Immunisieren eines Tieres mit dem vorliegenden Bbk-Protein oder einem Fragment davon. Die Splenozyten solcher Tiere werden extrahiert und mit einer geeigneten Myelomzelllinie fusioniert. Nach der vorliegenden Erfindung kann jede geeignete Myelomzelllinie verwendet werden. Nach der Fusion werden die resultierenden Hybridomzellen selektiv in HAT-Medium gehalten und anschließend durch serielle Verdünnung (Limiting Dilution) kloniert, wie beschrieben von Wands, et al., Gastroenterol. 80: 225–232 (1981). Die durch eine solche Selektion erhaltenen Hybridomzellen werden dann getestet, um Klone zu identifizieren, die Antikörper sezernieren, welche das Bbk-Protein binden können.
Durch die Anwendung der oben beschriebenen Verfahren lassen sich weitere Zelllinien erhalten, die Antikörper produzieren können, welche Epitope des vorliegenden Bbk-Proteins erkennen.
Es lassen sich beispielsweise weitere Hybridomas produzieren und mit minimalem Screening isolieren, die monoklonale Antikörper produzieren, welche die Feststellung des vorliegenden Bbk-Proteins ermöglichen. Hybridomas, die monoklonale Antikörper produzieren, welche für Epitope spezifisch sind, die auf dem vorliegenden Bbk-Protein vorhanden sind, werden am effektivsten produziert, indem zuerst ein Tier, aus dem Hybridomas produziert werden können, wie beispielsweise eine Balb/c-Maus, mit einer ersten subkutanen Injektion von Freund-Adjuvans immunisiert wird, gefolgt von Booster-Injektionen innerhalb einiger Tage. Die Fusion kann mithilfe einer beliebigen Technik durchgeführt werden, die einem durchschnittlichen Fachmann üblicherweise bekannt ist. Das Screening von Hybridomas, um zu bestimmen, welche davon monoklonale Antikörper produzieren, die für das vorliegende Peptid spezifisch sind, ist geradlinig und kann in einem ELISA- oder RIA-Standardformat erfolgen. In einem RIA-Screeningformat werden beispielsweise der Kulturüberstand oder Aszitesflüssigkeit aus einem monoklonalen Antikörper produzierenden Hybridoma mit ¹²⁵I-Peptid umgesetzt. Die Isolierung weiterer Hybdridomas, die mAbs derselben Spezifität wie der hierin beschriebenen sezernieren, kann durch die Technik des Screenings auf Anti-Idiotypen erfolgen. Potocmjak, et al., Science 215: 1637 (1982). Ein Anti-Idiotyp(Anti-Id-Antikörper)-Antikörper ist, in Kürze, ein Antikörper, der eine spezielle Determinante erkennt, die allgemein mit der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers assoziiert ist. Ein Id-Antikörper kann erzeugt werden, indem ein Tier derselben Spezies und desselben genetischen Typs (z. B. Mausstamm) als Herkunft des mAb mit dem gegen das vorliegende Bbk-Protein oder ein Fragment davon, für das ein Anti-Id hergestellt wird, erzeugten mAb immunisiert wird. Das immunisierte Tier erkennt und reagiert auf die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers, indem es einen Antikörper gegen diese idiotypischen Determinanten (den Anti-Id-Antikörper) produziert.
Durch Verwendung eines Anti-Id-Antikörpers, der für idiotypische Determinanten auf einem bestimmten mAb gerichtet ist, ist es dann möglich, andere B-Zell- oder Hybridomklone mit dem gleichen Idiotyp zu identifizieren. Die Idiotypidentität zwischen dem Antikörperprodukt von zwei Klonen macht es hoch wahrscheinlich, dass die Antikörperprodukte der beiden Klone dieselben Antigenepitope erkennen.
Der Anti-Id-Antikörper kann auch als „Immunogen" verwendet werden, um eine Immunreaktion in einem anderen Tier zu induzieren, das einen so genannten Anti-Anti-Id-Antikörper produziert. Der Anti-Anti-Id kann vom Epitop her identisch mit dem ursprünglichen Antikörper sein, der den Anti-Id induziert hat.
Durch Verwendung von Antikörpern gegen die idiotypischen Determinanten eines mAb ist es also möglich, andere Klone zu identifizieren, die Antikörper identischer Spezifität exprimieren.
Entsprechend können mAb gegen das vorliegende Bbk-Protein verwendet werden, um Anti-Id-Antikörper in geeigneten Tieren, wie beispielsweise in BALG/c-Mäusen zu induzieren. Milzzellen von solchen immunisierten Mäusen werden verwendet, um Anti-Id-Hybridome zu produzieren, die Anti-Id-mAbs sezernieren. Darüber hinaus können die Anti-Id-MAbs an einen Träger wie beispielsweise Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) gekoppelt und zur Immunisierung weiterer BALG/c-Mäuse verwendet werden. Seren dieser Mäuse enthalten Anti-Anti-Id-Antikörper, die die Bindungseigenschaften des für das Antigenepitop spezifischen ursprünglichen mAb aufweisen. Die Anti-Id-mAbs haben daher ihre eigenen idiotypischen Epitope bzw. „Idiotope", die strukturelle Ähnlichkeit mit dem untersuchten Epitop aufweisen.
Zur Replikation können die Hybridomzellen dieser Erfindung in vitro oder in vivo kultiviert werden. Aufgrund der Ausbildung hoher Titer von mAbs ist die In-vivo-Produktion das gegenwärtig bevorzugte Herstellungsverfahren. Zellen der einzelnen Hybridomas werden, in Kürze, intraperitoneal in Pristan-geprimte BALB/c-Mäuse injiziert, um Aszitesflüssigkeit zu produzieren, die hohe Konzentrationen der gewünschten mAbs enthält. Aus solchen Aszitesflüssigkeiten oder aus Kulturüberständen können unter Anwendung von einem Fachmann gut bekannten Säulenchromatographieverfahren mAbs des Isotyps IgM oder IgG gereinigt werden.
Von besonderem Interesse für die vorliegende Erfindung sind Antikörper, die in Menschen produziert werden oder mittels Rekombinations- oder sonstiger Technologie derart „humanisiert" (d. h. im Menschen nicht-immunogen) sind, dass sie im Menschen nicht antigen sind oder für längere Zeit im zirkulierenden Serum eines Empfängers bleiben.
Humanisierte Antikörper (d. h. chimäre Antikörper) können beispielsweise hergestellt werden, indem ein immunogener Anteil eines Antikörpers durch einen entsprechenden, aber nicht-immunogenen Anteil ersetzt wird ((Robinson, et al., Internationale Patentveröffentlichung PCT/US86/02269 ; Akira, et al., Europäische Patentanmeldung 184,187 ; Taniguchi, M., Europäische Patentanmeldung 171,496 ; Morrison, et al., Europäische Patentanmeldung 173,494 ; Neuberger, et al., PCT-Anmeldung WO 86/01533 , Cabilly, et al., Europäische Patentanmeldung 125,023 ; Retter, et al., Science 240: 1041–1043 (1988): Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439–3443 (1987); Liu, et al., J. Immunol. 139: 3521–3526 (1987): Sun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218 (1987); Nishimura, et al., Canc. Res. 47: 999–1005 (1987): Wood, et al., Nature 314: 446–449 (1985)); Shaw, et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553–1559 (1988). Allgemeine Übersichten „humanisierter" chimärer Antikörper geben Morrison, S. L. (Science. 229: 1202–1207 (1985)) und Oi, et al., BioTechniques 4: 214 (1986).
Alternativ können geeignete „humanisierte" Antikörper erzeugt werden, wie beschrieben von Jones, et al., Nature 321: 552–525 (1986); Verhoeyan, et al., Science 234: 1534 (1988) und Beidler, et al., J. Immunol. 141: 4053–4060 (1988).
Das vorliegende Bbk-Protein, Fragmente davon, Hybride davon, Bbk-Mutanten oder Antikörpers dagegen können in Immunassays für die Feststellung des Bbk-Proteins in einer menschlichen Gewebeprobe verwendet werden. Antikörper gegen das vorliegende Bbk-Protein können beispielsweise verwendet werden, um das vorliegende Bbk-Protein in einer menschlichen Gewebeprobe festzustellen. Die Immunassays können kompetitiv oder in der Art eines „Sandwich" sein, wie ansonsten gut bekannt ist, und beruhen alle auf der Bildung eines Antikörper-Antigen-Immunkomplexes. Diese Assays sind einem Fachmann gut bekannt.
Für die Zwecke der Assays können der Antikörper oder das Antigen immobilisiert oder markiert werden. Es gibt viele Träger, an die der Antikörper/das Antigen zur Immobilisierung gebunden und die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Gut bekannte Träger umfassen unter anderem Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Zellulosen, Polyacrylamide, Agarosen und Magnetit. Für die Zwecke der Erfindung können die Träger bis zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich sein. Ein Fachmann kennt viele weitere geeignete Träger für die Bindung des Antikörpers oder des Antigens bzw. ist in der Lage, solche mithilfe von Routineexperimentierung festzustellen.
Je nach der jeweiligen Ausführungsform der Erfindung werden mindestens einer bzw. eines der Antikörper oder Antigenpeptide mit einem erfassbaren Marker wie beispielsweise einem Enzym, einem radioaktiven Isotop, einer fluoreszierenden Verbindung, einer chemilumineszierenden Verbindung oder einer biolumineszierenden Verbindung gekoppelt.
Ein durchschnittlicher Fachmann kennt weitere geeignete Marker zur Bindung an die Antikörper oder das/die Antigenpeptid(e) bzw. ist in der Lage, solche mithilfe von Routineexperimentierung festzustellen. Darüber hinaus kann die Bindung dieser Marker an die Antikörper oder das Antigen bzw. die Antigene mittels Standardtechniken erfolgen, die einem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind.
Die Antikörper oder das/die Antigenpeptid(e) können an ein Enzym gebunden werden. Wenn dieses Enzym später seinem Substrat ausgesetzt wird, reagiert es wiederum derart mit dem Substrat, um eine chemische Einheit zu produzieren, die sich beispielsweise spektrophotometrisch oder fluorometrisch nachweisen lässt. Beispiele von Enzymen, die zur erfassbaren Markierung verwendet werden können, sind Amylatdehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, Delta-5-steroidisomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, α-Glycerophosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glukoseoxidase, β-Galaktosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glukose-6-phosphatdehydrogenase, Glukoamylase und Acetylcholinesterase.
Das Vorhandensein eines Antikörpers oder Antigens kann auch durch Markierung des Antikörpers oder Antigens mit einem radioaktiven Isotop festgestellt werden. Das Vorhandensein des radioaktiven Isotops kann durch solche Mittel mit der Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers bestimmt werden. Besonders geeignete Isotope sind ³H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁴⁷Co, ⁵⁰Fe, ⁷⁵Se und ¹⁵²Eu.
Es ist möglich, das Vorhandensein des Antikörpers oder Antigens zu erfassen, indem der Antikörper oder das Antigenpeptid mit einer fluoreszierenden Verbindung markiert werden. Wenn der floureszierend markierte Antikörper oder das floureszierend markierte Antigenpeptid Licht der richtigen Wellenlänge ausgesetzt sind, lässt sich ihr Vorhandensein dann aufgrund der Fluoreszenz des Farbstoffs feststellen. Zu den gängigsten fluoreszierend markierten Verbindungen zählen Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthaldehyd und Fluorescamin.
Eine andere Möglichkeit zur erfassbaren Markierung des Antikörpers oder Antigens ist durch Kopplung an eine chemilumineszierende Verbindung. Das Vorhandensein des chemilumineszierend markierten Antikörpers oder Antigenpeptids wird dann erfasst, indem das Vorhandensein von Lumineszenz bestimmt wird, die im Verlauf einer chemischen Reaktion entsteht. Beispiele besonders geeignete chemilumineszierender Markierungsverbindungen Luminol, Isoluminol, aromatischer Acridiniumester, Imidaxol, Acridiniumsalz und Oxalatester.
