ES2297860T3

ES2297860T3 - Proteina bbk asociada a adoptosis.

Info

Publication number: ES2297860T3
Application number: ES97928708T
Authority: ES
Inventors: Gregory J. Gallo
Original assignee: Immunogen Inc
Current assignee: Immunogen Inc
Priority date: 1996-05-29
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 2008-05-01
Anticipated expiration: 2017-05-29
Also published as: CA2256372A1; EP0910387B1; DE69738322D1; JP2000510686A; WO1997045128A1; EP0910387A1; US5834234A; US6057132A; JP4005636B2; EP0910387A4; DE69738322T2

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA BBK AISLADA, A SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS QUE CODIFICAN Y REGULAN LA EXPRESION DE LA PROTEINA, A ANTICUERPOS DIRIGIDOS CONTRA LA PROTEINA Y A VECTORES RECOMBINANTES Y CELULAS ANFITRIONAS QUE CONTIENEN SECUENCIAS GENETICAS QUE CODIFICAN Y REGULAN LA EXPRESION DE LA SECUENCIA DE LA PROTEINA. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A ADN, CADN Y ARN GENOMICOS QUE CODIFICAN LA SECUENCIA DE LA PROTEINA BBK Y LAS SECUENCIAS DE ARN DE SENTIDO INVERSO. LOS ANTICUERPOS PUEDEN UTILIZARSE PARA DETECTAR BBK EN ESPECIMENES BIOLOGICOS, INCLUYENDO, POR EJEMPLO, MUESTRAS DE TEJIDO HUMANO. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A PROCEDIMIENTOS PARA TRATAR ENFERMEDADES DEGENERATIVAS QUE SE CARACTERIZAN EN UNA PROLIFERACION CELULAR INAPROPIADA O EN LA MUERTE CELULAR INAPROPIADA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A PROCEDIMIENTOS PARA LA DIAGNOSIS DE ENFERMEDADES DEGENERATIVAS QUE SE CARACTERIZAN EN UNA PROLIFERACION CELULAR INAPROPIADA O EN UNA MUERTE CELULAR INAPROPIADA ASI COMO A PROCEDIMIENTOS PARA MONITORIZAR EL PROGRESO DE LAS ENFERMEDADES DEGENERATIVAS.

Description

Proteína Bbk asociada a apoptosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la fisiología celular, y más en particular a la apoptosis. Aún más en particular, la presente invención se refiere a la nueva proteína asociada a apoptosis Bbk; a las secuencias de nucleótidos que codifican Bbk; a los productos y procesos implicados en el clonado, la preparación y la expresión de genes y secuencias de nucleótidos que codifican Bbk; a los anticuerpos con especificidad hacia Bbk; y a los usos diagnósticos y terapéuticos de lo mencionado anteriormente.

Antecedentes de la invención

La "apoptosis" se refiere al suicidio celular que se desarrolla mediante un proceso fisiológico activo (Kerr, J.F., et al., Br. J. Cancer 26:239-257 (1972); Wyllie, A.H., Nature 284:555-556 (1980)). Las células que mueren mediante apoptosis experimentan cambios morfológicos característicos, que incluyen contracción celular, y condensación y fragmentación nuclear. La apoptosis desempeña un papel importante en los procesos del desarrollo, que incluyen la morfogénesis, maduración del sistema inmunitario y homeostasis tisular, mediante lo cual el número de células está limitado en los tejidos, que se están renovando de forma continua mediante la división celular (Ellis, R.E., et al., Annu. Rev. Cell. Biol. 7:663-698 (1991); Oppenheim, R.W., et al., Neurosci. 14:453-501 (1991); Cohen, J.J., et al., Annu. Rev. Immunol. 10:267-293 (1992); Raff, M.C., Nature 356:397-400 (1992)). La apoptosis es una salvaguardia celular importante contra la tumorigénesis (Williams, G.T., Cell 65:1097-1098 (1991); Lane, D.P. Nature 362:786-787 (1993)). Los defectos en la ruta apoptótica pueden contribuir al inicio o la progresión de neoplasias malignas. Bajo ciertas condiciones las células experimentan apoptosis en respuesta a la expresión forzada de oncogenes u otros genes que controlan la proliferación celular; (Askew, D., et al., Oncogene 6:195-1922 (1991); Evan, G.I., et al., Cell 69:119-128 (1992); Rao, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7742-7746 (1992); Smeyne, R.J., et al., Nature 363:166-169 (1993)). Una diversidad de trastornos degenerativos puede implicar una apoptosis anormal, que da como resultado la muerte celular prematura o inadecuada (Barr, P.J., et al., Biotechnology 12:487-493 (1994)). La infección productiva por ciertos virus puede depender de la inhibición de la muerte de las células hospedadoras mediante productos génicos virales anti-apoptóticos (Rao, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7742-7746 (1992); Ray, C.A., et al., Cell 69:597-604 (1992); White, E., et al., Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580 (1992); Vaux, D.L., et al., Cell 76:777-779 (1994), y la inhibición de la apoptosis puede alterar el curso (es decir, lítico frente a latente) de la infección viral; (Levine, B., et al., Nature 361:739-742 (1993)). La apoptosis generalizada de los linfocitos T desencadenada por la infección por VIH puede, al menos en parte, ser responsable de la deficiencia del sistema inmunitario asociada al SIDA (Gougeon M., et al., Science 260:1269-1270 (1993)). El papel de la apoptosis en los sucesos normales y patológicos del ciclo celular se revisa en Holbrook, N.J., et al., Eds., Cellular Aging and Cell Death, Wiley-Liss, Inc., editorial, Nueva York, N.Y. (1996).

El producto del gen bcl-2 se ha estudiado detenidamente como un inhibidor potente de la muerte celular apoptótica. El gen bcl-2 se identificó originariamente en el punto de ruptura de la translocación t(14:18) que se da frecuentemente en los linfomas foliculares de células B humanas (Bakhshi, A., et al., Cell 41:899-906 (1985); Cleary, M.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: (1985); Tsujimoto, Y., et al., Science 229:1390-1393 (1985)). Esta translocación da como resultado la activación constitutiva de la expresión del gen bcl-2 debido a la yuxtaposición con el locus de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. Bcl-2 funciona como un oncogén en esta enfermedad inhibiendo de manera inapropiada la apoptosis, que limitaría normalmente la acumulación de estas células (McDonnell, T.J., et al., Cell 57:79-88 (1989); Hockenbery, D., et al., Nature 348:334-336 (1990)). Por lo tanto, las células B se acumulan durante la fase inactiva del linfoma debido a su incapacidad para morir, más que por su proliferación incontrolada.

La actividad anti-apoptótica de Bcl-2 no se limita a las células B. Un gran número de estudios han demostrado que la expresión ectópica de Bcl-2 puede inhibir la apoptosis desencadenada por diversos estímulos en multitud de líneas celulares (Vaux, D.L., et al., Nature 335:440-442 (1988); Sentman, C.L., et al., Cell 67:879-888 (1991); Strasser, A., et al., Cell 67:889-899 (1991); Hockenbery, D.M., et al., Cell 75:241-251 (1993)). Bcl-2 bloquea la muerte celular inducida mediante privación de factores de crecimiento, lesión del ADN, expresión de oncogenes, estrés oxidativo e infección viral. La capacidad de Bcl-2 de bloquear la apoptosis prácticamente en todos los sistemas sugiere que Bcl-2 está estrechamente conectado con la maquinaria que lleva a cabo realmente el programa de muerte celular. Esta visión está apoyada además por la conservación de la función de Bcl-2 entre especies. El gen ced9 del nemátodo C. elegans funciona para inhibir la muerte programada en ciertas líneas celulares del gusano en desarrollo (Ellis, H.M., et al., Cell 44:817-829 (1986)). Ced9 parece ser un homólogo funcional de Bcl-2, ya que Bcl-2 puede complementar a ced9 en gusanos transgénicos (Vaux, D.L., et al., Science 258:1955-1957 (1991)). Bcl-2 puede funcionar también en células de insectos, tal como se demostró mediante la capacidad de Bcl-2 de inhibir la apoptosis inducida mediante infección con baculovirus (Alnemri, E.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7295-7299 (1992)). No se conoce bien el mecanismo molecular mediante el cual Bcl-2 interviene para bloquear la muerte celular.

Se han identificado genes celulares adicionales que exhiben una homología de secuencia significativa con Bcl-2 y, cuando se ensayan, estos genes parecen funcionar también como reguladores de la muerte celular apoptótica. Se aisló un pariente de Bcl-2, Bcl-X, mediante hibridación de ADN con rigurosidad baja al gen Bcl-2 (Boise, L.H., et al., Cell 74:597-608 (1993)). El ARN de Bcl-X se somete a corte y empalme de manera diferencial para producir una forma larga, denominada Bcl-X_{L}, y una forma más corta, Bcl-X_{S}, que alberga una deleción interna corta. Bcl-X_{L} funciona para inhibir la muerte celular de forma muy parecida a Bcl-2, mientras la forma delecionada, Bcl-X_{S}, puede inhibir la protección por Bcl-2 y puede funcionar como una especie "negativa dominante". Un segundo pariente de Bcl-2, Bax, se identificó bioquímicamente como una proteína hallada en co-inmunoprecipitados con Bcl-2 (Oltvai, Z.N., et al., Cell 74:609-619 (1993)). El aislamiento del cADN correspondiente reveló que la proteína Bax muestra una homología de secuencia sustancial con Bcl-2. Bax forma heterodímeros con Bcl-2 y parece inducir la apoptosis y funcionar como un regulador negativo de la función de Bcl-2. Se demostró que la expresión ectópica de Bax bloquea la protección contra la apoptosis proporcionada por la expresión de Bcl-2.

Se aislaron originariamente dos parientes de Bcl-2 celulares adicionales, Mcl-1 y A1 (Kozopas, K.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3516-3520 (1993); Lin, E.Y., et al., J. Immunol. 151:1979-1988 (1993)) en forma de ARNm inducidos en respuesta a estímulos específicos: diferenciación inducida mediante éster de forbol de células de leucemia mieloide (Mcl-1); y tratamiento con GM-CSF de células de médula ósea murinas (A1). Todavía no se sabe si Mcl-1 o A1 pueden modular la apoptosis.

Además de estos parientes de Bcl-2 celulares, se han identificado varios homólogos de Bcl-2 codificados por virus de ADN. Se observó que el producto del gen BHRF-1 del virus de Epstein-Barr contiene homología de secuencia respecto de Bcl-2, y se ha demostrado posteriormente que funciona como un inhibidor de la apoptosis (Henderson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8479-8488 (1993)). De forma similar, el gen LMW5-HL del virus de la fiebre porcina africana codifica una proteína estructuralmente similar a Bcl-2 (Neilan, J.G., et al., J. Virol. 67:4391-4394 (1993)). La proteína E1b 19kD de adenovirus parece ser funcionalmente equivalente a Bcl-2, aunque la homología de secuencia primaria es bastante limitada (White, E., et al., Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580 (1992)). Es probable que estos genes funcionen para asegurar la replicación del ADN viral evitando la apoptosis de la célula infectada. El descubrimiento de que los virus de ADN sin relación entre sí hayan desarrollado genes que funcionan aparentemente para imitar la acción de Bcl-2 apoya la conclusión de que Bcl-2 representa un regulador importante de la apoptosis.

El aislamiento y la caracterización de un gen relacionado con bcl-2, denominado bak, se describe en la solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/321.071, presentada el 11 de octubre de 1994, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos de número de serie 08/287.427, presentada el 9 de agosto de 1994 (bak se denomina en ella bcl-y). La expresión ectópica de Bak acelera la muerte de una línea de células dependientes de IL-3 tras la privación de la citocina, y se opone a la protección contra la apoptosis proporcionada por Bcl-2. Además, la expresión forzada de Bak es suficiente para inducir la apoptosis de fibroblastos privados de suero, lo que plantea la posibilidad de que Bak active directamente o sea ella misma un componente de la maquinaria de muerte celular.

Los genes relacionados con Bcl-2 celulares conocidos, cuando se analizaron, tuvieron distintos patrones de expresión, y así pueden funcionar en tejidos diferentes. El programa de muerte celular está presente en todos los tejidos y puede estar regulado mediante diferentes genes relacionados con Bcl-2. Aunque la expresión de Bcl-2 es necesaria para el mantenimiento del sistema inmunitario maduro, es deseable identificar otros genes que pueden controlar la muerte celular apoptótica en otros linajes. Desde el punto de vista del desarrollo farmacéutico, sería deseable identificar o desarrollar agentes que activen o inhiban la apoptosis, dependiendo de la situación clínica.

El documento WO 96/05232 describe la proteína relacionada con la apoptosis Bcl-y y el método y sus usos.

El documento WO 96/13614 describe un regulador de muerte celular asociado a Bcl-x/Bcl-2.

Zha, H. et al. (1996) describe que la proteína proapoptótica Bax heterodimeriza con Bcl-2 y homodimeriza con Bax por medio de un dominio nuevo (BH3) distinto de BH1 y BH2 (J. Biol. Chem. 271:7440-7444).

Yang et al. (1995) describe Bad, una molécula de unión heterodimérica para Bcl-x_{L} y Bcl-2 que desplaza a Bax y provoca la muerte celular (Cell 80:285-291).

Boyd et al. (1995) describe Bik, una proteína nueva que induce la muerte celular que comparte un motivo de secuencia definido con las proteínas de la familia de Bcl-2 y que interacciona con proteínas promotoras de supervivencia virales y celulares (Oncogene 11:1921-1928).

Resumen de la invención

El presente inventor ha descubierto sorprendentemente una composición nueva de materia que se ha aislado y caracterizado, y que se describe aquí en varias de las realizaciones. El aquí denominado "Bbk" parece ser un miembro de la familia de Bcl-2, y puede, entre otros, inducir la apoptosis en las células y oponerse a la función de Bcl-2 y de los inhibidores de la muerte celular relacionados en las células. El aislamiento de un cADN de Bbk humano de tamaño completo reveló que la secuencia de aminoácidos de Bbk deducida comparte homología con Bcl-2. El ARNm de Bbk parece expresarse de forma generalizada en los tejidos humanos primarios. Bbk es un regulador importante de la apoptosis en los tejidos humanos y/o en las células tumorales.

La expresión de Bbk acelera la apoptosis cuando se expresa en fibroblastos de rata normales (Rat1), y en líneas de células tumorales humanas que incluyen las células HeLa y BT549. La coexpresión de Bak y Bbk en células Rat1 no bloquea la inducción de la apoptosis, lo que sugiere que su capacidad para unirse entre sí no inhibe su capacidad para provocar la apoptosis. Su coexpresión puede dar como resultado la inducción cooperativa de la muerte celular. La función apoptótica de Bbk se puede invertir mediante la coexpresión de las proteínas de supervivencia conocidas, Bcl-2, Bcl-x_{L} y BHRF1 del virus de Epstein-Barr. El incremento de la proporción de Bbk respecto de las proteínas de supervivencia puede restablecer la apoptosis, como se ha demostrado previamente con la proteína promotora de la apoptosis Bik.

La presente invención se refiere así a una proteína asociada a apoptosis Bbk, a los productos y los procesos implicados en el clonado, la preparación y la expresión de los genes de Bbk; a los anticuerpos con especificidad hacia Bbk; y a las sondas de nucleótidos que corresponden a la secuencia de nucleótidos de Bbk o a sus porciones. El polipéptido de Bbk es útil para producir anticuerpos hacia él. Los anticuerpos y las sondas son útiles para detectar y aislar Bbk en muestras biológicas que incluyen, por ejemplo, células de todos los tejidos humanos, que incluyen tejido cardíaco, tejido pulmonar, células tumorales, placenta, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas.

La presente invención se refiere además a homólogos de especie y a homólogos virales de Bbk.

La presente invención se refiere a la identificación, caracterización y secuenciación de los cADNs y fragmentos genómicos que codifican el Bbk que está presente en las células humanas.

Según la presente invención, se proporcionan secuencias genéticas que codifican Bbk. La presente invención también proporciona vectores de expresión que contienen tales secuencias genéticas, hospedadores transformados con tales vectores de expresión, y métodos para producir el Bbk recombinante o modificado mediante ingeniería genética.

La presente invención también proporciona anticuerpos que reconocen específicamente Bbk.

El cADN de Bbk y la proteína recombinante son útiles para producir anticuerpos que reconocen específicamente Bbk. Tales anticuerpos son útiles para detectar y aislar Bbk en una muestra biológica. La presente proteína Bbk es también útil como regulador de la apoptosis.

Se ha aislado un cADN pequeño de una línea de células B transformadas mediante VEB. La secuencia de aminoácidos de la proteína Bbk comparte homología de secuencia con los dominios de Bcl-2.

La presente invención se refiere además a un método para aislar clones parciales de Bbk mediante el uso de clonado con reacción en cadena de la polimerasa (PCR), a partir de diversas líneas celulares tumorales humanas.

La presente invención se dirige además a métodos para inducir o inhibir la apoptosis en individuos que padecen trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inadecuada o una muerte celular inadecuada, respectivamente. Los trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inadecuada incluyen, por ejemplo, trastornos inflamatorios, cáncer, que incluye linfomas, tumores genotípicos, etc. Los trastornos degenerativos caracterizados por una muerte celular inadecuada incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), muerte celular debida a radioterapia o quimioterapia, etc.

La presente invención también se refiere a métodos para detectar la presencia de proteína Bbk, así como a métodos dirigidos al diagnóstico de trastornos degenerativos, los cuales están asociados a un nivel incrementado o disminuido de expresión o mutaciones de Bbk, comparado con el nivel esperado de expresión de Bbk en la población de células normales.

La presente invención se dirige además a métodos para monitorizar el progreso de los trastornos degenerativos asociados a niveles incrementados o disminuidos de expresión de Bbk, mediante la monitorización de la expresión de Bbk.

La presente invención también se refiere a métodos para determinar si una enfermedad/trastorno degenerativo está asociada a la expresión anormal de Bbk, así como a los métodos para determinar el efecto de la sobreexpresión o pérdida de la expresión de Bbk en modelos animales, tales como ratones transgénicos y/o ratones nulos homocigotos. Los métodos para determinar si una enfermedad/trastorno degenerativo está asociada a la expresión anormal de Bbk incluyen analizar la expresión de Bbk en el tejido enfermo comparado con el tejido normal mediante, por ejemplo, transferencias de Northern y/o Western, así como mediante otros métodos de ensayo fácilmente elegidos y empleados por las personas de experiencia habitual en la técnica.

La presente invención se refiere a híbridos de Bbk para uso terapéutico.

La presente invención también se refiere a métodos para modular los efectos apoptóticos administrando la presente proteína Bbk, una proteína mutante o híbridos a un individuo que padece un trastorno degenerativo caracterizado por una proliferación celular inadecuada o una muerte celular inadecuada, para estabilizar la proliferación celular inadecuada (es decir, inducir la apoptosis) o para estabilizar la muerte celular inadecuada (es decir, inhibir la apoptosis), respectivamente, y/o para restablecer en cada caso el comportamiento celular normal. La Fig. 3 ilustra los niveles de ARNm de Bbk expresado en una diversidad de tejidos fetales y adultos sanos.

La presente invención se refiere además a los equivalentes funcionales que incluyen fragmentos funcionales de Bbk, que incluyen, por ejemplo, péptidos de Bbk tales como BH1 y BH2, y otras regiones de homología reconocida por el presente inventor entre Bbk y otras proteínas relacionadas con la apoptosis, que incluyen Bcl-2 y Bax.

En un aspecto particular, la presente invención se dirige a un dominio proteico nuevo que se ha identificado y cartografiado en una secuencia corta en la parte central de la molécula de Bbk. Este dominio proteico nuevo, que el inventor ha designado "dominio BH3 de Bbk", es esencial tanto para la interacción de Bbk con Bak como para la función de destrucción celular de Bbk. Las especies de Bbk truncadas que abarcan el dominio BH3 de Bbk son suficientes por sí mismas para destruir células en ensayos de transfección.

El dominio BH3 de Bbk comparte menos de un veinticinco por ciento de identidad con el dominio GD descrito por primera vez en Bak en la solicitud de Estados Unidos de número de serie 08/440.391, presentada el 12 de mayo de 1995 (BH3 se denomina en ella dominio GD). Sin embargo, como se observó con respecto al dominio GD en Bak, la mutación de elementos del dominio BH3 en Bbk disminuye la destrucción celular y la función de unión de la proteína. Así, el dominio BH3 de Bbk es responsable de la mediación en interacciones proteína/proteína claves importantes para las acciones de múltiples moléculas reguladoras de la muerte celular.

En un aspecto, por lo tanto, la invención se dirige a péptidos purificados y aislados que comprenden el dominio BH3 de Bbk y a moléculas que imitan su estructura y/o función, útiles para inducir o modular el estado apoptótico de una célula. Los compuestos químicos que alteran la función del dominio BH3 de Bbk tienen utilidad como agentes moduladores de la apoptosis. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se dirige a agentes capaces de alterar la función del dominio BH3 de Bbk. Tales agentes incluyen, pero no se limitan a, moléculas que se unen al dominio BH3 de Bbk, moléculas que interfieren con la interacción del dominio BH3 de Bbk con otra(s) proteína(s), y moléculas que comprenden el dominio BH3 de Bbk que está alterado de alguna manera. La invención proporciona métodos para identificar las moléculas que modulan la apoptosis alterando la función del dominio BH3 de Bbk, lo que por lo tanto comprende las realizaciones adicionales contempladas.

