DE69735604T2

DE69735604T2 - Hypophysentumor verursachende gene und verwandte produkte

Info

Publication number: DE69735604T2
Application number: DE69735604T
Authority: DE
Inventors: Shlomo Los Angeles MELMED; Lin Los Angeles PEI
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 1996-11-21
Filing date: 1997-11-21
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2017-11-22
Also published as: WO1998022587A3; ATE321854T1; US6723519B2; US20030177511A1; JP2002511734A; EP0944722A2; WO1998022587A2; DE69735604D1; US20020068716A1; US6900032B2; US20030167496A1; US20020068353A1; US20020106778A1; US6911320B2; US6750327B2; EP0944722B1; US20030069197A1; US6455305B1; US20020086845A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Nucleinsäuren und dadurch codierte Proteine. Nucleinsäuren der Erfindung codieren eine neue Familie von Proteinen von Hypophysentumor-spezifischem Gen. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Herstellen und Verwenden derartiger Nucleinsäuren und Proteine.
BESCHREIBUNG DES HINTERGRUNDS
Krebse und Tumore sind die zweithäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten, wobei sie 450000 Tode im Jahr verursachen. Einer von drei Amerikanern entwickelt Krebs und einer von fünf stirbt an Krebs (Scientific American Medicine, Teil 12, I, 1, Abschnitt datiert 1987). Wenn auch ein beträchtlicher Fortschritt beim Identifizieren einiger von den wahrscheinlichen Umwelt- und Vererbungsursachen von Krebs gemacht wurde, zeigt die Statistik für die Krebstodesrate eine Notwendigkeit für wesentliche Verbesserung in der Therapie von Krebs und verwandten Krankheiten und Erkrankungen an.
Eine Anzahl von Krebsgenen, d.h. Genen, die an der Ätiologie von Krebs beteiligt sind, ist in Verbindung mit erblichen Formen von Krebs und in einer großen Anzahl von gut untersuchten Turmorzellen identifiziert worden. Die Untersuchung von Krebsgenen hat geholfen, etwas Verständnis für den Prozeß der Tumorgenese zu schaffen. Wenn es auch eine größere Menge bleibt, was über Krebsgene gelernt werden muß, dienen die gegenwärtig bekannten Krebsgene als nützliche Modelle für das Verstehen der Tumorgenese.
Krebsgene werden allgemein eingeteilt in „Onkogene", welche, wenn aktiviert, Tumorgenese fördern, und „Tumorsuppressorgene", welchen es, wenn beschädigt, nicht gelingt, Tumorgenese zu unterdrücken. Wenn auch diese Einteilungen eine nützliche Methode zur begrifflichen Fassung von Tumorgenese schaffen, ist es ebenfalls möglich, daß ein spezielles Gen in Abhängigkeit von der speziellen allelischen Form dieses Gens, seinen regulatorischen Elementen, dem genetischen Hintergrund und der Gewebeumgebung, in welcher es wirkt, sich unterscheidende Rollen spielen kann.
Tumorsuppressorgene sind Gene, die in ihren Wildtyp-Allelen Proteine exprimieren, die abnormale zelluläre Proliferation unterdrücken. Wenn das Gen, codierend für ein Tumorsuppressorprotein, mutiert oder deletiert wird, kann es dem resultierenden mutanten Protein oder dem vollständigen Fehlen der Expression von Tumorsuppressorprotein mißlingen, zelluläre Proliferation korrekt zu regulieren, und abnormale zelluläre Proliferation kann stattfinden, insbesondere wenn es schon existierenden Schaden an dem zellulären regulatorischen Mechanismus gibt. Es ist gezeigt worden, daß eine Anzahl von gut untersuchten menschlichen Tumoren und Tumorzellinien fehlende oder nichtfunktionelle Tumorsuppressorgene aufweist. Zu Beispielen von Tumorsuppressionsgenen gehören, ohne aber darauf begrenzt zu sein, das Retinoblastomsuszeptibilitätsgen oder RB-Gen, das p53-Gen, das im Colonkarzinom deletierte (DDC) Gen und das Tumorsuppressorgen vom Neurofibromatose-Typ 1 (NF-1). Verlust von Funktion oder Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen kann eine zentrale Rolle bei der Initiierung und/oder Progression einer bedeutenden Anzahl von menschlichen Krebsen spielen.
Hypophysenvorderlappentumore sind meistens gutartige, Hormon sekretierende oder hormoninaktive Adenome, entstehend aus einer monoklonalen Expansion einer genetisch mutierten Zelle. Die Pathogenese von Tumorbildung in dem Hypophysenvorderlappen ist intensiv untersucht worden.
Mechanismen für Hypophysentumorgenese beinhalten eine Mehrschrittkaskade von kürzlich charakterisierten molekularen Ereignissen. Das am besten charakterisierte Onkogen in Hypophysentumoren ist gsp, ein konstitutiv aktives Gasα, resultierend aus der Aktivierung von Punktmutationen in diesem Gen.
Gasa-Mutationen erfolgen in etwa 40% von GH-sekretierenden Tumoren und konstitutiv aktiviertes CREB wird auch in einer Untergruppe dieser Tumore gefunden. Obwohl die Wichtigkeit von GSa-mutanten Proteinen in der Entwicklung von Wachstumshormon sekretierenden Hypophysentumoren gut begründet ist, enthält nur etwa ein Drittel dieser Tumore diese Mutationen, was das Vorhandensein von zusätzlichen transformierenden Ereignissen in der Hypophysentumorgenese anzeigt. Obwohl Punktmutationen von Ras-Onkogen, der Verlust von Heterozygotie (LOH) nahe dem Rb-Locus auf Chromosom 13 und LOH auf Chromosom 11 an einigen Hypophysentumoren beteiligt sind, bleibt der Mechanismus, der Hypophysenzelltransformation bewirkt großenteils unbekannt. So gibt es einen Bedarf auf dem Fachgebiet für zusätzliche Hypophysen-abgeleitete Proteine, die mit Hypophysenzelltransformation verbunden sind.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte, gereinigte Proteine des Säuger-Pituitary-Transforming-Gens (PTTG), früher Proteine des Säuger-Hypophysentumor-spezifischen Gens (PTSG) genannt. Die PTTG-Proteine der Erfindung und Fragmente davon sind in Bioassays, als Immunogene zum Herstellen von anti-PTTG-Antikörpern oder in derartige Proteine und/oder Antikörper enthaltenden therapeutischen Zusammensetzungen verwendbar. Diese Erfindung betrifft auch einen transgenen nicht-humanen Säuger, der PTTG-Protein expimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch isolierte Nucleinsäuren, die PTTG-(PTSG)-Proteine von Säugerursprung, wie beispielsweise Mensch, Ratte usw., codieren. Die PTTG codierende Nucleinsäure wird auch in Form von einem sie tragenden Vektor, als hybridisierende Sonden/Primer, in sie tragenden Wirtszellen, als Antisense-Oligonucleotide, in DNA- und RNA-Form und verwandten Zusammensetzungen bereitgestellt. Die hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle können in dem Fachmann bekannte Expressionssysteme eingebracht werden. Die PTTG-Nucleinsäuren sind als Sonden zum Untersuchen der Anwesenheit und/oder Menge eines PTTG-Gens oder mRNA-Transkripts in einer gegebenen Probe verwendbar. Die hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle und Oligonucleotidfragmente davon sind auch als Primer und/oder Template in einer PCR-Reaktion zum Amplifizieren von PTTG-Proteine codierenden Genen verwendbar.
Antikörper, die immunoreaktiv mit PTTG-Proteinen der Erfindung sind, werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Antikörper sind in diagnostischen Assays zur Bestimmung der Niveaus von PTTG-Proteinen, vorhanden in einer gegebenen Probe, z.B. Gewebeproben, biologische Flüssigkeiten, Western-Blots und dergleichen, verwendbar. Die Antikörper können auch verwendet werden, um PTTG-Proteine aus rohen Zellextrakten und dergleichen zu reinigen. Darüber hinaus werden diese Antikörper als therapeutisch nützlich angesehen, um der biologischen Wirkung von PTTGs in vivo entgegenzuwirken oder sie zu ergänzen.
Verfahren und diagnostische Systeme zum Bestimmen der Niveaus von PTTG-Protein in verschiedenen Gewebeproben werden gleichfalls bereitgestellt. Diese diagnostischen Verfahren können zum Überwachen des Niveaus von therapeutisch verabreichtem PTTG-Protein oder Fragmenten davon verwendet werden, um die Aufrechterhaltung therapeutisch wirksamer Mengen zu erleichtern. Diese diagnostischen Verfahren können ebenfalls verwendet werden, um pathologische und physiologische Störungen zu diagnostizieren, die aus abnormalen Niveaus von PTTG-Protein resultieren.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes, reines Polypeptid bereitgestellt, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die Hypophysentumor erzeugende Eigenschaft induziert, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 oder durch Varianten davon codiert ist, welche Varianten mindestens 60% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und imstande sind, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren.
Die Varianten können mindestens 70% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und sind imstande, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren. Die Varianten können mindestens 90% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und sind imstande, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren. Die Varianten können mindestens 95% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und sind imstande, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren. Das Variantennucleotid kann mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 unter mäßig stringenten Bedingungen, äquivalent dem Hybridisieren in 50% Formamid, 5 × Denhart-Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C, hybridisieren. Das Variantennucleotid kann mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren und Hybride erzeugen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind.
Vorzugsweise umfaßt das Polypeptid des ersten Aspekts die Aminosäuresequenz, codiert durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No:1.
Das Polypeptid kann SEQ. ID No: 2 und biologisch aktive Varianten davon umfassen, welche Varianten mindestens 70% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden. Die Varianten können mindestens 80% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden. Die Varianten können mindestens 90% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden. Die Varianten können mindestens 95% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden.
Vorzugsweise umfaßt das Polypeptid SEQ.ID No: 2.
Das Polypeptid kann von Säugerursprung sein. Das Polypeptid kann aus der Gruppe, bestehend aus Polypeptiden von Menschen-, Ratten-, Mäuse-, Schweine-, Schafs-, Hunde- und Rinderursprung, ausgewählt sein.
Gemäß einem zweiten Aspekt wird eine Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid des ersten Aspekts und einen Träger, bereitgestellt.
Gemäß einem dritten Aspekt wird ein isoliertes, gereinigtes Polynucleotid, bestehend aus den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No:1, bereitgestellt. Das Polynucleotid kann eine Nucleinsäure, codierend das Peptid von SEQ.ID No: 2, umfassen.
Gemäß einem vierten Aspekt wird ein Polynucleotid, umfassend die Antisense-Nucleinsäure des Polynucleotids des dritten Aspekts, bereitgestellt.
Das Polynucleotid kann weiterhin eine nachweisbare Markierung oder einen Marker umfassen. Das Polynucleotid kann mit mRNA unter stringenten Bedingungen hybridisieren, die Hybride erzeugen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind.