Entsprechend kann auch eine biolumineszierende Verbindung verwendet werden, um den Antikörper oder das Antigenpeptid zu markieren. Biolumineszenz ist eine spezielle Art von Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen vorkommt und bei der katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Das Vorhandensein eines biolumineszierenden Bindungspartners würde durch Feststellung von Lumineszenz bestimmt. Wichtige biolumineszierende Verbindungen für Markierungszwecke sind Luziferin, Luziferase und Aquorin.
Der Antikörper oder das bzw. die Antigenpeptid(e) zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Assay sind ideal für die Zubereitung eines Kits geeignet. Ein solches Kit kann ein Trägermittel aufweisen, das kompartimentalisiert ist, um in enger Beschränkung mindestens ein Behältermittel wie beispielsweise Fläschchen, Röhrchen und dergleichen aufzunehmen, wobei jedes Behältermittel eines der separaten Elemente zur Verwendung in dem Verfahren aufweist.
Beispielsweise kann eines der Behältermittel einen ersten Antikörper aufweisen, der an einen unlöslichen oder teilweise löslichen Träger gebunden ist. Ein zweiter Behälter kann einen löslichen, erfassbar markierten sekundären Antikörper in lyophylisierter Form oder in Lösung aufweisen. Das Trägermit tel kann auch ein drittes Behältermittel enthalten, welches einen erfassbar markierten dritten Antikörper in lyophylisierter Form oder in Lösung aufweist. Ein solches Kit kann für Sandwich-Assays verwendet werden.
Darüber hinaus kann das Trägermittel auch mehrere Behälter enthalten, von denen jeder verschiedene, vorbestimmte Mengen des vorliegenden Bbk-Peptids aufweist. Diese Behälter kann dann verwendet werden, um eine Standardkurve zu erstellen, die zur Interpolation der Ergebnisse verwendet werden kann, welche von der Probe, die die unbekannte Menge des vorliegenden Bbk-Proteins enthält, erhalten wird.
Bildung kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. In-vitro-Bildgebung lässt sich mit den oben erwähnten Markern durchführen. In-vivo-Bildgebung erfolgt mit diagnostisch effektiven, markierten Antikörpern. Der Begriff „diagnostisch effektiv" bedeutet, dass die verabreichte Menge an erfassbar markiertem Antikörper ausreichend ist, um im Vergleich zu einem Hintergrundsignal festzustellen, an welchem Ort das Bbk-Protein vorhanden ist.
Die Dosierung von erfassbar markiertem Antikörper oder Antigen(en) für die Diagnose variiert je nach Gesichtspunkten wie Alter, Zustand, Geschlecht und Ausmaß der Krankheit bei dem Patienten, Gegenindikationen, falls vorhanden, und anderen Variablen, um von dem einzelnen Arzt angepasst zu werden. Die Dosierung kann von 0,01 mg/kg bis 2000 mg/kg variieren, vorzugsweise von 0,1 mg/kg bis 1000 mg/kg.
Der Begriff „diagnostisch markiert" bedeutet, dass ein diagnostisch erfassbarer Marker an dem Antikörper befestigt ist.
Es gibt viele verschiedene Bildgebungsmarker und Markierungsverfahren, die einem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind. Beispiele der Arten von Markern, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen radioaktive Isotope und paramagnetische Isotope.
Für die diagnostische In-vivo-Bildgebung ist die Art der verfügbaren Erfassungsvorrichtung ein Hauptfaktor bei der Auswahl eines bestimmten Radionuklids. Das gewählte Radionuklid muss eine Art von Zerfall aufweisen, die für die jeweilige Art von Vorrichtung erfassbar ist. Generell kann jedes herkömmliche Verfahren zur Visualisierung diagnostischer Bildgebung erfindungsgemäß angewandt werden.
Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Auswahl eines Radionuklids für die In-vivo-Diagnose ist, dass die Halbwertszeit eines Radionuklids lang genug sein muss, dass es zum Zeitpunkt der maximalen Aufnahme durch das Ziel noch erfassbar ist, aber kurz genug sein muss, so dass die schädliche Strahlung auf den Wirt minimiert wird. Idealerweise fehlt einem Radionuklid, das bei der In-vivo-Bildgebung verwendet wird, eine bestimmte Emission, es produziert aber eine große Zahl von Photonen im Bereich 140–200 keV, was mit herkömmlichen Gammakameras leicht erfassbar ist.
Für die In-vivo-Diagnose können Radionuklide entweder direkt oder indirekt mithilfe einer intermediären funktionellen Gruppe an einen Antikörper oder ein Antigen gebunden werden. Intermediäre funktionelle Gruppen, die häufig verwendet werden, um Radioisotope, die als Metallionen vorliegen, an einen Antikörper oder ein Antigen zu binden, sind Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) und Ethlendiamintetraessigsäure (EDTA). Typische Beispiele von Metallionen, die an Immunglobuline gebunden werden können, sind ^99mTC, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁷²As, ⁸⁹Zr und ²⁰¹Tl.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Antikörper können für die Zwecke der In-vivo-Diagnose auch mit paramagnetischen Isotopen markiert werden. Elemente, die in dieser Hinsicht besonders geeignet sind (wie bei Magnetreso nanzbildgebungstechniken (MRT-Techniken)) umfassen ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr und ⁵⁶Fe.
Präparationen der Bildgebungsantikörper zur Verabreichung umfassen sterile wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele nicht-wässriger Lösungsmittel sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, Pflanzenöl wie Olivenöl und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösung und gepufferte Medien, parenterale Vehikel einschließlich Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat oder fixierte Öle. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoffnachfülllösungen, Elektrolyt-Nachfülllösungen wie beispielsweise die auf Ringer-Dextrose-Basis und dergleichen. Es können auch Konservierungsmittel und sonstige Zusatzstoffe vorhanden sein, wie beispielsweise Antibiotika, Antioxidanzien, Chelatbildner und inerte Gase und dergleichen. Siehe Remington's Pharmaceutical Science. 16. Auflage, Mac Hrsg. 1980.
Natürlich ist das exprimierte Bbk-Protein ein intrazelluläres Protein. Entsprechend ist einem Fachmann bekannt, dass diagnostische und therapeutische In-vivo-Verfahren, welche die erfindungsgemäßen Antikörper verwenden, gewisse Mechanismen erfordern könnten, mit denen solche Antikörper Bbk in der Zelle erfassen können. Ein solches Verfahren ist es, die Antikörper oder Fragmente davon durch die Zellmembran in die Zelle selbst einzuführen. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem der Antikörper an einem Liganden befestigt wird, für den die Zielzelle Rezeptorstellen enthält. Der Antikörper kann damit zusammen mit dem Liganden in die Zellmembran bzw. durch die Zellmembran transportiert werden. Geeignete Liganden umfassen Wachstumsfaktoren und Zytokine, die nach Rezeptorbindung internalisiert werden. Zu den geeigneten Wachstumsfaktoren gehören der epidermale Wachstumsfaktor (EGF), Tumorwachstumsfaktor alpha (TGF-α), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), Insulin und die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren 1 und 2 (IGF-1 und IGF-2). Geeignete Zytokine umfassen G-CSF, GM-CSF, Erythropoietin, IL-1 und IL-2. Es gibt auch Rezeptoren, die Nährstoffe und Vitamine in die Zelle transportieren. Diese Nährstoffe sind für die Verwendung als Liganden in der vorliegenden Erfindung geeignet und umfassen Folat, Dihydrofolat, Tetrahydrofolat und Vitamin-B12.
Die Wahl eines Trägerliganden richtet sich nach mehreren Faktoren, wie einem Fachmann bekannt ist. Zu diesen gehören beispielsweise die Kinetik des Liganden und seines Rezeptors und des Transportes allgemein, der passiv oder aktiv sein kann, wobei aktiv transportierte Liganden bevorzugt sind. Die Mittel zum Befestigen des Antikörpers an dem Liganden variieren ebenfalls innerhalb von Grenzen und können beispielsweise kovalent oder ionisch sein, wobei zu berücksichtigen ist, dass eine solche Befestigung die Ligand-Rezeptor-Affinität nicht auf unakzeptable Art und Weise verändern darf.
Zu den Beispielen von Rezeptoren, die für eine solche Anwendung geeignet sind, gehören der Rezeptor für das Low-Density-Lipoprotein (LDL), der alle für die Rezeptorendozytose erforderlichen Informationen enthält, Davis, et al., J. Cell Biol. 107(6/3): Abstr. Nr. 3112 (1988) sowie bekannte gehirnspezifische Rezeptoren wie beispielsweise die für Dopamin. Diesbezüglich wird geschätzt, wenn der Ligand selbst ein für den Rezeptor spezifische(r)(s) Antikörper bzw. Fragment wäre, an die der erfindungsgemäße Antikörper konjugiert sein kann.
Ein Fachmann dürfte es besonders wünschenswert finden, Antikörperfragmente der Erfindung (wie beispielsweise Fab- oder F(ab)₂-Fragmente) anzuwenden, bei denen eine geringere Wahrscheinlichkeit besteht, dass sie in die Ligand-Rezeptor-Interaktion eingreifen, und die leichter durch die Zellmembran transportiert werden. Einzelkettige Antikörper können sich aus diesen und anderen Gründen als wünschenswert erweisen, wie ein Fachmann anerkennen wird.
Wenn ein Antikörper wie oben beschrieben in die Membran einer Zelle oder in die Zelle transportiert werden soll, ist es bevorzugt, den Antikörper derart diagnostisch oder therapeutisch zu markieren, dass der Marker relativ effektiver ist, wenn der Antikörper an seine antigene Stelle auf dem Bbk-Protein gebunden ist. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem ein Marker verwendet wird, der als Ergebnis der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes aktiv oder erfassbar wird. Alternativ kann der Antikörper selbst derart markiert werden, dass die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes eine Konformationsänderung in dem Antikörper induziert, um den zuvor nicht exponierten oder weniger vollständig exponierten Marker vollständiger zu exponieren. Alle obigen Kriterien und weitere sind für einen Fachmann, der diese Aspekte der Erfindung ausführt, offensichtlich.
Es ist außerdem möglich, Liposomen zu verwenden, welche die Antikörper der vorliegenden Erfindung in ihren Membranen aufweisen, um die Antikörper spezifisch an den Zielbereich abzugeben. Diese Liposomen können derart hergestellt sein, dass sie, abgesehen von dem Antikörper, solche therapeutischen Mittel wie Wirkstoffe, Radioisotope, Lektine und Toxine enthalten, die am Zielort wirksam sind.
PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine therapeutisch wirksame Menge des vorliegenden Bbk-Proteins, funktionelle Äquivalente, Fragmente und/oder Hybride und/oder Mutanten davon enthalten, sowie Vektoren, die eine cDNA enthalten, welche mindestens eines der Vorangehenden kodiert, sind geeignet, um Patienten zu behandeln, die an degenerativen Erkrankungen leiden, welche durch unangebrachten Zelltod oder unangebrachte Zellproliferation gekennzeichnet sind.
Hybride von Bbk umfassen Hybride von Bbk und beispielsweise Bcl-2, Bcl-x_L, Bcl-x_S, Bax, Mcl-1, c-myc, LMW5-HL, BHRF-1, Bak, Bik und A1. Solche Hybride weisen im Vergleich zu der Aktivität von Bbk alleine verstärkte, verminderte oder intermediäre Apoptoseinduktions- oder -suppressionsaktivität auf. Diese Hybride können von einem durchschnittlichen Fachmann einfach ausgewählt, hergestellt und angewandt werden. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten daher eine therapeutisch wirksame Menge des vorliegenden Bbk-Proteins, funktionelle Äquivalente, Fragmente und/oder Hybride und/oder Mutanten davon, und können gegebenenfalls mindestens einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und/oder Exzipienten enthalten, die einem durchschnittlichen Fachmann bekannt sind. Verabreichung, Dosierung und Häufigkeit und Länge des Behandlungszyklus können von einem durchschnittlichen Fachmann für einen bestimmten Patienten einfach optimiert werden. Beispielsweise kann die vorliegende pharmazeutische Zusammensetzung als sterile wässrige oder nicht-wässrige Suspension oder Emulsion formuliert sein, wie oben beschrieben, beispielsweise für Lösungen für die intravenöse Verabreichung.
THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN
Der programmierte Zelltod ist ein Vorgang, bei dem Zellen während der normalen Entwicklung von gesunden Geweben und Organen eine Kondensierung und Fragmentierung des Zellkerns durchlaufen. Der Vorgang ist entscheidend, um das Gleichgewicht zwischen dem Wachstum neuer Zellen und der Beseitigung alter Zellen aufrecht zu erhalten. Wenn die Apoptose nicht richtig funktioniert, entweder indem Zellen veranlasst werden, vorzeitig zu sterben, oder indem verhindert wird, dass sie planmäßig sterben, entwickeln sich verschiedene Krankheiten.
Das vorliegende Apoptose-assoziierte Bbk-Protein, funktionelle Äquivalente, Fragmente und/oder Hybride und/oder Mutanten davon sowie Vektoren, die eine cDNA enthalten, welche die Vorangehenden kodiert, sind für die Behandlung degenerativer Erkrankungen geeignet, welche durch unangebrachten Zelltod oder unangebrachte Zellproliferation gekennzeichnet sind. Bei bestimmten Erkrankungen können verschiedene Zelltypen betroffen sein, wobei es wünschenswert sein kann, die Apoptose in einem Zelltyp zu induzieren, während die Apoptose in einem anderen Zelltyp unterdrückt wird. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, bei Patienten, die an einer akuten Lungenverletzung leiden, die Apoptose in Lungengewebezellen zu unterdrücken, indem die erfindungsgemäße Bbk-Proteinmutante verabreicht wird (oder indem die Expression einer solchen Bbk-Proteinmutante in solchen Zellen herbeigeführt wird), während die Apoptose in Fibroblastenzellen, die in der Lunge aufgrund der entzündlichen Reaktion vorhanden sein könnten, durch Verabreichung des erfindungsgemäßen Bbk-Proteins induziert wird (oder indem die Expression des Bbk-Proteins in solchen Zellen herbeigeführt wird).
Die therapeutischen Mittel der vorliegenden Erfindung können wie oben erläutert unter der Maßgabe verabreicht werden, dass das Mittel die Zellmembran passiert. Das therapeutische Mittel kann alleine, in Kombination mit oder während des Behandlungszyklus mit anderen aus dem Stand der Technik für die Behandlung einer bestimmten Krankheit bekannten, annehmbaren Therapien verabreicht werden. Beispielsweise kann das vorliegende therapeutische Mittel verabreicht werden, um Apoptose in einem Krebspatienten zu induzieren, der auch einer klassischen Krebstherapie unterzogen wird, einschließlich beispielsweise Bestrahlungstherapie, Chemotherapie und Behandlung mit Antikrebsmedikamenten, einschließlich beispielsweise Topoisomeraseinhibitoren, alkylierenden Mitteln, Antimetaboliten und Hormonantagonisten. Darüber hinaus können die vorliegenden therapeutischen Mittel auch gleichzeitig mit einer Gentherapie verabreicht werden. Beispielsweise können die vorliegenden therapeutischen Mittel einem Patienten verabreicht werden, der an einer degenerativen Erkrankung des Zentralnervensystems leidet, während der Patient begleitend einer Gentherapie unterzogen wird, um neurotrophe Hormone nachzuliefern.
Eine verfrühte verbreitete Apoptose (unangebrachter Zelltod) verursacht viele der Schäden, die mit degenerativen Erkrankungen, einschließlich beispielsweise AIDS, Chemotherapie und Bestrahlung und Gewebeatrophie, assoziiert sind. Bei AIDS-Patienten werden Lymphozyten sogar in der asymptomatischen Phase der HIV-Infektion aktiviert, und solche Zellen sterben vorzeitig durch Apoptose. Solche Erkrankungen könnten die Behandlung durch Verabreichung einer Bbk-Proteinmutante zulassen.
Ein Fachmann wird begrüßen, dass die Verabreichung der verschiedenen erfindungsgemäßen Proteine an bestimmte Zielzellen oder Gewebe, wie hierin beschrieben, die Verabreichung der Proteine selbst, wie auch die Expression der Nukleotidsequenzen, welche diese Proteine kodieren, durch die Zielzellen oder -gewebe durch verschiedene bekannte Mittel und nach den Lehrern der vorliegenden Beschreibung umfassen soll.
Degenerative Erkrankungen, die durch unangebrachte Zellproliferation gekennzeichnet sind, umfassen Krebs, Autoimmunerkrankungen, Gewebehypertrophie und entzündliche Erkrankungen, einschließlich Entzündung infolge einer akuten Gewebeverletzung, einschließlich beispielsweise einer akuten Lungenverletzung. Diese Erkrankungen können durch Verabreichen des vorliegenden Bbk-Proteins oder eines Funktionsäquivalents behandelt werden.
Karzinome entstehen, wenn Veränderungen in der DNA die anomale Akkumulierung von Zellen verursachen. Die relative Rate von Zellteilung und Zelltod bestimmt, wie schnell ein Karzinom wächst. Manche Karzinomzellen teilen sich langsamer als normale Zellen, aber aufgrund der verlängerten Lebensdauer der Zelle wird das Karzinom dennoch größer. Die Apoptose ist ein effizientes Verfahren zur Prävention einer malignen Transformation, da sie Zellen mit genetischen Läsionen entfernt. Eine defekte Apoptose kann die Entwicklung von Krebs fördern, zum einen, weil die Akkumulierung sich teilender Zellen zugelassen wird, und zum anderen, weil die Entfernung genetischer Varianten mit verstärktem malignem Potenzial behindert wird. Die vorliegenden therapeutischen Mittel, einschließlich des vorliegenden Bbk-Proteins, funktioneller Äquivalente, Fragmente und Hybride davon, sowie Vektoren, die eine cDNA enthalten, welche mindestens eines der Vorangehenden kodiert, können an Krebspatienten verabreicht werden, um Apoptose zu induzieren.
Durch Verabreichung der vorliegenden therapeutischen Mittel lassen sich viele Arten von Krebs behandeln, einschließlich beispielsweise Karzinome, Sarkome und Leukämie/Lymphome, einschließlich beispielsweise Karzinome wie Adenokarzinome, Plattenzellkarzinome, Karzinome der Organe, einschließlich Brust, Kolon, Kopf, Hals, etc.; Sarkome einschließlich Chondrosarkom, Melanosarkom, etc.; und Leukämie und Lymphome, einschließlich akuter lymphatische Leukämie, akuter myelogener Leukämie, Non-Hodgkin-Lymphom, Burkitt-Lymphom, B-Zelllymphom, T-Zelllymphom, etc. Sonstige Zustände, die einer Behandlung mit dem vorliegenden therapeutischen Mittel zugänglich sind, umfassen Pilzinfektionen.
Die vorliegenden therapeutischen Mittel können verwendet werden, um Autoimmunerkrankungen zu behandeln. Lebenslang können zufällige Genrekombination und somatische Hypermutation potenziell autoreaktive T- und B-Lymphozyten hervorbringen. Unter normalen Bedingungen sterben unreife Lymphozyten, die Autoantigene binden, durch Apoptose. Ein Defekt in der Deletion dieser Lymphozyten schafft jedoch eine Veranlagung für Autoimmunität.
Die vorliegenden therapeutischen Mittel können an Patienten, die an Autoimmunerkrankungen leiden, verabreicht werden, um Apoptose in autoreaktiven T-Lymphozyten zu induzieren, beispielsweise bei Patienten, die an systemischem Lupus erythematodes leiden. Zu den sonstigen Autoimmunerkrankungen, die für eine Behandlung durch Suppression oder Induktion von Apoptose durch die Verabreichung der vorliegenden therapeutischen Mittel zugänglich sind, gehören beispielsweise rheumatoide Arthritis, Myasthenia gravis, Morbus Basedow, Hashimoto-Thyreoiditis, insulinresistenter Diabetes, allergische Rhinitis, Asthma, funktionelle autonome Anomalien, juveniler insulinabhängiger Diabetes, Morbus Addison, idiopathischer Hypoparathyreoidismus, spontane Infantilität, vorzeitige Ovarialinsuffizienz, Pemphigus, bullöses Pemphigoid, primäre biliäre Zirrhose, autoimmune hämolytische Anämie, idiopathische thrombozytopenische Purpura, idiopathische Neutropenie, Goodpasture-Syndrom, rheumatoide Arthritis und Sjögren-Syndrom.
Die vorliegenden therapeutischen Mittel können verwendet werden, um eine Entzündung infolge einer akuten Lungenverletzung durch Induktion von Apoptose zu behandeln. Der Krankheitsprozess beginnt mit einer explosiven entzündlichen Reaktion in der Alveolenwand. Im Anschluss an die resultierende Gewebezerstörung folgt eine umfangreiche Fibroproliferation des alveolären Luftraums, bestehend aus Fibroblasten, Kapillaren und deren Bindegewebeprodukten. Fukuda, Y., et al., Am. J. Pathol. 126: 171–182 (1987). Ein wichtiger Mechanismus für die systematische Eliminierung der Vorstehenden ist die Apoptose, d. h. der programmierte Zelltod.
Die vorliegenden therapeutischen Mittel können auch verwendet werden, um degenerative Erkrankungen infolge von vorzeitigem oder exzessivem Zellverlust während des Alterns zu behandeln, der zu Organfunktionsstörungen und Krankheit führen kann. Solche degenerativen Erkrankungen umfassen degenerative Erkrankungen des Zentralnervensystems infolge des Alterns oder anderer Faktoren, die zum Tod von Neuronen führen. Die vorliegenden therapeutischen Mittel, die eine Bbk-Proteinmutante oder Hybride davon enthalten, können einem Patienten verabreicht werden, der an einer solchen degenerativen Erkrankung leidet, um Apoptose zu unterdrücken. Darüber hinaus können die vorliegenden therapeutischen Mittel begleitend zu einer Gentherapie verabreicht werden, um Gene bereitzustellen, die neurotrophe Hormone, einschließlich beispielsweise eines Nervenwachstumsfaktors, kodieren. Zu den sonstigen Zuständen, die für eine Behandlung unter Verwendung der vorliegenden therapeutischen Mittel zugänglich sind, gehört beispielsweise die Alzheimer-Krankheit.
Ein durchschnittlicher Fachmann kann leicht weitere degenerative Erkrankungen identifizieren, die durch unangebrachten Zelltod oder unangebrachte Zellproliferation oder beide gekennzeichnet und für eine Behandlung unter Verwendung der vorliegenden therapeutischen Mittel zugänglich sind. Die vorliegenden therapeutischen Mittel können das Bbk-Protein selbst sowie Fragmente, funktionelle Äquivalente und/oder Hybride und/oder Mutanten davon umfassen, die an eine Zielzelle verabreicht werden. Alternativ können erfindungsgemäße therapeutische Mittel verabreicht werden, indem die Zielzelle mit einem Vektor infiziert wird, der eine cDNA enthält, die mindestens eines der Vorstehenden kodiert. Die vorliegenden therapeutischen Mittel können wie unten erläutert an die gewünschte Zielzelle verabreicht werden, beispielsweise, indem ein Rezeptor auf der Oberfläche der Zielzelle gewählt wird, der für diesen Zelltyp spezifisch ist. Die vorliegenden therapeutischen Mittel können alleine oder in Kombination mit anderen annehmbaren Wirkstofftherapien verabreicht werden. Darüber hinaus können die vorliegenden therapeutischen Mittel begleitend zu anderen annehmbaren Therapien verabreicht werden, welche für die jeweilige behandelte degenerative Erkrankung spezifisch sind. Beispielsweise können die vorliegenden therapeutischen Mittel begleitend mit Chemotherapeutika, einer Gentherapie oder dergleichen verabreicht werden. Unabhängig davon, ob es sich um das Bbk-Protein selbst oder einen Vektor handelt, der das Protein kodiert, muss das therapeutische Mittel die Zellmembran durchqueren.