En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a los productos y procesos implicados en el clonado, la preparación y la expresión de péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk; a los anticuerpos con especificidad hacia el dominio BH3 de Bbk; y a las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio BH3 de Bbk o sus porciones. Los péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk son útiles para producir anticuerpos hacia ellos. Tales anticuerpos son útiles para detectar y aislar proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk en muestras biológicas que incluyen, por ejemplo, células de todos los tejidos humanos, que incluyen tejido cardiaco, tejido pulmonar, células tumorales, tejido cerebral, placenta, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas, así como para modular la actividad apoptótica de las proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk en tales muestras biológicas, y constituyen aspectos adicionales de la invención.

Aún en otro aspecto, la invención proporciona vectores de expresión que contienen secuencias genéticas, hospedadores transformados con tales vectores de expresión, y métodos para producir los péptidos del dominio BH3 de Bbk recombinante de la invención.

La presente invención se dirige adicionalmente a métodos para inducir o inhibir la apoptosis en las células y/o tejidos de individuos que padecen trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inadecuada o una muerte celular inadecuada, respectivamente. Los trastornos degenerativos caracterizados por la proliferación celular inadecuada incluyen, por ejemplo, enfermedades inflamatorias, cáncer, que incluye linfomas, tal como hiperplasia prostática, tumores genotípicos, etc. Los trastornos degenerativos caracterizados por una muerte celular inadecuada incluyen, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), muerte celular debida a radioterapia o quimioterapia, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson, etc.

La presente invención se refiere también a métodos para detectar la presencia del péptido del dominio BH3 de Bbk, así como a métodos dirigidos al diagnóstico de trastornos degenerativos, los cuales están asociados a un nivel incrementado o disminuido de expresión de proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk, comparado con el nivel esperado de expresión de tales proteínas en la población de células normales.

La presente invención se refiere al uso terapéutico de los péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk.

La presente invención también se refiere a métodos para modular el estado apoptótico de una célula mediante la administración de péptidos que comprenden el péptido del dominio BH3 de Bbk, o sus mutantes, a un individuo que padece un trastorno degenerativo caracterizado por una proliferación celular inadecuada o una muerte celular inadecuada, para estabilizar la proliferación celular inadecuada (es decir, inducir la apoptosis) o estabilizar la muerte celular inadecuada (es decir, inhibir la apoptosis), respectivamente, y/o en cada caso restablecer el comportamiento celular normal.

La presente invención se dirige también a sondas de nucleótidos que se pueden usar para determinar la presencia de Bbk, así como para identificar y aislar homólogos, que incluyen los homólogos de especie y los homólogos vira-
les.

Estos y otros objetivos y aspectos de la invención serán aparentes para los expertos a partir de la siguiente descripción.

Descripción de las figuras

Figura 1. Características del sistema de doble híbrido en levaduras (adaptado del manual de Clontech).

Figura 1(A). Una ilustración esquemática de la proteína GAL4 de levadura que muestra el dominio de unión al ADN (DU) que interacciona con la secuencia activadora de 5' (UAS) de GAL1 y el dominio de activación de la transcripción (DA) que estimula la transcripción.

Figura 1(B). El DU de GAL4 fusionado a la proteína X se puede unir a la UAS de GAL1, pero no puede estimular la transcripción debido a la carencia de un dominio de activación. El DA de GAL4 fusionado a la proteína Y tampoco es capaz de estimular la transcripción debido a la incapacidad de localizar el promotor.

Figura 1(C). La interacción de la fusión DU de GAL4/proteína X con la UAS de GAL1 y su interacción adicional con la fusión DA de GAL4/proteína Y permite la reconstitución de la función de GAL4 y la estimulación de la transcripción.

Figura 2. Secuencia de nucleótidos y marco de lectura abierto (ORF) putativo del clon de Bbk [ID SEC Nºs: 9-11]. Las flechas indican los puntos de inicio de varios clones relacionados también aislados mediante el análisis de doble híbrido. También se indica la posición de un inserto AAG identificado en varios clones.

Figura 3. Análisis de transferencia de Northern de tejidos fetales y adultos humanos (Clontech). Las transferencias se hibridaron con ADN de Bbk marcado con ^{32}P (panel superior) y ADN de \beta-actina como control. Los marcadores de tamaño son como define el fabricante.

Figura 4. Expresión de la proteína Bbk.

Figura 4(A). Traducción in vitro de Bbk marcado con ^{35}S en lisado de reticulocitos de conejo. Los controles incluyen la traducción de proteína luciferasa, que se resolvió mediante electroforesis en gel con SDS y se visualizó mediante autorradiografía. Se muestran las movilidades en el gel de los marcadores de peso molecular proteicos teñidos previamente (Amersham).

Figura 4(B). Expresión de Bbk en células transfectadas. Se transfectaron plásmidos que expresan Bax o Bbk marcados con epítopo de hemaglutinina (HA) en células COS7. Los lisados se prepararon 48 h tras la transfección. Los lisados de las células COS7 sin transfectar se incluyen como control negativo. Se detectaron las proteínas mediante electroforesis en gel con SDS y transferencia de Western de lisados celulares con el anticuerpo monoclonal anti-HA 12CA5 (Boehringer Mannheim). Las proteínas Bax y Bbk se indican con flechas.

Figura 5. Efecto de la expresión de Bbk sobre la viabilidad de células Rat1. Las células se transfectaron con los plásmidos indicados, con un plásmido que expresa \beta-galactosidasa (pRcCMV/\betagal, 0,16 \mug). Las células se tiñeron 24 h tras la transfección para identificar las células que expresan \beta-galactosidasa vivas y muertas. Se halló la media de los valores de los experimentos por triplicado y se representaron con barras de error que representan el EEM.

Figura 5(A). Efecto de la expresión transitoria de vector (0,42 \mug de pRcCMV), Bak (0,21 \mug de pcDNA1/HABak + 0,21 \mug de pRcCMV), Bbk (0,21 \mug de pcDNA3/HABbk + 0,21 \mug de pRcCMV), o Bak + Bbk (0,21 \mug de pcDNA3/HABak + 0,21 \mug de pcDNA3/HABbk) en células Rat1.

Figura 5(B). Efecto de las proteínas de supervivencia Bcl-2 (0,21 \mug de pcDNA3/HABbk + 0,21 \mug de pRcCMV/
Bcl-2), Bcl-x_{L} (0,21 \mug de pcDNA3/HABbk + 0,21 \mug de pRcCMV/Bcl-x_{L}), o BHRF1 del virus de Epstein-Barr (0,21 \mug de pcDNA3/HABbk + 0,21 \mug de pRcCMV/BHRF1) sobre la inducción con Bbk de la apoptosis en células Rat1.

Figura 6. Efecto de la expresión de Bbk sobre la viabilidad de células HeLa y células BT549.

Figura 6(A). Las células HeLa se transfectaron con pRcCMV/\betagal (0,16 \mug) más vector (0,42 \mug de pRcCMV), Bak (0,21 \mug de pcDNA1/HABak + 0,21 \mug de pRcvCMV), o Bbk (0,21 \mug de pcDNA3/HABbk + 0,21 \mug de pRcCMV). Se registró el número de células teñidas y se representó como se describió en la Figura 5.

Figura 6(B). Las células BT549 se transfectaron como se describió en el panel (A).

Figura 7. Interacción de Bbk con miembros de la familia de Bcl-2. Se produjo una proteína de fusión de glutatión S-transferasa (GST) con Bbk en E. coli y se purificó en glutatión-agarosa. Se incubó la proteína Bbk purificada o el control de GST con Bak, Bax y Bik marcados con HA traducido in vitro (IVT) o Bcl-x_{L} marcado con Flag, marcados con ^{35}S. Los complejos se capturaron en esferas de glutatión-agarosa, se sometieron a electroforesis en gel con SDS, y se visualizaron mediante autorradiografía. Los complejos capturados se comparan con una alícuota del material IVT de inicio.

Figura 8. Alineamiento de secuencias de Bbk con los dominios BH2 y BH3 de los miembros de la familia de Bcl-2.

Figura 8(A). Las secuencias del dominio BH2 de Bak [ID SEC Nº: 13], Bax [ID SEC Nº: 14], Bik [ID SEC Nº: 15], Bcl-2 [ID SEC Nº: 16] y Bcl-x_{L} [ID SEC Nº: 17] están alineadas con las regiones homólogas de Bbk [ID SEC Nº: 12]. Los residuos que son idénticos o conservativos en al menos tres de las proteínas están recuadrados. Los recuadros negros indican residuos idénticos, mientras los recuadros grises indican residuos conservativos. La numeración indica la posición del primer residuo de aminoácido mostrado para cada secuencia.

Figura 8(B). Las secuencias de los dominios BH3 de Bak [ID SEC Nº: 19], Bax [ID SEC Nº: 20], Bik [ID SEC Nº: 21], Bcl-2 [ID SEC Nº: 22] y Bcl-x_{L} [ID SEC Nº: 23] están alineadas con las regiones homólogas de Bbk. El sombreado y la numeración son como se describe en el panel (A).

Figura 9. Análisis de deleciones y mutaciones puntuales de Bbk [ID SEC Nº: 1] en células Rat1.

Figura 9(A). Las células Rat1 se transfectaron con pRcCMV/\betagal (0,16 \mug) más vector (0,42 \mug de pRcCMV), Bbk de tamaño completo (0,42 \mug de pcDNA3/HABbk), o mutantes por deleción de Bbk (0,42 \mug de pcDNA3/HA\Delta1-105 o 0,42 \mug de pcDNA3/HA\Delta142-249). Se registró el número de células teñidas y se representó como se describió en la Figura 5.

Figura 9(B). Los mutantes puntuales de alanina del dominio BH3 de Bbk (PM-LVLEE [ID SEC Nº: 25], PM-V [ID SEC Nº: 2], PM-L [ID SEC Nº: 3], PM-EE [ID SEC Nº: 4]) se comparan con el dominio BH3 de Bbk de tipo natural [ID SEC Nº: 1]. El sombreado es como se describió en la Figura 8, con las sustituciones de alanina indicadas como recuadros contorneados.

Figura 9(C). Los mutantes puntuales de alanina mostrados en el panel (B) (0,42 \mug de cada uno de pcDNA3/HAPM-LVLEE, pcDNA3/HAPM-V, pcDNA3/HAPM-L, pcDNA3/HAPM-EE más 0,16 \mug de pRcCMV/\betagal) se transfectaron en células Rat1 y se compararon con células transfectadas con vector plasmídico de control o Bbk de tipo natural como se describió en el panel (A). Se registró el número de células teñidas y se representó como se describió en la Figura 5.

Figura 10. Efecto de la expresión del dominio BH3 de Bbk sobre la viabilidad de las células Rat1. Se transfectaron células Rat1 con pRcCMV/b\betagal (0,16 mg) más vector (0,42 mg de pRcCMV), Bbk de tamaño completo (0,42 mg de pRcCMV/HABbk), o dominio BH3 de Bbk (0,42 mg de pRcCMV/HABbkBH3). Se registró el número de células teñidas y se representó como se describió en la Figura 5.

Figura 11. Interacción de mutantes puntuales de Bbk con Bak analizada mediante el sistema de doble híbrido en levaduras. El plásmido cebo de Bak (pAS2/Bak\DeltaC) se co-transformó en levaduras con plásmidos que expresan fusiones del dominio de activación de Gal4 con mutaciones puntuales de alanina de Bbk (pACT/PM-LVLEE, pACT/PM-V, pACT/PM-L y pACT/PM-EE) y Bbk de tipo natural (pACT/Bbk). Como control positivo, se co-transformaron como anteriormente los plásmidos suministrados por el fabricante (Clontech) que expresan cebo de p-53 (pVA3) y antígeno T de SV40 (pTD1). Como control negativo, pACT/Bbk se co-transformó con pAS2, que expresa solamente el dominio de activación de Gal4 como cebo. Se analizaron tres colonias individuales de cada transformación por triplicado en función de la actividad de \beta-galactosidasa mediante el uso del ensayo en cultivo líquido descrito por el fabricante (Clontech). Después se calculó la media de las medidas por triplicado de cada una de las tres colonias para generar un valor único para cada par de proteínas interaccionantes. Los datos se representan en forma de unidades de \beta-galactosidasa (Miller, J.H., Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, Nueva York (1972)) con barras de error que representan el EEM.

Descripción detallada de la invención

Los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los significados entendidos normalmente por alguien de experiencia habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención, a menos que se defina de otra manera. Se hace referencia aquí a diversas metodologías conocidas para los expertos en la técnica. Las publicaciones y otros materiales que exponen tales metodologías conocidas a las que se hace referencia se incorporan aquí como referencia en su totalidad, como si se expusieran íntegramente. Las obras de referencia clásicas que exponen los principios generales de la tecnología del ADN recombinante incluyen Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, Nueva York (1989); McPherson, M. J., Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991); Jones, J., Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford (1992); Austen, B. M. y Westwood, O. M. R., Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford (1991). Se puede utilizar cualquier material y/o método adecuado conocido para los expertos para llevar a cabo la presente invención; sin embargo, se describen los materiales y/o métodos preferidos. Los materiales, reactivos y similares a los que se hace referencia en la siguiente descripción y ejemplos son obtenibles de fuentes comerciales, a menos que se indique de otra manera.

Esta invención se dirige más en general a una proteína nueva designada proteína "destructora con unión a Bak" o "Bbk", basándose en su capacidad de unirse específicamente a la proteína Bak y de destruir células tumorales humanas inmortalizadas. Por lo tanto, esta invención comprende las secuencias de aminoácidos de Bbk o de los mutantes de Bbk, las secuencias genéticas que codifican tales secuencias de aminoácidos, los vehículos de expresión que contienen las secuencias genéticas, los hospedadores transformados con ellos y el Bbk recombinante y el ARN complementario producidos mediante tal expresión en el hospedador transformado. La invención comprende además anticuerpos dirigidos contra Bbk y/o sus fragmentos, o contra mutantes de Bbk.

El proceso para modificar genéticamente tales secuencias proteicas, según la invención, se facilita por medio del clonado de las secuencias genéticas que son capaces de codificar el péptido, y por medio de la expresión de tales secuencias genéticas. Como se usa aquí, la expresión "secuencias genéticas" pretende referirse a una molécula de ácido nucleico (preferiblemente ADN). Las secuencias genéticas que son capaces de codificar las proteínas derivan de una diversidad de fuentes. Estas fuentes incluyen ADN genómico, cADN, ADN sintético, y sus combinaciones. La fuente preferida del ADN genómico o ARNm es el tejido humano, que incluye corazón, pulmón, células tumorales, placenta, hígado, músculo esquelético y páncreas. El ARNm se puede usar después para obtener cADN mediante técnicas conocidas para los expertos en la técnica. Se pueden sintetizar sondas basadas en la secuencia de nucleótidos de Bbk mediante los métodos conocidos en la técnica.

El ADN genómico de la proteína o fragmento de Bbk de la invención puede o no incluir intrones que se dan de forma natural. Además, tal ADN genómico se puede obtener en asociación con la región del promotor de 5' de las secuencias génicas de la proteína Bbk y/o con la región de terminación de la transcripción de 3'. Además, tal ADN genómico se puede obtener en asociación con las secuencias genéticas que codifican la región sin traducir de 5' del ARNm de la proteína Bbk y/o con las secuencias genéticas que codifican la región sin traducir de 3'. En la medida en que una célula hospedadora puede reconocer las señales reguladoras transcripcionales y/o traduccionales asociadas con la expresión del ARNm y de la proteína, las regiones sin transcribir de 5' y/o 3' del gen nativo, y/o las regiones sin traducir de 5' y/o 3' del ARNm, se pueden conservar y emplear para la regulación transcripcional y traduccional. El ADN genómico de la proteína Bbk se puede extraer y purificar a partir de tejido humano por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Berger, S.L., et al., Eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press (1987)).

De forma alternativa, el ARNm se puede aislar a partir de cualquier célula que produzca o exprese la proteína, y usarse para producir cADN por medios bien conocidos en la técnica (por ejemplo, véase Berger, S.L., et al., Eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press (1987)). Preferiblemente, la preparación de ARNm usada estará enriquecida en ARNm que codifica la proteína Bbk, de forma natural mediante el aislamiento a partir de células que están produciendo grandes cantidades de la proteína, o in vitro, mediante técnicas usadas habitualmente para enriquecer preparaciones de ARNm de secuencias específicas, que incluyen, por ejemplo, centrifugación en gradiente de sacarosa o PCR. Después se puede preparar cADN, por ejemplo, mediante transcripción inversa. El cADN se puede amplificar después mediante PCR con el uso de cebadores adecuados.

Para el clonado en un vector, tales preparaciones de ADN adecuadas (ADN genómico humano o cADN) se cortan aleatoriamente o se escinden enzimáticamente, respectivamente, y se ligan en vectores apropiados para formar una biblioteca génica recombinante (genómica o de cADN). Se puede insertar una secuencia de ADN que codifica la proteína Bbk o sus equivalentes funcionales en un vector de ADN de acuerdo con técnicas convencionales, que incluyen la formación de extremos romos o salientes para la ligadura, la digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, el tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseadas, y la ligadura con ligasas apropiadas. Las técnicas para tales manipulaciones se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, Nueva York (1989), y se conocen bien en la técnica.

Se pueden cribar las bibliotecas que contienen los clones de la proteína Bbk, y se puede identificar un clon de Bbk mediante cualquier medio que seleccione específicamente el ADN de la proteína Bbk tal como, por ejemplo, (a) mediante hibridación con sonda(s) de ácido nucleico apropiada(s) que contiene(n) una secuencia específica para el ADN de esta proteína, o (b) mediante análisis traduccional seleccionado mediante hibridación, en el que el ARNm nativo que hibrida con el clon en cuestión se traduce in vitro y los productos de traducción se caracterizan adicionalmente, o (c) si las secuencias genéticas clonadas son capaces por sí mismas de expresar ARNm, mediante inmunoprecipitación de un Bbk o fragmento traducido producido por el hospedador que contiene el clon.

Las sondas oligonucleotídicas específicas para la proteína que se pueden usar para identificar clones para esta proteína se pueden diseñar a partir del conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína Bbk. La secuencia de residuos de aminoácidos en un péptido se denomina aquí por medio del uso de sus denominaciones de tres letras empleadas habitualmente o mediante sus denominaciones de una única letra. Se puede hallar una lista de estas denominaciones de tres letras y de una letra en libros de texto tales como Biochemistry, 2ª ed., Lehninger, A., Worth Publishers, Nueva York, NY (1975). Cuando la secuencia de aminoácidos se lista de forma horizontal, se pretende que el extremo amino esté en el extremo izquierdo, mientras se pretende que el extremo carboxilo esté en el extremo derecho. Los residuos de aminoácidos en un péptido se pueden separar mediante guiones. Tales guiones pretenden únicamente facilitar la presentación de la secuencia.

Debido a que el código genético es degenerado, se puede usar más de un codón para codificar un aminoácido particular (Watson, J.D., en: Molecular Biology of the Gene, 3ª ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977), págs. 356-357). Los fragmentos peptídicos se analizan para identificar las secuencias de aminoácidos que pueden estar codificadas mediante oligonucleótidos que tienen el grado más bajo de degeneración. Esto se lleva a cabo preferiblemente mediante la identificación de las secuencias que contienen los aminoácidos que están codificados solamente por un único codón.

Aunque a veces una secuencia de aminoácidos puede estar codificada por solamente una única secuencia oligonucleotídica, con frecuencia la secuencia de aminoácidos puede estar codificada mediante cualquiera de un grupo de oligonucleótidos similares. De forma importante, aunque todos los miembros de este grupo contienen secuencias oligonucleotídicas que son capaces de codificar el mismo fragmento peptídico y, así, contienen potencialmente la misma secuencia oligonucleotídica que el gen que codifica el fragmento peptídico, solamente un miembro de este grupo contiene la secuencia de nucleótidos que es idéntica a la secuencia que codifica el exón del gen. Debido a que este miembro está presente dentro del grupo, y es capaz de hibridar al ADN incluso en presencia de los otros miembros del grupo, es posible emplear el grupo de oligonucleótidos sin fraccionar de la misma manera que se emplearía un único oligonucleótido para clonar el gen que codifica el péptido.