Das Polynucleotid kann eine RNA sein. Das Polynucleotid kann eine DNA sein.
Gemäß einem fünften Aspekt wird eine Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid gemäß dem dritten Aspekt, bereitgestellt.
Gemäß einem sechsten Aspekt wird ein Vektor, umfassend das Polynucleotid gemäß dem dritten Aspekt, bereitgestellt.
Gemäß einem siebenten Aspekt wird eine Zusammensetzung, umfassend den Vektor gemäß dem sechsten Aspekt und einen Träger, bereitgestellt.
Gemäß einem achten Aspekt wird eine Wirtszelle, tragend den Vektor gemäß dem sechsten Aspekt, bereitgestellt.
Gemäß einem neunten Aspekt wird eine Zusammensetzung, umfassend die Wirtszelle gemäß dem achten Aspekt und einen Träger, bereitgestellt.
Gemäß einem zehnten Aspekt wird ein diagnostischer Kit für ein Säuger-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, umfassend mindestens ein Polynucleotid gemäß dem dritten Aspekt und Instruktionen für seine Markierung zur Verwendung beim Nachweis der Pituitary-Tumor-Transforming-Gen codierenden DNA, bereitgestellt.
Gemäß einem elften Aspekt wird ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen gemäß dem ersten Aspekt, umfassend Kultivieren der Wirtszellen gemäß dem achten Aspekt in einem Expressionsmedium und unter wirksamen Expressionsbedingungen, bereitgestellt;
Exprimierenlassen eines Proteins des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen und Ansammeln in dem Medium; und Abtrennen des Mediums, umfassend das Protein des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, von den Zellen.
Das Verfahren kann weiterhin das Abtrennen des Proteins des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen von dem Medium und allen verbleibenden Komponenten umfassen.
Gemäß einem zwölften Aspekt wird bereitgestellt ein isolierter Antikörper eines diagnostischen Kits für ein anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, ein isolierter Antikörper eines diagnostischen Kits für ein anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, selektiv bindend ein isoliertes, reines Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die Hypophysentumor erzeugende Wirkung induziert, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ ID No: 1 codiert ist.
Der Antikörper kann ein monoklonaler Antikörper sein.
Der Antikörper kann ein polyklonaler Antikörper sein.
Gemäß einem dreizehnten Aspekt wird eine Zusammensetzung, umfassend den Antikörper gemäß dem zwölften Aspekt und einen Träger, bereitgestellt.
Gemäß einem vierzehnten Aspekt wird ein transgener nichtmenschlicher Säuger, tragend mindestens ein nichtnatives Polynucleotid, bereitgestellt, welches ein Polypeptid gemäß dem ersten Aspekt exprimiert.
Der transgene nichtmenschliche Säuger kann ein mutiertes Polynucleotid tragen, welches eine mutierte Aminosäuresequenz, identifiziert als mutierte SEQ ID No: 2, exprimiert.
Der transgene nichtmenschliche Säuger kann ein knock-out-Lebewesen sein.
Der transgene nichtmenschliche Säuger kann eine transgene Maus sein.
Gemäß einem fünfzehnten Aspekt wird ein Verfahren zum Identifizieren von Nucleinsäure des diagnostischen Kits für ein Säuger-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen bereitgestellt, umfassend Inkontaktbringen der Nucleinsäure einer Säugerprobe mit dem Antisense-Polynucleotid gemäß dem vierten Aspekt in markierter Form unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die Hybride erzeugen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind; Nachweisen der Anwesenheit einer Markierung in der hybridisierten Nucleinsäure der Probe; und Identifizieren der Anwesenheit einer Säugernucleinsäure in der Anwesenheit der Markierung in der Nucleinsäure der Säugerprobe.
Gemäß einem sechzehnten Aspekt wird ein Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure des diagnostischen Kits für ein Säuger-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen bereitgestellt, umfassend das Verfahren des fünfzehnten Aspekts; und Abtrennen der markierten hybridisierten Nucleinsäure von der unmarkierten Nucleinsäure aus der Säugerprobe.
Gemäß einem siebzehnten Aspekt wird ein Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von Peptid des diagnostischen Kits für ein menschliches Pituitary-Tumor-Transforming-Gen in einer Probe bereitgestellt, umfassend Inkontaktbringen einer menschlichen Probe mit dem Antikörper und Zulassen der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper gemäß dem zwölften Aspekt und einem Peptid des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, vorhanden in der Probe; Nachweisen der Anwesenheit eines Komplexes Antikörper-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen des diagnostischen Kits; und Bestimmen, daß ein menschliches PTTG-Peptid, wenn ein Peptid-Antikörper-Komplex des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming Gen, in der Probe vorhanden ist.
Der Antikörper kann eine nachweisbare Markierung tragen und der Nachweisschritt kann durch Nachweisen der Antikörper-Markierung nach Abtrennung des markierten Komplexes von unmarkiertem und markiertem Antikörper ausgeführt werden.
Gemäß einem achtzehnten Aspekt wird die Verwendung einer einsträngigen Nucleotidsequenz, die unter in hohem Maße stringenten Bedingungen mit der SEQ.ID No: 1 einer Nucleinsäure hybridisiert und welche Hybride erzeugt, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind, in einem diagnostischen in-vitro-Test für Tumore bereitgestellt.
Gemäß einem neunzehnten Aspekt wird ein in-vitro-Verfahren zum Nachweisen einer pathologischen Masse, verbunden mit der Expression eines Pituitary-Tumor-Transforming-Gens, bereitgestellt, umfassend Nachweisen einer transkribierten oder mutanten Nucleinsäure einer Sequenz des Polynucleotids gemäß dem dritten Aspekt in einer Zelle, die von einem Patienten erhalten worden ist.
Gemäß einem zwanzigsten Aspekt wird ein Kit zum diagnostischen Nachweis eines Pituitary-Tumor-Transforming-Gens bereitgestellt, umfassend den Antikörper gemäß dem zwölften Aspekt; und Instruktionen für seinen Gebrauch.
Der Kit nach kann weiterhin ein Polypeptid eines Pituitary-Tumor-Transforming-Gens, selektiv gebunden durch den Antikörper, umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUR
1 zeigt die Auswirkung der PTTG-Expression auf die Zellproliferation. Die Zellwachstumsgeschwindigkeit wird als Extinktion bei 595 nm ausgedrückt. Die Fehlerbalken stellen SEM (n=6) dar. Es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung entstand aus einem Wunsch von den Erfindern, Verfahren zum Nachweis von Krankheiten oder Leiden, verbunden mit der Überproduktion von, oder Abnormalitäten in, PTTG-Expression gegenüber dem Stand der Technik zu verbessern. Die Erfinder haben sich vorgenommen, ein PTTG-Gen in einer Spezies zu isolieren und haben dann Sonden, basierend auf der so gefundenen Gensequenz, benutzt, um die genomische DNA von anderen Spezies, insbesondere menschlichen, zu sondieren und haben ein Verfahren zum Mutieren des PTTG-Gens ebenso wie ein Verfahren zum Ersetzen defekter PTTG-Gene ausgedacht. Sie haben zusätzlich ein transgenes Lebewesen zur Verwendung als Modell für die Untersuchung derartiger Krankheiten und Leiden bei Menschen konzipiert. Diese Erfindung stellt daher isolierte, gereinigte Proteine, Polypeptide und Fragmente davon von Säuger-Hypophysentumor-spezifischem Gen (PTTG), codiert durch die Nucleinsäure der Erfindung bereit. Wie hier verwendet bezieht sich der Ausdruck „PTTG" auf eine Säugerfamilie von isolierten und/oder im wesentlichen reinen Proteinen, vorzugsweise menschlichen, die imstande sind, Zellen in Gewebekultur, z.B. NIH-3T3-Zellen und dergleichen, zu transformieren. Die PTTG-Proteine der Erfindung haben die Fähigkeit, Tumorbildung bei nackten Mäusen, z.B. wenn transfiziert in NIH-3T3-Zellen und dergleichen, zu induzieren. Die PTTG-Proteine der Erfindung schließen natürlich vorkommende allelische Varianten davon, codiert durch mRNA, erzeugt durch alternatives Spleißen eines primären Transkripts, ein und schließen weiter Fragmente ein, welche mindestens eine native biologische Aktivität, wie beispielsweise Immunität erzeugende Eigenschaft, behalten.
Um Gene zu identifizieren, die speziell in Hypophysentumorzellen exprimiert werden, haben die Erfinder GH sekretierende und Prolactin sekretierende Ratten-Hypophysentumorzellinien benutzt. In dieser Weise benutzten sie sie, um das Gemisch von normalen Geweben, vorhanden in chirurgisch ausgeschnittenen menschlichen Hypophysentumoren und festen experimentellen Rattentumoren, zu eliminieren. Beim Screenen von etwa 30% der exprimierten mRNA wurde ein Hypophysentumor transformierendes Gen (PTTG) identifiziert und charakterisiert. Die Sequenz von PTTG enthüllte keine Homologie zu irgendwelchen bekannten Sequenzen in der GenBank. Das PTTG-Gen codiert ein Protein von 199 Aminosäuren, das kein charakterisiertes funktionelles Motiv enthält, was klar anzeigt, daß PTTG ein neues Protein ist.
Die Erfinder haben die Hypophysentumor-spezifische Expression von PTTG durch Northern-Blot-Analyse gezeigt. Anders als Hypophysentumorzellen ist Hodengewebe das einzige normale nicht-Tumorgewebe, das PTTG-Expression zeigt. Interessanterweise scheint die PTTG-Messenger-RNA im Hoden etwa 300 bp kürzer als die des Hypophysentumors zu sein, was anzeigt, daß der Hoden-Messenger eine PTTG-Spleißvariante des Hypophysen-Messengers ist.