Ein Verfahren zum Einführen des Bbk-Proteins oder von Fragmenten davon in die Membran einer Zelle oder in die Zelle selbst ist, das Protein an einem Liganden anzubringen, für den die Zielzelle Rezeptorstellen enthält. Das Protein kann so zusammen mit dem Liganden in die Zellmembran oder durch die Zellmembran transportiert werden.
Die Wahl eines Trägerliganden richtet sich nach mehreren Faktoren, wie hierin erläutert und einem Fachmann bekannt ist. Zu den geeigneten gewebespezifischen Rezeptoren gehören: Gehirn: Nervenwachstumsfaktorrezeptor (NGF-R); Brust: Prolaktinrezeptor; Magen: Gastrinrezeptor; Haut: der Rezeptor des Melanozyten-stimulierenden Hormons (MSH-R); Leber. Asialoglykoproteinrezeptor; Schilddrüse: der Rezeptor des Thyreoidea-stimulierenden Hormons (TSH-R); Eierstöcke: der Rezeptor des luteinisierenden Hormons (LH-R); Hoden: der Rezeptor des humanen chorionischen Gonadotropins (hCG-R); T-Zellen: T-Zellrezeptoren: 3-Zellen: CD19; Lunge: Hyaluronatrezeptor, CD44-Isoform 4 V (J. Cell. Biol. 124, 7182, 1994). Diesbezüglich wird geschätzt, dass der Ligand möglicherweise ein für den Rezeptor spezifischer Antikörper oder ein spezifisches Fragment ist, an den bzw. das das erfindungsgemäße Bbk-Protein konjugiert werden kann.
Es könnte wünschenswert sein, aktive erfindungsgemäße Bbk-Fragmente zu verwenden, bei denen die Wahrscheinlichkeit geringer ist, dass sie in die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor eingreifen, und die leichter durch die Zellmembran transportiert werden.
Wenn ein Protein durch die Membran einer Zelle oder in die Zelle transportiert werden soll, wie oben beschrieben, und es sich bei dem Liganden um einen Antikörper handelt, ist es bevorzugt, das Protein diagnostisch oder therapeutisch derart zu markieren, dass der Marker verhältnismäßig effektiver ist, wenn das Protein gebunden ist, beispielsweise durch Mittel, die zu den hierein in Kontext mit dem Antikörpertransport Beschriebenen analog sind,
Es ist auch möglich, Liposomen zu verwenden, die die Proteine der vorliegenden Erfindung in ihrer Membran aufweisen, um das vorliegende Bbk-Protein spezifisch zu dem Zielbereich zu bringen. Diese Liposomen können derart hergestellt werden, dass sie, abgesehen von dem Bbk-Protein, solche therapeutischen Mittel wie Wirkstoffe, Radioisotope, Lektine und Toxine enthalten, die am Zielort freigesetzt werden würden.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Verabreichen der Nukleotidsequenzen, die Bbk kodieren (und deren funktioneller Äquivalente und/oder Hybride und/oder Mutanten) für diagnostische und therapeutische Zwecke ist die Verwendung viraler Vektoren. Zu den geeigneten viralen Vektoren für den Gentransfer gehören Retroviren (zur Übersicht siehe Miller, et al., Methods Enzymol. 217: 581–599 (1993)), einschließlich des humanen Immundefizienzvirus (HIV), Adenovirusderivate (für Beispiele siehe Erzurum, et al., Nucleic Acids Res. 21: 1607–12 (1993); Zahner, et al., Nat. Genet. 6: 75–83 (1994); Davidson, et al., Nat. Genet. 3: 219–223 (1993)), des adenoassoziierten Virus (AAV) (d. h. siehe Flotte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10613–7 (1993)) und Herpesvirus-Vektoren (d. h. siehe Anderson. et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13: 503–15 (1993)). Ein durchschnittlicher Fachmann kann leicht weitere geeignete Viren auswählen und anwenden. Zu den sonstigen Verfahren zur Verabreichung von DNA gehört der liposomenvermittelte Gentransfer (Alton, et al., Nat. Gen. 5: 135–42 (1993): Nabel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11307–11 (1993)).
Auch die Verwendung viraler Vektoren für die Einführung von Genen in Säugetierzellen wird im Überblick betrachtet, beispielsweise in Varmus, Science 240 (4858): 1427 (1988); Eglitis et al., BioTechniques 6, 7: 608 (1988); Jaenisch, Science 240 (4858): 1468 (1988); und Bernstein et al., Genet. Eng. (N. Y.) 7: 235 (1985).
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann es bevorzugt sein, ein abgeschwächtes (attenuiertes) Virus bzw. einen abgeschwächten Retrovirusstamm zu verwenden. Somit ist es beispielsweise möglich, Retroviren, die abgeschwächte Zytopathie aufweisen, als Vektoren für die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen zu verwenden, wie beispielsweise HIV-2_ST (Kong et al., Science 240 (4858): 1525 (1988)) oder HIV-2_UCI (Evans et al., Science 240 (4858): 1523 (1988)), die über einen CD4-unabhängigen Mechanismus in neurale Zellen gelangen (Funke et al., J. Exp. Med. 165: 1230 (1987)). Die Neurobiologie von HIV-Infektionen ist beispielsweise beschrieben in Johnson et al., FASEB J. 2 (14): 2970 (1988). Ein Fachmann kann durch Ausübung von Routinefertigkeiten gegen verschiedene Zellpopulationen mit bekannter Anfälligkeit für Viren vorgehen. Beispielsweise ist bekannt, dass CD4 im menschlichen Gehirn eine Transkriptvariante aufweist, deren Gehalt im Vorderhirn am höchsten ist (Maddon et al., Cell 47: 333 (1986)). Mögliche Verfahren, deren Ziel die Expression retroviraler Gene in spezifischen Zelltypen ist, sind als Übersicht von Boris-Lawrie und H. Temin Curr. Opin. Genet. Dev. Vol. 3, S. 102–9 (1993) beschrieben.
Idealerweise trifft dann der Fachmann die Wahl eines Genverabreichungssystems, wobei die Ziele eines effizienten und stabilen Gentransfers mit einem angemessenen Maß an Genexpression auf dem Gewebe entsprechende Weise und ohne Nebenwirkungen zu berücksichtigen sind. Siehe beispielsweise Wolff et al., Rheum. Dis. Clin. North Am. 14 (2): 459 (1988). Was die gezielte Verabreichung an ein Zentralnervensystem anbelangt, bieten viele virale Vektoren, einschließlich HIV, den Vorteil, in der Lage zu sein, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren (Johnson et al., FASEB J. 2 (14): 2970 (1988)).
DIAGNOSTISCHE ANWENDUNGEN
Antikörper, die gegen das vorliegende Bbk-Protein, Fragmente, funktionelle Äquivalente oder Hybride oder Mutanten davon erzeugt wurden, können verwendet werden, um das Bbk-Protein in einer menschlichen Gewebeprobe festzustellen und um degenerative Erkrankungen zu diagnostizieren, die mit der Expression des Bbk-Proteins assoziiert sind. Des Weiteren können solche Antikörper verwendet werden, um das Fortschreiten degenerativer Erkrankungen, die mit der Expression des Bbk-Proteins assoziiert sind, zu überwachen.
Für die Anwendung bei den diagnostischen Tests in der vorliegenden Erfindung sind menschliche Zellen jeglicher Herkunft geeignet. Die Zellen können aus jedem menschlichen Gewebe isoliert werden, einschließlich beispielsweise Herz, Lunge, Tumorzellen, Gehirn, Plazenta, Leber, Skelettmuskel, Niere und Bauchspeicheldrüse. Die Extraktion von Proteinen aus der Zellprobe kann durch ein Beliebiges der vielen aus dem Stand der Technik bekannten Mittel erfolgen. Beispielsweise können Zellen mithilfe eines Detergens mechanisch lysiert werden. Falls gewünscht, können Nukleinsäuren durch enzymatischen Verdau oder durch Ausfällen aus der Zellpräparation entfernt werden. Solche Mittel sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Unter Anwendung der hierin ausgeführten Verfahren können Antikörper erzeugt werden, die mit den Bbk-Proteinen immunreaktiv sind. Anschließend können mithilfe der natürlichen Genprodukte von bbk geeignete Antikörper gescreent werden.
Die extrahierten Proteine aus der Zellprobe können unter für die Ausbildung von Antikörper-Antigen-Komplexe geeigneten Bedingungen mit dem Antikörper in Kontakt gebracht werden. Generell handelt es sich bei solchen Bedingungen um physiologische Bedingungen. Der Proteinextrakt kann an einen festen Träger wie beispielsweise einen Nitrozellulosefilter oder eine Mikrotiterplatte gebunden werden.
Der Antikörper trägt im Allgemeinen einen Marker, bei dem es sich um einen radioaktiven Marker, einen fluoreszierenden Marker oder ein Enzymkonjugat handelt, welches unter geeigneten Bedingungen beispielsweise ein farbiges Reaktionsprodukt hervorbringt. Antikörper und die Markierung von Antikörpern sind hierin beschrieben und einem Fachmann bekannt. Wenn der Antikörper nicht markiert ist, kann er alternativ mittels eines zweiten Antikörpers aus einer anderen Spezies erfasst werden, der mit dem ersten Antikörper in Reaktion gebracht wird. Geeignete Assaytechniken, Marker und Erfassungsmittel sind hierin erläutert.
Als Kontrolle wird eine Parallelprobe zu der Testprobe verwendet. Die Kontrollprobe besteht aus einer äquivalenten Menge an Proteinen, die aus Zellen extrahiert wurden, vorzugsweise auf dieselbe Weise wie die der Testprobe. Die Menge an Protein kann durch Anwendung von Techniken, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, einfach bestimmt werden, einschließlich beispielsweise der Lowry- oder Bradford-Technik. Die für die Herstellung der Kontrollprobe verwendeten Zellen können aus Zellen desselben Zelltyps wie die Testzellen gewählt sein, aus einem normalen Menschen isoliert sein, der nicht an der degenerativen Erkrankung leidet, an welcher der Mensch, dem die Testprobe entnommen wurde, leidet, und es kann sich dabei um Zellen aus dem getesteten Menschen handeln, deren Zelltyp sich vom Zelltyp der Testzellen unterscheidet.
Testproben können auch nach aus dem Stand der Technik gut bekannten Verfahren auf einen erhöhten Spiegel an von dem bbk-Gen transkribierter mRNA untersucht werden. Beispielsweise kann aus B-Zellen extrahierte RNA verwendet werden, oder alternativ kann mRNA aus zellulärer Gesamt-RNA isoliert werden. Die mRNA kann beispielsweise durch Affinitätschromatographie auf Oligo(dT)-Zellulose gereinigt werden, die den Poly(A)-Trakt am 3'-Ende der meisten mRNAs bindet. Wie einem Fachmann gut bekannt ist, ist es essenziell, dass die Ribonukleaseaktivität während der Präparation und dem Test minimiert wird.