Mediante el uso del código genético (Watson, J.D., en: Molecular Biology of the Gene, 3ª ed., W.A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977)), se pueden identificar uno o más oligonucleótidos diferentes a partir de la secuencia de aminoácidos, cada uno de los cuales sería capaz de codificar la presente proteína Bbk o un fragmento. La probabilidad de que un oligonucleótido particular constituirá, de hecho, la secuencia que codifica la proteína real se puede estimar considerando las relaciones de emparejamientos anormales de bases y la frecuencia con la que se usa realmente un codón particular (para codificar un aminoácido particular) en las células eucarióticas. Tales "reglas de uso de codones" se describen en Lathe, et al., J. Molec. Biol. 183:1-12 (1985). Mediante el uso de las "reglas de uso de codones" de Lathe, se identifica una secuencia oligonucleotídica única, o un grupo de secuencias oligonucleotídicas, que contiene una secuencia de nucleótidos "muy probable" capaz de codificar la secuencia de la proteína Bbk.

El oligonucleótido adecuado, o grupo de oligonucleótidos, que es capaz de codificar un fragmento del gen de la proteína Bbk (o que es complementario a tal oligonucleótido, o grupo de oligonucleótidos) se puede sintetizar por medios bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, S.A. Narang, Ed., Synthesis and Application of DNA and RNA, Academic Press, San Diego, CA) y emplearlo como una sonda para identificar y aislar el gen de la proteína Bbk clonado mediante métodos conocidos en la técnica. Los métodos de hibridación de ácidos nucleicos e identificación de clones se describen en Maniatis, et al., Eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, (1982); Berger, et al., Eds., Guide to Molecular Cloning Techniques, Academic Press, San Diego, CA, (1988); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, Nueva York (1989); y en Hames, et al., Eds., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, (1985), cuyas referencias se incorporan aquí como referencia. Los miembros de la biblioteca génica anteriormente descrita que se descubre que son capaces de tal hibridación se analizan después para determinar los límites y la naturaleza de las secuencias que codifican la proteína Bbk que contienen.

Para facilitar la detección de la secuencia de ADN que codifica la proteína Bbk o el fragmento deseado, se marca la sonda de ADN anteriormente descrita con un grupo o marcador detectable. Tal grupo o marcador detectable puede ser cualquier material que tenga una propiedad física o química detectable. Tales materiales se han desarrollado en el campo de la hibridación de ácidos nucleicos, y en general se puede aplicar a la presente invención cualquier marcador útil en tales métodos. En particular, son útiles los marcadores radiactivos, tales como ^{32}P, ^{3}H, ^{14}C, ^{35}S, ^{125}I o similares. Se puede emplear cualquier marcador radiactivo que proporcione una señal adecuada y tenga una semivida suficiente. El oligonucleótido se puede marcar de forma radiactiva, por ejemplo, mediante "desplazamiento de mella" mediante métodos bien conocidos, como se describe, por ejemplo, en Rigby, et al., J. Mol Biol. 113:237 (1977) y mediante síntesis de sustitución con T4 ADN polimerasa como se describe, por ejemplo, en Deen, et al., Anal. Biochem. 135:456 (1983).

De forma alternativa, los polinucleótidos son también útiles como sondas de hibridación de ácidos nucleicos cuando se marcan con un marcador que no es radiactivo, tal como biotina, una enzima o un grupo fluorescente o quimioluminiscente. Véase, por ejemplo, Leary, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 80:4045 (1983); Renz, et al., Nucl. Acids Res. 12:3435 (1984); y Renz, M., EMBO J. 6:817 (1983).

Así, la identificación real de las secuencias de la proteína Bbk permite la identificación de una secuencia teórica de ADN "más probable", o un grupo de tales secuencias, capaces de codificar tal péptido. Mediante la construcción de un oligonucleótido complementario a esta secuencia teórica (o mediante la construcción de un grupo de oligonucleótidos complementarios al grupo de oligonucleótidos "más probables"), se obtiene una molécula de ADN (o grupo de moléculas de ADN), capaz de funcionar como sonda(s) para la identificación y el aislamiento de los clones que contienen el gen de la proteína Bbk.

En una manera alternativa de clonar el gen de la proteína Bbk, se prepara una biblioteca mediante el uso de un vector de expresión, mediante el clonado del ADN o, más preferiblemente, el cADN preparado a partir de una célula capaz de expresar la proteína Bbk, en un vector de expresión. La biblioteca se criba después en función de los miembros que expresan la proteína Bbk, por ejemplo, cribando la biblioteca con anticuerpos hacia la proteína Bbk.

Los métodos anteriormente descritos son capaces, por lo tanto, de identificar las secuencias genéticas que son capaces de codificar las proteínas Bbk o sus fragmentos. Para caracterizar adicionalmente tales secuencias genéticas y para producir la proteína recombinante, es deseable expresar las proteínas que codifican estas secuencias. Tal expresión identifica aquellos clones que expresan las proteínas que poseen las características de las proteínas Bbk. Tales características pueden incluir la capacidad de unir de forma específica el anticuerpo a la proteína Bbk, y la capacidad de provocar la producción de un anticuerpo o anticuerpos que son capaces de unirse a la proteína Bbk.

Para expresar la proteína Bbk o un equivalente funcional, o su mutante, son necesarias señales transcripcionales y traduccionales reconocibles por un hospedador adecuado. Las secuencias clonadas que codifican Bbk obtenidas, por ejemplo, por medio de los métodos descritos anteriormente, y preferiblemente en una forma bicatenaria, se pueden unir de manera operable a secuencias que controlan la expresión transcripcional en un vector de expresión, e introducirlas en una célula hospedadora, procariota o eucariota, para producir proteína Bbk recombinante o un equivalente funcional suyo. Dependiendo de si la cadena de la secuencia que codifica Bbk está unida de manera operable a las secuencias que controlan la expresión transcripcional, también es posible expresar ARN complementario de Bbk o un equivalente funcional suyo.

La expresión de Bbk en hospedadores diferentes puede dar como resultado modificaciones postraduccionales diferentes que pueden alterar las propiedades de Bbk. La presente invención abarca la expresión de la proteína Bbk, o de su equivalente funcional, o de un mutante de Bbk en células procarióticas y eucarióticas, y, en particular, se prefiere la expresión eucariótica.

Los hospedadores procarióticos preferidos incluyen bacterias tales como E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia, etc. El hospedador procariótico más preferido es E. coli. También se pueden utilizar otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcescens, y diversas especies de Pseudomonas. En tales condiciones la proteína puede no estar glicosilada. El hospedador procariótico debe ser compatible con el replicón y las secuencias de control del plásmido de expresión.

Para expresar la proteína Bbk (o un equivalente funcional suyo) o un mutante de Bbk en una célula procariótica (tal como, por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Pseudomonas, Streptomices, etc.), es necesario unir de manera operable la secuencia que codifica Bbk a un promotor procariótico funcional. Tales promotores pueden ser constitutivos o, más preferiblemente, regulables (es decir, inducibles o reprimibles). Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor int del bacteriófago \lambda, el promotor bla del gen de \beta-lactamasa de pBR322, y el promotor CAT del gen de cloranfenicol acetiltransferasa de pBR325, etc. Los ejemplos de promotores procarióticos inducibles incluyen los promotores derecho e izquierdo principales del bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), los promotores trp, recA, lacZ, lacI y gal de E. coli, los promotores de \alpha-amilasa (Ulmanen, I., et al., J. Bacteriol. 162:176-182 (1985)) y sigma-28 específicos de B. subtilis (Gilman, M.Z., et al., Gene 32:11-20 (1984)), los promotores de los bacteriófagos de Bacillus (Gryczan, T.J., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, Inc., NY (1982)), y los promotores de Streptomyces (Ward, J.M., et al., Mol. Gen. Genet. 203:468-478 (1986)). Los promotores procarióticos se revisan en Glick, B.R., (J. Ind. Microbiol. 1:277-282 (1987)); Cenatiempo, Y. (Biochimie 68:505-516 (1986)); y Gottesman, S. (Ann. Rev. Genet. 18:415-442 (1984)).

La expresión apropiada en una célula procariótica también requiere la presencia de un sitio de unión al ribosoma en dirección 5' de la secuencia que codifica el gen. Tales sitios de unión al ribosoma se describen, por ejemplo, en Gold, L., et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35:365-404 (1981)).

Los hospedadores eucarióticos especialmente preferidos incluyen células de mamíferos in vivo, en animales o en cultivo de tejidos. Los principios generales del cultivo en células de mamíferos se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Butler, M. y Dawson, M., Eds., Cell Culture LabFax, Bios Scientific Publishers Ltd., Oxford, R.U. y Academic Press, Inc., San Diego, CA, editores (1992), y en las referencias citadas en ellos.

La expresión de Bbk en hospedadores eucarióticos requiere el uso de regiones reguladoras funcionales en tales hospedadores, y preferiblemente sistemas reguladores eucarióticos. Se puede emplear una gran diversidad de secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, dependiendo de la naturaleza del hospedador eucariótico. Las señales reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden derivar también de las secuencias genómicas de virus que infectan a las células eucarióticas, tales como adenovirus, papilomavirus bovino, virus simio, herpesvirus, o similares. Preferiblemente, estas señales reguladoras están asociadas a un gen particular que es capaz de producir un nivel elevado de expresión en la célula hospedadora.

En los eucariotas, en los que la transcripción no está ligada a la traducción, tales regiones de control pueden o no proporcionar un codón iniciador de metionina (AUG), dependiendo de si la secuencia clonada contiene tal metionina. Tales regiones incluirán, en general, una región promotora suficiente para dirigir la iniciación de la síntesis de ARN en la célula hospedadora. Se prefieren los promotores de los genes mamíferos heterólogos que codifican un producto de ARNm capaz de ser traducido, y, especialmente, se pueden emplear los promotores intensos tales como el promotor de actina, colágeno, miosina, etc., con tal de que funcionen también como promotores en la célula hospedadora. Los promotores eucarióticos preferidos incluyen el promotor del gen de metalotioneína I de ratón (Hamer, et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); el promotor TK de herpesvirus (McKnight, S., Cell 31:355-365 (1982)); el promotor temprano de SV40 (Benoist, et al., Nature (London) 290:304-310 (1981)); y el promotor de HCMV (Boshart, et al., Cell 41:521 (1985)); en levaduras, se puede usar el promotor del gen gal4 (Johnston, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6971-6975 (1982); Silver, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5951-5955 (1984)) o un promotor de gen glicolítico.

Como se conoce en general, la traducción del ARNm eucariótico se inicia en el codón que codifica la primera metionina. Por esta razón, es preferible asegurar que la unión entre un promotor eucariótico y una secuencia de ADN que codifica la proteína Bbk, o un equivalente funcional suyo, no contiene ningún codón intermedio que sea capaz de codificar una metionina. La presencia de tales codones da como resultado la formación de una proteína de fusión (si el codón AUG está en el mismo marco de lectura que la secuencia de ADN que codifica Bbk) o una mutación por desplazamiento del marco de lectura (si el codón AUG no está en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica Bbk).

Si se desea, se puede construir un producto de fusión de Bbk. Por ejemplo, la secuencia que codifica Bbk o su fragmento se puede unir a una secuencia señal que permitirá la secreción de la proteína desde, o la compartimentación de la proteína en, un hospedador particular. Tales secuencias señal se pueden diseñar con o sin sitios para proteasas específicas, de forma que la secuencia del péptido señal se puede eliminar posteriormente.

Se pueden seleccionar señales reguladoras de iniciación de la transcripción que permiten la represión o la activación, de forma que se puede modular la expresión de los genes unidos de manera operable. Son de interés las señales reguladoras que son sensibles a la temperatura, de forma que mediante la variación de la temperatura se puede reprimir o iniciar la expresión, o que están sujetas a regulación química, p.ej., por un metabolito. También son de interés las construcciones en las que se proporciona ARNm de Bbk y ARN complementario en una forma transcribible, pero con diferentes promotores u otros elementos reguladores transcripcionales, de forma que la inducción de la expresión de ARNm de Bbk va acompañada por la represión de la expresión del ARN complementario, y/o la represión de la expresión del ARNm de Bbk va acompañada por la inducción de la expresión del ARN complementario.

Las señales traduccionales no son necesarias cuando se desea expresar secuencias de ARN complementarias de Bbk.

Si se desea, se pueden obtener las regiones no transcritas y/o no traducidas en 3' de la secuencia que codifica la proteína Bbk mediante los métodos de clonado anteriormente descritos. La región no transcrita de 3' se puede conservar por sus elementos de secuencia reguladora de la terminación transcripcional; la región no traducida de 3' se puede conservar por sus elementos de secuencia reguladora de la terminación de la traducción, o por aquellos elementos que dirigen la poliadenilación en las células eucarióticas. Cuando las señales de las secuencias de control de la expresión nativas no funcionan de manera satisfactoria en la célula hospedadora, entonces se pueden sustituir por las secuencias funcionales en la célula hospedadora.

Los vectores de la invención pueden comprender además otros elementos reguladores unidos de manera operable, tales como secuencias potenciadoras, o elementos de ADN que confieren expresión específica de tejido o de célula a un gen unido de manera operable.

Hay disponibles muchos sistemas de vectores para transformar una célula de mamífero con las construcciones de ADN de la invención, dependiendo de si se desea insertar la construcción de ADN de Bbk en el ADN cromosómico de la célula hospedadora, o permitir que exista en una forma extracromosómica.

Si la secuencia de ADN que codifica bbk y un promotor unido de manera operable se introducen en una célula eucariótica receptora en forma de una molécula de ADN (o ARN) sin replicación, que puede ser una molécula lineal o una molécula circular covalente cerrada que es incapaz de replicación autónoma, entonces la expresión de la proteína Bbk se puede dar por medio de la expresión transitoria de la secuencia introducida.

Se pueden construir transformantes genéticamente estables con sistemas de vectores, o sistemas de transformación, en los que el ADN de bak se integra en el cromosoma hospedador. Tal integración puede darse de novo dentro de la célula o, en una realización preferida, estar asistida por la transformación con un vector que se inserta de forma funcional en el cromosoma hospedador, por ejemplo, con vectores retrovirales, transposones u otros elementos de ADN que favorecen la integración de secuencias de ADN en los cromosomas. Se emplea un vector que es capaz de integrar las secuencias génicas deseadas en un cromosoma de la célula hospedadora mamífera.

Las células que tienen integrado de forma estable el ADN introducido en sus cromosomas se seleccionan también introduciendo uno o más marcadores que permiten la selección de las células hospedadoras que contienen el vector de expresión en el cromosoma, por ejemplo, el marcador puede proporcionar resistencia a biocidas, p.ej., resistencia a antibióticos, o a metales pesados, tales como cobre, o similares. El gen marcador seleccionable puede estar unido directamente a las secuencias génicas de ADN a expresar, o introducirse en la misma célula mediante cotransfección.

En otra realización, la secuencia introducida se incorpora en un vector plasmídico o viral capaz de replicación autónoma en el hospedador receptor. Se puede emplear cualquiera de una amplia diversidad de vectores para este fin, como se resume más adelante.

Los factores de importancia al seleccionar un vector plasmídico o viral particular incluyen: la facilidad con la que se pueden reconocer y seleccionar las células receptoras que contienen el vector de aquellas células receptoras que no contienen el vector; el número de copias del vector que se desea en un hospedador particular; y si es deseable poder "transferir" el vector entre células hospedadoras de diferentes especies.

Los plásmidos eucarióticos preferidos incluyen los derivados del papilomavirus bovino, virus vaccinia, SV40, y, en levaduras, los plásmidos que contienen el círculo de 2 micras, etc., o sus derivados. Tales plásmidos se conocen bien en la técnica (Botstein, et al., Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); Broach, J.R., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, págs. 445-470 (1981); Broach, J.R., Cell 28:203-204 (1982); Bollon, et al., J. Clin, Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis, T., "Gene Expression", en: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, vol. 3, Academic Press, NY, págs. 563-608 (1980)), y están disponibles comercialmente. Por ejemplo, se han descrito los sistemas de vectores de expresión en mamíferos que utilizan el promotor MSV-LTR para controlar la expresión del gen clonado, y en los que es posible cotransfectar con un virus auxiliar para amplificar el número de copias del plásmido, e integrar el plásmido en los cromosomas de las células hospedadoras (Perkins, et al., Mol. Cell Biol. 3:1123 (1983); Clontech, Palo Alto, California).

Una vez que se prepara el vector o la secuencia de ADN que contiene la(s) construcción(es) para la expresión, la(s) construcción(es) de ADN se introduce(n) en una célula hospedadora apropiada mediante cualquiera de una diversidad de medios adecuados, que incluyen la transfección. Tras la introducción del vector, las células receptoras se cultivan en un medio selectivo, que selecciona el crecimiento de las células que contienen el vector. La expresión de la(s) secuen-
cia(s) génica(s) clonada(s) da como resultado la producción de la proteína Bbk, o la producción de un fragmento de esta proteína. Esta expresión puede tener lugar de una manera continua en las células transformadas, o de una manera controlada, por ejemplo, la expresión tras la inducción de la diferenciación de las células transformadas (por ejemplo, mediante la administración de bromodesoxiuracilo a células de neuroblastoma o similares).

La proteína expresada se aísla y se purifica de acuerdo con condiciones convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, o similares.

Se puede purificar Bbk cultivando las células hospedadoras transformadas en condiciones adecuadas que se conocen bien en la técnica, las células se pueden recoger y romper para extraer la proteína celular total. La proteína se puede colocar después, por ejemplo, en una columna de separación por tamaño con esferas de sefarosa o agarosa, y se pueden recoger las proteínas del peso molecular correcto. El peso molecular predicho de Bbk es 26,7 kDa, y se desplaza con un peso molecular aparente de aproximadamente 37 kDa en geles de SDS-poliacrilamida.

Se puede llevar a cabo una purificación adicional mediante el uso de un anticuerpo anti-Bbk. Tal anticuerpo se puede usar para inmunoprecipitar las proteínas Bbk del grupo de proteínas celulares del peso molecular aproximado correcto. Tales anticuerpos pueden generarse, por ejemplo, contra los polipéptidos sintetizados según la secuencia o subsecuencias de la secuencia mostrada en la Fig. 2. De forma alternativa, los anticuerpos se pueden generar contra proteínas de fusión, que contienen secuencias de Bbk así como las de otras proteínas. Tras la inmunoprecipitación, las proteínas Bbk se pueden liberar de los anticuerpos para proporcionar una preparación sustancialmente pura de proteína Bbk.

Las secuencias que codifican el ADN de bbk de la presente invención se pueden usar para obtener secuencias genéticas de ARN complementario de Bbk, ya que la secuencia de ARN complementario será la secuencia hallada en la cadena opuesta a la cadena que transcribe el ARNm del núcleo del péptido. La cadena de ADN complementario se puede unir también de manera operable a un promotor en un vector de expresión, de forma que la transformación con este vector da como resultado un hospedador capaz de expresar un ARN complementario de Bbk en la célula transformada. El ARN complementario y su expresión se pueden usar para interaccionar con el ADN o ARN de bbk endógeno, de forma que se inhibe o reprime la transcripción o traducción de los genes bbk de una manera sumamente específica. El uso de sondas de ARN complementarias para bloquear la expresión génica se describe, por ejemplo, en Lichtenstein, C., Nature 333:801-802 (1988).

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Identificación, caracterización y uso de composiciones de fragmentos de Bbk que comprenden el dominio BH3 de Bbk

Se ha identificado un dominio nuevo dentro de la molécula de Bbk que parece ser necesario y suficiente para las actividades biológicas conocidas de Bbk. Este dominio, designado aquí como el "dominio BH3 de Bbk", es suficiente para mediar en la función de destrucción celular, y puede ser suficiente para la interacción física con Bak. Se ha demostrado que la mutación de las secuencias del dominio BH3 de Bbk reducen la actividad apoptótica de la proteína Bbk en fibroblastos Rat1. Estos experimentos demuestran que el dominio BH3 de Bbk es necesario para la destrucción celular y para la actividad de unión a Bak de la proteína Bbk. Estas observaciones sugieren que Bbk modula o regula la apoptosis por medio de un mecanismo que implica el dominio BH3 de Bbk. Como apreciarán los expertos familiarizados con la presente invención, las secuencias que comprenden el dominio BH3 de Bbk son útiles para modular la apoptosis en las células. De forma similar, los compuestos y composiciones que son capaces de unirse al dominio BH3 de Bbk son útiles como agentes para la modulación de la actividad apoptótica en las células.

Como se usa aquí, la expresión "dominio BH3 de Bbk" se refiere a un dominio proteico identificado por primera vez en Bbk, que se demuestra aquí que es esencial para la interacción de Bbk con Bak y para la función de destrucción celular de Bbk, y a los péptidos y/o moléculas capaces de imitar su estructura y/o función. En una realización preferida, la presente invención comprende un péptido que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

1

que corresponde a los residuos de aminoácidos 125-137 de Bbk, así como sus equivalentes funcionales. "Equivalente funcional" quiere decir un péptido que posee una actividad biológica o característica inmunológica sustancialmente similar a la del dominio BH3 de Bbk, y pretende incluir los "fragmentos", "variantes", "análogos", "homólogos" o "derivados químicos" que poseen tal actividad o característica. Los equivalentes funcionales del dominio BH3 de Bbk, por tanto, pueden no compartir una secuencia de aminoácidos idéntica, y son posibles las sustituciones de aminoácidos conservativas o no conservativas, de aminoácidos convencionales o no convencionales.