Die Wichtigkeit von PTTG in der Tumorgenese wird durch seine Fähigkeit veranschaulicht, 3T3-Fibroblasten, wenn überexprimiert in diesen Zellen, zu transformieren, wie durch morphologische Veränderung und Verankerungs-unabhängiges Wachstum von PTTG-Transfektanten in weichem Agar gezeigt wird. Dieses Ergebnis wird darüber hinaus durch die Entdeckung unterstrichen, daß mehrfache Tumorzellinien reichliche Mengen von PTTG exprimieren. Weiterhin entwickelten nackte Mäuse, injiziert mit PTTG exprimierenden 3T3-Zellen, innerhalb von 3 Wochen an allen Injektionsstellen große Tumore. Diese Werte zeigen, daß PTTG allein zu zellulärer Transformation imstande ist, ohne ein komplementäres Onkogen zu erfordern, und daß es in vivo potent tumorerzeugend ist. Im allgemeinen erfordert volle Zelltransformation zwei komplementäre Onkogene. Siehe Land et al., Nature, 304:696 (1983); Schwab et al., Nature, 316:160 (1985); Ruley et al., Nature 304:602 (1983). In einigen Fällen jedoch kann die Überexpression eines einzelnen Onkogens ausreichend sein, um zelluläre Transformation zu induzieren, wie es in der Rat-1-Zelltransformation durch Überexpression des Ras-Gens allein der Fall ist. Siehe, Reynolds, V.L., Oncogene, 1:323 (1987). Im vorliegenden Fall haben die Erfinder gefunden, daß PTTG Zellproliferation in kultivierten transfizierten Zellen innerhalb von 72 Stunden Untersuchungszeit nicht stimuliert. Tatsächlich haben sie gefunden, daß PTTG unerwarteterweise alle Proliferation in kultivierten transfizierten Zellen hemmt. Diese antiproliferative Wirkung ist der potenten Hemmung des Zellwachstums ähnlich, die von Massaque et al. mit TGFB gesehen wird. Siehe Massaque et al., Ann. Rev. Cell Biol. 6:597 (1990). Sobald die Zellen jedoch transformiert sind, wird die Zellproliferation beschleunigt und bei nackten Mäusen wird schnelles Wachstum von Tumoren gesehen.
Die PTSG-Proteine dieser Erfindung sind Polypeptid, selektiv gebunden durch anti-PTTG (anti-PTTG)-Antikörper, wobei der Antikörper vorzugsweise an das menschliche Protein bindet, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 und 5 bis 50 Aminosäuren lange Fragmente, welche an anti-PTTG-Antikörper binden, einschließt. Die isolierten PTSG-Proteine der Erfindung sind im allgemeinen frei von anderen zellulären Komponenten und/oder Kontaminanten, die normalerweise mit einer nativen in-vivo-Umgebung verbunden sind, obwohl sie einen bestimmten Gehalt an diesen Produkten, wie beispielsweise Proteine, RNA, DNA und Polysaccharide, haben können.
Die PTTG-Proteine werden primär, obwohl nicht exklusiv, durch Hypophysentumorzellen exprimiert, wobei Expression im Hoden nachgewiesen ist. Das Transkript in Ratten-Hypophysentumorzellen hat eine Größe von etwa 1,3 kb, während das Transkript im Hoden etwa 1 kb beträgt, wie durch einen Northern-Blot-Assay beobachtet wurde. Spleißvariante cDNA-Transkripte, codierend eine PTTG-Familie von Proteinen, werden durch die vorliegende Erfindung klar ebenfalls in Erwägung gezogen.
Die Verwendung der Begriffe „isoliert" und/oder „gereinigt" in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen als einem Modifizierungsmittel von DNA, RNA, Polypeptid oder Proteinen bedeutet, daß die DNA, RNA, das Polypeptid oder die Proteine, die so bezeichnet sind, in derartiger Form durch die Hand des Menschen hergestellt worden sind und so von ihrer nativen zellulären in-vivo-Umgebung getrennt sind. Als Ergebnis dieser menschlichen Intervention sind die rekombinanten DNAs, RNAs, das Polypeptid und die Proteine der Erfindung auf hier beschriebenen Wegen verwendbar, auf denen die DNAs, RNAs, das Polypeptid und die Proteine, wie sie natürlicherweise vorkommen, es nicht sind.
Wie hier verwendet bezieht sich „Säuger" auf die Varietät der Spezies, aus welcher das PTTG-Protein der Erfindung abgeleitet ist, z.B. Mensch, Ratte, Maus, Kaninchen, Affe, Pavian, Rind, Schwein, Schaf, Hund, Katze und dergleichen. Ein bevorzugtes PTTG-Protein hier ist menschliches PTTG.
Ebenfalls Teil dieser Erfindung ist das PTTG-Gen, welches, wenn defekt oder vorhanden, für Hypophysentumorgenese verantwortlich ist. Eine Suche von GenBank und Proteinprofilanalyse (BLAST-Programmsuche von Datenbanken des nationalen Zentrums für Biotechnologieinformation) zeigte an, daß PTTG keine Homologie mit bekannten Sequenzen teilt und sein codiertes Protein in hohem Maße hydrophil ist und keine bekannten funktionellen Motive enthält.
Gegenwärtig bevorzugte PTTG-Proteine der Erfindung schließen Aminosäuresequenzen ein, die im wesentlichen die gleichen sind wie die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2 und Fragmente davon, etwa 5 bis 10 Aminosäuren lang, ebenso wie biologisch aktive modifizierte Formen davon. Der Fachmann erkennt, daß zahlreiche Reste der vorstehend beschriebenen Sequenzen mit anderen, chemisch, sterisch und/oder elektronisch ähnlichen Resten substituiert werden können, ohne die biologische Aktivität der resultierenden Rezeptorspezies wesentlich zu verändern. Außerdem werden größere Polypeptidsequenzen, die im wesentlichen die gleiche Sequenz wie SEQ ID NO:2 darin enthalten (z.B. Spleißvarianten), in Betracht gezogen.
Wie hier angewendet bezeichnet der Begriff „im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz" Aminosäuresequenzen, die mindestens etwa 70% Identität in bezug auf die Referenzaminosäuresequenz haben und die Eigenschaft vergleichbarer funktioneller und biologischer Aktivität des Proteins, definiert durch die Referenzaminosäuresequenz, behalten. Vorzugsweise haben Proteine mit „im wesentlichen der gleichen Aminosäuresequenz" mindestens etwa 80%, stärker bevorzugt 90% Aminosäureidentität in bezug auf die Referenzaminosäuresequenz; wobei mehr als etwa 95% Aminosäuresequenzidentität besonders bevorzugt sind. Es wird jedoch erkannt, daß Polypeptid (oder die vorstehend bezeichneten Nucleinsäuren), die weniger als die beschriebenen Niveaus von Sequenzidentität enthalten, die als Spleißvarianten entstehen oder die durch konservative Aminosäuresubstitutionen oder durch Substitution von degenerierten Codons modifiziert sind, ebenfalls innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung eingeschlossen sind.
Der Begriff „biologisch aktiv" oder „funktionell", wenn hier als Modifizierungsmittel des (der) PTTG-Proteins(e) dieser Erfindung oder eines Polypeptidfragments davon verwendet, bezieht sich auf ein Polypeptid, das mindestens eine der funktionellen charakteristischen Eigenschaften, zugeschrieben dem PTTG, zeigt. Zum Beispiel ist eine biologische Aktivität von PTTG die Fähigkeit, Zellen in vitro (z.B. NIH-3T3-Zellen und dergleichen) zu transformieren. Noch eine andere biologische Aktivität von PTTG ist die Fähigkeit, Tumorbildung bei nackten Mäusen zu induzieren (z.B. wenn in NIH-3T3-Zellen und dergleichen transfiziert).
PTTG ist auch als Immunogen für die Erzeugung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die selektiv an PTTG binden, aktiv. So wird eine PTTG codierende Nucleinsäure der Erfindung ein Polypeptid codieren, das spezifisch durch einen Antikörper erkannt wird, der ebenfalls spezifisch das PTTG-Protein erkennt, vorzugsweise menschliches, einschließend die Aminosäuresequenz SEQ ID NO:2, und Fragmente davon, etwa 5 bis 50 Aminosäuren lang, welche an den anti-PTTG-Antikörper binden. Derartige Aktivität kann durch ein beliebiges dem Fachmann bekanntes Verfahren untersucht werden. Zum Beispiel kann ein Test-Polypeptid, codiert durch eine PTTG cDNA, verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche dann auf ihre Fähigkeit, an das Protein einschließlich der in SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz zu binden, untersucht werden. Wenn der Antikörper an das Test-Polypeptid und das Protein einschließlich der in SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz mit im wesentlichen der gleichen Affinität bindet, dann besitzt das Polypeptid die erforderliche biologische Aktivität.
Die PTTG-Proteine der Erfindung können durch Verfahren isoliert werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. die hier beschriebenen rekombinanten Expressionssysteme, Ausfällung, Gelfiltration, Ionenaustausch, Umkehrphasen- und Affinitätschromatographie und dergleichen. Andere bekannte Verfahren sind bei Deutscher et al., Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Führer zur Proteinreinigung: Methoden in der Enzymologie), Band 182 (Academic Press (1990)) beschrieben. Alternativ kann das isolierte Polypeptid der vorliegenden Erfindung unter Verwendung bekannter rekombinanter Verfahren, wie zum Beispiel bei Sambrook et al., vorstehend (1989) beschrieben, erhalten werden.
Ein Beispiel der Mittel zum Herstellen des (der) Polypeptids(e) der Erfindung ist, Nucleinsäuren, codierend das PTTG, in einer geeigneten Wirtszelle, wie beispielsweise eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Amphibienzelle (d.h. Oozyte) oder eine Säugerzelle, zu exprimieren, wobei Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, und das exprimierte Polypeptid, wiederum unter Verwendung bekannter Verfahren, zu gewinnen. Das PTTG-Polypeptid der Erfindung kann direkt aus Zellen isoliert werden, die mit Expressionsvektoren wie den hier beschriebenen transformiert worden sind. Das Polypeptid der Erfindung, biologisch aktive Fragmente und funktionelle Äquivalente davon können auch durch chemische Synthese erzeugt werden. Zum Beispiel kann synthetisches Polypeptid unter Verwendung des automatischen Peptidsynthetisierers von Applied Biosystems, Inc., Modell 30A oder 431A (Foster City, CA) erzeugt werden, wobei die durch den Hersteller bereitgestellte Chemie angewendet wird.
Ebenfalls eingeschlossen durch den Begriff PTTG sind Polypeptidfragmente oder Polypeptidanaloge davon. Der Begriff „Polypeptidanaloges" schließt ein beliebiges Polypeptid mit einer Sequenz des Aminosäurerests, die im wesentlichen identisch mit einer speziell hier angegebenen Sequenz ist, ein, bei welchem ein oder mehrere Reste konservativ mit einem funktionell ähnlichen Rest substituiert worden sind und welches die Fähigkeit zeigt, PTTG wie hier beschrieben nachzuahmen. Zu Beispielen konservativer Substitutionen gehören die Substitution von einem nichtpolaren (hydrophoben) Rest wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin für einen anderen, die Substitution von einem polaren (hydrophilen) Rest für einen anderen, wie beispielsweise zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutamin und Asparagin, zwischen Glycin und Serin, die Substitution von einem basischen Rest wie beispielsweise Lysin, Arginin oder Histidin für einen anderen, oder die Substitution von einem sauren Rest wie beispielsweise Asparaginsäure oder Glutaminsäure für einen anderen. Der Ausdruck „konservative Substitution" schließt auch die Verwendung eines chemisch derivatisierten Rests anstelle eines nicht derivatisierten Rests ein, mit der Maßgabe, daß ein derartiges Polypeptid die erforderliche Bindungsaktivität zeigt.