Eine DNA-Sonde kann aus einer beliebigen der Proteinkodierungssequenzen des bbk-Gens ausgewählt werden. Vorzugsweise wird die Sonde aus Sequenzen des 5'- bzw. ersten Exons des Gens ausgewählt, so dass RNA festgestellt werden kann. Vorzugsweise enthält die Sonde mindestens 15 Nukleotide der bbk-Sequenz. Zur Durchführung der Hybridisierung ist es wünschenswert, dass die Sonde einzelsträngig ist. Wenn daher die Sonde doppelsträngig ist, sollte sie zu einer einzelsträngigen Form denaturiert werden. Mittel für die Denaturierung sind aus dem Stand der Technik gut bekannt, einschließlich einer Behandlung mit Lauge oder Wärme. Die Sonde kann dann mit der aus der Zellprobe gewonnenen RNA unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, bei denen sich homologe RNA-DNA-Hybride bilden und stabil sind. Solche Bedingungen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt. Es gibt viele und allseits bekannte Mittel zur Feststellung von Hybriden, die aber häufig die Verwendung radioaktiv markierter Sonden und von Nukleasen beinhalten, die einzelsträngige DNA abbauen. Es können andere aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren verwendet werden.
Von jeder der oben beschriebenen Herkunftszellen können Kontrollproben zur Verwendung in den diagnostischen Antikörpertests gewonnen werden. Proben und Kontrollen sollten vorzugsweise parallel unter gleichen Bedingungen hergestellt werden.
Die diagnostischen Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind geeignet um zu bestimmen, ob eine Krankheit/degenerative Erkrankung mit einer anomalen Bbk-Expression, mit der Expression von Bbk-Mutanten verknüpft ist, sowie, um den Effekt einer Überexpression oder eines Verlustes der Expression von Bbk in Tiermodellen wie beispielsweise in transgenen Mäusen und/oder homozygoten Null-Mäusen festzustellen. Verfahren zur Bestimmung, ob eine Krankheit/degenerative Erkrankung mit einer anomalen Bbk-Expression verknüpft ist, umfassen die Analyse der Bbk-Expression in erkranktem Gewebe im Vergleich zu normalem Gewebe beispielsweise durch Northern- und/oder Western-Blots sowie durch andere Testverfahren, die von einem durchschnittlichen Fachmann leicht gewählt und angewandt werden können. Wenn festgestellt worden ist, dass eine Krankheit/degenerative Erkrankung mit einer anomalen Bbk-Expression verknüpft ist, kann die Krankheit/degenerative Erkrankung in einem Individuum diagnostiziert werden.
Die folgenden Beispiele sollen der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung dienen.
BEISPIELE
A. Material und Verfahren
1. Hefe-Two-Hybrid-Analyse.
Die Bestandteile des Hefe-Two-Hybrid-Systems wurden von Clontech Laboratories (Katalognummer K1605-l, K1605-D, HL4006AE) erhalten. Dazu gehörte der GAL4-Bindungsdomäne-Fusionsvektor pAS2, die Hefestämme Y190 und Y187 und eine cDNA-Bibliothek von Aktivierungsdomänen menschlicher Lymphozyten. Bak wurde unter Verwendung von Standardprotokollen (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York (1989)) in den pAS2-Vektor subkloniert. Zur Erzeugung einer im Leseraster liegenden Fusion mit Bak wurde der Vektor pAS2 durch Verdau mit NdeI modifiziert, die Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I stumpf gemacht und wieder ligiert. Das Bak-Gen wurde durch Verdau mit BamHI und EcoRI aus pcDNA1/amp (beschrieben in der gemeinsam anhängigen US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/321,071, eingereicht am 11. Oktober 1994, bei der es sich um eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/287,427 handelt, die am 9. August 1994 eingereicht wurde (bak wird darin als bcl-y bezeichnet)) entfernt, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I stumpf gemacht und in den modifizierten pAS2-Vektor ligiert, der mit SmaI verdaut und mit Kalbsdarmphosphatase behandelt worden war, um terminale Phosphate zu entfernen. Der Bak/GAL4-Bindungsdomäne-Fusionsvektor (pAS2/BakΔC) wurde über den Fusionspunkt hinweg DNA-sequenziert, um zu prüfen, ob das GAL4-Leseraster über die Klonierungsverbindungsstelle hinweg und in das offene Leseraster von Bak hinein erhalten wurde. Mit der Bak/GAL4-Bindungsdomäne als Köder und der cDNA-Bibliothek von Aktivierungsdomänen menschlicher Lymphozyten wurden nach den Anleitungen des Herstellers eine Two-Hybrid-Analyse, β-Galaktosidase-Filterassays und eine Feststellung von falsch Positiven durchgeführt. Aus den positiven Klonen wurde Plasmid-DNA isoliert und wie vom Hersteller beschrieben in E. coli transformiert. Bakterielle Klone wurden durch Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung weiter analysiert.
2. Zusätzliche Plasmidkonstrukte.
Alle Plasmidkonstrukte wurden unter Verwendung von Standardprotokollen (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, New York (1989)) hergestellt. Es wurde eine modifizierte Form des Säugetierexpressionsplasmids pcDNA3 (Clontech) hergestellt, in dem der Influenzahämagglutinin(HA)-Epitopmarker (MGYPYDVPDYASLS) zwischen die HindIII- und die XhoI-Stelle der Polylinker-Klonierungsregion eingeführt wurde, um pcDNA3/HA zu erzeugen. Das im Two-Hybrid-Screen erhaltene Bbk-Gen (pACT/Bbk) wurde aus dem Plasmid mit der GAL4-Aktivierungsdomäne auf einem XhoI-Fragment entfernt und in die XhoI-Schnittstelle des oben beschriebenen pcDNA3/HA-Vektors subkloniert, um pcDNA3/HABbk zu erhalten. Dies führt zu einer im Leseraster liegenden Fusion von Bbk mit dem HA-Marker, wobei sich der HA-Marker am N-Terminus von Bbk befindet.
Die Deletionsmutante Δ1–105 wurde direkt aus dem Two-Hybrid-Screen erhalten und auf eine ähnliche Weise wie das Volllängen-Bbk subkloniert, um pcDNA3/HAΔ1–105 zu erhalten. Die Mutante pcDNA3/HAΔ142–249 wurde erzeugt, indem pcDNA3/HABbk mit PflMI und XbaI verdaut wurde, um Sequenzen zwischen Nukleotid 338–958 zu entfernen, und die deletierten Sequenzen anschließend durch ein per Polymerasekettenreaktion (PCR) erzeugtes DNA-Fragment von PflMI bis XbaI zu ersetzen, das den Bbk-Nukleotiden 338–476 entspricht. Nach Aminosäure 141 wurde ein im Leseraster liegendes Stopp-Codon eingebaut.
Die Alaninpunktmutanten pcDNA/HAPM-LVLEE (L₁₂₅V₁₂₉L₁₃₂E₁₃₄E₁₃₅ ersetzt durch A-Reste), pcDNA/HAPM-V (V₁₂₉ ersetzt durch einen A-Rest), pcDNA/HAPM-L (L₁₃₂ ersetzt durch einen A-Rest), pcDNA/HAPM-EE (E₁₃₄E₁₃₅ ersetzt durch A-Reste) wurden erzeugt, indem Wildtyp-Bbk-Sequenzen zwischen Nukleotid 338–476 (ein PflMI-Fragment) durch PCR-erzeugte PflMI-Fragmente ersetzt wurden, denen Alanincodons an den bezeichneten Positionen eingebaut worden sind. Bbk-Gene, die die Alaninpunktmutationen tragen, wurden aus den pcDNA/HA-Vektoren entfernt und ebenfalls in die XhoI-Polylinkerschnittstelle von pACT kloniert, um pACT/PM-LVLEE, pACT/PM-V, pACT/PM-L und pACT/PM-EE zu erzeugen. Diese Plasmide erzeugen eine im Leseraster liegende Fusion zwischen den Bbk-Mutanten und der Gal4-Aktivierungsdomäne zur Verwendung bei der Hefe-Two-Hybrid-Analyse.
Das Plasmid pRcCMV/HABbkBH3, welches die Bbk-Aminosäurereste 117–166 exprimiert und die Bbk-BH3-Domäne aufweist, wurde wie unten beschrieben konstruiert. Mittels PCR wurde ein Fragment des Bbk-Gens erzeugt, welches Aminosäurereste 117–166 kodiert (wobei nach Aminosäure 166 ein Stoppcodon eingebaut wurde), und anschließend in die XhoI-Stelle von pcDNA3/HA (siehe oben) kloniert, welche mithilfe des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase stumpf gemacht worden war. Das Fusionsgen aus HA-Marker und Bbk-BH3 wurde dann auf einem HindIII/XbaI-Fragment entfernt und in die HindII/XbaI-Schnittstellen von pRcCMV (Clontech) subkloniert. Diese Klonierung führte zu der im Leseraster liegenden Fusion des HA-Markers und der Bbk-BH3-Domäne zur Verwendung bei Transfektionen von Säugetierzellen. Ein Kontrollplasmid, welches Wildtyp-Bbk kodiert, wurde ähnlich konstruiert, indem das HindIII/XbaI-Fragment aus pcDNA3/HABbk (siehe oben) entfernt und die die HindII/XbaI-Schnittstellen von pRcCMV subkloniert wurde.
Es wurde eine Glutathion-S-Transferasefusion von Bbk (GST-Bbk) hergestellt, indem ein BglII- bis EcoRI-Fragment von Bbk in die BamHI- bis EcoRI-Schnittstellen des Plasmids pGEX2TK (Pharmacia) subkloniert wurde. Das BglII- bis EcoRI-Fragment von Bbk wurde in mehreren Schritten erzeugt. Zunächst wurde das Startmethionin von Bbk entfernt, indem ein BglII- bis Bsu34I-Fragment von pcDNA3/HABbk durch einen doppelsträngigen Oligonukleotidadapter ersetzt wurde. Die XbaI-Schnittstelle dieses modifizierten pcDNA3/HABbk-Plasmids wurde anschließend mithilfe von EcoRI-Linern in eine EcoRI-Schnittstelle verwandelt.
Andere Plasmide, die Bak, Bik, Bax, Bcl-x_L, Bcl-2 und Epstein-Barr-Virus BHRFI exprimieren, sind zuvor beschrieben worden (Boyd, J. M., et al., Oncogene 11: 1921 (1995); Chittenden, T., EMBO J. 14 (22): 5589 (1995); die gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/321,071, eingereicht am 11. Oktober 1994, bei der es sich um eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/287,427 handelt, die am 9. August 1994 eingereicht wurde (darin wird bak als bcl-y bezeichnet)).
3. Northern-Blot-Analyse.
Es wurden Northern Blots mit mehreren menschlichen fetalen und adulten Geweben von Clontech Laboratories erworben und nach dem Protokoll des Anbieters sequenziell mit ³²P-markierten Sonden hybridisiert, welche die gesamte Kodierungsregion von Bbk und β-Aktin aufwiesen.
4. In-vitro-Translation.
35S-Methionin-markierte Proteine wurden unter Verwendung des TnT T7/T3-gekoppelten Retikulozy tenlysatsystems (Promega) unter Befolgung der Anleitungen des Herstellers in vitro synthetisiert. Die Translationsprodukte wurden einer SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese unterzogen. Das Gel wurde fixiert, in Fluorographie-Verstärkungslösung (Amplify, Amersham) inkubiert, getrocknet und bei –70°C einer Autoradiographie unterzogen.
5. Western-Blut-Analyse.
COS7-Zellen wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum und L-Glutamin, kultiviert. Die Zellen wurden mit 2 μg Plasmid-DNA mithilfe von LipofectAMINE (Gibco/BRL) transfiziert, und 24 Stunden nach der Transfektion wurden Zelllysate hergestellt. Anteile der Zellextrakte (etwa 100 mg) wurden einer Elektrophorese auf einem SDS-Polyacrylamidgel unterzogen und anhand von Standardverfahren auf eine Nylonmembran übertragen (Harlow, E., et al., Antibodies: A Laboratory Manual (1988)). Der Blot wurde mit dem monoklonalen Anti-HA-Epitop-Antikörper 12CA5 (Klodziej, P. A., et al., Meth. Enzymol. 194: 508–519 (1991)) inkubiert, der anschließend mit einem sekundären Antikörper unter Verwendung des ECL-Systems (Amersham) erfasst wurde.