La referencia aquí a una sustitución de aminoácidos "conservativa" pretende significar la intercambiabilidad de los residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, glicocola, alanina, valina, leucina e isoleucina forman un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas; serina y treonina son aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxiladas; asparagina y glutamina son aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida; fenilalanina, tirosina y triptófano son aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas; lisina, arginina e histidina son aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas; ácido aspártico y ácido glutámico son aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas; y cisteína y metionina son aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre. El intercambiar un aminoácido de un grupo dado con otro aminoácido de ese mismo grupo se consideraría una sustitución conservativa. Los grupos de sustituciones conservativas preferidas incluyen asparagina-glutamina, alanina-valina, lisina-arginina, fenilalanina-tirosina y valina-leucina-isoleucina.

En realizaciones adicionales de la invención, se proporcionan péptidos que tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

2

que corresponden a mutantes puntuales de alanina como se muestra en la Figura 9, que también demuestran una función de destrucción celular de Bbk significativa. El dominio BH3 de Bbk descrito aquí está implicado exclusivamente tanto en la destrucción celular como en la actividad de unión a Bak de Bbk.

Es probable que la importancia funcional del dominio BH3 de Bbk esté relacionada con su capacidad para mediar en una o más interacciones proteína/proteína con otros miembros de la familia de Bcl-2, o con otra(s) proteína(s) celular(es) todavía sin identificar. El presente inventor no pretende limitarse por una teoría particular; sin embargo, independientemente de su(s) mecanismo(s) de acción, el dominio BH3 de Bbk es de importancia fundamental en Bbk para mediar en estas interacciones proteína/proteína.

Los agentes capaces de modular las interacciones proteína/proteína mediadas por el dominio BH3 de Bbk pueden incluir péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk, así como mutantes del dominio BH3 de Bbk o de las proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk. Un "mutante", como se usa aquí, se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la del péptido o proteína natural en al menos un aminoácido. Los mutantes pueden tener la misma actividad biológica e inmunológica que el péptido del dominio BH3 de Bbk natural o la proteína natural. Sin embargo, la actividad biológica o inmunológica de los mutantes puede diferir o no estar presente. Por ejemplo, un mutante del dominio BH3 de Bbk puede carecer de la actividad biológica que caracteriza al péptido del dominio BH3 de Bbk natural, pero puede ser útil como antígeno para generar anticuerpos contra el dominio BH3 de Bbk o para la detección o purificación de anticuerpos contra el dominio BH3 de Bbk, o como un agonista (competitivo o no competitivo), antagonista o agonista parcial de la función del péptido del dominio BH3 de Bbk natural.

La modulación de las interacciones proteína/proteína mediadas por el dominio BH3 de Bbk se puede llevar a cabo también mediante agonistas o antagonistas de los péptidos del dominio BH3 de Bbk. Se lleva a cabo el cribado de bibliotecas peptídicas, bibliotecas de compuestos y otros bancos de información para identificar agonistas o antagonistas de la función de las proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk, con ensayos para detectar la capacidad de los agonistas o antagonistas potenciales de inhibir o aumentar la unión del dominio BH3 de Bbk, p.ej., la homodimerización o heterodimerización del dominio BH3 de Bbk.

Por ejemplo, se pueden usar ensayos de cribado de elevado rendimiento para identificar compuestos que modulan la función de unión a proteínas del dominio BH3 de Bbk. Tales ensayos de cribado facilitan la identificación de los compuestos que aceleran o inhiben la apoptosis influyendo en las interacciones proteína/proteína mediadas por el dominio BH3 de Bbk. Por ejemplo, un cribado in vitro de compuestos que alteran la interacción del dominio BH3 de Bbk con Bak comprende placas multipocillo revestidas con Bak que se incuban con una sonda del péptido del dominio BH3 de Bbk marcada en presencia de uno o más compuestos a ensayar. Las moléculas que alteran específicamente la interacción podrían, en principio, unirse al dominio "ligando" BH3 de Bbk o al dominio "receptor" en Bak. Cada clase de compuesto sería un agente candidato modulador de la apoptosis.

Así, la invención proporciona un método para cribar en busca de un agente capaz de modular la apoptosis, que comprende revestir una placa multipocillo con Bak e incubar la placa multipocillo revestida con una sonda del péptido del dominio BH3 de Bbk marcada en presencia de un agente que se desea ensayar, en el que la alteración de la interacción del dominio BH3 de Bbk con Bak indica que dicho agente es capaz de modular la apoptosis. Los agentes identificados mediante este método son también realizaciones contempladas de la invención.

Los marcadores adecuados incluyen un marcador detectable tal como una enzima, isótopo radiactivo, compuesto fluorescente, compuesto quimioluminiscente o compuesto bioluminiscente. Las personas de experiencia habitual en la técnica conocerán otros marcadores adecuados, o serán capaces de determinarlos mediante el uso de experimentación rutinaria. Además, la unión de estos marcadores a los péptidos se lleva a cabo mediante el uso de métodos estándar conocidos en la técnica.

Un cribado de velocidad elevada de agentes que se unen directamente al dominio BH3 de Bbk puede emplear bibliotecas combinatorias inmovilizadas o "marcadas". Los agentes que se unen específicamente a tales bibliotecas son candidatos a ensayar en función de su capacidad de bloquear las interacciones Bbk/Bak. Como se discutió anteriormente, tales agentes pueden funcionar como inhibidores de la apoptosis inhibiendo directamente la función de Bbk (y/o Bbk/Bak), o incrementando la actividad efectiva de Bcl-2 endógeno (o de otro miembro de la familia de Bcl-2). Tales agentes serían útiles para inhibir la apoptosis anormal en los trastornos degenerativos o tras la lesión isquémica.

Los anticuerpos contra los péptidos del dominio BH3 de Bbk de la invención se pueden usar para cribar bibliotecas de expresión de cADN, para identificar los clones que contienen insertos de cADN que codifican proteínas estructuralmente relacionadas, con inmunorreactividad cruzada, que pueden ser miembros de la familia de proteínas del dominio BH3 de Bbk. Se conoce en la técnica el cribado de bibliotecas de expresión de cADN y ARNm. De forma similar, se usan anticuerpos contra los péptidos del dominio BH3 de Bbk para identificar o purificar proteínas con inmunorreactividad cruzada relacionadas con este dominio, o para detectar o determinar la cantidad de proteínas que contienen el dominio BH3 de Bbk en una célula o población de células, por ejemplo, en tejidos o células, tales como linfocitos obtenidos de un paciente. Los métodos conocidos para tales medidas incluyen la inmunoprecipitación de los extractos celulares seguida de PAGE, la detección in situ mediante métodos inmunohistoquímicos, y métodos de ELISA, todos los cuales se conocen bien en la técnica.

La modulación de la apoptosis según la invención incluye métodos que emplean polinucleótidos complementarios específicos que son complementarios para toda o parte de las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk descrito aquí. Tales polinucleótidos complementarios pueden incluir adiciones, deleciones, sustituciones o transposiciones de nucleótidos, con tal de que persista la hibridación específica a la secuencia seleccionada como objetivo. Se contemplan como polinucleótidos complementarios según la invención los oligonucleótidos de ARN o ADN complementarios solubles que pueden hibridar específicamente con especies de ARNm que codifican proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk, y que evitan la transcripción de las especies de ARNm y/o la traducción del polipéptido codificado. La producción de proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk se inhibe mediante los polinucleótidos complementarios según la invención, y tales polinucleótidos complementarios pueden inhibir la apoptosis, la senescencia y similares, y/o invertir el fenotipo transformado de las células. Se puede usar un casete de expresión heterólogo para producir polinucleótidos complementarios en una célula transfectada o transgénica. Los polinucleótidos complementarios también se pueden administrar como oligonucleótidos solubles al medio externo de la célula seleccionada como objetivo, tal como el medio de cultivo de las células in vitro o el líquido intersticial (p.ej., a través del sistema circulatorio) in vivo. Los polinucleótidos complementarios y sus usos son conocidos para los expertos, y se describen, por ejemplo, en Melton, D.A., Ed, Antisense RNA and DNA, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (1988).

La actividad biológica predicha de los agentes identificados según la invención varía dependiendo de las suposiciones hechas con respecto al mecanismo de la función de Bbk/Bak. Por ejemplo, se prediría que un agente que se una firmemente al dominio BH3 de Bbk inhibiese la función de Bbk (y quizás de Bbk/Bak). Suponiendo que Bbk (y/o Bbk/Bak) sea la molécula reguladora de la muerte celular activa, un agente que se una firmemente al dominio BH3 de Bbk puede inhibir la función de Bbk. Tales agentes podrían, por lo tanto, exhibir actividad anti-apoptótica en condiciones en las que Bbk tiene un efecto apoptótico demostrado. Los agentes de esta clase podrían tener utilidad para tratar enfermedades caracterizadas por una muerte celular excesiva o inadecuada, que incluyen, por ejemplo, las enfermedades neurodegenerativas y la lesión que resulta de la isquemia.

También se proporcionan moléculas peptidomiméticas del péptido del dominio BH3 de Bbk en la presente invención, y pueden actuar como fármacos para la modulación de la apoptosis, por ejemplo, bloqueando la función de las proteínas que comprenden el dominio BH3 de Bbk o interfiriendo con las interacciones mediadas por el dominio BH3 de Bbk. Se entiende habitualmente en la industria farmacéutica que las moléculas peptidomiméticas incluyen fármacos no peptídicos que tienen propiedades análogas a las del péptido mimetizado. Los principios y prácticas del diseño de moléculas peptidomiméticas se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Fauchere J., Adv. Drug Res. 15: 29 (1986); y Evans et al., J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Se pueden usar moléculas peptidomiméticas que albergan una similitud estructural hacia los péptidos terapéuticamente útiles para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Típicamente, tales moléculas peptidomiméticas tienen uno o más enlaces peptídicos sustituidos opcionalmente con un enlace que puede conferir propiedades deseables, tales como resistencia a la ruptura química in vivo. Tales enlaces pueden incluir -CH_{2}NH-, -CH_{2}S-, -CH_{2}-CH_{2}-, -CH=CH-, -COCH_{2}-, -CH(OH)CH_{2}- y -CH_{2}SO-. Las moléculas peptidomiméticas pueden exhibir propiedades farmacológicas incrementadas (semivida biológica, velocidades de absorción, etc.), especificidad diferente, estabilidad incrementada, ahorro en la producción, antigenicidad disminuida y similares, que hacen su uso particularmente deseable como agentes terapéuticos.

La inmunización de animales con péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk sólo o en conjunción con adyuvantes mediante métodos conocidos puede producir anticuerpos específicos para el péptido del dominio BH3 de Bbk. Se puede utilizar para este fin el antisuero obtenido mediante procedimientos convencionales. Por ejemplo, se puede inmunizar un mamífero, tal como un conejo, con un péptido que comprende el dominio BH3 de Bbk, por lo que se induce la formación de anticuerpos policlonales contra él. También se pueden generar anticuerpos monoclonales mediante el uso de procedimientos conocidos. Tales anticuerpos se pueden usar según la invención para detectar la presencia y cantidad de los péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk.

Los péptidos del dominio BH3 de Bbk de la invención se pueden usar para la detección de Bbk y otras proteínas por medio de ensayos estándar, que incluyen radioinmunoanálisis y enzimoinmunoanálisis.

Los expertos apreciarán que la estructura química exacta de los péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk variará dependiendo de varios factores. Por ejemplo, una proteína dada se puede obtener en forma de una sal ácida o básica, o en forma neutra, ya que en la molécula se hallan grupos carboxilo y amino ionizables. Para los fines de la invención, por tanto, se pretende que cualquier forma de los péptidos que comprenden el dominio BH3 de Bbk que mantienen la actividad terapéutica o diagnóstica del péptido natural estén dentro del alcance de la presente invención.

La expresión "sustancialmente homólogo", como se usa aquí, se refiere a la capacidad de una primera secuencia de ADN que codifica Bbk para hibridar con una segunda secuencia de ADN que codifica lo anteriormente mencionado, en condiciones rigurosas, por ejemplo, a alrededor de 0,1x tampón de citrato sódico-cloruro sódico (SSC) a una temperatura de alrededor de 65ºC. La expresión "sustancialmente puro" significa que la proteína o molécula de interés está esencialmente exenta de cualquier otro constituyente biológico detectable. Un "fragmento" de una molécula tal como Bbk pretende referirse a cualquier variante de la molécula que posee la actividad biológica de la proteína Bbk. Una "variante" de una molécula pretende referirse a una molécula sustancialmente similar en estructura y actividad biológica o características inmunológicas a la molécula completa, o a un fragmento suyo. Así, con tal de que dos moléculas posean una actividad similar, se consideran variantes, tal como esa expresión se usa aquí, incluso si la composición o estructura secundaria, terciaria o cuaternaria de una de las moléculas no es idéntica a la que se halla en la otra, o si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica. Un "análogo" de una molécula pretende referirse a una molécula sustancialmente similar en función a la molécula completa o a un fragmento suyo. Como se usa aquí, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando contiene restos químicos adicionales que no son normalmente parte de la molécula. Tales restos pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, etc. de la molécula. Los restos pueden disminuir de forma alternativa la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Los restos capaces de actuar como mediadores de tales efectos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). Los procedimientos para unir tales restos a una molécula se conocen bien en la técnica. El término "modular" quiere decir, para los fines de la presente invención, la inducción de la apoptosis mediante la administración de la proteína Bbk de la invención, un fragmento activo suyo, un equivalente funcional suyo, y/o la inhibición o inducción de la apoptosis mediante la administración de un híbrido de Bbk o un mutante de Bbk, o la administración de un vector que contiene cADN que codifica cualquiera de lo anteriormente mencionado, a las células particulares de un individuo que padece cualquier trastorno degenerativo que da como resultado un crecimiento celular inadecuado, por ejemplo, que incluye linfomas, tumores genotípicos, cáncer, o trastornos caracterizados por una muerte celular inadecuada, por ejemplo, que incluye SIDA que da como resultado la muerte de las células T, para estabilizar la proliferación celular inadecuada o la muerte celular inadecuada, y preferiblemente para restablecer el comportamiento celular normal.

El término "administración" quiere decir cualquier modo de administración que da como resultado la administración del agente terapéutico a través de la membrana celular y en la célula deseada. El sitio de administración y las células los seleccionará alguien de experiencia habitual en la técnica basándose en la comprensión del trastorno degenerativo particular a tratar. Además, alguien de experiencia habitual en la técnica puede determinar y optimizar la dosis, frecuencia de dosis y duración del ciclo de tratamiento dependiendo del trastorno degenerativo particular a tratar. Alguien de experiencia habitual en la técnica puede seleccionar fácilmente también el modo de administración particular y puede incluir, por ejemplo, un modo oral, intravenoso, subcutáneo, intramuscular, etc., con el requisito de que el agente terapéutico cruce la membrana celular. El agente terapéutico de la presente invención puede ser la proteína Bbk y/o sus equivalentes funcionales y/o híbridos de Bbk o mutantes de Bbk y/o un vector de contiene cADN que codifica lo anteriormente mencionado. La expresión "agente terapéutico" quiere decir la presente proteína Bbk, sus fragmentos, equivalentes funcionales y/o híbridos o mutantes, así como los vectores que contienen cADN que codifica cualquiera de lo anteriormente mencionado. El agente terapéutico presente se puede administrar solo o en combinación y/o de forma concurrente con otros fármacos adecuados y/o ciclos de terapia. La expresión "trastorno degenerativo" quiere decir, para los fines de esta invención, cualquier trastorno caracterizado por una proliferación celular inadecuada o una muerte celular inadecuada o en algunos casos, ambas. La expresión "proliferación celular inadecuada" quiere decir un incremento estadísticamente significativo del número de células comparado con la proliferación de ese tipo particular de células en la población normal. También están incluidos los trastornos en los cuales una célula está presente y/o persiste en una localización inadecuada, p.ej., la presencia de fibroblastos en tejido pulmonar tras una lesión pulmonar aguda. Por ejemplo, tales células incluyen células cancerosas que exhiben propiedades de invasión y metástasis y que son sumamente anaplásicas. Tales células incluyen, pero no se limitan a, células cancerosas que incluyen, por ejemplo, células tumorales. La expresión "muerte celular inadecuada" quiere decir una disminución estadísticamente significativa del número de células comparado con la presencia de ese tipo particular de células en la población normal. Tal representación disminuida puede ser debida a un trastorno degenerativo particular, que incluye, por ejemplo, SIDA (VIH), que da como resultado la muerte inadecuada de las células T, enfermedades autoinmunitarias que se caracterizan por una muerte celular inadecuada. La expresión "enfermedad autoinmunitaria" quiere decir un trastorno provocado por una respuesta inmunitaria dirigida contra autoantígenos. Tales enfermedades se caracterizan por la presencia de autoanticuerpos circulantes o inmunidad mediada por células contra autoantígenos, junto con lesiones inflamatorias provocadas por células inmunocompetentes o complejos inmunitarios en tejidos que contienen los autoantígenos. Tales enfermedades incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide.

El término "inhibición" quiere decir, para los fines de esta invención, el resultado conseguido administrando una cantidad de un agente terapéutico que contiene híbridos de Bbk o mutantes de Bbk eficaces para inhibir la apoptosis en un individuo que padece un trastorno degenerativo caracterizado por una muerte celular inadecuada. La inhibición de la apoptosis se consigue cuando el número del tipo particular de células afectadas permanece estable o se incrementa su número hasta un nivel dentro del intervalo observado en la población normal de células. El término "estable" quiere decir el estado alcanzado cuando ya no se observa una disminución estadísticamente significativa del número de células en el individuo que se está tratando, comparado con el número de células observado al inicio del ciclo de tratamiento. El término "inducción" quiere decir, para los fines de esta invención, el resultado conseguido mediante la administración de una cantidad de un agente terapéutico que contiene el Bbk de la invención, eficaz para inducir la apoptosis en las células de un individuo que padece un trastorno degenerativo caracterizado por una proliferación celular inadecuada. La inducción de la apoptosis se consigue cuando el número de células permanece estable o disminuye hasta un nivel dentro del intervalo observado en la población normal de células. Alguien de experiencia habitual en la técnica puede determinar fácilmente si se ha conseguido la inducción de la apoptosis.

La expresión "híbrido de Bbk" quiere decir, para los fines de esta invención, las proteínas que son proteínas híbridas de las presentes proteínas Bbk, sus fragmentos, y/o los equivalentes o mutantes funcionales, con otras proteínas asociadas a la apoptosis codificadas por genes que incluyen, por ejemplo, Bcl-2, Bax, c-myc, LMW5-HL, Bbk, Bcl-X_{L}, Bcl-X_{S}, BHRF-1, Mcl-1, A1 y ced9, sus fragmentos y/o sus equivalentes funcionales, para producir una proteína que exhibe actividad de inducción o inhibición de la apoptosis incrementada, disminuida o intermedia comparado con la actividad de Bbk solo. Tales híbridos se pueden producir, por ejemplo, fusionando la primera mitad de la región codificante del cADN de bbk con la segunda mitad de la región codificante del cADN de bcl-2, o bax, o bcl-x_{L}, o bcl-x_{S} o viceversa. Además, añadiendo o sustituyendo segmentos de bcl-2, bax, bcl-x_{L}, o bcl-x_{S} al cADN de bbk, se pueden generar productos génicos quiméricos de valor terapéutico. Alguien de experiencia habitual en la técnica puede producir y emplear fácilmente tales híbridos mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica. Alguien de experiencia habitual en la técnica puede determinar fácilmente si un híbrido particular exhibe actividad de inducción o inhibición de la apoptosis incrementada, disminuida o intermedia mediante el uso de métodos de cribado conocidos y como se describe aquí. La expresión "comportamiento celular normal" quiere decir, para los fines de esta invención, células en las que la apoptosis transcurre de forma normal. El comportamiento celular normal se observa en un organismo que es capaz de eliminar las células senescentes, dañadas o anormales que podrían interferir con la función de los órganos o transformarse en tumores. La apoptosis que transcurre de forma normal representa una respuesta celular coordinada hacia estímulos nocivos que no son letales de manera inmediata.

El término "paciente" o "individuo" quiere decir, para los fines de la presente invención, animales, que incluyen humanos y mamíferos, que padecen un trastorno degenerativo. La expresión "mutante de Bbk" quiere decir, para los fines de la presente invención, un mutante de Bbk que exhibe la actividad inversa (inhibición de la apoptosis) de la proteína Bbk de la invención debido a la sustitución de uno o más aminoácidos o de los nucleótidos correspondientes. La expresión "proteína Bbk asociada a apoptosis" quiere decir, para los fines de la presente invención, tanto la proteína natural aislada como la producida de forma recombinante aislada (es decir, Bbk sintético) que exhibe, entre otros, inducción de la apoptosis de tejido humano que incluye, por ejemplo, células tumorales y líneas de células humanas establecidas, y de tejidos de otros animales que incluyen mamíferos. Esta expresión incluye cualquier análogo, homólogo, mutante o derivado de Bbk natural aislado que incluye fragmentos que tienen menos del número natural de aminoácidos, tales como fragmentos parciales de Bbk natural o sintético que mantienen las características biológicas o inmunológicas del polipéptido descrito en esta solicitud. Esta expresión también incluye cualquier péptido que contiene la secuencia de una proteína Bbk natural aislada, o de un análogo u homólogo suyo, junto con uno o más aminoácidos flanqueantes, que mantiene las características biológicas o inmunológicas de la proteína Bbk de la invención.