„Chemisches Derivat" bezeichnet ein betreffendes Polypeptid mit einem oder mehreren Resten, chemisch derivatisiert durch Umsetzung einer funktionellen Seitengruppe. Zu derartigen derivatisierten Molekülen gehören zum Beispiel diejenigen Moleküle, in welchen freie Aminogruppen derivatisiert worden sind, um Aminhydrochloride, p-Toluolsulfonylgruppen, Carbobenzoxygruppen, t-Butyloxycarbonylgruppen, Chloracetylgruppen oder Formylgruppen zu erzeugen. Freie Carboxylgruppen können derivatisiert werden, um Salze, Methyl- und Ethylester oder andere Typen von Estern oder Hydraziden zu erzeugen. Freie Hydroxylgruppen können derivatisiert werden, um O-Acyl- oder O-Alkylderivate zu erzeugen. Der Imidazolstickstoff von Histidin kann derivatisiert werden, um Nim-Benzylhistidin zu erzeugen. Ebenfalls eingeschlossen als chemische Derivate sind diejenigen Peptide, welche ein oder mehrere natürlich vorkommende Aminosäurederivate der zwanzig Standardaminosäuren enthalten. Zum Beispiel kann 4-Hydroxyprolin für Prolin substituiert werden; kann 5-Hydroxylysin für Lysin substituiert werden; kann 3-Methylhistidin für Histidin substituiert werden; kann Homoserin für Serin substituiert werden; und kann Ornithin für Lysin substituiert werden. Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung schließt auch ein Polypeptid mit einer oder mehreren Additionen und/oder Deletionen von Resten relativ zu der Sequenz eines Polypeptids, dessen Sequenz hier angegeben ist, ein, so lange wie die erforderliche Aktivität aufrechterhalten wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Zusammensetzungen bereit, die einen verträglichen Träger und eines von einem isolierten gereinigten PTTG-Polypeptid, einem aktiven Fragment oder Polypeptidanalogen davon, oder einem gereinigten reifen Protein und aktiven Fragmenten davon allein oder in Kombination miteinander enthalten. Dieses Polypeptid oder Protein kann rekombinant abgeleitet, chemisch synthetisiert oder aus nativen Ausgangsstoffen gereinigt sein. Wie hier verwendet schließt der Begriff „verträglicher Träger" einen beliebigen von den standardmäßigen pharmazeutischen Trägern, wie beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Wasser und Emulsionen wie beispielsweise eine Öl/Wasser- oder Wasser/Öl-Emulsion und verschiedenartige Typen von Benetzungsmitteln, ein.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden isolierte Nucleinsäuren bereitgestellt, welche die PTTG-(Pituitary-Tumor-Transforming-Gen)-Proteine der Erfindung und Fragmente davon codieren. Die hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle sind zum Herstellen der Proteine der Erfindung verwendbar, wenn derartige Nucleinsäuren in eine Vielfalt von dem Fachmann bekannten Proteinexpressionssystemen eingebracht werden. Außerdem können derartige Nucleinsäuremoleküle oder Fragmente davon mit einem leicht nachweisbaren Substituenten markiert und als Hybridisierungssonden zum Untersuchen der Anwesenheit und/oder Menge eines PTTG-Gens oder mRNA-Transkripts in einer gegebenen Probe verwendet werden. Die hier beschriebenen Nucleinsäuremoleküle und Fragmente davon sind ebenfalls als Primer und/oder Template in einer PCR-Reaktion zum Amplifizieren von das hier beschriebene Protein der Erfindung codierenden Genen verwendbar.
Der Begriff „Nucleinsäure" (auch bezeichnet als Polynucleotide) schließt Ribonucleinsäure (RNA) oder Desoxyribonucleinsäure (DNA), Sonden, Oligonucleotide und Primer ein. DNA kann entweder komplementäre DNA (cDNA) oder genomische DNA sein, z.B. ein Gen, codierend ein PTTG-Protein. Ein Mittel zum Isolieren einer Nucleinsäure, codierend ein PTTG-Polypeptid, ist, mit einer natürlichen oder künstlich gestalteten DNA-Sonde unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren eine Säugergenbank zu sondieren. DNA-Sonden, abgeleitet von dem PTTG-Gen, sind für diesen Zweck besonders nützlich. DNA und cDNA-Moleküle, die PTTG-Polypeptid codieren, können verwendet werden, um komplementäre genomische DNA, cDNA oder RNA von Säuger- (z.B. Mensch, Maus, Ratte, Kaninchen, Schwein und dergleichen) oder anderen tierischen Ausgangsstoffen zu erhalten, oder um durch das Screenen von cDNA- oder genomischen Genbanken nach nachstehend ausführlicher beschriebenen Verfahren verwandte cDNA oder genomische Klone zu isolieren. Beispiele von Nucleinsäuren sind RNA, cDNA oder isolierte genomische DNA, codierend ein PTTG-Polypeptid. Zu derartigen Nucleinsäuren können, ohne aber darauf begrenzt zu sein, Nucleinsäuren, umfassend SEQ ID NO:1, Allele davon, vorzugsweise zumindest die Nucleotide 293-889 von SEQ ID NO:1 oder spleißvariante cDNA-Sequenzen davon, gehören.
Wie hier verwendet beziehen sich die Ausdrücke „spleißvariant" oder „alternativ gespleißt", wenn verwendet, um eine spezielle Nucleotidsequenz, codierend einen Rezeptor der Erfindung, zu beschreiben, auf eine cDNA-Sequenz, die aus dem bekannten Spleißvorgang eukaryotischer RNA entsteht. Der RNA-Spleißvorgang beinhaltet die Entfernung von Intronen und das Einbinden von Exonen aus eukaryotischen primären RNA-Transkripten, um reife RNA-Moleküle des Cytoplasmas zu erzeugen. Verfahren zum Isolieren von spleißvarianten Nucleotidsequenzen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel kann der Fachmann Nucleotidsonden, abgeleitet von der PTTG codierenden DNA von SEQ ID NO:1, Allele davon, Spleißvarianten davon oder Fragmente davon, etwa 10 bis 150 Nucleotide lang, und ihre Antisense-Nucleinsäuren anwenden, um die cDNA- oder genomische Genbank der gleichen oder einer anderen Spezies wie hier beschrieben zu screenen.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen DNAs, codierend die PTTG-Proteine dieser Erfindung, SEQ ID NO:1, Allele davon, Spleißvarianten davon und Fragmente davon, etwa 10 bis 150 Nucleotide lang, und Antisense-Nucleinsäuren davon. In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen DNA-Moleküle, codierend die Proteine der Erfindung, die Nucleotide 293-889 von SEQ ID NO:1, Allele davon, Spleißvarianten davon und Fragmente davon, etwa 10 bis 150 Nucleotide lang.
Wie hier angewendet bezieht sich der Begriff „im wesentlichen die gleiche Nucleotidsequenz" auf DNA mit hinreichender Identität mit dem Referenzpolynucleotid, derart, daß sie mit dem Referenznucleotid unter mäßig stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. In einer Ausführungsform codiert DNA mit im wesentlichen der gleichen Nucleotidsequenz wie die Referenznucleotidsequenz im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie die, angegeben in SEQ ID NO:2, oder eine größere Aminosäuresequenz, die SEQ ID NO:2 einschließt. In einer anderen Ausführungsform hat DNA mit „im wesentlichen der gleichen Nucleotidsequenz" wie die Referenznucleotidsequenz mindestens 60% Identität in bezug auf die Referenznucleotidsequenz. DNA mit mindestens 70%, stärker bevorzugt mindestens 90%, noch stärker bevorzugt mindestens 95% Identität mit der Referenznucleotidsequenz wird bevorzugt.
Die vorliegende Erfindung schließt auch Nucleinsäuren ein, welche sich von den Nucleinsäuren, angegeben in SEQ ID NO:1, unterscheiden, aber welche den gleichen Phänotyp haben. Phänotypisch ähnliche Nucleinsäuren werden auch als „funktionell äquivalente Nucleinsäuren" bezeichnet. Wie hier verwendet schließt der Ausdruck „funktionell äquivalente Nucleinsäuren" Nucleinsäuren, gekennzeichnet durch schwache und nicht aufeinanderfolgende Sequenzvariationen, ein, die in im wesentlichen der gleichen Weise funktionieren, wobei das (die) gleiche(n) Proteinprodukt(e) erzeugt wird (werden), wie die hier offenbarten Nucleinsäuren. Insbesondere codieren funktionell äquivalente Nucleinsäuren Polypeptide, die die gleichen sind wie diejenigen, die hier offenbart sind, oder die konservative Aminosäurevariationen haben oder die größeres Polypeptid kodieren, das SEQ ID NO:2 einschließt. Zum Beispiel schließen konservative Variationen Substitution eines nichtpolaren Restes mit einem anderen nichtpolaren Rest oder Substitution eines geladenen Restes mit einem ähnlich geladenen Rest ein. Diese Variationen schließen diejenigen ein, die vom Fachmann als diejenigen erkannt sind, die die tertiäre Struktur des Proteins nicht wesentlich verändern.
Weiterhin werden Nucleinsäuren, codierend PTTG-Popypeptide, bereitgestellt, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes nicht notwendigerweise mit den Nucleinsäuren der Erfindung unter spezifizierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren. Bevorzugte Nucleinsäuren, codierend das PTTG-Popypeptid der Erfindung, umfassen Nucleotide, codierend SEQ ID NO:2 und Fragmente davon, etwa 5 bis 50 Aminosäuren lang. Exemplarische Nucleinsäuren, codierend ein PTTG-Protein der Erfindung, können aus den folgenden ausgewählt werden.

(a) DNA, codierend die Aminosäuresequenz, angegeben in SEQ ID NO:2,
(b) DNA, die mit der DNA von (a) unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisiert, wobei die DNA biologisch aktives PTTG codiert, oder
(c) DNA, degeneriert in bezug auf entweder vorstehendes (a) oder vorstehendes (b), wobei die DNA biologisch aktives PTTG codiert.

Hybridisierung bezeichnet die Bindung komplementärer Stränge von Nucleinsäure (d.h. sense:Antisense-Stränge oder Sonde:Ziel-DNA) miteinander durch Wasserstoffbindungen, ähnlich den Bindungen, die natürlicherweise in chromosomaler DNA vorkommen. Stringenzniveaus, verwendet, um eine gegebene Sonde mit Ziel-DNA zu hybridisieren, können leicht durch den Fachmann variiert werden.
Der Ausdruck „stringente Hybridisierung" wird hier verwendet, um Bedingungen zu bezeichnen, unter welchen Polynucleinsäurehybride stabil sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, wird die Stabilität von Hybriden in der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride reflektiert. Im allgemeinen ist die Stabilität eines Hybrids eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der Temperatur. Typischerweise wird die Hybridisierungsreaktion unter Bedingungen niedrigerer Stringenz, gefolgt von Waschungen variierender, aber höherer Stringenz, durchgeführt. Bezugnahme auf Hybridisierungsstringenz betrifft derartige Waschbedingungen.