6. Analyse der transienten Transfektion.
Rat1-, HeLa- und BT549-Zellen wurden bei 37°C, 7% CO₂ in DMEM mit 10% fetalem Kälberserum, 4 nM L-Glutamin, 50 Einheiten/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin kultiviert. Die Zellen wurden 24 Stunden vor der Transfektion mit 3,5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen ausplattiert. Ein Plasmid, das β-Galaktosidase von E. coli kodiert (pRcCMV/βgal, 0,16 μg), wurde mit insgesamt 0,42 μg des relevanten Plasmids bzw. der relevanten Plasmide wie in den Legenden der Figuren definiert gemischt. Das Plasmidgemisch wurde zu 25 μl OPTIMEM (Gibco/BRL) gegeben und anschließend mit 27 μl LipofectAMINE-Lösung (2 μl Stammlösung gemischt mit 25 μl OPTIMEM) gemischt. Nach einer Inkubation von 30 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Plasmidgemische mit 200 μl OPTIMEM verdünnt und zu Zellen gegeben, die einmal mit OPTIMEM gewaschen worden waren. Nach 4 Stunden unter normalen Wachstumsbedingungen wurden die Zellen mit 250 μl DMEM, 20% fetalem Kälberserum, 4 mM L-Glutamin gefüttert und konnten dann 24 Stunden unter Normalbedingungen wachsen. Die Zellen wurden anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, mit 0,2% Glutaraldehyd, 2% Paraformaldehyd, 49,2 mM Natriumphosphat (pH 7,3) für 5 Minuten bei 4°C fixiert und zweimal mit PBS gewaschen. β-Galaktosidase exprimierende Zellen werden nach einer 1- bis 4-ständigen Inkubation mit 80 mM Na₂HPO₄, 20 mM NaH₂PO₄, 1,3 mM MgCl₂, 1 mg/ml X-Gal (verdünnt aus einer 20-mg/ml-Stammlösung, hergestellt in Dimethylformamid), 3 mM K₄Fe(CN)₆/3H₂O als blaue Zellen identifiziert. Lebende blaue Zellen werden als solche identifiziert, die eine flache Morphologie haben, während tote blaue Zellen rund sind.
7. Proteininteraktionen in vitro.
Das Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein von Bbk (GST-Bbk) wurde in E. coli von Plasmid pGEX2TK-Bbk exprimiert und durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agarose gereinigt (Smith, D. B. and Johnson, K. S., Gene 67: 31–40 (1988)). ³⁵S-Methionin-markiertes, HA-Epitop-markiertes Bak, Bax, Bik und Flag-Epitop(Kodak)-markiertes Bcl-x_L wurden mithilfe eines gekoppelten Transkriptions-/Translationssystems in Kaninchenretikulozytenlysaten (Promega) in vitro exprimiert. Markierte Proteine wurden im Voraus mit 10% Glutathion-Agarose in 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,2) enthaltend 0,25% NP-40, 142,5 mM KCl, 5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA (Puffer A), entfernt. Es wurde GST-Bbk zugegeben (Endkonzentration: 1–3 μM) und die Mischungen wurden für 60 Minuten bei 4°C inkubiert. Proteinkomplexe wurden mit 10% Glutathion-Agarose erfasst und zweimal mit Puffer A und einmal mit Puffer A ohne NP-40 gewaschen. Die Proteine wurden durch Inkubation in SDS-PAGE-Probenpuffer bei 100°C für 5 Minuten von den Kügelchen eluiert- und auf 4–20%ige SDS-Polyacrylamidgele (Novex) geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele fixiert und in einer Fluorographie-Verstärkungslösung (Amplify, Amersham) inkubiert. Die Gele wurden getrocknet und bei –70°C einer Autoradiographie unterzogen.
8. Flüssigkultur-β-Galaktosidaseassays.
Die Affinität von Interaktionen zwischen Bbk/Bak und Bbk-Mutante/Bak wurde mithilfe eines Flüssig-β-Galaktosidaseassays mit o-Nitrophenylgalaktosid (ONPG) als Substrat wie im Protokoll des Herstellers (Clontech) beschrieben quantifiziert. Die für die Analyse verwendeten Plasmide sind in den Figurenlegenden genannt.
B. Ergebnisse
1. Identifizierung von mit Bak interagierenden Proteinen durch Hefe-Two-Hybrid-Analyse.
Bak wird in vielen Zellen exprimiert (gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/321,071, eingereicht am 11. Oktober 1994, bei der es sich um eine Teilfortführungsanmeldung der US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/287,427 handelt, die am 9. August 1994 eingereicht wurde (darin wird bak als bcl-y bezeichnet)); Kiefer, M. C., et al., Nature 374: 736 (1995)). Die Überexpression von Bak induziert Tod durch Apoptose. Es wurde angenommen, dass Regulatoren oder Effektoren der Apoptose möglicherweise an Bak binden. Daher wurden mithilfe des Hefe-Two-Hybrid-Systems ( US-Patent Nr. 5,283,173 ) Proteine identifiziert, die mit Bak interagieren. Das Prinzip dieser Vorgehensweise ist in 1 zusammengefasst.
GAL4 ist ein Transkriptionsaktivatorprotein der Hefe, das zwei distinkte Domänen aufweist, die DNA-Bindungsdomäne und die Transkriptionsaktivierungsdomäne (1A). Die DNA-Bindungsdomäne bindet an ein spezifisches DNA-Sequenzelement im GAL4-Promotor, was die Transkriptionsaktivierungsdomäne in die Nähe des Promotors bringt, wo er die Transkription stimuliert. Es wurde gezeigt, dass diese Domänen trennbar sind, obgleich sie die Transkription nicht stimulieren können, wenn sie getrennt sind. Die Transkriptionsaktivierung kann jedoch wiederhergestellt werden, wenn eine Verknüpfung zwischen den beiden getrennten Domänen hergestellt wird. Eine solche Verknüpfung kann hergestellt werden, indem die GAL4-Domänen als Hybridproteine exprimiert werden, wobei diese Domänen mit heterologen Proteinen (Protein X und Protein Y in 1B–C) fusioniert werden, die bekanntermaßen intakt sind. In dem in 1 gezeigten Szenario dient die GAL4-Bindungsdomäne dazu, Protein X zum GAL4-Promotor zu bringen, und die anschließende Interaktion mit Protein Y wiederum bringt die GAL4-Aktivierungsdomäne zu dem Promotor, wo sie die Transkription stimulieren kann. Der GAL4-Promotor, bzw. ein Promotor, der das GAL4-DNA-Sequenzelement enthält, kann verwendet werden, um die Transkription selektierbarer Markergene (wie beispielsweise HIS3) und Reportergene (wie beispielsweise lacZ) zu steuern.
Das oben beschriebene System lässt sich verwenden, um die Interaktion von Proteinen zu untersuchen, die bekanntermaßen interagieren, und um neuartige interagierende Proteine zu identifizieren und zu isolieren. Im letzteren Fall wird ein relevantes Protein mit der GAL4-Bindungsdomäne fusioniert und als „Köder" verwendet, um interagierende Proteine einzufangen, die als GAL4-Aktivierungsdomänenfusionen exprimiert werden. In den hier beschriebenen Experimenten wurde ein Fusionsprotein aus GAL4-DNA-Bindungsdomäne und Bak als Köder verwendet, um mit Bak interagierende Proteine zu isolieren, die als Fusion mit der GAL4-Aktivierungsdomäne exprimiert werden, welche aus einer cDNA-Bibliothek Epstein-Barr-Virus-transformierter menschlicher B-Lymphozyten (Clontech) erzeugt werden. Two-Hybrid-Analyse, Selektion interagierender Klone, β-Galaktosidase-Filterassay und Identifizierung falsch Positiver wurden nach den Spezifikationen des Herstellers (Clontech) durchgeführt.
2. Sequenzanalyse eines stark bindenden Bak-Bindungsklons bbk.
Elf der am stärksten bindenden Bindungsklone (beurteilt anhand der Intensität der blauen Farbe in β-Galaktosidase-Filterassays) wurden durch DNA-Sequenzierung als Klone verschiedener Länge desselben Gens bestimmt. Mittels Restriktionsenzymanalyse wurde die ungefähre Größe dieser Klone identifiziert. Klon bbk war der größte der Klone und wurde daher für eine erschöpfende DNA-Sequenzierung sowohl des oberen als auch des unteren Strangs ausgewählt. Die Sequenz von Klon bbk ist in 2 gezeigt. Sechs der elf Klone wiesen denselben Sequenzstartpunkt wie bbk auf, während es fünf Klone gab, die Deletionen verschiedener Länge (bis zu Nukleotid 33, 151, 178, 242 und 364 von Klon bbk) aufwiesen. Drei der elf Klone wiesen einen intakten 3'-Terminus auf, wie durch Vorhandensein eines polyadenylierten (PolyA-)Endstücks festgestellt wurde. Das Fehlen eines PolyA-Endstücks in den übrigen Klonen ist wahrscheinlich auf ein fehlerhaftes Priming während der DNA-Synthese infolge der AT-reichen Art des Gens in dieser Region zurückführbar. Die verbleibenden Klone hatten dennoch 3'-Termini, die innerhalb von 30 Basen des echten 3'-Terminus lagen (einschließlich Klon bbk, der 10 Basen kürzer ist).
Die Sequenz von bbk wurde mit der Genbank-Datenbank unter Verwendung des BLAST-Programms des NCBI verglichen. Diese Analyse hat zahlreiche cDNAs mit exprimierten Sequenzmarkern (Expressed Sequence Tags, EST) (Zugangsnummer: H26516, H42839, H59025, H59896, H59897, H72004, H72005, H89857, H90702, R02556, R02674, R07849, R07901, R36543, R38463, R58365, R78883, R78977, R85622) mit signifikanter Homologie (Poisson-Summen-P(N)-werte kleiner oder gleich 5,5e-26) zu bbk identifiziert. Diese cDNAs beginnen und enden auch innerhalb mehrerer Basen des Endpunkts von bbk, was darauf hinweist, dass bbk ein Klon mit fast vollständiger Länge ist.
Bbk kodiert ein offenes Leseraster (Open Reading Frame, ORF) von 249 Aminosäuren, beginnend mit Nukleotidnummer 51 und endend mit Nukleotidnummer 799. Dieser ORF befindet sich im selben Raster wie das von der N-terminal an Bbk fusionierten GAL4-Aktivierungsdomäne prognostizierte Raster. Die Sequenz, die das prognostizierte Methionin-Startcodon umgibt, stimmt mit der Kozak-Konsensussequenz überein (Kozak, M. Nucleic Acids Res. 15: 8125 (1987)), und es gibt keine zusätzlichen Methionine oder im Leseraster liegende Stopp-Codons in der putativen nicht-translatierten bbk-Sequenz, die sich zwischen der Gal4-Aktivierungsdomäne und dem Bbk-ORF befindet. Es wird daher angenommen, dass der echte ORF des Bbk-Gens identifiziert wurde. Es ist interessant, darauf hinzuweisen, dass mehrere der Klone, die durch Two-Hybrid-Analyse isoliert wurden, sowie mehrere der EST-Klone zwischen Nukleotid 157 und 158 von Bbk drei zusätzliche Nukleotide (AAG) aufweisen, die nicht in Bbk vorhanden sind. Diese Nukleotide könnten als Ergebnis der Verwendung einer alternativen Splice-Stelle eingeführt worden sein. Die Addition dieser drei Nukleotide in der putativen Kodierungsregion bewahrt das prognostizierte Leseraster und hätte zur Folge, einen Argininrest an Position 36 einzuführen. Eine Analyse von Proteindatenbanken unter Verwendung des putativen Bbk-ORF identifizierte Sequenzen von nur begrenzter Homologie. Daher können neuartige Proteine, die mit dem in Zusammenhang mit Apoptose stehenden Protein Bak interagieren, durch Verwendung des Two-Hybrid-Systems identifiziert werden.