Construcción e identificación de anticuerpos generados contra Bbk, sus equivalentes funcionales, fragmentos, híbridos o mutantes

En la siguiente descripción, se hará referencia a diversas metodologías conocidas para los expertos en la técnica de inmunología. Las obras de referencia clásicas que exponen los principios generales de la inmunología incluyen la obra de Catty, D., Antibodies. A Practical Approach, vol. 1, IRL Press, Washington, DC (1988); Klein, J., Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, Nueva York (1982); Kennett, et al., Monoclonal Antibodies. Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Nueva York (1980); Campbell, A., "Monoclonal Antibody Technology", en: Burdon, R., et al., Eds., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 13, Elsevier, Amsterdam (1984); y Eisen, H.N., en: Davis, B.D., et al., Eds., Microbiology, 3ª ed., Harper & Row, Filadelfia (1980).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unir así la molécula al anticuerpo. El término "epítopo" pretende referirse a la porción de un hapteno que puede ser reconocida por un anticuerpo y unirse al anticuerpo. Un antígeno puede tener un epítopo, o más de uno. Un "antígeno" es capaz de inducir en un animal la producción de un anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. La reacción específica mencionada anteriormente pretende indicar que el antígeno reaccionará, de una manera sumamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente, y no con la multitud de otros anticuerpos que se pueden provocar mediante otros antígenos.

La expresión "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab), tal como se usa aquí, pretende incluir moléculas intactas así como sus fragmentos (tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab y F(ab)_{2}) que son capaces de unirse a un antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab)_{2} carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión inespecífica a tejidos que un anticuerpo intacto (Wahl, et al., J. Nucl. Med. 24:16-325 (1983)).

Los anticuerpos de la presente invención tienen especificidad hacia uno o más epítopos presentes en el péptido de Bbk, o un idiotipo en el Bbk presente. Los anticuerpos de la invención pueden ser policlonales o monoclonales, con tal de que se produzcan con el presente polipéptido de Bbk o su fragmento como inmunógeno. Ambos tipos de anticuerpos se pueden utilizar en las aplicaciones descritas aquí.

Los presentes anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de la presente proteína Bbk en una muestra de tejido humano. La presente proteína Bbk se puede detectar poniendo en contacto la muestra con una cantidad eficaz para la formación de imágenes del presente anticuerpo apropiado marcado de forma detectable y detectando el marcador, por lo que se establece la presencia de la proteína Bbk en la muestra. La detección se puede llevar a cabo mediante formación de imágenes in vivo. La proteína Bbk se puede detectar también mediante técnicas de inmunoanálisis conocidas, que incluyen, por ejemplo, RIA, ELISA etc., mediante el uso de anticuerpos apropiados según la invención.

Los anticuerpos de la presente invención se preparan mediante cualquiera de una diversidad de métodos conocidos. Por ejemplo, se pueden administrar a un mamífero células que expresan la proteína Bbk para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales que son capaces de unirse a la proteína Bbk. Por ejemplo, la proteína Bbk o un fragmento suyo se sintetiza químicamente y se purifica mediante HPLC para dejarlo sustancialmente exento de contaminantes. Tal preparación se introduce después en un animal para producir antisueros policlonales de actividad sumamente específica.

Se pueden generar anticuerpos policlonales en cualquier animal adecuado, que incluye, por ejemplo, ratones, conejos o cabras. Se puede inyectar el péptido inmunógeno de Bbk o su fragmento sólo o unido a vehículos inmunoactivantes apropiados, tales como hemocianina de lapa californiana (KLH). Véase Catty, D., Ed., Antibodies, A Practical Handbook, vols. I y II, IRL Press, Washington, DC (1988).

Se pueden preparar anticuerpos monoclonales de diversas maneras mediante el uso de técnicas bien conocidas por las personas de experiencia habitual en la técnica. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales mediante el uso de la tecnología de hibridomas (Kohler, et al., Nature 256:495 (1975); Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler, et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., págs. 563-681 (1981)); Roger H. Kennett, et al., Eds., Monoclonal Antibodies - Hybridomas: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press (1980). En general, tales procedimientos implican la inmunización de un animal con la presente proteína Bbk, o un fragmento suyo. Se espera que los esplenocitos de tales animales se extraigan y se fusionen con una línea adecuada de células de mieloma. Se puede emplear cualquier línea adecuada de células de mieloma de acuerdo con la presente invención. Tras la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen de forma selectiva en medio HAT, y después se clonan mediante dilución limitante como describió Wands, et al., Gastroenterol. 80:225-232 (1981). Las células de hibridoma obtenidas por medio de tal selección se ensayan después para identificar los clones que secretan anticuerpos capaces de unirse a la proteína Bbk.

Por medio de la aplicación de los métodos anteriormente descritos, se pueden obtener líneas celulares adicionales capaces de producir anticuerpos que reconocen los epítopos de la presente proteína Bbk.

Por ejemplo, se pueden producir y aislar fácilmente hibridomas adicionales que producen anticuerpos monoclonales que permiten la detección de la presente proteína Bbk con un cribado mínimo. Los hibridomas que producen anticuerpos monoclonales específicos para los epítopos que se hallan en la presente proteína Bbk se producen de manera más eficaz inmunizando primero un animal a partir del cual se pueden producir hibridomas, tal como, por ejemplo, un ratón Balb/c, con inyecciones subcutáneas iniciales de adyuvante de Freund, seguido de inyecciones de refuerzo a los pocos días. La fusión se puede llevar a cabo mediante el uso de cualquiera de las técnicas conocidas normalmente para las personas de experiencia habitual en la técnica. El cribado de los hibridomas para determinar cuáles están produciendo anticuerpos monoclonales específicos para el péptido presente es sencillo, y se puede llevar a cabo en un formato de ELISA o RIA estándar. Por ejemplo, en un formato de cribado mediante RIA, el sobrenadante del cultivo, o el líquido ascítico de un hibridoma que produce anticuerpo monoclonal, se hace reaccionar con ^{125}I-péptido. El aislamiento de otros hibridomas que secretan mAbs de la misma especificidad que los descritos aquí se puede llevar a cabo mediante la técnica de cribado anti-idiotipo. Potocmjak, et al., Science 215:1637 (1982). Brevemente, un anticuerpo anti-idiotipo (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados en general con el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo. Se pueden preparar un anticuerpo Id inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (p.ej., cepa de ratón) que la fuente del mAb, con el mAb generado contra la presente proteína Bbk o su fragmento hacia el que se está preparando un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización produciendo un anticuerpo hacia estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id).

Mediante el uso de un anticuerpo anti-Id que es específico para los determinantes idiotípicos de un mAb dado, es posible entonces identificar otros clones de células B o de hibridomas que comparten ese idiotipo. La identidad idiotípica entre el producto de anticuerpo de dos clones hace sumamente probable que los productos de anticuerpo de los dos clones reconozcan los mismos epítopos antigénicos.

El anticuerpo anti-Id se puede usar también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal, por lo que se produce un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser idéntico de forma epitópica al mAb original que indujo el anti-Id.

Así, usando anticuerpos hacia los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de idéntica especificidad.

Por lo tanto, los mAbs generados contra la presente proteína Bbk se pueden usar para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Se usan células de bazo de tales ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que secretan mAbs anti-Id. Además, los mAbs anti-Id se pueden unir a un portador tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y usarlos para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para el epítopo del antígeno. Los mAbs anti-Id tienen así sus propios epítopos idiotípicos, o "idiotipos" estructuralmente similares al epítopo que se va a analizar.

Para la replicación, las células de hibridoma de esta invención se pueden cultivar in vitro o in vivo. La producción de títulos elevados de mAbs in vivo hace de éste el método de producción preferido. Brevemente, las células de los hibridomas individuales se inyectan de forma intraperitoneal en ratones BALB/c sensibilizados con pristano para producir liquido ascítico que contiene concentraciones elevadas de los mAbs deseados. Los mAbs de los isotipos IgM o IgG se pueden purificar a partir de tales líquidos ascíticos, o de los sobrenadantes de los cultivos, mediante el uso de métodos de cromatografía en columna bien conocidos para los expertos en la técnica.

Son de interés especial para la presente invención los anticuerpos que se producen en humanos, o que están "humanizados" (es decir, que no son inmunógenos en un humano) mediante tecnología recombinante o de otro tipo, de forma que no serán antigénicos en humanos, o se mantendrán en el suero circulante de un receptor durante un periodo de tiempo más largo.

Los anticuerpos humanizados se pueden producir, por ejemplo, sustituyendo una porción inmunógena de un anticuerpo con una porción correspondiente pero no inmunógena (es decir, anticuerpos quiméricos) (Robinson, et al., publicación de patente internacional PCT/US86/02269; Akira, et al., solicitud de patente europea 184.187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171.496; Morrison, et al., solicitud de patente europea 173.494; Neuberger, et al., solicitud PCT WO 86/01533, Cabilly, et al., solicitud de patente europea 125.023; Better, et al., Science 240:1041-1043 (1988); Liu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Liu, et al., J. Immunol. 139:3521-3526 (1987); Sun, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218 (1987); Nishimura, et al., Canc. Res. 47:999-1005 (1987); Wood, et al., Nature 314:446-449 (1985)); Shaw, et al., J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559 (1988). Se proporcionan revisiones generales de anticuerpos quiméricos "humanizados" en Morrison, S.L. (Science, 229:1202-1207 (1985)) y en Oi, et al., BioTechniques 4:214 (1986)).

Los anticuerpos "humanizados" adecuados se pueden producir de forma alternativa como describió Jones, et al., Nature 321:552-525 (1986); Verhoeyan, et al., Science 234:1534 (1988), y Beidler, et al., J. Immunol. 141:4053-4060 (1988).

La presente proteína Bbk, sus fragmentos, sus híbridos, los mutantes de Bbk, o los anticuerpos hacia ellos se pueden utilizar en inmunoanálisis para la detección de la proteína Bbk en una muestra de tejido humano. Por ejemplo, los anticuerpos contra la presente proteína Bbk se pueden usar para detectar la presente proteína Bbk en una muestra de tejido humano. Los inmunoanálisis pueden ser competitivos o de tipo sándwich, como es bien conocido por otra parte, y dependen de la formación de un inmunocomplejo anticuerpo-antígeno. Estos ensayos son bien conocidos para los expertos en la técnica.

Para los fines de los ensayos, se puede inmovilizar o marcar el anticuerpo o el antígeno. Existen muchos soportes a los que se puede unir el anticuerpo/antígeno para la inmovilización, y que se pueden usar en la presente invención. Los soportes conocidos incluyen, pero no se limitan a, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magnetita. La naturaleza del soporte puede ser soluble hasta cierto punto o insoluble para los fines de la invención. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros soportes adecuados para unir el anticuerpo o el antígeno, o serán capaces de determinarlos mediante el uso de experimentación rutinaria.

Dependiendo de la realización particular de la invención, se unirá uno o más de los anticuerpos o péptido(s) antigénico(s) con un marcador detectable tal como una enzima, isótopo radioactivo, compuesto fluorescente, compuesto quimioluminiscente o compuesto bioluminiscente.

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Las personas de experiencia habitual en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para unirlos a los anticuerpos o péptido(s) antigénico(s), o serán capaces de determinarlos mediante el uso de experimentación rutinaria. Además, la unión de estos marcadores a los anticuerpos o antígeno(s) se puede realizar mediante el uso de técnicas estándar conocidas normalmente para las personas de experiencia habitual en la técnica.

Los anticuerpos o péptido(s) antigénico(s) se pueden unir a una enzima. Esta enzima, a su vez, cuando se expone más tarde a su sustrato, reaccionará con el sustrato de manera que se producirá un resto químico que se puede detectar, por ejemplo, mediante medios espectrofotométricos o fluorimétricos. Los ejemplos de enzimas que se pueden usar para marcar de forma detectable son amilato deshidrogenasa, nucleasa de staphylococcus, \Delta5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, \alpha-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, \beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa.

La presencia de un anticuerpo o antígeno se puede detectar además marcando el anticuerpo o antígeno con un isótopo radiactivo. La presencia del isótopo radiactivo se puede determinar mediante métodos tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo. Los isótopos que son particularmente útiles son ^{3}H, ^{125}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{36}Cl, ^{57}Co, ^{59}Fe, ^{75}Se y ^{152}Eu.

Es posible detectar la presencia del anticuerpo o antígeno marcando el anticuerpo o péptido antigénico con un compuesto fluorescente. Cuando se expone el anticuerpo o péptido antigénico marcado de forma fluorescente a luz de la longitud de onda apropiada, se puede detectar su presencia debido a la fluorescencia del colorante. Entre los compuestos de marcado fluorescente más habituales están el isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

Otra manera en la que se puede marcar de forma detectable el anticuerpo o antígeno es uniéndolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo o péptido antigénico marcado de forma quimioluminiscente se determina después detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Los ejemplos de compuestos de marcado quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminol, éster de acridinio aromático, imidaxol, sal de acridinio, y éster de oxalato.

De forma similar, también se puede usar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo o péptido antigénico. La bioluminiscencia es un tipo especial de quimioluminiscencia que se halla en sistemas biológicos y en el que una proteína catalítica incrementa la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una molécula de unión bioluminiscente se determinaría detectando la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para los fines del marcado son luciferina, luciferasa y aecuorina.

Los anticuerpos o el/los péptido(s) antigénico(s) para el uso en el ensayo de la invención son adecuados idealmente para la preparación de un equipo. Tal equipo puede comprender un medio portador que está compartimentado para recibir en estrecha proximidad uno o más recipientes tales como viales, tubos y similares, y cada uno de dichos recipientes comprende uno de los distintos elementos a usar en el método.

Por ejemplo, uno de los recipientes puede comprender un primer anticuerpo unido a un soporte insoluble o parcialmente soluble. Un segundo recipiente puede comprender un segundo anticuerpo soluble marcado de forma detectable en forma liofilizada o en disolución. El medio portador puede contener también un tercer recipiente que comprende un tercer anticuerpo marcado de forma detectable en forma liofilizada o en disolución. Tal equipo se puede usar para ensayos de tipo sándwich.

Además, el medio portador puede contener también una diversidad de recipientes, cada uno de los cuales comprende cantidades predeterminadas diferentes del péptido de Bbk presente. Estos últimos recipientes se pueden usar entonces para preparar una curva patrón que se puede usar para interpolar los resultados obtenidos de la muestra que contiene la cantidad desconocida de la presente proteína Bbk.

Se puede llevar a cabo diagnóstico por imágenes in vitro o in vivo. El diagnóstico por imágenes in vitro se puede realizar con los marcadores mencionados previamente. El diagnóstico por imágenes in vivo se realiza con anticuerpos marcados de manera eficaz para el diagnóstico. La expresión "eficaz para el diagnóstico" significa que la cantidad administrada de anticuerpo marcado de forma detectable es suficiente para permitir la detección del sitio con presencia de proteína Bbk cuando se compara con una señal de fondo.

En general, la dosis de anticuerpo o antígeno(s) marcado(s) de forma detectable para el diagnóstico variará dependiendo de consideraciones tales como la edad, estado, sexo y grado de la enfermedad en el paciente, las contraindicaciones, si las hay, y otras variables, a ser ajustadas por el propio médico. La dosis puede variar de 0,01 mg/kg a 2000 mg/kg, preferiblemente 0,1 mg/kg a 1000 mg/kg.

La expresión "marcado de forma diagnóstica" significa que el anticuerpo tiene unido a él un marcador detectable de forma diagnóstica.

Existen muchos marcadores diferentes de diagnóstico por imágenes y métodos de marcado conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. Los ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden usar en la presente invención incluyen isótopos radiactivos e isótopos paramagnéticos.

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Para el diagnóstico por imágenes in vivo, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor importante al seleccionar un radionucleido dado. El radionucleido elegido debe tener un tipo de desintegración que sea detectable para un tipo dado de instrumento. En general, se puede utilizar cualquier método convencional para visualizar las imágenes diagnósticas de acuerdo con la invención.

Otro factor importante para seleccionar un radionucleido para el diagnóstico in vivo es que la semivida del radionucleido sea lo suficientemente larga, de forma que sea aún detectable en el momento de la absorción máxima por el objetivo, pero lo suficientemente corta de forma que se minimice la radiación nociva al hospedador. De forma ideal, un radionucleido usado para el diagnóstico por imágenes in vivo carecerá de una emisión de partículas, y producirá un gran número de fotones en un intervalo de 140-200 keV, que se pueden detectar fácilmente mediante cámaras gamma convencionales.

Para el diagnóstico in vivo, los radionucleidos se pueden unir al anticuerpo o antígeno directa o indirectamente mediante el uso de un grupo funcional intermedio. Los grupos funcionales intermedios que se usan a menudo para unir radioisótopos que existen como iones metálicos a anticuerpos o antígenos son ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Los ejemplos típicos de iones metálicos que se pueden unir a inmunoglobulinas son ^{99m}Tc, ^{123}I, ^{111}In, ^{131}I, ^{97}Ru, ^{67}Cu, ^{67}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr y ^{201}Tl.

Los anticuerpos usados en el método de la invención se pueden marcar también con isótopos paramagnéticos para los fines del diagnóstico in vivo. Los elementos que son particularmente útiles (como en las técnicas de diagnóstico por imágenes mediante resonancia magnética (MRI)) de esta manera incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.

Las preparaciones de los anticuerpos para diagnóstico por imágenes para administración incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceite vegetal tal como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, que incluyen medios salinos y tamponados, vehículos parenterales que incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen regeneradores de nutrientes y líquidos, regeneradores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También puede haber presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Véase, en general, Remington's Pharmaceutical Science, 16ª ed. Mac Eds. 1980.

Por supuesto, la proteína Bbk expresada es una proteína intracelular. Por lo tanto, los expertos reconocerán que los métodos diagnósticos y terapéuticos in vivo que emplean los anticuerpos de la invención pueden requerir algún mecanismo mediante el cual tales anticuerpos puedan detectar Bbk en la célula. Un método tal es introducir los anticuerpos o sus fragmentos en la propia célula a través de la membrana celular. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, uniendo el anticuerpo a un ligando para el cual la célula seleccionada como objetivo contiene receptores. El anticuerpo puede ser transportado así hacia la membrana celular o a través de la membrana celular junto con el ligando. Los ligandos adecuados incluyen factores de crecimiento y citocinas que son interiorizados tras la unión al receptor. Los factores de crecimiento adecuados incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento tumoral \alpha (TGF-\alpha), factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), insulina, y factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2 (IGF-1 e IGF-2). Las citocinas adecuadas incluyen G-CSF, GM-CSF, eritropoyetina, IL-1 e IL-2. Se observa que también existen receptores que portan nutrientes y vitaminas hacia las células. Estos nutrientes son adecuados para el uso como ligandos en la presente invención, e incluyen folato, dihidrofolato, tetrahidrofolato y vitamina B12.

La elección de un ligando portador dependerá de diversos factores, como apreciarán los expertos. Estos incluyen, por ejemplo, la cinética del ligando y su receptor, y del transporte global, que puede incluir el pasivo o el activo, y se prefieren los ligandos transportados de manera activa. Los medios para unir el anticuerpo al ligando variarán también dentro de ciertos límites, y pueden ser, por ejemplo, uniones covalentes o iónicas, teniendo en cuenta que tal unión no debería alterar de manera inaceptable la afinidad ligando-receptor.

Los ejemplos de receptores adecuados para tales aplicaciones incluyen el receptor para lipoproteína de baja densidad (LDL), que se ha demostrado que contiene toda la información necesaria para la endocitosis del receptor, Davis et al., J. Cell Biol. 107(6/3): resumen nº 3112 (1988), así como los receptores conocidos específicos del cerebro, tales como los de dopamina. A este respecto, se apreciará que el ligando puede ser él mismo un anticuerpo o fragmento específico para el receptor, al que puede estar conjugado el anticuerpo de la invención.

Además, los expertos pueden hallar particularmente deseable emplear fragmentos de anticuerpo de la invención (tales como, por ejemplo, los fragmentos Fab o F(ab')_{2}), que es menos probable que interfieran con la interacción ligando-receptor, y pueden ser transportados más fácilmente a través de la membrana celular. Los anticuerpos de cadena única pueden resultar ser más preferibles por estas y otras razones, como apreciarán los expertos.

Cuando un anticuerpo se debe transportar a la membrana de la célula o hacia la célula como se describió anteriormente, se preferirá marcar de forma diagnóstica o terapéutica el anticuerpo, de manera que el marcador será relativamente más eficaz cuando el anticuerpo se una a su sitio antigénico en la proteína Bbk. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el empleo de un marcador que se haga activo o detectable como resultado de la formación del complejo antígeno-anticuerpo. De forma alternativa, se puede marcar el propio anticuerpo de forma que la formación del complejo antígeno-anticuerpo induzca un cambio conformacional en el anticuerpo para exponer, o exponer más, el marcador que previamente no estaba expuesto, o que estaba menos expuesto. Todos los criterios anteriores, y otros, serán aparentes para los expertos en llevar a cabo estos aspectos de la invención.