Wie hier verwendet bezeichnet der Ausdruck „mäßig stringente Hybridisierung" Bedingungen, die Ziel-DNA gestatten, eine komplementäre Nucleinsäure zu binden, die etwa 60% Identität, vorzugsweise etwa 75% Identität, stärker bevorzugt etwa 85% Identität mit der Ziel-DNA hat; wobei mehr als etwa 90% Identität mit der Ziel-DNA besonders bevorzugt werden. Vorzugsweise sind mäßig stringente Bedingungen Bedingungen, äquivalent der Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhart-Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,2 × SSPE, 0,2% SDS bei 65°C.
Der Ausdruck „Hybridisierung mit hoher Stringenz" bezeichnet Bedingungen, die Hybridisierung von nur denjenigen Nucleinsäuresequenzen gestatten, die stabile Hybride in 0,018 M NaCl bei 65°C bilden (d.h., wenn ein Hybrid in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil ist, wird es unter Bedingungen hoher Stringenz, wie sie hier in Betracht gezogen werden, nicht stabil sein). Bedingungen hoher Stringenz können zum Beispiel durch Hybridisierung in 50% Formamid, 5 × Denhart-Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,1 × SSPE und 0,1% SDS bei 65°C bereitgestellt werden.
Der Ausdruck „Hybridisierung mit geringer Stringenz" bezeichnet Bedingungen, äquivalent der Hybridisierung in 10% Formamid, 5 × Denhart-Lösung, 6 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C und nachfolgendes Waschen in 0,1 × SSPE, 0,2% SDS bei 50°C. Denhart-Lösung und SSPE (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) sind dem Fachmann bekannt wie es andere geeignete Hybridisierungspuffer sind.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „degeneriert" Codons, die sich in mindestens einem Nucleotid von einer Referenznucleinsäure, z.B. SEQ ID NO:1, unterscheiden, aber die gleichen Aminosäuren wie die Referenznucleinsäure codieren. Zum Beispiel sind Codons, spezifiziert durch die Tripletts „UCU", „UCC", „UCA" und „UCG", in bezug aufeinander degeneriert, da alle vier von diesen Codons die Aminosäure Serin codieren.
Bevorzugte Nucleinsäuren, codierend das (die) Polypeptid(e) der Erfindung, hybridisieren unter mäßig stringenten, vorzugsweise hoch stringenten Bedingungen, mit im wesentlichen der gesamten Sequenz, oder wesentlichen Anteilen, d.h. typischerweise mindestens 15-30 Nucleotiden, von SEQ ID NO:1, obwohl längere Fragmente ebenfalls in Betracht gezogen werden.
Stellengerichtete Mutagenese einer Region von PTTG cDNA wird hier für die Herstellung mutanter PTTG cDNAs in Betracht gezogen. Zum Beispiel kann der Transformer Mutagenesis Kit (erhältlich von Clontech) verwendet werden, um eine Varietät von Missense- und/oder Nonsense-Mutationen zu PTTG cDNA aufzubauen.
Die Nucleinsäuren der Erfindung können durch eine Vielfalt von Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, z.B. die hier beschriebenen Verfahren, indem PCR-Amplifikation unter Verwendung von Oligonucleotid-Primern aus verschiedenen Regionen von SEQ ID NO:1 und dergleichen angewendet wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls markierte PTTG codierende cDNAs, oder Fragmente davon, angewendet werden, um (eine) Genbank(en) (z.B. cDNA, genomische und dergleichen) für zusätzliche Nucleinsäuresequenzen, codierend verwandte neue Säuger-PTTG-Proteine, zu sondieren. Aufbau von Säuger-cDNA- und genomischen Genbanken, vorzugsweise einer menschlichen Genbank, ist auf dem Fachgebiet bekannt. Screening einer derartigen cDNA- oder genomischen Genbank wird anfangs unter Bedingungen sehr niedriger Stringenz ausgeführt, welche eine Temperatur von weniger als etwa 42°C, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 50% und eine mäßige bis niedrige Salzkonzentration umfassen.
Gegenwärtig bevorzugte Sonden-basierende Screeningbedingungen umfassen eine Temperatur von etwa 37°C, eine Formamidkonzentration von etwa 20% und eine Salzkonzentration von etwa 5 × Standardkochsalzcitrat (SSC; 20 × SSC enthalten 3 M Natriumchlorid, 0,3 M Natriumcitrat, pH 7,0). Derartige Bedingungen erlauben die Identifikation von Sequenzen, welche einen wesentlichen Grad von Ähnlichkeit mit der Sondensequenz haben, ohne perfekte Homologie zu erfordern. Der Ausdruck „wesentliche Ähnlichkeit" bezeichnet Sequenzen, welche mindestens 50% Homologie teilen. Vorzugsweise werden Hybridisierungsbedingungen ausgewählt, welche die Identifikation von Sequenzen erlauben, die mindestens 70% Homologie mit der Sonde haben, während sie Sequenzen diskriminieren, welche einen niedrigeren Grad von Homologie mit der Sonde haben. Als Ergebnis werden Nucleinsäuren mit im wesentlichen der gleichen, d.h. ähnlichen, Sequenz wie die Codierungsregion der Nucleinsäuren der Erfindung, vorzugsweise wie die Nucleotide 293-889 von SEQ ID NO:1, erhalten.
Wie hier verwendet ist eine Nucleinsäure-„Sonde" einsträngige DNA oder RNA, oder Analoge davon, die eine Sequenz von Nucleotiden hat, die mindestens 14, vorzugsweise mindestens 20, stärker bevorzugt mindestens 50, zusammenhängende Basen einschließt, die die gleichen sind wie (oder das Komplement davon) beliebige 14 oder mehr zusammenhängende Basen, angegeben in SEQ ID NO:1. Bevorzugte Regionen, aus welchen Sonden aufzubauen sind, schließen 5' und/oder 3' codierende Regionen von SEQ ID NO:1 ein. Außerdem kann die gesamte cDNA, codierend die Region eines PTTG-Proteins der Erfindung, oder die gesamte Sequenz entsprechend SEQ ID NO:1 als Sonde verwendet werden. Sonden können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, wie nachstehend beschrieben, markiert und in verschiedenen diagnostischen Kits verwendet werden.
Wie hier verwendet bezeichnen die Begriffe „Markierung" und „anzeigende Mittel" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Herstellung eines nachweisbaren Signals beteiligt sind. Eine beliebige Markierung oder ein anzeigendes Mittel können mit Nucleinsäuresonden der Erfindung, exprimierten Proteinen, Polypeptidfragmenten oder Antikörpermolekülen verknüpft werden. Diese Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Derartige Verbindungen selbst sind in klinischer diagnostischer Chemie bekannt.
Das Markierungsmittel kann ein fluoreszentes Markierungsmittel sein, das chemisch ohne Denaturierung an Antikörper oder Antigene bindet, wobei ein Fluorochrom (Farbstoff) erzeugt wird, der ein nützlicher immunofluoreszenter Tracer ist. Eine Beschreibung immunofluoreszenter Analysetechniken wird in DeLuca „Immunofluorescence Analysis" (Immunofluoreszenzanalyse) in Antibody as a Tool (Antikörper als Werkzeug), Marchalonis et al., Hrsg., John Wiley & Sons Ltd., S. 189-231 (1982) gefunden.
In einer Ausführungsform ist die anzeigende Gruppe ein Enzym, wie beispielsweise Meerrettichperoxidase (HRP), Glucoseoxidase und dergleichen. In einer anderen Ausführungsform werden radioaktive Elemente als Markierungsmittel angewendet. Die Verknüpfung einer Markierung mit einem Substrat, d.h. das Markieren von Nucleinsäuresonden, Antikörpern, Polypeptid und Proteinen ist auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel kann ein Antikörper der Erfindung durch metabolische Einbringung von radiomarkierten Aminosäuren, bereitgestellt in dem Kulturmedium, markiert werden. Siehe zum Beispiel Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:346 (1981). Herkömmliche Mittel von Proteinkonjugation oder Kuppeln durch aktivierte funktionelle Gruppen sind besonders anwendbar. Siehe zum Beispiel Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Bd. 8, Ergänz. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984) und die US-Patentschrift 4493795.
Ebenfalls bereitgestellt werden Antisense-Oligonucleotide mit einer Sequenz, die fähig ist, sich spezifisch mit einem Teil einer mRNA zu verbinden, die PTTG-Polypeptid codiert, so daß Translation der mRNA verhindert wird. Das Antisense-Oligonucleotid kann eine Sequenz haben, die fähig ist, sich spezifisch mit einem Teil der Sequenz der cDNA, codierend PTTG-Polypeptid, zu verbinden. Wie hier verwendet schließt der Ausdruck „verbindet sich spezifisch" die Fähigkeit einer Nucleinsäuresequenz ein, eine komplementäre Nucleinsäuresequenz zu erkennen und damit über die Erzeugung von Wasserstoffbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren doppelt helikale Segmente zu erzeugen. Ein Beispiel eines Antisense-Oligonucleotids ist ein Antisense-Oligonucleotid umfassend chemische Analoge des Nucleotids.
Zusammensetzungen, umfassend eine Menge des vorstehend beschriebenen Antisense-Oligonucleotids, die wirksam die Expression von PTTG-Polypeptid verringern, indem sie durch eine Zellmembran hindurchgehen und sich spezifisch mit mRNA, codierend PTTG-Polypeptid, verbinden, wobei so Translation verhindert wird, und ein verträglicher hydrophober Träger, der imstande ist, durch eine Zellmembran hindurch zu gehen, werden hier ebenfalls bereitgestellt. Geeignete hydrophobe Träger werden zum Beispiel in den US-Patentschriften 5334761; 4889953; 4897355 und dergleichen beschrieben. Der vernägliche hydrophobe Träger, imstande, durch Zellmembranen hindurch zu gehen, kann auch eine Struktur umfassen, welche an einen Rezeptor, spezifisch für einen ausgewählten Zelltyp, bindet und dadurch durch Zellen des ausgewählten Zelltyps aufgenommen wird. Die Struktur kann Teil eines Proteins sein, von dem bekannt ist, an einen Zelltyp-spezifischen Rezeptor zu binden.