3. Expression von Bbk-mRNA in fetalem und adultem Gewebe
Es wurde eine Northern-Blot-Analyse durchgeführt, um das Expressionsmuster und die Größe der Boten-RNA von Bbk zu bestimmen. Northern Blots von fetalem und adulten Gewebe, die mithilfe einer Bbk-Sonde analysiert wurden (3), zeigen, dass Bbk eine einzelne mRNA-Spezies von etwa 0,8–1,2 kb ist. Die Größe dieser mRNA stimmt mit der Auffassung überein, dass ein Volllängen-Klon isoliert worden ist. Die Northern-Blot-Analyse zeigt auch, dass Bbk in vielen verschiedenen Geweben exprimiert wird, wobei die Verteilung ungefähr der von Bak entspricht (Kiefer, M. C., et al., Nature 374: 736 (1995)), was die Annahme stützt, dass Bbk und Bak in der Zelle zusammen als Komplex vorliegen.
4. Expression von Bbk in vitro und in transfizierten Zellen.
Die abgeleitete Aminosäuresequenz von Bbk prognostiziert ein Protein mit einem MW von 26,7 kD. Der Bbk-Klon wurde aus dem Hefe-Two-Hybrid-Vektor für die Expression in vitro unter Verwendung des T7-Promotors und für die Expression in Säugetierzellen unter Verwendung des Immediate-Early-Promotors des humanen Zytomegalievirus in pcDNA3 (Clontech) subkloniert. Zur Feststellung des Proteins wurde die Bbk-Sequenz am Aminoterminus an ein Segment mit 14 Aminosäuren fusioniert, das vom Influenza-Hämagglutinin-Antigen (HA) abgeleitet ist. Dieses kurze Peptid liefert ein gut charakterisiertes Epitop, das die immunologische Erfassung des „markierten" Proteins durch den monoklonalen Antikörper 12CA5 (Boehringer Mannheim) ermöglicht. In-vitro-Transkription/Translation des Bbk-Klons in Kaninchenretikulozytenlysaten produziert ein Protein mit einer elektrophoretischen Mobilität auf SDS-Polyacrylamidgelen, die einem Molekulargewicht von etwa 37 kD (4A) entspricht, in ungefährer Übereinstimmung mit der aus der konzeptionellen Translation der cDNA-Sequenz plus dem HA-Marker und durch Klonierung eingeführter unspezifischer Aminosäuren prognostizierten Sequenz. Der pcDNA3-Vektor, der HA-markiertes Bbk exprimiert, wurde in COS7-Zellen transfiziert. Achtundvierzig (48) Stunden nach der Transfektion wurden Zelllysate hergestellt und im Western Blot mit dem monoklonalen Anti-HA-Antikörper analysiert. In den COS7-Zellextrakten wurde das HA-markierte Bbk-Protein der geeigneten Größe festgestellt (4B). Diese Ergebnisse zeigen, dass das von der isolierten Bbk-cDNA kodierte Protein sowohl in vitro als auch in vivo exprimiert werden kann.
5. Expression von Bbk beschleunigt Zelltod in Rat1-, HeLa- und BT549-Zellen
Der von dem pcDNA3-Vektor exprimierte HA-markierte Bbk-Klon wurde mit einem Plasmid, das β-Galaktosidase exprimiert, in normale Rattenfibroblasten (Rat1-Zellen) und in die menschlichen Tumorzelllinien HeLa und BT549 cotransfiziert, um den Effekt der Bbk-Expression auf die zelluläre Vitalität zu bestimmen. Ein solcher Zelltodassay wurde zuvor beschrieben (Miura, M., et al., Cell 75: 653 (1993); Boyd, J. M., et al., Oncogene 11: 1921 (1995); Chittenden, T., et al., EMBO J. 14 (22): 5589 (1995); die gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/440,391, eingereicht am 12. Mai 1995) und besteht aus der Cotransfektion eines relevanten Gens in Zellen mit dem β-Galaktosidase-Gen als Marker für Transfektanden. Der Effekt des transfizierten Genproduktes auf die zelluläre Vitalität wird gemessen, indem 24 Stunden nach der Transfektion blaue Zellen (β-Galaktosidase-positiv) relativ zu Vektorkontrollzellen gezählt werden. Inerte bzw. antiapoptotische Genprodukte zeigen sich als flache (lebende) blaue Zellen in ähnlicher Zahl wie die der Vektorkontrollen, während sich schädliche Genprodukte als allgemeine Verringerung der Zahl blauer Zellen bzw. als Anstieg der Häufigkeit runder (toter) blauer Zellen zeigen. Die Ergebnisse in 5A zeigen deutlich eine Verringerung der Zahl blauer Zellen, wenn Rat1-Zellen mit einem Bbk exprimierenden Plasmid transfiziert werden. Es scheint daher, dass Bbk wie sein Bindungspartner Bak Zelltod induzieren kann. Sowohl Bak als auch Bbk können Apoptose induzieren, wenn sie individuell in Rat1-Zellen exprimiert werden. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, legt dies nahe, dass entweder die Bak/Bbk-Interaktion für die Induktion von Apoptose nicht erforderlich ist oder dass es Rattenhomologe von Bak und Bbk gibt, die funktionell mit den humanen Proteinen interagieren können. Alternativ könnte die Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen als regulatorische Funktion dienen, um ihr apoptotisches Potenzial zu modulieren. Die Daten in 5A zeigen, dass die Coexpression von Bak und Bbk die Induktion der Apoptose nicht blockiert, was nahe legt, dass ihre Fähigkeit, sich gegenseitig zu binden, ihre Fähigkeit, Apoptose zu fördern, nicht hemmt. Weil Bak und Bbk individuell jeweils potente Förderer des Zelltods sind, war es jedoch möglich, in diesen Assays zu bestimmen, ob ihre Corexpression zu einer kooperativen Induktion der Apoptose führt.
Die apoptotische Funktion von Bbk kann durch die Coexpression der bekannten Überlebensproteine Bcl-2, Bcl-x_L und Epstein-Barr-Virus BHRF1 (5B) umgekehrt werden. Das Ausmaß des von den mit der Apoptose in Zusammenhang stehenden Proteinen Bak und Bik geförderten Zelltods ist in Gegenwart der Überlebensproteine ähnlich reduziert (nicht gezeigt). Die Zytotoxizität von Bik lässt sich wiederherstellen, indem das Verhältnis des Apoptose fördernden Proteins Bik relativ zu diesen Überlebensproteinen erhöht wird. Diese Beobachtung lässt den Schluss zu, dass Apoptose fördernde Proteine unter geeigneten Umständen die Wirkung von Überlebensproteinen tatsächlich unterdrücken können. Die Zelltod fördernden Proteine können daher verwendet werden, um Apoptose in Zellen zu induzieren, bei denen das Überleben auf der Wirkung eines der mit Bcl-2 verwandten Zellüberlebensproteine abhängt.
Die Fähigkeit von Bbk, Apoptose zu induzieren, ist auch in den Tumorzelllinien HeLa und BT549 ersichtlich (6A, B). Das Ausmaß der von Bbk induzierten Apoptose ist vergleichbar mit dem von Bak in den BT549-Zellen, während Bbk in HeLa-Zellen bei der Induktion von Zelltod etwas weniger effektiv ist als Bak. Obgleich Bbk Zelltod induzieren kann, scheinen menschliche Tumorzellen gegenüber der apoptotischen Funktion von Bbk in verschiedenem Maß empfindlich zu sein. Zellen, die gegenüber eine Bbk-induzierten Apoptose weniger empfindlich sind, können jedoch im Anschluss an eine Behandlung mit Bbk empfindlicher gegenüber herkömmlichen Antikrebstherapien werden. Es wurde daher nun ein neuartiges Protein identifiziert, das Bak bindet und in verschiedenen Zelltypen Apoptose induziert.
6. Bbk interagiert mit Bak, Bax, Bcl-x_L in vitro.
Die Umkehr der von Bbk-induzierten Apoptose durch Zellüberlebensmitglieder der Bcl-2-Familie könnte nahe legen, dass diese Proteine mit Bbk interagieren können. Es sollte bestimmt werden, ob Bbk nur mit Bak interagiert, oder ob es auch an andere Proteine binden kann, die bekanntermaßen an der Apoptose beteiligt sind. Es wurde ein Glutathion-S-Transferase(GST)-Bbk-Fusionsprotein in E. coli exprimiert und über Glutathion-Agarose gereinigt. HA-markiertes Bak, Bax und Bik sowie Bcl-x_L _, markiert mit dem FLAG-Epitop (Kodak), wurden durch In-vitro-Translation radioaktiv markiert und anschließend mit GST-Bbk oder GST alleine inkubiert. Komplexe wurden auf Glutathion-Agarose isoliert und durch SDS-PAGE analysiert. 7 zeigt deutlich eine Bbk-Interaktion mit Bak, Bcl-x_L und Bax, aber nicht mit Bik. Diese Interaktionen sind spezifisch, da GST alleine mit keinem der in vitro translatierten Materialien Komplexe bildet. Bbk kann daher offensichtlich mit mehreren Mitgliedern der Bcl-2-Familie interagieren. Bbk scheint nicht ausschließlich mit den Zelltod induzierenden Mitgliedern der Bcl-2-Familie zu interagieren, wie sich an seiner Interaktion mit Bcl-x_L zeigt, trotz der Tatsache, dass Bbk aufgrund seiner Interaktion mit dem Zelltodförderer Bak isoliert wurde. Interessanterweise kann Bbk jedoch nicht mit Bik interagieren, einem neuartigen Tod induzierenden Protein, der mit den Mitgliedern der Bcl-2-Familie die BH3-Domäne teilt (Boyd, J. M., et al., Oncogene 11: 1921 (1995)).
7. Bbk teilt Sequenzhomologie mit der Bcl-2-Proteinfamilie
Die Beobachtung, dass Bbk mit mehreren Mitgliedern der Bcl-2-Familie interagiert und ebenfalls eine in Zusammenhang mit Apoptose stehende Funktion hat, lässt den Schluss zu, dass Bbk weitere Sequenzhomologie teilen könnte. Die oben durchgeführten Datenbankrecherchen haben keine Sequenzhomologie zu Mitgliedern der Bcl-2-Familie ergeben, aber eine sorgfältige visuelle Inspektion identifizierte ein Motiv, das mit der BH2-Domäne von Bcl-2 und verwandten Familienmitgliedern hoch homolog ist (8A). Eine Ausrichtung (Alignment) des Bbk-ORF mit Mitgliedern der Bcl-2-Familie unter Verwendung der BH2-Domäne als Anker ergab keine Homologie mit der BH1-Domäne von Bcl-2, zeigt aber eine gewisse Homologie (8B) zu der neu definierten BH3-Domäne (gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/440,391, eingereicht am 12. Mai 1995 (BH3 ist darin als GD-Domäne bezeichnet)). Bbk scheint damit ein neuartiges, Tod förderndes Mitglied der Bcl-2-Proteinfamilie zu sein.