También es posible utilizar liposomas que tienen los anticuerpos de la presente invención en sus membranas para administrar específicamente los anticuerpos al área seleccionada como objetivo. Estos liposomas se pueden producir de forma que contienen, además del anticuerpo, agentes terapéuticos tales como fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas, que actuarían en el sitio seleccionado como objetivo.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de la presente proteína Bbk, sus equivalentes funcionales, fragmentos y/o híbridos y/o mutantes, así como los vectores que contienen cADN que codifica uno o más de lo anteriormente mencionado, son útiles para tratar a pacientes que padecen trastornos degenerativos caracterizados por una muerte celular inadecuada o una proliferación celular inadecuada.

Los híbridos de Bbk incluyen híbridos de Bbk y, por ejemplo, de Bcl-2, ced-9, Bcl-X_{L}, Bcl-X_{S}, Bax, Mcl-1, c-myc, LMW5-HL, BHRF-1, Bak, Bik y A1. Tales híbridos exhiben actividad de inducción o inhibición de la apoptosis incrementada, disminuida o intermedia comparado con la actividad de Bbk solo. Estos híbridos pueden ser seleccionados, producidos y empleados fácilmente por alguien de experiencia habitual en la técnica. Las composiciones farmacéuticas según la invención contendrán así una cantidad terapéuticamente eficaz de la presente proteína Bbk, sus equivalentes funcionales, fragmentos y/o híbridos y/o mutantes, y pueden contener opcionalmente uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables, conocidos para las personas de experiencia habitual en la técnica. La administración, dosis y frecuencia, y duración del ciclo de tratamiento pueden ser optimizadas fácilmente para un paciente particular por alguien de experiencia habitual en la técnica. Por ejemplo, la presente composición farmacéutica se puede formular en forma de suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles, como se describió anteriormente, por ejemplo para disoluciones para administración intravenosa.

Aplicaciones terapéuticas

La muerte celular programada es un proceso en el que las células experimentan condensación y fragmentación nuclear durante el desarrollo normal de los tejidos y órganos sanos. El proceso es fundamental para mantener el equilibrio entre el crecimiento de las células nuevas y la eliminación de las células viejas. Cuando la apoptosis no funciona correctamente, provocando que las células mueran de forma prematura o evitando que mueran cuando está programado, se desarrollan diversos trastornos.

La presente proteína Bbk asociada a la apoptosis, sus equivalentes funcionales, fragmentos y/o híbridos y/o mutantes, así como los vectores que contienen el cADN que codifica lo anteriormente mencionado, son útiles para tratar trastornos degenerativos, los cuales se caracterizan por una muerte celular inadecuada o una proliferación celular inadecuada. Los trastornos particulares pueden implicar diferentes tipos de células, por lo que puede ser deseable inducir la apoptosis en un tipo de células a la vez que se inhibe la apoptosis en el otro. Por ejemplo, puede ser deseable inhibir la apoptosis en células de tejido pulmonar en un paciente que padece lesión pulmonar aguda administrando la proteína mutante de Bbk de la invención (o llevando a cabo la expresión de tal proteína mutante de Bbk en esas células), a la vez que se induce la apoptosis en los fibroblastos que pueden estar presentes en el pulmón debido a la respuesta inflamatoria, administrando la proteína Bbk de la invención (o llevando a cabo la expresión de la proteína Bbk en esas células).

Los agentes terapéuticos de la presente invención se pueden administrar como se discutió anteriormente, con el requisito de que el agente debe atravesar la membrana celular. El agente terapéutico se puede administrar solo, o en combinación o durante el ciclo de tratamiento con otras terapias aceptables conocidas en la técnica para tratar un trastorno particular. Por ejemplo, los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar para inducir la apoptosis en un paciente de cáncer que se está sometiendo también a terapia antitumoral clásica que incluye, por ejemplo, radioterapia, quimioterapia y tratamiento con fármacos antineoplásicos que incluyen, por ejemplo, inhibidores de topoisomerasas, agentes alquilantes, antimetabolitos y antagonistas hormonales. Además, los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar también de forma concurrente con la terapia génica. Por ejemplo, los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar a un paciente que padece un trastorno degenerativo del sistema nervioso central a la vez que el paciente se somete de forma concurrente a terapia génica para restablecer las hormonas neurotróficas.

La apoptosis generalizada prematura (muerte celular inadecuada) provoca gran parte del daño asociado a los trastornos degenerativos que incluyen, por ejemplo, SIDA, quimioterapia y radiación, y atrofia tisular. En los pacientes de SIDA, los linfocitos están activados incluso en la fase asintomática de la infección por VIH, y esas células mueren de forma prematura mediante apoptosis. Tales trastornos pueden admitir el tratamiento mediante la administración de una proteína mutante de Bbk.

Los expertos apreciarán que la administración de las diversas proteínas de la invención a células o tejidos particulares seleccionados como objetivo, como se describe aquí, pretende abarcar la administración de las propias proteínas así como la expresión por las células o tejidos seleccionados como objetivo de las secuencias de nucleótidos que codifican esas proteínas, mediante diversos medios conocidos y de acuerdo con las enseñanzas de la presente memoria descriptiva.

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Los trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inadecuada incluyen cáncer, trastornos autoinmunitarios, hipertrofia tisular, y trastornos inflamatorios que incluyen la inflamación que surge de la lesión tisular aguda que incluye, por ejemplo, la lesión pulmonar aguda. Estos trastornos se pueden tratar mediante la administración de la presente proteína Bbk o de un equivalente funcional.

Los cánceres surgen cuando los cambios en el ADN provocan la acumulación anómala de las células. Las velocidades comparativas de la división celular y de la muerte celular determinan la velocidad a la que crece el cáncer. Algunas células cancerosas se dividen más lentamente que las células normales, pero el cáncer todavía puede crecer debido a la duración prolongada de la vida celular. La apoptosis es un método eficaz para evitar la transformación maligna, porque elimina las células con lesiones genéticas. La apoptosis anormal puede favorecer el desarrollo del cáncer, tanto permitiendo la acumulación de células en división como impidiendo la eliminación de las variantes genéticas que tienen un potencial maligno incrementado. Los presentes agentes terapéuticos, que incluyen la presente proteína Bbk, sus equivalentes funcionales, fragmentos e híbridos, junto con los vectores que contienen cADN que codifica uno o más de lo anteriormente mencionado, se pueden administrar a pacientes de cáncer para inducir la apoptosis.

Se pueden tratar muchos tipos de cáncer mediante la administración de los presentes agentes terapéuticos, que incluyen, por ejemplo, carcinomas, sarcomas y leucemia/linfomas, que incluye, por ejemplo, carcinomas tales como adenocarcinomas, carcinomas escamosos, carcinoma de órganos que incluyen mama, colon, cabeza, cuello, etc.; sarcomas que incluyen condrosarcoma, melanosarcoma, etc.; y leucemia y linfomas que incluyen leucemia linfoide aguda, leucemia mieloide aguda, linfoma no Hodgkin, linfoma de Burkitt, linfomas de células B, linfomas de células T, etc. Otras enfermedades susceptibles de tratamiento mediante el uso del presente agente terapéutico incluyen las infecciones fúngicas.

Los presentes agentes terapéuticos se pueden usar para tratar enfermedades autoinmunitarias. La recombinación genética aleatoria y la hipermutación somática pueden generar potencialmente linfocitos T y B autorreactivos a lo largo de la vida. En condiciones normales, los linfocitos inmaduros que se unen a autoantígenos mueren mediante apoptosis. Sin embargo, un defecto en la eliminación de estos linfocitos predispone hacia la autoinmunidad.

Los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar a pacientes que padecen trastornos autoinmunitarios para inducir la apoptosis en los linfocitos T autorreactivos, por ejemplo, en pacientes que padecen lupus eritematoso sistémico. Otras enfermedades autoinmunitarias susceptibles de tratamiento mediante la inhibición o la inducción de la apoptosis por medio de la administración de los presentes agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, miastenia gravis, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, diabetes resistente a la insulina, rinitis alérgica, asma, anormalidades autónomas funcionales, diabetes insulinodependiente juvenil, enfermedad de Addison, hipoparatiroidismo idiopático, infertilidad espontánea, insuficiencia ovárica prematura, pénfigo, pénfigo vesicular, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica idiopática, neutropenia idiopática, síndrome de Goodpasture, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren.

Los presentes agentes terapéuticos se pueden usar para tratar la inflamación que resulta de la lesión pulmonar aguda mediante la inducción de la apoptosis. El proceso de la enfermedad comienza con una respuesta inflamatoria explosiva en la pared alveolar. Como consecuencia de la destrucción tisular resultante, le sigue una fibroproliferación extensa del espacio aéreo alveolar, que consiste en fibroblastos, capilares y sus productos de tejido conectivo. Fukuda, Y., et al., Am. J. Pathol. 126:171-182 (1987). Un mecanismo importante para la eliminación sistemática de lo anteriormente mencionado es la apoptosis, es decir, la muerte celular programada.

Los presentes agentes terapéuticos se pueden usar también para tratar trastornos degenerativos debidos a la pérdida prematura o excesiva de células durante el envejecimiento, que puede conducir a la disfunción de los órganos y a la enfermedad. Tales trastornos degenerativos incluyen las enfermedades degenerativas del sistema nervioso central debidas al envejecimiento u otros factores que dan como resultado la muerte de las neuronas. Los presentes agentes terapéuticos que contienen proteína mutante de Bbk o sus híbridos se pueden administrar a un paciente que padece tal trastorno degenerativo para inhibir la apoptosis. Además, los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar de forma concurrente con la terapia génica para proporcionar genes que codifican hormonas neurotróficas que incluyen, por ejemplo, factor de crecimiento nervioso. Otros trastornos susceptibles de tratamiento mediante la utilización de los presentes agentes terapéuticos incluyen, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.

Alguien de experiencia habitual en la técnica puede identificar fácilmente otros trastornos degenerativos caracterizados por una muerte celular inadecuada o una proliferación celular inadecuada, o ambas, que son susceptibles de tratamiento mediante el uso de los presentes agentes terapéuticos. Los presentes agentes terapéuticos pueden incluir la propia proteína Bbk, así como sus fragmentos, equivalentes funcionales y/o híbridos y/o mutantes que se administran a una célula seleccionada como objetivo. De forma alternativa, los agentes terapéuticos según la invención se pueden administrar infectando la célula seleccionada como objetivo con un vector que contiene un cADN que codifica uno o más de lo anteriormente mencionado. Los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar a la célula deseada seleccionada como objetivo como se discute más adelante, por ejemplo, eligiendo un receptor en la superficie de la célula seleccionada como objetivo que es específico para ese tipo de célula. Los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar solos o en combinación con otras terapias farmacológicas aceptables. Además, los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar de forma concurrente con otras terapias aceptables específicas para el trastorno degenerativo particular a tratar. Por ejemplo, los presentes agentes terapéuticos se pueden administrar de forma concurrente con agentes quimioterápicos, terapia génica, o similares. Ya sea la propia proteína Bbk o el vector que codifica la proteína, el agente terapéutico debe cruzar la membrana celular.

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Un método para introducir la proteína Bbk o sus fragmentos en la membrana de la célula o en la propia célula es uniendo la proteína a un ligando para el cual la célula seleccionada como objetivo contiene receptores. La proteína puede ser transportada así hacia la membrana celular o a través de la membrana celular junto con el ligando.

La elección de un ligando portador dependerá de diversos factores, como se discute aquí y conocen los expertos. Los receptores específicos de tejido adecuados incluyen: Cerebro: receptor para el factor de crecimiento nervioso (NGF-R); mama: receptor de prolactina; estómago: receptor de gastrina; piel: receptor de la hormona estimulante de melanocitos (MSH-R), hígado: receptor de asialoglicoproteína; tiroides: receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSH-R); ovarios: receptor de la hormona luteinizante (LH-R), testículos: receptor de gonadotropina coriónica humana (hCG-R), células T: receptores de células T; células B: CD19; isoforma 4V del receptor de hialuronato pulmonar CD44 (J. Cell. Biol. 124, 7182, 1994). A este respecto, se apreciará que el ligando puede ser un anticuerpo o un fragmento específico para el receptor, al que se puede conjugar la proteína Bbk de la invención.

Puede ser deseable emplear fragmentos de Bbk activos según la invención, que es menos probable que interfieran con la interacción ligando-receptor, y que pueden ser transportados más fácilmente a través de la membrana celular.

Cuando se debe transportar una proteína a través de la membrana de la célula o hacia la célula como se describió anteriormente y el ligando es un anticuerpo, se preferirá marcar de manera diagnóstica o terapéutica la proteína, de forma que el marcador será relativamente más eficaz cuando la proteína está unida, tal como, por ejemplo, mediante medios análogos a los descritos aquí en el contexto del transporte de anticuerpos.

También es posible utilizar liposomas que tienen las proteínas de la presente invención en su membrana para administrar de forma específica las presentes proteínas Bbk al área seleccionada como objetivo. Estos liposomas se pueden producir de forma que contengan, además de la proteína Bbk, otros agentes terapéuticos que incluyen fármacos, radioisótopos, lectinas y toxinas, que se liberarían en el sitio seleccionado como objetivo.

Una manera preferida para administrar las secuencias de nucleótidos que codifican Bbk (y sus equivalentes funcionales y/o híbridos y/o mutantes) para fines diagnósticos o terapéuticos es mediante el uso de vectores virales. Tales vectores virales para la transferencia génica incluyen retrovirus (revisados en Miller, et al., Methods Enzymol. 217:581-599 (1993)) que incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), derivados de adenovirus (por ejemplo, véase Erzurum, et al., Nucleic Acids Res. 21:1607-12 (1993); Zabner, et al., Nat. Genet. 6:75-83 (1994); Davidson, et al., Nat. Genet. 3:219-223 (1993)), virus adeno-asociados (AAV), (es decir, véase Flotte, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10613-7 (1993)) y vectores de herpesvirus (es decir, véase Anderson, et al., Cell. Mol. Neurobiol. 13:503-15 (1993)). Las personas de experiencia habitual en la técnica pueden seleccionar y emplear fácilmente otros virus adecuados. Otros métodos para la administración de ADN incluyen la transferencia génica mediada por liposomas (Alton, et al., Nat. Genet. 5:135-42 (1993); Nabel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11307-11 (1993)).

El uso de vectores virales para la introducción de genes en células de mamíferos también se revisa, por ejemplo, en Varmus, Science 240(4858):1427 (1988); Eglitis et al., BioTechniques 6,7:608 (1988); Jaenisch, Science 240(4858):1468 (1988); y Bernstein et al., Genet. Eng. (N.Y.) 7:235 (1985).

Para los fines de la presente invención, se puede preferir emplear una cepa viral o retroviral atenuada. Así, por ejemplo, es posible usar como vectores para las secuencias de ADN de la invención retrovirus que tienen características citopáticas atenuadas, tales como HIV-2_{ST} (Kong et al., Science 240(4858):1525 (1988)) o HIV-2_{UC1} (Evans et al., Science 240(4858):1523 (1988)), que entra en células neurales mediante un mecanismo dependiente de CD4 (Funke et al., J. Exp. Med. 165:1230 (1987)). La neurobiología de las infecciones por VIH se describe, por ejemplo, en Johnson et al., FASEB J. 2(14):2970 (1988). Los expertos serán capaces de seleccionar como objetivo diferentes poblaciones de células que tienen susceptibilidades conocidas hacia los virus mediante el ejercicio de prácticas rutinarias. Por ejemplo, se sabe que CD4 tiene un transcrito variante en el cerebro humano, con el mayor contenido en el prosencéfalo (Maddon et al., Cell 47:333 (1986). Los métodos posibles para dirigir la expresión génica retroviral hacia tipos celulares específicos se revisan en Boris-Lawrie y H. Temin Curr. Opin. Genet. Dev. vol. 3, págs. 102-9 (1993).

De forma ideal, pues, la elección de un sistema de administración génica será realizada por expertos, teniendo en cuenta los objetivos de transferencia génica eficaz y estable, con un nivel apropiado de expresión génica, de una manera apropiada para los tejidos, y sin ningún efecto adverso. Véase, por ejemplo, Wolff et al., Rheum. Dis. Clin. North Am. 14(2):459 (1988). Con respecto a la administración a un objetivo del sistema nervioso central, los vectores virales, que incluyen el VIH, ofrecen la ventaja de ser capaces de atravesar la barrera hematoencefálica (Johnson et al., FASEB J. 2(14):2970 (1988)).

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Aplicaciones diagnósticas

Los anticuerpos generados contra la presente proteína Bbk, sus fragmentos, equivalentes funcionales o híbridos o mutantes se pueden usar para detectar la proteína Bbk en una muestra de tejido humano, así como para diagnosticar trastornos degenerativos asociados con la expresión de la proteína Bbk. Además, tales anticuerpos se pueden usar también para monitorizar el progreso de trastornos degenerativos asociados con la expresión de la proteína Bbk.

Cualquier fuente de células humanas es adecuada para el uso en los ensayos diagnósticos de la presente invención. Las células se pueden aislar a partir de cualquier tejido humano que incluye, por ejemplo, corazón, pulmón, células tumorales, cerebro, placenta, hígado, músculo esquelético, riñón y páncreas. La extracción de proteínas a partir de la muestra de células se puede realizar mediante cualquiera de los muchos medios conocidos en la técnica. Por ejemplo, las células se pueden lisar mediante un detergente o mediante medios mecánicos. Si se desea, se pueden eliminar los ácidos nucleicos de la preparación de células mediante digestión enzimática o mediante precipitación. Tales medios se conocen bien en la técnica.

Se pueden generar anticuerpos que son inmunorreactivos con las proteínas Bbk mediante los métodos expuestos aquí. Después se pueden cribar los anticuerpos apropiados mediante el uso de los productos génicos naturales de bbk.

Las proteínas extraídas a partir de la muestra de células se pueden poner en contacto con el anticuerpo en condiciones adecuadas para la formación del complejo anticuerpo-antígeno. En general, tales condiciones son las condiciones fisiológicas. El extracto de proteínas se puede unir a un soporte sólido tal como un filtro de nitrocelulosa o una placa de microtitulación.

El anticuerpo albergará en general un marcador que es un marcador radiactivo, un marcador fluorescente o una enzima conjugada que en las condiciones apropiadas produce, por ejemplo, un producto de reacción coloreado. Los anticuerpos y el marcado de anticuerpos se describe aquí, y es conocido para los expertos. De forma alternativa, si el anticuerpo no está marcado, se puede detectar por medio de un segundo anticuerpo de otra especie que se hace reaccionar con el primer anticuerpo. Las técnicas de ensayo, marcadores y medios adecuados para la detección se discuten aquí.

Se emplea una muestra paralela a la muestra de ensayo para proporcionar el control. La muestra de control consiste en una cantidad equivalente de proteínas extraídas de las células, preferiblemente de la misma manera que las de la muestra de ensayo. La cantidad de proteína se puede determinar fácilmente mediante el empleo de métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, por ejemplo, los métodos de Lowry o Bradford. Las células usadas para preparar la muestra de control se pueden seleccionar de células del mismo tipo celular que las células de ensayo aisladas de un humano normal que no padece el trastorno degenerativo que padece el humano del que se tomó la muestra de ensayo, de células del mismo tipo celular que las de la muestra de ensayo aisladas de una línea establecida de células normales, y de células del humano que se está ensayando, cuyo tipo celular es diferente del tipo celular de las células de ensayo.

Las muestras de ensayo se pueden cribar también en función de niveles elevados de ARNm transcrito a partir del gen bbk, según los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar el ARN extraído de células B, o se puede aislar de forma alternativa el ARNm a partir del ARN celular total. El ARNm se puede purificar, por ejemplo, mediante cromatografía de afinidad con oligo-(dT)-celulosa que se une al tramo de poli (A) del extremo 3' de la mayoría de ARNm. Como conocen bien los expertos en la técnica, es esencial que se minimice la actividad de ribonucleasa durante la preparación y el ensayo.

Se puede seleccionar una sonda de ADN a partir de cualquiera de las secuencias codificantes de proteínas del gen bbk. Preferiblemente, la sonda se seleccionará de las secuencias del extremo 5' o del primer exón del gen, de forma que se puede detectar el ARN. Preferiblemente, la sonda contiene al menos 15 nucleótidos de la secuencia de bbk. Para realizar la hibridación, es deseable que la sonda sea monocatenaria. Así, si la sonda es bicatenaria, se debería desnaturalizar hasta una forma monocatenaria. Los medios de desnaturalización son bien conocidos en la técnica, e incluyen el tratamiento alcalino o térmico. La sonda se puede poner en contacto después con el ARN derivado de la muestra de células en condiciones en las que se forman y son estables los híbridos ARN-ADN homólogos. Tales condiciones se conocen bien en la técnica. Hay muchos medios para detectar los híbridos que son muy conocidos, pero a menudo implican el uso de sondas marcadas radiactivamente y nucleasas que degradan el ADN monocatenario. Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica.