Antisense-Oligonucleotid-Zusammensetzungen sind verwendbar, um Translation von mRNA, codierend Polypeptid der Erfindung, zu hemmen. Synthetische Oligonucleotide, oder andere chemische Antisense-Strukturen, sind gestaltet, um an mRNA, codierend PTTG-Polypeptid, zu binden und Translation von mRNA zu hemmen, und sind als Zusammensetzungen verwendbar, um Expression von PTTG-assoziierten Genen in einer Gewebeprobe oder bei einem Patienten zu hemmen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Kits zum Nachweisen von Mutationen, Duplikationen, Deletionen, Umordnungen oder Aneuploidien in dem PTTG-Gen, umfassend mindestens eine PTTG-Sonde oder ein Antisense-Nucleotid der Erfindung, bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung stellt Mittel zum Modulieren der Niveaus der Expression von PTTG-Polypeptid durch Anwenden synthetischer Antisense-Oligonucleotid-Zusammensetzungen (nachstehend SAOC) bereit, welche Translation von mRNA, codierend dieses Polypeptid, hemmen. Synthetische Oligonucleotide oder andere chemische Antisense-Strukturen, gestaltet, um mRNA zu erkennen und selektiv daran zu binden, werden konstruiert, um komplementär mit Teilen des PTTG-Codierungsstrangs oder Nucleotidsequenzen, angegeben in SEQ ID No: 1, zu sein. Die SAOC ist gestaltet, stabil im Blutstrom zur Verabreichung an einen Patienten durch Injektion oder durch direkte Integration an die Tumorstelle oder stabil bei Laborzellkulturbedingungen zu sein. Die SAOC ist gestaltet, fähig zu sein, durch die Zellmembran hindurchzugehen, um kraft physikalischer und chemischer Eigenschaften des SAOC in das Cytoplasma der Zelle einzutreten, welche es befähigen, durch Zellmembranen hindurchzugehen, zum Beispiel durch Gestalten von kleinen hydrophoben chemischen SAOC-Strukturen oder kraft spezifischer Transportsysteme in der Zelle, welche das SAOC erkennen und es in die Zelle transportieren. Außerdem kann die SAOC zur Verabreichung nur an bestimmte ausgewählte Zellpopulationen gestaltet sein, indem die SAOC zielgerichtet angewendet wird, um durch spezifische zelluläre Aufnahmemechanismen erkannt zu werden, welche die SAOC nur innerhalb ausgewählter Zellpopulationen binden und aufnehmen.
Zum Beispiel kann die SAOC gestaltet sein, an einen Rezeptor zu binden, der nur in einem bestimmten Zelltyp gefunden wird, wie vorstehend diskutiert wird. Die SAOC ist ebenfalls gestaltet, eine Ziel-mRNA-Sequenz zu erkennen und selektiv an sie zu binden, welche einer Sequenz, enthalten innerhalb der Sequenz, angegeben in SEQ ID No: 1, entsprechen kann. Die SAOC ist gestaltet, eine Ziel-mRNA-Sequenz zu inaktivieren, indem sie entweder daran bindet und Zersetzung der mRNA durch zum Beispiel RNase-I-Digestion induziert oder die Translation von mRNA-Zielsequenz hemmt, indem die Bindung von Translations-regulierenden Faktoren oder Ribosomen beeinträchtigt wird oder andere chemische Strukturen, wie beispielsweise Ribozymsequenzen oder reaktive chemische Gruppen, welche die Ziel-mRNA entweder zersetzen oder chemisch modifizieren, eingeschlossen werden. Es wurde gezeigt, daß SAOCs zu derartigen Eigenschaften imstande sind, wenn sie gegen mRNA-Ziele gerichtet werden (siehe Cohen et al., TIPS, 10:435 (1989) und Weintraub, Sci. American, Hanuar (1990), S. 40).
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Verfahren für die rekombinante Herstellung des (der) PTTG-Proteines(e) der Erfindung durch Exprimieren der vorstehend beschriebenen Nucleinsäuresequenzen in geeigneten Wirtszellen bereitgestellt. Systeme zur rekombinanten DNA-Expression, die geeignet sind, um die hier beschriebenen PTTG-Proteine herzustellen, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zum Beispiel können die vorstehend beschriebenen Nucleotidsequenzen zur weiteren Manipulation in Vektoren eingebracht werden. Wie hier verwendet bezeichnet Vektor (oder Plasmid) gesonderte Elemente, die verwendet werden, um heterologe DNA zur weiteren Expression oder Replikation davon in Zellen einzuführen.
Geeignete Expressionvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und schließen Vektoren ein, die imstande sind, DNA zu exprimieren, die operativ mit einer regulatorischen Sequenz wie beispielsweise einer Promotorregion verknüpft ist, die imstande ist, die Expression derartiger DNA zu regulieren. So bezeichnet ein Expressionsvektor ein rekombinantes DNA- oder RNA-Konstrukt, wie beispielsweise ein Plasmid, eine Phage, rekombinanten Virus oder einen anderen Vektor, der bei Einführung in eine geeignete Wirtszelle zu Expression der insertierten DNA führt. Geeignete Expressionsvektoren sind dem Fachmann bekannt und schließen diejenigen ein, die in eukaryotischen Zellen und/oder prokaryotischen Zellen replizierbar sind, und diejenigen, die episomal bleiben, oder diejenigen, welche in das Wirtszellgenom integrieren. Außerdem können Vektoren geeignete Verpackungssignale enthalten, die den Vektor befähigen, durch eine Anzahl von viralen Virionen, z.B. Retroviren, Herpesviren, Adenoviren, verpackt zu werden, was zu der Erzeugung eines „viralen Vektors" führt.
Wie hier verwendet bezeichnet eine Promotorregion ein Segment von DNA, das die Transkription von DNA steuert, mit welcher es operativ verknüpft ist. Die Promotorregion schließt spezifische Sequenzen ein, die für RNA-Polymerase-Erkennung, Bindung und Transkriptionsinitiierung ausreichend sind. Außerdem schließt die Promotorregion Sequenzen ein, die diese Erkennungs-, Bindungs- und Transkriptionsinitiierungsaktivität von RNA-Polymerase modulieren. Diese Sequenzen können cis-wirkend sein oder können ansprechend auf trans-wirkende Faktoren sein. Promotoren, abhängig von der Natur der Regulierung, können konstitutiv oder reguliert sein. Zu exemplarischen Promotoren, in Erwägung gezogen zur Verwendung in der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung, gehören der frühe SV40-Promotor, der Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor, der Steroid-induzierbare Promotor des Mäusemammatumorvirus (MMTV), der Promotor des Moloney-Rattenleukämievirus (/MMLV) und dergleichen.
Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „operativ verknüpft" die funktionelle Beziehung von DNA mit regulatorischen und Effektornucleotidsequenzen, wie beispielsweise Promotoren, Enhancer, transkriptionelle und translationale Stopstellen und andere Signalsequenzen. Zum Beispiel bezeichnet die operative Verknüpfung von DNA mit einem Promotor die physikalische und funktionelle Beziehung zwischen der DNA und dem Promotor, derart, daß die Transkription derartiger DNA von dem Promotor durch eine RNA-Polymerase initiiert wird, die die DNA spezifisch erkennt, an sie bindet und sie transkribiert.
Wie hier verwendet bezeichnet Expression den Vorgang, durch welchen Polynucleinsäuren in mRNA transkribiert und in Peptide, Polypeptid oder Proteine translatiert werden. Wenn die Polynucleinsäure von genomischer DNA abgeleitet ist, kann Expression, wenn eine geeignete eukaryotische Wirtszelle oder ein Organismus ausgewählt ist, Spleißen der mRNA einschließen.
Prokaryotische Transformationsvektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und dazu gehören die Vektoren pBlueskript und Phage Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA) und dergleichen. Andere geeignete Vektoren und Promotoren sind ausführlich in der US-Patentschrift 4798885, erteilt am 17. Januar 1989, offenbart.
Zu anderen geeigneten Vektoren zur Transformation von E.-coli-Zellen gehören die pET-Expressions-Vektoren (Novagen, siehe die US-Patentschrift 4952496), z.B. pETIIa, welches den T7-Promotor, T7-Terminator, den induzierbaren E.-coli-lac-Operator und das lac-Repressor-Gen enthält; und pET 12a-c, welche den T7-Promotor, T7-Terminator und das E.-coli-ompT-Sekretionssignal enthalten. Ein anderer geeigneter Vektor ist das pIN-IIIompA2 (siehe Duffaud et al., Meth. in Enzymology, 153:492-507, 1987), welches den lpp-Promotor, den lacUV5-Promotor-Operator, das ompA-Sekretionssignal und das lac-Repressor-Gen enthält.
Exemplarische eukaryotische Transformationsvektoren, die das klonierte Rinder-Papilloma-Virus-Genom, die klonierten Genome der Rattenretroviren und eukaryotische Kassetten, wie beispielsweise das pSV-2-gpt-System (beschrieben von Mulligan und Berg, 1979, Nature, Bd. 277:108-114), das Okayama-Berg-Klonierungssystem (Mol. Cell Biol. Bd. 2: 161-170, 1982) und der Expressionsklonierungsvektor, beschrieben vom Genetics Institute (Science Bd. 228:810-815, 1985), einschließen, sind verfügbar, welche wesentliche Sicherung von zumindest einiger Expression des interessierenden Proteins in der transformierten eukaryotischen Zellinie bereitstellen.
Besonders bevorzugte Basisvektoren, welche regulatorische Elemente enthalten, die mit den PTTG codierenden DNAs der Erfindung zur Transfektion von Säugerzellen verknüpft werden können, sind auf dem Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor basierende Vektoren wie beispielsweise pcDNA1 (Invitrogen, San Diego, CA), auf MMTV-Promotor basierende Vektoren wie beispielsweise pMAMNeo (Clontech, Palo Alto, CA) und pMSG (Pharmacia, Piscataway, NJ) und auf SV40-Promotor basierende Vektoren wie aspSVP (Clontech, Palo Alto, CA).
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden „rekombinante Zellen" bereitgestellt, die die Nucleinsäuremoleküle (d.h. DNA oder mRNA) der vorliegenden Erfindung enthalten. Verfahren zum Transformieren geeigneter Wirtszellen, vorzugsweise Bakterienzellen und stärker bevorzugt E.-coli-Zellen, ebenso wie Verfahren, anwendbar zum Kultivieren der Zellen, enthaltend ein Gen, codierend ein heterologes Protein, sind allgemein auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch) (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1989).
Exemplarische Verfahren zum Einführen (Transduzieren) von Expressionsvektoren, enthaltend Nucleinsäuren der Erfindung, in Wirtszellen, um transduzierte rekombinante Zellen (d.h. Zellen, enthaltend rekombinante homologe Nucleinsäure) zu erzeugen, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zur Übersicht Friedmann, 1989, Science, 244:1275-1281; Mulligan, 1993, Science, 260:926-932). Zu exemplarischen Verfahren der Transduktion gehören z.B. Infektion, die virale Vektoren anwendet (siehe z.B. die US-Patentschriften 4405712 und 4650764), Calciumphosphat-Transfektion (US-Patentschriften 4399216 und 4634665), Dextransulfat-Transfektion, Elektroporation, Lipofektion (siehe z.B. die US-Patentschriften 4394448 und 4619794), Cytofektion, Bombardierung mit Teilchenkügelchen und dergleichen. Die heterologe Nucleinsäure kann gegebenenfalls Sequenzen einschließen, welche ihre extrachromosomale (d.h. episomale) Erhaltung erlauben, oder es kann bewirkt werden, daß die heterologe DNA in das Genom des Wirts integriert (als alternatives Mittel zur Sicherung stabiler Erhaltung in dem Wirt).