8. Bbk-induzierte Apoptose wird durch seine BH3-ähnliche Domäne vermittelt
Es wurde zuvor gezeigt, dass die BH3-Domäne von Bak sowohl notwendig als auch ausreichend für dessen Induktion von Zelltod ist (gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/440,391, eingereicht am 12. Mai 1995 (BH3 ist darin als GD-Domäne bezeichnet)). Weil Bbk eine schwache Homologie mit der Bak-BH3-Domäne aufweist, sollte bestimmt werden, ob diese Region bei Bbk eine ähnliche Funktion aufweist. Um diese Theorie zu testen, wurde eine Reihe von Deletionen hergestellt, die in die putative BH3-Domäne eingreifen, und in dem Test auf Zelltod von Rat1-Zellen getestet. Die Ergebnisse in 9A zeigen, dass zwei dieser Mutanten, Δ1–105 (eine Deletion des N-Terminus bis Aminosäurerest 106) und Δ142–249 (eine Deletion am C-Terminus, beginnend bei Aminosäurerest 142) die Fähigkeit zur Induktion von Apoptose bewahren. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass ein großer Anteil des Bbk-Moleküls (einschließlich der BH2-Domäne) für die zytotoxische Aktivität von Bbk entbehrlich ist. Des Weiteren definieren diese Daten die Region zwischen Aminosäure 106 bis 141 als notwendig für Bbk, um Zelltod zu induzieren. Interessanterweise fällt diese Region mit der putativen BBk-BH3-Domäne zusammen (Rest 125–137). Um definitiv zu beweisen, dass diese Region für die Zytotoxizität von Bbk erforderlich ist, wurden vier Alanin-Scanningmutanten (9B) hergestellt, die mehrere konservierte Reste mutieren, und hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Induktion von Apoptose in Rat1-Zellen getestet. Die in 9C gezeigten Ergebnisse zeigen, dass PM-LVLEE, das fünf Alaninsubstitutionen in dem BH3-Element enthält, seine Fähigkeiten zur Induktion von Apoptose vollständig verloren hat. Um zu beweisen, dass die Aufhebung der Zytotoxizität in PM-LVLEE nicht auf einen fehlerhafte Synthese zurückzuführen ist, wurde seine Expression in COS7-Zellen verifiziert, wo es in vergleichbarem Maß wie Wildtyp-Bbk produziert wurde. Die Daten stützen daher den Schluss, dass die BH3-Region von Bbk für seine apoptotische Funktion absolut notwendig ist. Die übrigen Mutanten, PM-V, PM-L und PM-EE, sind einzelne und doppelte Alaninmutationen, die konstruiert wurden, um präziser definieren zu können, welche BH3-Reste für die Bbk-induzierte Apoptose erforderlich sind. Die Daten in 9C zeigen, dass jede dieser Substitutionen die Induktion von Zelltod reduziert, aber nicht aufhebt, was darauf hindeutet, dass alle mutierten Reste teilweise für die Zytotoxizität von Bbk benötigt werden. Auch diese Mutanten wurden jeweils in COS7-Zellen in vergleichbarem Maß wie Wildtyp-Bbk exprimiert.
Um zu bestimmen, ob auch die Bbk-BH3-Domäne ausreichend wäre, um Apoptose zu induzieren, wurde ein Plasmid in Rat1-Zellen transfiziert, das nur Aminosäure 117–166 von Bbk exprimiert (welche die Bbk-BH3-Domäne zwischen Rest 125–137 umfassen). Die Ergebnisse in 10 zeigen, dass die Expression dieses Peptids aus 50 Aminosäuren, welches die Bbk-BH3-Domäne umfasst, ausreicht, um Apoptose zu induzieren. Es scheint daher, dass die BH3-Domäne von Bbk insofern in ihrer Funktion analog zu der Bak-BH3-Domäne ist, als sie sowohl notwendig als auch ausreichend für die Induktion von Apoptose ist.
9. Die Apoptose-Induktion durch Bbk korreliert mit seiner Fähigkeit zur Bindung von Bak
Die gemeinsam anhängige US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/440,391, eingereicht am 12. Mai 1995, zeigte, dass die Bak-BH3-Domäne für dessen zytotoxische Aktivität sowie für dessen Fähigkeit, Bcl-x_L, ein anti-apoptotisches Mitglied der Bcl-2-Familie, zu binden, verantwortlich ist. Da die Bbk-BH3-Domäne die gleiche Fähigkeit zur Induktion der Apoptosefunktion auf ähnliche Weise wie bei der Bak-BH3-Domäne zu haben scheint, war es von Interesse, zu bestimmen, ob die Bbk-BH3-Domäne die Interaktion zwischen Bbk und Bak vermittelt. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden die oben zur Definition der Apoptose induzierenden Domäne von Bbk verwendeten Alaninmutationen (PM-LVLEE, PM-V, PM-L, PM-EE) mit der Gal4-Aktivierungsdomäne zur Verwendung in dem Hefe-Two-Hybrid-System mit Bak als Köder fusioniert. In diesem Assay ist der Grad der Expression der β-Galaktosidase ein Maß für die Affinität und/oder Stabilität der Interaktion zwischen den beiden Proteinen, wobei hohe Mengen eine starke Interaktion und geringe Mengen eine schwache Interaktion anzeigen. 11 zeigt, dass PM-LVLEE, die Bbk-Mutante, die ihre Fähigkeit zur Induktion von Apoptose verloren hat, auch die Fähigkeit zur Bindung von Bak verloren hat, wie sich an der geringen Menge an β-Galaktosidase (vergleichbar mit der Negativkontrolle) zeigte. Die Mutanten, welche einen mittleren Grad an apoptotischem Potenzial beibehalten haben (PM-V, PM-L, PM-EE) behalten einen mittleren Grad der Interaktion mit Bak bei. Diese direkte Korrelation zwischen der Zytotoxizität von Bbk und der Bindung von Bbk an Bak ist ein weiterer Beleg für die Hypothese, dass die Interaktion zwischen Bbk und Bak für die Induktion von Apoptose erforderlich ist. Alternativ bleibt die Möglichkeit, dass es weitere Bindungspartner für Bbk gibt, die ebenfalls mit seiner BH3-Domäne interagieren, um Zelltod zu bewirken.
SEQUENZLISTE
SEQUENZLISTE

Claims

Ein isoliertes Bbk(Bak binding killer)-Protein, aufweisend die Aminosäuresequenz wie dargelegt in Sequenz-ID Nr. 11.
Das isolierte Bbk-Protein nach Anspruch 1, wobei das Protein ein menschliches Protein ist.
Das isolierte Bbk-Protein nach Anspruch 2, wobei das Protein durch die Nukleotidsequenz wie in Sequenz-ID Nr. 9 dargelegt kodiert ist.
Eine isolierte Nukleotidsequenz, kodierend für das Bbk-Protein, wie sie in Sequenz-ID Nr. 9 dargelegt ist.
Die isolierte Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, wobei die Sequenz Genom-DNA aufweist.
Die isolierte Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, wobei die Sequenz cDNA aufweist.
Die isolierte Nukleotidsequenz nach Anspruch 4, wobei die Sequenz RNA aufweist.
Ein isoliertes rekombinantes DNA-Molekül, aufweisend eine Nukleotidsequenz, die das Bbk-Protein kodiert, wie sie in Sequenz-ID Nr. 9 dargelegt ist.
Das isolierte rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 8, wobei das Molekül ein Vektor ist.
Ein Vektor, aufweisend ein rekombinantes DNA-Molekül, wobei das rekombinante DNA-Molekül eine Aminosäuresequenz oder eine variante Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Aminosäuresequenz ein Bbk-Peptid oder -Protein ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sequenz-ID Nr. 1, Sequenz-ID Nr. 2, Sequenz-ID Nr. 3, Sequenz-ID Nr. 4 und Sequenz-ID Nr. 11, und wobei die variante Aminosäurensequenz in einer Zelle eine Apoptose induziert und durch eine DNA-Sequenz kodiert ist, die zu einer DNA-Sequenz hybridisiert, die unter stringenten Bedingungen einer Natriumcitrat/Natriumchlorid (SSC) Pufferkonzentration von ungefähr 0,1× bei einer Temperatur von ungefähr 65°C ein Bbk-Peptid oder -Protein aus der Gruppe kodiert.
Der Vektor nach Anspruch 10, wobei der Vektor eine Antisense-RNA des rekombinanten Moleküls expressiert.
Der Vektor nach Anspruch 11, wobei das rekombinante DNA-Molekül eine Nukleotidsequenz wie in Sequenz-ID Nr. 9 dargelegt umfasst.
Eine mit dem Vektor nach einem der Ansprüche 10, 11 oder 12 transformierte Wirtszelle.
Die Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Ein Verfahren zum Herstellen eines isolierten Bbk-Polypeptids gemäß Anspruch 1, aufweisend: (a) Herstellen des Vektors gemäß Anspruch 10; (b) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit dem Sektor von Schritt (a); (c) Kultivieren der Wirtszelle von Schritt (b) unter Bedingungen, welche die Expression des Bbk-Polypeptids durch die Wirtszelle ermöglichen; und (d) Isolieren des von der Wirtszelle nach Schritt (c) expressierten Bbk-Polypeptids, wobei das isolierte Bbk-Protein erzeugt wird.
Das Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Ein gegen das Bbk-Protein gemäß Anspruch 1 gerichteter Antikörper.
Der Antikörper nach Anspruch 17, wobei der Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen Antikörper, einem anti-idiotypischen Antikörper und einem anti-anti-idiotypischen Antikörper.
Der Antikörper nach Anspruch 18, wobei der Antikörper erfassbar markiert ist.
Der Antikörper nach Anspruch 19, wobei der Antikörper erfassbar markiert ist mit einer erfassbaren Markierung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einer radioaktiven Markierung, einer Enzym-Markierung, einer Co-Faktor-Markierung, einer floureszenten Markierung, einer paramagnetischen Markierung, einer chemie-luminiszenten Markierung und einer Metall-Markierung.
Eine erfassbar markierte Nukleotid-Sonde, aufweisend eine erste Nukleotidsequenz, welche zu einer zweiten Nukleotidsequenz, die speziell das Bbk-Protein nach Anspruch 3 kodiert, komplementär ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, aufweisend das Bbk-Protein nach Anspruch 3 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Eine in vitro Verfahren zum Induzieren von Apoptosis bei einer Zelle, aufweisend ein Einführen einer Menge des Bbk-Proteins nach Anspruch 3, die zum Induzieren einer Apoptosis bei der Zelle wirksam ist, in eine nichtapoptotische Zelle.
Das Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Bbk-Protein durch Expression eines Bbk-kodierenden Nukleotids in die nichtapoptotische Zelle eingeführt wird.
Ein Peptid, aufweisend die Bbk-BH3-Domäne, welche eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Sequenzen dargelegt in Sequenz-ID Nr. 1, Sequenz-ID Nr. 2, Sequenz-ID Nr. 3 und Sequenz-ID Nr. 4, aufweist.
Das Peptid nach Anspruch 25, bestehend aus einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
wobei das Peptid bei transfizierten Ratten-1-Zellen Apoptosis induziert.
Eine isolierte Nukleotidsequenz, welche das Peptid gemäß Anspruch 25 oder 26 kodiert.
Ein Vektor, aufweisend die Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 27.
Eine mit dem Vektor gemäß Anspruch 28 transformierte Wirtszelle.
Die Wirtszelle nach Anspruch 29, wobei die Wirtszelle eine Säugetierzelle ist.
Ein Produkt gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, 17 bis 22 und 25 bis 29 zur Verwendung in der Medizin.
Ein Produkt gemäß Anspruch 31 für die Verwendung bei der Diagnose, der Behandlung oder dem Überwachen von degenerativen Funktionsstörungen, gekennzeichnet durch eine unangebrachte Zellproliferation oder einen unangebrachten Zelltod.
Die Verwendung eines Produktes gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, 17 bis 22 und 25 bis 29 für die Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von Entzündungszuständen, Krebs, Autoimmunkrankheiten, einer erlangten Immundefektkrankheit, Zelltod aufgrund einer Bestrahlungstherapie und Chemotherapie oder neurodegenerative Krankheiten.