Las muestras de control pueden derivar de cualquiera de las fuentes de células descritas anteriormente para el uso en los ensayos de diagnóstico con anticuerpos. Las muestras y los controles se deberían preparar preferiblemente en paralelo en condiciones similares.

Los métodos y composiciones diagnósticas de la presente invención son útiles para determinar si una enfermedad/trastorno degenerativo está asociada a la expresión anormal de Bbk, a la expresión de mutantes de Bbk, así como para determinar el efecto de la sobreexpresión o de la pérdida de expresión de Bbk en modelos animales tales como ratones transgénicos y/o ratones nulos homocigotos. Los métodos para determinar si una enfermedad/trastorno degenerativo está asociada a la expresión anormal de Bbk incluyen analizar la expresión de Bbk en el tejido enfermo comparado con la del tejido normal mediante, por ejemplo, transferencias de Northern y/o Western, así como mediante otros métodos de ensayo fácilmente elegidos y empleados por las personas de experiencia habitual en la técnica. Una vez que se ha determinado que una enfermedad/trastorno degenerativo está asociada a la expresión anormal de Bbk, se puede diagnosticar la enfermedad/trastorno en un individuo.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustración, no a modo de limitación.

Ejemplos A. Materiales y métodos

1. Análisis de doble híbrido en levaduras. Los componentes del sistema de doble híbrido en levaduras se obtuvieron de Clontech Laboratories (números de catálogo K1605-1, K1605-D, HL4006AE). Estos incluyeron el vector de fusión con el dominio de unión de GAL4 pAS2, las cepas de levadura Y190 e Y187, y la biblioteca del dominio de activación de cADN de linfocitos humanos. Bak se subclonó en el vector pAS2 mediante el uso de protocolos estándar (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, Nueva York (1989)). Para crear una fusión en el marco de lectura con Bak, se modificó el vector pAS2 mediante digestión con NdeI, haciendo los extremos romos con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, y mediante nueva ligadura. Se extrajo el gen de Bak de pcDNA1/amp (descrito en la solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/321.071, presentada el 11 de octubre de 1994, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos de número de serie 08/287.427, presentada el 9 de agosto de 1994 (bak se denomina en ella bcl-y)) mediante digestión con BamHI y EcoRI, se hizo romo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I, y se ligó en el vector pAS2 modificado, que se había digerido con SmaI y se había tratado con fosfatasa intestinal bovina para eliminar los fosfatos terminales. Se secuenció el ADN del vector de fusión Bak/dominio de unión de GAL4 (pAS2/Bak\DeltaC) a través del punto de fusión para verificar que se conservó el marco de lectura de GAL4 a través de la unión de clonado y en el marco de lectura abierto de Bak. Se realizó el análisis de doble híbrido, ensayos en filtro de \beta-galactosidasa, y detección de falsos positivos mediante el uso del cebo de Bak/dominio de unión de GAL4 y la biblioteca del dominio de activación de GAL4 de cADN de linfocitos siguiendo las instrucciones del fabricante. Se aislaron los ADNs plasmídicos de los clones positivos y se transformaron en E. coli como describe el fabricante. Los clones bacterianos se analizaron adicionalmente mediante análisis con enzima de restricción y secuenciación del ADN.

2. Construcciones plasmídicas adicionales. Todas las construcciones plasmídicas se hicieron mediante el uso de protocolos estándar (Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, Nueva York (1989)). Se creó una forma modificada del plásmido de expresión en mamíferos pcDNA3 (Clontech) en el que se había insertado el marcador de epítopo de hemaglutinina (HA) de la gripe (MGYPYDVPDYASLS) entre los sitios HindIII y XhoI de la región de clonado del poliligador para generar pcDNA3/HA. Se extrajo el gen de Bbk obtenido en el cribado de doble híbrido (pACT/Bbk) del plásmido del dominio de activación de GAL4 en un fragmento de XhoI y se subclonó en el sitio de XhoI del vector pcDNA3/HA descrito anteriormente para crear pcDNA3/HABbk. Esto da como resultado una fusión en el marco de lectura de Bbk con el marcador de HA en el extremo N-terminal de Bbk.

El mutante por deleción \Delta1-105 se obtuvo directamente a partir del cribado de doble híbrido y se subclonó de una manera similar a Bbk de tamaño completo para crear pcDNA3/HA\Delta1-105. El mutante pcDNA3/HA\Delta142-249 se creó digiriendo pcDNA3/HABbk con PflMI y XbaI para eliminar las secuencias entre los nucleótidos 338-958, y posteriormente sustituyendo las secuencias delecionadas con un fragmento de ADN de PflMI a XbaI generado mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que corresponde a los nucleótidos 338-476 de Bbk. Se incorporó un codón de parada en el marco de lectura tras el aminoácido 141.

Los mutantes puntuales de alanina pcDNA/HAPM-LVLEE (L_{125}V_{129}L_{132}E_{134}E_{135} sustituidos con residuos de A), pcDNA/HAPM-V (V_{129} sustituido con un residuo de A), pcDNA/HAPM-L (L_{132} sustituido con un residuo de A), pcDNA/HAPM-EE (E_{134}E_{135} sustituidos con residuos de A) se crearon sustituyendo las secuencias de Bbk de tipo natural entre los nucleótidos 338-476 (un fragmento de PflMI) con fragmentos de PflMI generados mediante PCR que habían incorporado los codones de alanina en las posiciones designadas. Los genes de Bbk que portaban las mutaciones puntuales de alanina se extrajeron de los vectores pcDNA/HA y se clonaron también en el sitio del poliligador de Xhol de pACT para crear pACT/PM-LVLEE, pACT/PM-V, pACT/PM-L y pACT/PM-EE. Estos plásmidos generan una fusión en el marco de lectura entre los mutantes de Bbk y el dominio de activación de Gal4 para el uso en el análisis de doble híbrido en levaduras.

Se construyó el plásmido pRcCMV/HABbkBH3 que expresa los residuos de aminoácidos de Bbk 117-166, que abarcan el dominio BH3 de Bbk, como se describe más adelante. Se generó un fragmento del gen de Bbk que codifica los residuos de aminoácidos 117-166 mediante PCR (con la incorporación de un codón de parada tras el aminoácido 166) y se clonó posteriormente en el sitio de XhoI de pcDNA3/HA (véase anteriormente) que se había hecho romo con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa. El gen de fusión marcador de HA/BH3 de Bbk se extrajo después en un fragmento HindIII/XbaI y se subclonó en los sitios de HindII/XbaI de pRcCMV (Clontech). Este clonado da como resultado la fusión en el marco de lectura del marcador de HA y el dominio BH3 de Bbk para el uso en transfecciones en células de mamíferos. Se construyó de manera similar un plásmido de control que codifica Bbk de tipo natural extrayendo el fragmento de HindIII/XbaI de pcDNA3/HABbk (véase anteriormente) y subclonándolo en los sitios HindII/XbaI de pRcCMV.

Se creó una fusión de glutatión S-transferasa con Bbk (GST-Bbk) mediante el subclonado de un fragmento de Bbk de BglII a EcoRI en los sitios de BamHI a EcoRI del plásmido pGEX2TK (Pharmacia). El fragmento BglII a EcoRI de Bbk se creó en varias etapas. Primero, se eliminó la metionina de iniciación de Bbk sustituyendo un fragmento BglII a Bsu36I de pcDNA3/HABbk con un adaptador oligonucleotídico bicatenario. El sitio de Xbal de este plásmido pcDNA3/HABbk modificado se convirtió después en un sitio de EcoRI mediante el uso de ligadores de EcoRI.

Otros plásmidos que expresan Bak, Bik, Bax, Bcl-x_{L}, Bcl-2 y BHRF1 del virus de Epstein-Barr se han descrito previamente (Boyd , J.M., et al., Oncogene 11:1921 (1995); Chittenden, T., EMBO J. 14(22):5589 (1995); solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/321.071, presentada el 11 de octubre de 1994, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos de número de serie 08/287.427, presentada el 9 de agosto de 1994 (bak se denomina en ella bcl-y)).

3. Análisis de transferencia de Northern. Se adquirieron transferencias de Northern de múltiples tejidos fetales y adultos humanos de Clontech Laboratories, y se hibridaron de forma secuencial con sondas marcadas con ^{32}P que abarcaban las regiones codificantes completas de Bbk y de \beta-actina siguiendo el protocolo del fabricante.

4. Traducción in vitro. Se sintetizaron proteínas marcadas con ^{35}S-metionina in vitro mediante el uso del sistema de lisado de reticulocitos acoplado a T7/T3 TnT (Promega) siguiendo los procedimientos del fabricante. Los productos de traducción se sometieron a electroforesis en SDS-poliacrilamida. El gel se fijó, se incubó en una disolución amplificadora de fluorografía (Amplify, Amersham), se secó y se sometió a autorradiografía a -70ºC.

5. Análisis de transferencia de Western. Se cultivaron células COS7 en DMEM suplementado con un 10% de suero bovino fetal y L-glutamina. Las células se transfectaron con 2 \mug de ADN plasmídico mediante el uso de LipofectAMINE (Gibco/BRL), y se prepararon lisados celulares 24 horas después de la transfección. Las porciones de los extractos de las células (aproximadamente 100 mg) se sometieron a electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a una membrana de nailon mediante métodos estándar (Harlow, E., et al., Antibodies: A Laboratory Manual (1988)). La transferencia se incubó con el anticuerpo monoclonal anti-epítopo de HA 12CA5 (Klodziej, P.A., et al., Meth. Enzymol. 194:508-519 (1991)), que se detectó posteriormente con un anticuerpo secundario mediante el uso del sistema ECL (Amersham).

6. Análisis de transfección transitoria. Se cultivaron células Rat1, HeLa y BT549 a 37ºC, 7% de CO_{2} en DMEM con un 10% de suero bovino fetal, L-glutamina 4 nM, 50 unidades/ml de penicilina y 50 \mug/ml de estreptomicina. Las células se colocaron en placas a 3,5 x 10^{4} células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos 24 horas antes de la transfección. Se mezcló un plásmido que codifica \beta-galactosidasa de E. coli (pRcCMV/\betagal, 0,16 \mug) con un total de 0,42 \mug de plásmido(s) de interés como se define en las leyendas de las figuras. La mezcla de plásmidos se añadió a 25 \mul de OPTIMEM (Gibco/BRL) y se mezcló posteriormente con 27 \mul de disolución LipofectAMINE (2 \mul de disolución de reserva diluida con 25 \mul de OPTIMEM). Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, las mezclas de plásmidos se diluyeron con 200 \mul de OPTIMEM y se añadieron a las células que se habían lavado previamente una vez con OPTIMEM. Después de 4 horas en condiciones de cultivo normales se añadieron a las células 250 \mul de DMEM, un 20% de suero bovino fetal, L-glutamina 4 mM, y después se dejaron crecer durante 24 horas en condiciones normales. Después se lavaron las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS), se fijaron con un 0,2% de glutaraldehído, un 2% de paraformaldehído, fosfato sódico 49,2 mM (pH 7,3) durante 5 minutos a 4ºC y se lavaron dos veces con PBS. Las células que expresan \beta-galactosidasa se identifican como células azules después de una incubación de 1-4 horas con Na_{2}HPO_{4} 80 mM, NaH_{2}PO_{4} 20 mM, MgCl_{2} 1,3 mM, 1 mg/ml de X-Gal (diluido a partir de una disolución de reserva de 20 mg/ml preparada en dimetilformamida), K_{3}Fe(CN)_{6} 3 mM, K_{4}Fe(CN)_{6}/3H_{2}O 3 mM. Las células azules vivas se identifican como aquellas que mantienen una morfología plana, mientras las células azules muertas son redondas.

7. Interacciones proteicas in vitro. Se expresó la proteína de fusión con glutatión S-transferasa de Bbk (GST-Bbk) en E. coli a partir del plásmido pGEX2TK-Bbk y se purificó mediante cromatografía de afinidad con el uso de glutatión-agarosa (Smith, D.B. y Johnson, K.S., Gene 67:31-40 (1988)). Se expresó Bak, Bax y Bik marcados con epítopo de HA y Bcl-x_{L} marcado con epítopo Flag (Kodak), marcados con ^{35}S-metionina in vitro mediante el uso de un sistema acoplado de transcripción/traducción en lisados de reticulocitos de conejo (Promega). Las proteínas marcadas se purificaron previamente con glutatión-agarosa del 10% en tampón HEPES 10 mM (pH 7,2) que contenía un 0,25% de NP-40, KCl 142,5 mM, MgCl_{2} 5 mM, EGTA 1 mM (tampón A). Se añadió GST-Bbk (concentración final 1-3 \muM) y las mezclas se incubaron durante 60 minutos a 4ºC. Los complejos proteicos se capturaron con glutatión-agarosa del 10% y se lavaron dos veces con tampón A y una vez con tampón A sin NP-40. Las proteínas eluyeron de las esferas mediante incubación en tampón de muestras de SDS-PAGE a 100ºC durante 5 minutos y se cargaron en geles de un 4-20% de SDS-poliacrilamida (Novex). Tras la electroforesis, los geles se fijaron y se incubaron en una disolución aumentadora de fluorografía (Amplify, Amersham). Los geles se secaron y se sometieron a autorradiografía a -70ºC.

8. Ensayos de \beta-galactosidasa en cultivo líquido. Se cuantificó la afinidad de las interacciones Bbk/Bak y Bbk mutante/Bak mediante el uso de un ensayo de \beta-galactosidasa en medio líquido con o-nitrofenilgalactósido (ONPG) como sustrato como describe el protocolo del fabricante (Clontech). Los plásmidos usados para el análisis son como se expone en las leyendas de las figuras.

B. Resultados 1. Identificación de proteínas que interaccionan con Bak mediante análisis de doble híbrido en levaduras

Bak se expresa en muchas células (solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/321.071, presentada el 11 de octubre de 1994, que es una continuación en parte de la solicitud de Estados Unidos de número de serie 08/287.427, presentada el 9 de agosto de 1994 (bak se denomina en ella bcl-y); Kiefer, M.C., et al., Nature 374:736 (1995)). La sobreexpresión de Bak induce la muerte mediante apoptosis. Se creía que los reguladores o efectores de la apoptosis podrían unirse a Bak. Las proteínas que interaccionan con Bak se identificaron, por tanto, mediante el uso del sistema de doble híbrido en levaduras (patente de EE.UU. nº 5.283.173). El principio de esta metodología se resume en la Figura 1.

GAL4 es una proteína activadora transcripcional de levaduras que tiene dos dominios distintos, el dominio de unión a ADN y el dominio de activación de la transcripción (Figura 1A). El dominio de unión al ADN se une a un elemento de secuencia del ADN específico en el promotor de GAL4, por lo que acerca el dominio de activación de la transcripción al promotor en el que funciona para estimular la transcripción. Se ha demostrado que estos dominios son separables, aunque cuando se separan no pueden funcionar para estimular la transcripción. La activación transcripcional puede, sin embargo, restablecerse si se hace una unión entre los dominios separados. Tal unión se puede hacer expresando los dominios de GAL4 como proteínas híbridas cuando estos dominios se fusionan con proteínas heterólogas (proteína X y proteína Y de la Figura 1B, C) que se sabe que interaccionan. En el esquema mostrado en la Figura 1, el dominio de unión de GAL4 sirve para llevar la proteína X al promotor de GAL4, y la interacción posterior con la proteína Y a su vez lleva al dominio de activación de GAL4 al promotor en el que puede estimular la transcripción. El promotor de GAL4, o un promotor que contiene el elemento de secuencia de ADN de GAL4, se puede usar para dirigir la transcripción de genes marcadores seleccionables (tales como HIS3) y genes indicadores (tales como lacZ).

El sistema descrito anteriormente se puede usar para estudiar la interacción de proteínas que se sabe que interaccionan, así como para identificar y aislar proteínas interaccionantes nuevas. En este último caso, se fusiona una proteína de interés al dominio de unión de GAL4 y se usa como "cebo" para capturar proteínas interaccionantes que se expresan como fusiones del dominio de activación de GAL4. En los experimentos descritos aquí, se usó una proteína de fusión dominio de unión al ADN de GAL4/Bak como cebo para aislar las proteínas interaccionantes con Bak expresadas como fusiones del dominio de activación de GAL4 generadas a partir de una biblioteca de cADN de linfocitos B humanos transformados con el virus de Epstein-Barr (Clontech). Se realizaron análisis de doble híbrido, selección de clones interaccionantes, ensayos en filtro de \beta-galactosidasa e identificación de falsos positivos siguiendo las instrucciones del fabricante (Clontech).

2. Análisis de secuencia de un clon ávido de unión a Bak, bbk

Se determinaron once de los clones con más avidez de unión (determinada mediante la intensidad del color azul en los ensayos en filtro de \beta-galactosidasa) mediante secuenciación del ADN, y fueron clones de longitud variable del mismo gen. Se usó análisis con enzimas de restricción para identificar los tamaños aproximados de estos clones. El clon bbk fue el mayor de los clones y se eligió, por lo tanto, para una secuenciación exhaustiva del ADN de ambas cadenas superior e inferior. La secuencia del clon bbk se muestra en la Figura 2. Seis de los once clones tienen el mismo inicio de secuencia que bbk, mientras que hay cinco clones que tienen deleciones de longitud variable (hasta los nucleótidos 33, 151, 178, 242 y 364 del clon bbk). Tres de los once clones tienen un extremo 3' intacto, tal como se determina mediante la presencia de una cola poliadenilada (poliA). Es probable que la ausencia de una cola de poliA en los clones restantes sea debida a un cebado anormal durante la síntesis del cADN debido a la naturaleza rica en AT del gen en esta región. Sin embargo, los clones restantes tienen extremos 3' que están dentro de las 30 bases del extremo 3' verdadero (lo que incluye al clon bbk, al que le faltan 10 bases).

La secuencia de bbk se comparó con la base de datos Genbank mediante el uso del programa BLAST del NCBI. Este análisis ha identificado numerosos cADNs marcadores de secuencia expresada (EST) (números de acceso: H26516, H42839, H59025, H59896, H59897, H72004, H72005, H89857, H90702, R02556, R02674, R07849, R07901, R36543, R38463, R58365, R78883, R78977, R85622) con una homología significativa (valores de suma de Poisson P(N) menores o iguales a 5,5e-26) hacia bbk. Estos cDNAs también comienzan y terminan dentro de varias bases del punto de finalización de bbk, lo que sugiere que bbk es un clon de tamaño prácticamente completo.

Bbk codifica un marco de lectura abierto (ORF) de 249 aminoácidos que comienza con el número de nucleótido 51 y termina en el número de nucleótido 799. Este ORF está en el mismo marco de lectura que el predicho para el dominio de activación de GAL4 que está fusionado de forma N-terminal a Bbk. La secuencia que rodea el codón de metionina de iniciación predicho es coherente con la secuencia consenso de Kozak (Kozak, M. Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)), y no hay metioninas adicionales o codones de parada en el marco de lectura en la secuencia de bbk putativa sin traducir presente entre el dominio de activación de Gal4 y el ORF de Bbk. Así, se cree que se ha identificado el ORF verdadero del gen de Bbk. Es interesante observar que varios de los clones aislados mediante análisis de doble híbrido, así como varios de los clones de EST, tienen tres nucleótidos adicionales (AAG) que no se hallan en Bbk, entre los nucleótidos 157 y 158 de Bbk. Estos nucleótidos se pueden introducir como resultado del uso de un sitio de corte y empalme alternativo. La adición de estos tres nucleótidos en la región codificante putativa mantiene el marco de lectura predicho y serviría para introducir un residuo de arginina en la posición 36. Un análisis de las bases de datos de proteínas mediante el uso del ORF putativo de Bbk identificó secuencias de homología limitada solamente. Así, se pueden identificar proteínas nuevas que interaccionan con la proteína relacionada con la apoptosis, Bak, por medio del uso del sistema de doble híbrido.

3. Expresión de ARNm de Bbk en tejidos fetales y adultos

Se realizó análisis de transferencia de Northern para determinar el patrón de expresión y el tamaño del ARN mensajero de Bbk. Las transferencias de Northern de tejido fetal y adulto sondeado con Bbk (Figura 3) demuestran que Bbk es una especie de ARNm único de aproximadamente 0,8-1,2 kb. Este tamaño de mensaje es coherente con la noción de que se ha aislado un clon de tamaño completo. El análisis mediante transferencia de Northern demuestra también que Bbk se expresa en muchos tejidos diversos con una distribución aproximadamente similar a la de Bak (Kiefer, M.C., et al., Nature 374:736 (1995)), lo que apoya la creencia de que Bbk y Bak pueden estar complejados en la célula.