Zu Wirtsorganismen, die für die Verwendung in der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen werden, gehören diejenigen Organismen, in welchen rekombinante Produktion von heterologen Proteinen ausgeführt worden ist. Zu Beispielen derartiger Wirtsorganismen gehören Bakterien (z. B. E. coli), Hefe (z.B. Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Hansenula polymorpha und P. pastoris; siehe z.B. die US-Patentschriften 4882279, 4837148, 4929555 und 4855231), Säugerzellen (z.B. HEK293, CHO und Ltkcells), Insektenzellen und dergleichen. Gegenwärtig bevorzugte Wirtsorganismen sind Bakterien. Das am meisten bevorzugte Bakterium ist E. coli.
In einer Ausführungsform können Nucleinsäuren, codierend die PTTG-Proteine der Erfindung, entweder in vivo oder in vitro unter Verwendung geeigneter viraler Vektoren, bekannt auf dem Fachgebiet, z.B. retrovirale Vektoren, Adenovirusvektoren und dergleichen, in Säugerzellen abgegeben werden. Außerdem wird, wo es wünschenswert ist, die in-vivo-Expression des PTTG dieser Erfindung zu begrenzen oder zu verringern, die Einführung des Antisense-Strangs der Nucleinsäure der Erfindung in Erwägung gezogen.
Auf Viren basierende Systeme stellen den Vorteil bereit, imstande zu sein, relativ hohe Niveaus der heterologen Nucleinsäure in eine Vielfalt von Zellen einzuführen. Geeignete virale Vektoren zum Einführen von PTTG-Nucleinsäure, codierend ein PTTG-Protein, in Säugerzellen (z.B. Segmente von vaskulärem Gewebe) sind auf dem Fachgebiet bekannt. Zu diesen viralen Vektoren gehören zum Beispiel Herpes-simplex-Virus-Vektoren (z.B. Geller et al., 1988, Science, 241:1667-1669), Vaccinia-Virus-Vektoren (z.B. Piccini et al., 1987, Meth. in Enzymology, 153:545-563; Cytomegalovirus-Vektoren (Mocarski et al., in Viral Vectors, Y. Gluzman und S.H. Hughes, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988, S. 78-84), Moloney-Rattenleukämievirus-Vektoren (Danos et al., 1980, PNAS, USA, 85:6469), Adenovirus-Vektoren (z.B. Logan et al., 1984, PNAS, USA, 81:3655-3659; Jones et al., 1979, Cell, 17:683-689; Berkner, 1988, Biotechniques, 6:616-626; Cotten et al., 1992, PNAS, USA, 89:6094-6098; Graham et al., 1991, Meth. Mol. Biol., 7:109-127), adenoassoziierter-Virus-Vektoren, Retrovirus-Vektoren und dergleichen. Siehe z.B. die US-Patentschriften 4405712 und 4650764. Besonders bevorzugte virale Vektoren sind der Adenovirus- und der retrovirale Vektor.
Zum Beispiel werden in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung Vektor-Komplexe von Adenovirus-Transferrin/Polylysin-DNA (TfAdpl-DNA) (Wagner et al., 1992, PNAS, USA, 89:6099-6103); Curiel et al., 1992, Hum. Gene Therapy, 3:147-154; Gao et al., 1993, Hum. Gene Ther., 4:14-24) angewendet, um Säugerzellen mit heterologer PTTG-Nucleinsäure zu transduzieren. Ein beliebiger von den hier beschriebenen Plasmidexpressionsvektoren kann in einem TfAdpl-DNA-Komplex angewendet werden.
Wie hier verwendet bezeichnet „retroviraler Vektor" die bekannten Gentransferplasmide, die eine Expressionskassette, codierend ein heterologes Gen, liegend zwischen zwei retroviralen LTRs, aufweisen. Retrovirale Vektoren enthalten typischerweise geeignete Verpackungssignale, die dem retroviralen Vektor, oder der RNA, transkribiert unter Verwendung des retroviralen Vektors als Templat, ermöglichen, in einer geeigneten Verpackungszellinie in ein virales Virion verpackt zu werden (siehe z.B. die US-Patentschrift 4650764).
Geeignete retrovirale Vektoren zur Verwendung hier sind zum Beispiel in der US-Patentschrift 5252479 und in den WIPO-Veröffentlichungen WO 92/07573, WO 90/06997, WO 89/05345, WO 92/05266 und WO 92/14829 beschrieben, welche eine Beschreibung von Verfahren zur effizienten Einführung von Nucleinsäuren in menschliche Zellen unter Verwendung derartiger retroviraler Vektoren bereitstellen. Zu anderen retroviralen Vektoren gehören zum Beispiel die Mäuse-Mammatumor-Virus-Vektoren (z.B. Sheckleford et al., 1988, PNAS, USA, 85:9655-9659) und dergleichen.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden anti-PTTG-Antikörper mit spezifischer Reaktivität mit PTTG-Polypeptid der vorliegenden Erfindung bereitgestellt. Aktive Fragmente von Antikörpern sind in die Definition von „Antikörper" eingeschlossen. Antikörper der Erfindung können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt werden, wobei das PTTG-Polypeptid der Erfindung, Proteine oder Teile davon als Antigene verwendet werden. Zum Beispiel können polyklonale und monoklonale Antikörper durch Verfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie sie zum Beispiel bei Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Antikörper: Ein Laborhandbuch) (Cold Spring Harbor Laboratory (1988)) beschrieben sind. Das PTSG-Polypeptid der Erfindung kann als Immunogene beim Erzeugen derartiger Antikörper benutzt werden. Alternativ können synthetische Peptide (unter Verwendung von im Handel erhältlichen Synthetisierungsmitteln) hergestellt und als Immunogene verwendet werden. Aminosäuresequenzen können durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie hydrophobe oder hydrophile Domänen des entsprechenden Polypeptids codieren. Veränderte Antikörper, wie beispielsweise chimäre, humanisierte, CDR-gepfropfte oder bifunktionelle Antikörper, können ebenfalls durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren erzeugt werden. Derartige Antikörper können auch durch Hybridoma, chemische Synthese oder rekombinante Verfahren hergestellt werden, die zum Beispiel bei Sambrook et al., vorstehend, und Harlow und Lane, vorstehend, beschrieben sind. Sowohl anti-Peptid- als auch anti-Fusionsprotein-Antikörper können verwendet werden (siehe zum Beispiel Bahouth et al., Trends Pharmacol. Sci. 12:338 (1991); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Gegenwärtige Protokolle in der Molekularbiologie) (John Wiley and Sons, NY (1989)).
So hergestellter Antikörper kann unter anderem in diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet werden, um das Niveau von PTTG-Protein, vorhanden in einer Probe eines Säuger-, vorzugsweise Menschen-, Körpers, wie beispielsweise Gewebe- oder Gefäßflüssigkeit, nachzuweisen. Derartige Antikörper können auch für die Reinigung des PTTG-Proteins der Erfindung durch Immunoaffinitäts- oder Affinitätschromatographie verwendet werden. Außerdem werden hier Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von PTTG-Polypeptid entweder auf der Oberfläche einer Zelle oder innerhalb einer Zelle (wie beispielsweise innerhalb des Kerns) in Betracht gezogen, welche Verfahren Inkontaktbringen der Zelle mit einem Antikörper, der unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an PTTG-Polypeptid gestatten, spezifisch an PTTG-Polypeptid bindet, Nachweisen der Anwesenheit des Antikörpers, gebunden an PTTG, und dadurch Nachweisen der Anwesenheit von Polypeptid der Erfindung auf der Oberfläche oder innerhalb der Zelle umfassen. In bezug auf den Nachweis eines derartigen Polypeptids können die Antikörper für in-vitro-diagnostische oder in-vivo-bildgebende Verfahren verwendet werden.
Zu immunologischen Verfahrensweisen, verwendbar für in-vitro-Nachweis von Ziel-PTTG-Polypeptid in einer Probe, gehören Immunoassays, die einen nachweisbaren Antikörper anwenden. Zu derartigen Immunoassays gehören zum Beispiel ELISA, mikrofluorimetrischer Pandex-Assay, Agglutinationsassays, Fließcytometrie, serumdiagnostische Assays und Verfahrensweisen mit immunohistochemischer Färbung, welche auf dem Fachgebiet bekannt sind. Ein Antikörper kann durch auf dem Fachgebiet bekannte verschiedenartige Mittel nachweisbar gemacht werden. Zum Beispiel kann ein nachweisbarer Marker direkt oder indirekt an den Antikörper gebunden werden. Zu verwendbaren Markern gehören zum Beispiel Radionuclide, Enzyme, Fluorogene, Chromogene und chemilumineszente Markierungen.
Die anti-PTTG-Antikörper der Erfindung modulieren die Aktivität des PTTG-Polypeptids in lebenden Tieren, in Menschen oder in daraus isolierten biologischen Geweben oder Flüssigkeiten. Demgemäß werden Zusammensetzungen, die einen Träger und eine Menge eines Antikörpers mit Spezifität für PTTG-Polypeptid umfassen, die wirksam natürlich vorkommende Liganden oder andere PTTG bindende Proteine vom Binden an PTTG-Polypeptid der Erfindung blockieren, hier in Betracht gezogen. Zum Beispiel kann ein monoklonaler Antikörper, gerichtet auf ein Epitop von PTTG-Polypeptid-Molekülen, vorhanden auf der Oberfläche einer Zelle und mit einer Aminosäuresequenz, die im wesentlichen die gleiche wie eine Aminosäuresequenz für ein Zelloberflächenepitop eines PTTG-Polypeptids einschließlich der Aminosäuresequenz, angegeben in SEQ ID NO:2 und Fragmenten davon, ist, für diesen Zweck verwendbar sein.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin transgene nichtmenschliche Säuger bereit, die imstande sind, exogene Nucleinsäuren, codierend PTTG-Polypeptid, zu exprimieren. Wie hier angewendet bezeichnet der Ausdruck „exogene Nucleinsäure" eine Nucleinsäuresequenz, die nicht nativ für den Wirt ist oder welche in dem Wirt in anderer als ihrer nativen Umgebung (z.B. als Teil eines gentechnisch hergestellten DNA-Konstrukts) vorhanden ist. Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Niveaus von PTTG können die PTTG-Proteine dieser Erfindung entweder überexprimiert, unterexprimiert oder in einer inaktiven mutierten Form, wie beispielsweise in den bekannten nichtmenschlichen knock-out-Transgenen, in nichtmenschlichen transgenen Säugern exprimiert werden.