4. Expresión de Bbk in vitro y en células transfectadas

La secuencia de aminoácidos deducida de Bbk predice una proteína de PM 26,7 kDa. El clon de Bbk se subclonó a partir del vector de doble híbrido en levaduras en pcDNA3 (Clontech) para la expresión in vitro mediante el uso del promotor T7, y para la expresión en mamíferos mediante el uso del promotor temprano inmediato de citomegalovirus. Para detectar la proteína, se fusionó la secuencia de Bbk en el extremo aminoterminal a un segmento de 14 aminoácidos derivado del antígeno de hemaglutinina (HA) de gripe. Este péptido corto proporciona un epítopo bien caracterizado que permite la detección inmunológica de la proteína "marcada" mediante el anticuerpo monoclonal 12CA5 (Boehringer Mannheim). La transcripción/traducción in vitro del clon de Bbk en lisados de reticulocitos de conejo produce una proteína con movilidad electroforética en geles de SDS-poliacrilamida que corresponde a un peso molecular de alrededor de 37 kDa (Figura 4A), que concuerda aproximadamente con el tamaño predicho de una traducción conceptual de la secuencia de cADN más el marcador de HA y los aminoácidos inespecíficos introducidos mediante el clonado. El vector pcDNA3 que expresa Bbk marcado con HA se transfectó en células COS7. Se prepararon lisados celulares 48 horas tras la transfección, y se analizaron mediante transferencia de Western con el anticuerpo monoclonal anti-HA. La proteína Bbk marcada con HA, de tamaño apropiado, se detectó en los extractos de células COS7 (Figura 4B). Estos resultados demuestran que la proteína codificada por el cADN de Bbk aislado se puede expresar tanto in vitro como in vivo.

5. La expresión de Bbk acelera la muerte celular en células Rat1, HeLa y BT549

El clon de Bbk marcado con HA expresado a partir del vector pcDNA3 se cotransfectó con un plásmido que expresa \beta-galactosidasa en fibroblastos de rata normal (células Rat1) y en las líneas tumorales humanas HeLa y BT549, para determinar el efecto de la expresión de Bbk sobre la viabilidad celular. Tal ensayo de muerte celular se ha descrito previamente (Miura, M., et al., Cell 75:653 (1993); Boyd, J.M., et al., Oncogene 11:1921 (1995); Chittenden, T., et al., EMBO J. 14(22):5589 (1995); solicitud de EE.UU. pendiente junto con la presente de número de serie 08/440.391, presentada el 12 de mayo de 1995; y consiste en la cotransfección de un gen de interés en células con un gen de \beta-galactosidasa como marcador de los transfectantes. El efecto de los productos génicos transfectados sobre la viabilidad celular se mide mediante el registro del número de células azules (positivas para \beta-galactosidasa) respecto de las células con vector de control 24 horas tras la transfección. Los productos génicos inertes o anti-apoptóticos se manifiestan como células azules planas (vivas) en número similar al de los vectores de control, mientras los productos génicos perjudiciales se pueden observar en forma de una reducción global del número de células azules o un incremento de la frecuencia de células azules redondeadas (muertas). Los resultados de la Figura 5A muestran claramente una disminución en el número de células azules cuando se transfectan células Rat1 con un plásmido que expresa Bbk. Así, parece que, como su molécula de unión Bak, Bbk puede inducir la muerte celular. Tanto Bak como Bbk pueden inducir la apoptosis cuando se expresan de forma individual en células Rat1. Aunque no se pretende limitarse por una teoría particular, esto sugiere que, o la interacción Bak/Bbk no es necesaria para la inducción de la apoptosis, o hay homólogos de rata de Bak y Bbk que pueden interaccionar funcionalmente con las proteínas humanas. De forma alternativa, la interacción entre estas dos proteínas puede servir como una función reguladora para modular su potencial apoptótico. Los datos de la Figura 5A demuestran que la coexpresión de Bak y Bbk no bloquea la inducción de la apoptosis, lo que sugiere que su capacidad para unirse entre sí no inhibe su capacidad para provocar la apoptosis. Sin embargo, debido a que Bak y Bbk son cada uno un promotor potente de la muerte celular individualmente, no fue posible en estos ensayos determinar si su coexpresión da como resultado una inducción cooperativa de la apoptosis.

La función apoptótica de Bbk se puede invertir mediante la coexpresión de las proteínas de supervivencia conocidas, Bcl-2, Bcl-x_{L} y BHRF1 del virus de Epstein-Barr (Figura 5B). El grado de muerte celular provocado por las proteínas relacionadas con la apoptosis, Bak y Bik, se reduce de forma similar en presencia de las proteínas de supervivencia (no mostrado). Mediante el incremento de la proporción de la proteína promotora de la apoptosis, Bik, respecto de estas proteínas de supervivencia se puede restablecer la citotoxicidad de Bik. Esta observación sugiere que en la situación apropiada las proteínas promotoras de la apoptosis pueden inhibir realmente la acción de las proteínas de supervivencia. Las proteínas promotoras de la muerte celular se pueden usar, por lo tanto, para inducir la apoptosis en células en las que la supervivencia depende de la acción de una de las proteínas de supervivencia celular relacionadas con Bcl-2.

La capacidad de Bbk para inducir la apoptosis es evidente también en las líneas de células tumorales, HeLa y BT549 (Figura 6A, B). El grado de la apoptosis inducida mediante Bbk es comparable al de Bak en las células BT549, mientras en las células HeLa Bbk es algo menos eficaz que Bak en la inducción de la muerte celular. Aunque Bbk puede inducir la muerte celular, las células tumorales humanas parecen exhibir grados variables de sensibilidad a la función apoptótica de Bbk. Las células que son menos sensibles a la apoptosis inducida por Bbk pueden, sin embargo, hacerse más sensibles a las terapias antineoplásicas convencionales tras el tratamiento con Bbk. Así, se ha identificado una proteína nueva que se une a Bak y que induce la apoptosis en una diversidad de tipos celulares.

6. Bbk interacciona con Bak, Bax, Bcl-x_{L} in vitro

La inversión de la apoptosis inducida por Bbk mediante los miembros de supervivencia celular de la familia de Bcl-2 puede indicar que estas proteínas pueden interaccionar con Bbk. Se deseó determinar si Bbk interacciona únicamente con Bak o si podría unirse también a otras proteínas que se sabe que están implicadas en la apoptosis. Se expresó una proteína de fusión glutatión S-transferasa (GST)-Bbk en E. coli y se purificó en glutatión-agarosa. Se marcaron radiactivamente Bak, Bax y Bik marcados con HA, así como Bcl-x_{L} marcado con el epítopo FLAG (Kodak) mediante traducción in vitro, y posteriormente se incubaron con GST-Bbk o GST sola. Los complejos se aislaron en glutatión-agarosa y se analizaron mediante SDS-PAGE. La Figura 7 muestra claramente la interacción de Bbk con Bak, Bcl-x_{L} y Bax pero no con Bik. Estas interacciones son específicas, ya que la GST sola no se compleja con el material traducido in vitro. Así, parece que Bbk puede interaccionar con varios miembros de la familia de Bcl-2. Bbk no parece interaccionar exclusivamente con los miembros inductores de la muerte celular de la familia de Bcl-2, como se demostró mediante su interacción con Bcl-x_{L}, a pesar del hecho de que Bbk se aisló por medio de su interacción con el promotor de muerte celular, Bak. Es interesante observar que Bbk no puede, sin embargo, interaccionar con Bik, una proteína nueva inductora de muerte celular que comparte el dominio BH3 con los miembros de la familia de Bcl-2 (Boyd, J.M., et al., Oncogene 11:1921 (1995)).

7. Bbk comparte homología de secuencia con la familia de proteínas de Bcl-2

Las observaciones de que Bbk interacciona con varios miembros de la familia de Bcl-2 y que comparte la función relacionada con la apoptosis sugirió que Bbk podría compartir además una homología de secuencia. Las búsquedas en las bases de datos realizadas anteriormente no revelaron ninguna homología de secuencia respecto de los miembros de la familia de Bcl-2, sin embargo, una inspección visual cuidadosa identificó un motivo que es sumamente homólogo al dominio BH2 de Bcl-2 y de los miembros de la familia relacionados (Figura 8A). La alineación del ORF de Bbk con los miembros de la familia de Bcl-2 mediante el uso del dominio BH2 como anclaje no reveló ninguna homología hacia el dominio BH1 de Bcl-2, pero muestra cierta homología (Figura 8B) hacia el dominio BH3 recién definido (solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/440.391, presentada el 12 de mayo de 1995 (BH3 se denomina en ella dominio GD)). Así, Bbk parece ser un nuevo miembro promotor de la muerte celular de la familia de proteínas de Bcl-2.

8. La apoptosis inducida por Bbk está mediada por su dominio similar a BH3

Se ha demostrado previamente que el dominio BH3 de Bak es necesario y suficiente para la inducción de la muerte celular (solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/440.391, presentada el 12 de mayo de 1995 (BH3 se denomina en ella dominio GD)). Debido a que Bbk comparte una homología débil con el dominio BH3 de Bak, se deseó determinar si esta región proporciona una función similar para Bbk. Para poner a prueba esta teoría se hicieron una serie de deleciones que se sitúan en el dominio BH3 putativo, y se ensayaron en el ensayo de muerte de células Rat-1. Los resultados de la Figura 9A demuestran que dos de estos mutantes, \Delta1-105 (una deleción del extremo N-terminal hasta el residuo 106) y \Delta142-249 (una deleción del extremo C-terminal que comienza en el aminoácido 142), aún mantienen la capacidad de inducir la apoptosis. Estos resultados sugieren que una gran porción de la molécula de Bbk (que incluye el dominio BH2) es prescindible para la actividad citotóxica de Bbk. Además, estos datos definen la región entre los aminoácidos 106 a 141 como necesaria para que Bbk induzca la muerte celular. De forma interesante, esta región coincide con el dominio BH3 de Bbk putativo (residuos 125-137). Para probar definitivamente que esta región fue necesaria para la citotoxicidad de Bbk, se hicieron cuatro mutantes de barrido de alaninas (Figura 9B) que mutan diversos residuos conservados, y se ensayaron en cuanto a su capacidad para inducir la apoptosis en células Rat1. Los resultados mostrados en la Figura 9C demuestran que PM-LVLEE, que contiene cinco sustituciones de alanina en el elemento BH3, ha perdido completamente su capacidad de inducción de la apoptosis. Para demostrar que la inhibición de la citotoxicidad en PM-LVLEE no es debida a una incapacidad para ser sintetizado, se verificó su expresión en células COS7 en las que se produjo a niveles comparables a los de Bbk de tipo natural. Los datos apoyan, por lo tanto, la conclusión de que la región BH3 de Bbk es absolutamente necesaria para su función apoptótica. Los mutantes restantes, PM-V, PM-L y PM-EE, son mutaciones simples y dobles que se construyeron para definir de forma más precisa los residuos de BH3 necesarios para la apoptosis inducida por Bbk. Los datos de la Figura 9C demuestran que cada una de estas sustituciones reduce, pero no elimina, la inducción de la muerte celular, lo que indica que todos los residuos mutados son necesarios en parte para la citotoxicidad de Bbk. De nuevo, cada uno de estos mutantes se expresó en las células COS7 a niveles comparables a los de Bbk de tipo natural.

Para determinar si el dominio BH3 de Bbk fue también suficiente para inducir la apoptosis, se transfectó un plásmido que expresaba solamente los aminoácidos 117-166 de Bbk (que incluye el dominio BH3 de Bbk entre los residuos 125-137) en células Rat1. Los resultados de la Figura 10 demuestran que la expresión de este péptido de 50 aminoácidos que abarca el dominio BH3 de Bbk es suficiente para inducir la apoptosis. Así, parece que el dominio BH3 de Bbk es análogo en función al dominio BH3 de Bak, en cuanto a que es tanto necesario como suficiente para la inducción de la apoptosis.

9. La inducción de la apoptosis mediante Bbk se correlaciona con su capacidad para unirse a Bak

La solicitud de Estados Unidos pendiente junto con la presente de número de serie 08/440.391, presentada el 12 de mayo de 1995, demostró que el dominio BH3 de Bak es responsable de su actividad citotóxica, así como de su capacidad de unirse a Bcl-x_{L}, un miembro anti-apoptótico de la familia de Bcl-2. Ya que el dominio BH3 de Bbk parece compartir la capacidad de inducir la función de apoptosis de una manera similar a la del dominio BH3 de Bak, fue interesante determinar si el dominio BH3 de Bbk media en la interacción Bbk/Bak. Para poner a prueba esta posibilidad, se fusionaron las mutaciones de alanina usadas anteriormente para definir el dominio inductor de la apoptosis de Bbk (PM-LVLEE, PM-V, PM-L, PM-EE) al dominio de activación de Gal4 para el uso en el sistema de doble híbrido en levaduras con Bak como cebo. En este ensayo, los niveles de expresión de \beta-galactosidasa son una medida de la afinidad y/o estabilidad de la interacción entre las dos proteínas, y los niveles elevados indican una interacción fuerte, y los niveles bajos indican una interacción débil. La Figura 11 demuestra que PM-LVLEE, el mutante de Bbk que ha perdido la capacidad de inducir la apoptosis, ha perdido también la capacidad de unirse a Bak, como se demuestra por los niveles bajos de \beta-galactosidasa (comparables al control negativo). Los mutantes que han mantenido los niveles intermedios de potencial apoptótico (PM-V, PM-L, PM-EE) mantienen niveles intermedios de interacción con Bak. Esta correlación directa entre la citotoxicidad de Bbk y la unión de Bbk a Bak apoya adicionalmente la hipótesis de que la interacción Bbk/Bak es necesaria para la inducción de la apoptosis. De forma alternativa, queda la posibilidad de que haya moléculas de unión adicionales para Bbk que también interaccionan con su dominio BH3 para llevar a cabo la muerte celular.

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(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: GALLO. Gregory J.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEINA BBK ASOCIADA A LA APOPTOSIS

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 28

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(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Hale and Dorr LLP

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(B): CALLE: 1455 Pennsylvania Avenue. N.W.

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(C): CIUDAD: Washington. D.C.

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(E): PAÍS: EE.UU

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(F): C.P: 20004

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(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

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(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Edición nº 1.0, Versión nº 1.25

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(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: PCT - PENDIENTE DE ASIGNAR

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: CON LA PRESENTE

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(vii): DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/632.514

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-MAY-1996

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(ix): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

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(A): NOMBRE: WIXON. Henry N.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32.073

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(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 104322.188

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(x): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN

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(A): TELÉFONO: (202)942-8459

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(B): TELEFAX: (202)942-8484

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:1:

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\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:2

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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\sa{Leu Arg Arg Leu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:6:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:6:

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\sa{Leu Arg Arg Leu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO 7:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO 7:

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\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:8:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:8:

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\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Glu}

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:9:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 958 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:9:

3

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 958 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:10:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 249 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

5

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Ala His Gly Gly Trp Glu Gly Ile Leu Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Ala Gln Arg Gly Gly Trp Val Ala Ala Leu Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp Asp Gly Leu Leu Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 15

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMATION SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{`Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Cly Asp Glu Met Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val His Leu Ala Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Arg Leu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

LISTADO DE SECUENCIAS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: GALLO, Gregory J.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROTEINA BBK ASOCIADA A LA APOPTOSIS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 29

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Hale and Dorr

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 1455 Pennsylvania Avenue, N.W.

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Washington, D.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: U.S.A.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): C.P: 20004

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: Compatible con PC IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Edición nº 1.0, Versión nº 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 08/632,514

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 29-MAYO-1996

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: WIXON, Henry N.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 32,073

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 104322.188

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (202)942-8459

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (202)942-8484

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 958 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 958 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 249 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:11:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Ala His Gly Gly Trp Glu Gly Ile Leu Ala Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Ala Gln Arg Gly Gly Trp Val Ala Ala Leu Asn Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Asp Gln Gly Gly Trp Asp Gly Leu Leu Ser Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Asp Asn Gly Gly Trp Asp Ala Phe Val Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Ile Gln Glu Asn Gly Gly Trp Asp Thr Phe Val Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID N0:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Gly Arg Gln Leu Ala Ile Ile Gly Asp Asp Ile Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Glu Cys Leu Lys Arg Ile Gly Asp Glu Leu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val His Leu Ala Leu Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Lys Gln Ala Leu Arg Glu Ala Gly Asp Glu Phe Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Arg Arg Leu Ala Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Ala Glu Glu Glu Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Arg Leu Val Ala Leu Leu Glu Ala Ala Ala Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Gly Tyr Pro Try Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Ser}

Claims

1. Una proteína Bbk (destructora con unión a Bak) aislada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en ID SEC Nº: 11.

2. La proteína Bbk aislada de la reivindicación 1, en la que dicha proteína es una proteína humana.

3. La proteína Bbk aislada de la reivindicación 2, en la que dicha proteína está codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC Nº: 9.

4. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica la proteína Bbk expuesta en ID SEC Nº: 9.

5. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia comprende ADN genómico.

6. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia comprende cADN.

7. La secuencia de nucleótidos aislada de la reivindicación 4, en la que dicha secuencia comprende ARN.

8. Una molécula de ADN recombinante aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína Bbk expuesta en ID SEC Nº: 9.

9. La molécula de ADN recombinante aislada de la reivindicación 8, en la que dicha molécula es un vector.

10. Un vector que comprende una molécula de ADN recombinante, en la que dicha molécula de ADN recombinante codifica una secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos variante, en la que dicha secuencia de aminoácidos es un péptido o proteína de Bbk seleccionado del grupo que consiste en ID SEC Nº:1, ID SEC Nº:2, ID SEC Nº:3, ID SEC Nº:4 e ID SEC Nº:11, y dicha secuencia de aminoácidos variante induce la apoptosis en una célula y está codificada por una secuencia de ADN que hibrida con una secuencia de ADN que codifica un péptido o proteína de Bbk de dicho grupo en condiciones rigurosas de una concentración de tampón de citrato sódico-cloruro sódico (SSC) de alrededor de 0,1x y a una temperatura de alrededor de 65ºC.

11. El vector de la reivindicación 10, en el que dicho vector expresa un ARN complementario de dicha molécula recombinante.

12. El vector de la reivindicación 11, en el que dicha molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos expuesta en ID SEC Nº: 9.

13. Una célula hospedadora transformada con el vector de cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 ó 12.

14. La célula hospedadora de la reivindicación 13, en la que dicha célula hospedadora es una célula de mamífero.

15. Un método para producir el polipéptido de Bbk aislado según la reivindicación 1, que comprende:

(a): construir el vector de la reivindicación 10;

(b): transformar una célula hospedadora adecuada con dicho vector de la etapa (a);

(c): cultivar la célula hospedadora de la etapa (b) en condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido de Bbk por dicha célula hospedadora; y

(d): aislar dicho polipéptido de Bbk expresado por la célula hospedadora de la etapa (c); en el que se produce proteína Bbk aislada.

16. El método según la reivindicación 15, en el que dicha célula hospedadora es una célula de mamífero.

17. Un anticuerpo dirigido contra la proteína Bbk de la reivindicación 3.

18. El anticuerpo de la reivindicación 17, en el que dicho anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo anti-idiotipo y un anticuerpo anti-anti-idiotipo.

19. El anticuerpo de la reivindicación 18, en el que dicho anticuerpo está marcado de manera detectable.

20. El anticuerpo de la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo está marcado de manera detectable con un marcador detectable seleccionado del grupo que consiste en: un marcador radiactivo, un marcador enzimático, un marcador de cofactor, un marcador fluorescente, un marcador paramagnético, un marcador quimioluminiscente y un marcador metálico.

21. Una sonda de nucleótidos marcada de manera detectable, que comprende una primera secuencia de nucleótidos que es complementaria a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica específicamente la proteína Bbk de la reivindicación 3.

22. Una composición farmacéutica que comprende la proteína Bbk de la reivindicación 3 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

23. Un método in vitro para inducir la apoptosis en una célula, que comprende introducir en una célula no apoptótica una cantidad de la proteína Bbk de la reivindicación 3 eficaz para inducir la apoptosis en dicha célula.

24. El método de la reivindicación 23, en el que dicha proteína Bbk se introduce expresando un nucleótido que codifica Bbk en dicha célula no apoptótica.

25. Un péptido que comprende el dominio BH3 de Bbk que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias expuestas como ID SEC Nº: 1, ID SEC Nº: 2, ID SEC Nº: 3 e ID SEC Nº: 4.

26. El péptido de la reivindicación 25 que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en

10

en el que dicho péptido induce la apoptosis en células Rat1 transfectadas.

27. Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica el péptido de las reivindicaciones 25 ó 26.

28. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 27.

29. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 28.

30. La célula hospedadora de la reivindicación 29, en la que dicha célula hospedadora es una célula de mamífero.

31. Un producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 17 a 22 y 25 a 29 para el uso en medicina.

32. Un producto según la reivindicación 31 para el uso en el diagnóstico, tratamiento o monitorización de trastornos degenerativos caracterizados por una proliferación celular inadecuada o una muerte celular inadecuada.

33. El uso de un producto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 17 a 22 y 25 a 29 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos inflamatorios, cáncer, enfermedades autoinmunitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, muerte celular debida a radioterapia y quimioterapia, o enfermedades neurodegenerativas.