Ebenfalls bereitgestellt werden transgene nichtmenschliche Säuger, die imstande sind, Nucleinsäuren zu exprimieren, die PTTG-Polypeptid codieren, die so mutiert sind, um zu normaler Aktivität unfähig zu sein, d.h. kein natives PTTG zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung stellt auch transgene nichtmenschliche Säuger mit einem Genom bereit, das Antisense-Nucleinsäuren umfaßt, komplementär zu Nucleinsäuren, codierend PTTG-Polypeptid, plaziert, um in Antisense-mRNA, komplementär zu mRNA, codierend PTTG-Polypeptid, überschrieben zu werden, welche mit der mRNA hybridisiert und dadurch die Translation davon verringert. Die Nucleinsäure kann zusätzlich einen induzierbaren Promotor und/oder gewebespezifische regulatorische Elemente umfassen, so daß Expression induziert oder auf spezifische Zelltypen beschränkt werden kann. Beispiele von Nucleinsäuren sind DNA oder cDNA mit einer Codierungssequenz, die im wesentlichen die gleiche ist wie die Codierungssequenz, die in SEQ ID NO:1 angegeben ist. Ein Beispiel eines nichtmenschlichen transgenen Säugers ist eine transgene Maus.
Modellsysteme von nichtmenschlichen Lebewesen, welche die physiologische und verhaltensmäßige Rolle von PTTG-Polypeptid erläutern, werden ebenfalls bereitgestellt und werden durch Erzeugen von nichtmenschlichen transgenen Lebewesen hergestellt, bei welchen unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken die Expression des PTTG-Polypeptids verändert wird. Zu Beispielen derartiger Techniken gehören die Insertion von normalen oder mutanten Versionen von Nucleinsäuren, codierend ein PTTG-Polypeptid, durch Mikroinjektion, retrovirale Infektion oder andere dem Fachmann bekannte Mittel in geeignete befruchtete Embryos, um ein nichtmenschliches transgenes Lebewesen zu erzeugen. (Siehe zum Beispiel Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (Manipulieren des Mäuseembryos: Ein Laborhandbuch) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1986)).
Ebenfalls hier in Betracht gezogen ist die Verwendung homologer Rekombination von mutanten oder normalen Versionen von PTTG-Genen mit dem Locus des nativen Gens in nichtmenschlichen transgenen Lebewesen, um die Regulation der Expression oder die Struktur von PTTG-Polypeptid zu verändern (siehe Capecchi et al., Science 244:1288 (1989); Zimmer et al., Nature 338:150 (1989)). Techniken homologer Rekombination sind auf dem Fachgebiet bekannt. Homologe Rekombination ersetzt das native (endogene) Gen mit einem rekombinanten oder mutierten Gen, um ein nichtmenschliches Lebewesen zu erzeugen, das kein natives (endogenes) Protein exprimieren kann, aber zum Beispiel ein mutiertes Protein exprimieren kann, was zu veränderter Expression von PTTG-Polypeptid führt.
Im Gegensatz zu homologer Rekombination fügt Mikroinjektion Gene zu dem Wirtsgenom hinzu, ohne Wirtsgene zu entfernen. Mikroinjektion kann ein nichtmenschliches transgenes Lebewesen erzeugen, das imstande ist, sowohl endogenes als auch exogenes PTTG-Protein zu exprimieren. Induzierbare Promotoren können mit der Codierungsregion von Nucleinsäuren verknüpft werden, um ein Mittel zur Regulierung der Expression des Transgens bereitzustellen. Gewebespezifische regulatorische Elemente können mit der Codierungsregion verknüpft werden, um gewebespezifische Expression des Transgens zu gestatten. Modellsysteme von nichtmenschlichen transgenen Lebewesen sind für in-vivo-Screening von Verbindungen zur Identifikation von spezifischen Liganden, d.h. Agonisten und Antagonisten, welche Proteinantworten aktivieren oder hemmen, nützlich.
Nucleinsäuren der Erfindung, Oligonucleotide (einschließlich Antisense), Vektoren, enthaltend dieselben, transformierte Wirtszellen, Polypeptid und Kombinationen davon, ebenso wie Antikörper der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Verbindungen in vitro zu screenen, um zu bestimmen, ob eine Verbindung als potentieller Agonist oder Antagonist zu dem PTTG-Polypeptid der Erfindung funktioniert. Diese in-vitro-Screening-Assays stellen Information betreffend die Funktion und Aktivität des PTTG-Polypeptids der Erfindung bereit, welche zu der Identifikation und Gestaltung von Verbindungen führen kann, die zu spezifischer Wechselwirkung mit einem oder mehreren Typen von Polypeptid, Peptiden oder Proteinen imstande sind.
Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereitgestellt, welche an PTTG-Polypeptid binden. Die Proteine der Erfindung können in einem kompetitiven Bindungsassay angewendet werden. Ein derartiger Assay kann sich auf das schnelle Screening einer großen Anzahl von Verbindungen einstellen, um zu bestimmen, welche Verbindungen, wenn überhaupt, imstande sind, an PTTG-Proteine zu binden. Anschließend können ausführlichere Assays mit denjenigen Verbindungen ausgeführt werden, von denen gefunden wurde, daß sie binden, um weiter zu bestimmen, ob derartige Verbindungen als Modulatoren, Agonisten oder Antagonisten der Proteine der Erfindung wirken.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Bioassay zum Identifizieren von Verbindungen bereitgestellt, welche die Aktivität des PTTG-Polypeptids der Erfindung modulieren. Gemäß diesem Verfahren werden die PTTG-Polypeptide der Erfindung in Kontakt mit einer „unbekannten" oder Testsubstanz (in Gegenwart eines Reportergenkonstrukts, wenn Antagonistaktivität getestet wird) gebracht, die Aktivität des Polypeptids wird anschließend an den Kontakt mit der „unbekannten" oder Testsubstanz überwacht, und diejenigen Substanzen, welche bewirken, daß das Reportergenkonstrukt exprimiert wird, werden als funktionelle Liganden für das PTTG-Polypeptid identifiziert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können transformierte Wirtszellen, die rekombinant das PTSG-Polypeptid der Erfindung exprimieren, in Kontakt mit einer Testverbindung gebracht werden, und die modulierende(n) Auswirkung(en) davon können dann ausgewertet werden, indem die PTTG-vermittelte Antwort (z.B. über Reportergenexpression) in Anwesenheit und Abwesenheit der Testverbindung verglichen wird oder indem die Antwort von Testzellen oder Kontrollzellen (d.h. Zellen, die kein PTTG-Polypeptid exprimieren) auf die Anwesenheit der Verbindung verglichen wird.
Wie hier verwendet bezeichnet eine Verbindung oder ein Signal, das „die Aktivität moduliert", von PTTG-Polypeptid dieser Erfindung eine Verbindung oder ein Signal, das die Aktivität von PTTG-Polypeptid verändert, so daß die Aktivität des PTTG-Polypeptids der Erfindung in Anwesenheit der Verbindung oder des Signals andersartig ist als in Abwesenheit der Verbindung oder des Signals. Insbesondere gehören zu derartigen Verbindungen oder Signalen Agonisten und Antagonisten. Ein Agonist schließt eine Verbindung oder ein Signal ein, die PTTG-Proteinfunktion aktivieren. Alternativ schließt ein Antagonist eine Verbindung oder ein Signal ein, die die PTTG-Proteinfunktion beeinträchtigen.
Typischerweise wird die Auswirkung eines Antagonisten als Blockierung von Agonist-induzierter Proteinaktivierung beobachtet. Zu Antagonisten gehören kompetitive und nicht kompetitive Antagonisten. Ein kompetitiver Antagonist (oder kompetitives Blockierungsmittel) wechselwirkt mit oder nahe der für Agonistbindung spezifischen Stelle. Ein nicht kompetitiver Antagonist oder Blockierungsmittel inaktiviert die Funktion des Polypeptids durch Wechselwirken mit einer anderen Stelle als die Stelle der Wechselwirkung mit dem Agonisten.
Wie für den Fachmann selbstverständlich, erfordern Assay-Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die PTTG-Aktivität modulieren, im allgemeinen Vergleich mit einer Kontrolle. Ein Typ einer „Kontrolle" ist eine Zelle oder Kultur, die im wesentlichen gleich wie die Testzelle oder Testkultur behandelt wird, die der Verbindung ausgesetzt wird, mit der Unterscheidung, daß die „Kontroll"-Zelle oder Kultur nicht der Verbindung ausgesetzt wird. Zum Beispiel kann bei Verfahren, die elektrophysiologische Verfahrensweisen mit Spannungsklammer verwenden, die gleiche Zelle in Anwesenheit oder Abwesenheit der Verbindung getestet werden, indem bloß die äußerliche Lösung, in der die Zelle badet, geändert wird. Ein anderer Typ von „Kontroll"-Zelle oder Kultur kann eine Zelle oder Kultur sein, die identisch mit den transfizierten Zellen ist, mit der Ausnahme, daß die „Kontroll"-Zelle oder Kultur keine nativen Proteine exprimiert. Demgemäß wird die Antwort der transfizierten Zelle auf die Verbindung mit der Antwort (oder deren Fehlen) der „Kontroll"-Zelle oder Kultur auf die gleiche Verbindung unter den gleichen Reaktionsbedingungen verglichen.
In noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann die Aktivierung von PTTG-Polypeptid durch Inkontaktbringen des Polypeptids mit einer wirksamen Menge von mindestens einer Verbindung, identifiziert durch die vorstehend beschriebenen Bioassays, moduliert werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zum Diagnostizieren oder Nachweisen einer pathologischen Masse (wie zum Beispiel ein endokriner oder nicht endokriner Tumor, atherosklerotische Plaque und dergleichen) bereitgestellt, wobei das Verfahren das Nachweisen einer transkribierten oder mutanten Sequenz einschließlich SEQ ID NO:1 in Zellen, die von einem Patienten erhalten worden sind, umfaßt.
In einer speziellen Ausführungsform sind die hier beschriebenen diagnostischen Verfahren der Erfindung für Differentialdiagnose von bösartigen im Verhältnis zu gutartigen Tumoren in Biopsieprüfstücken und dergleichen verwendbar. In einer anderen Ausführungsform sind die hier beschriebenen diagnostischen Verfahren der Erfindung zum Vorhersagen von Tumorverhalten und Ansprechbarkeit auf Therapie verwendbar.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden in-vitro-Verfahren zum Diagnostizieren von Hypophysentumoren bereitgestellt, wobei das Verfahren das Nachweisen einer transkribierten mRNA-Sequenz, einschließend SEQ ID NO:1, in Hypophysen-abgeleiteten Zellen eines Patienten umfaßt.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden diagnostische Systeme, vorzugsweise in Kit-Form, bereitgestellt, die mindestens eine Nucleinsäure der Erfindung in einem geeigneten Verpackungsmaterial umfassen. Die diagnostischen Nucleinsäuren sind von den hier beschriebenen PTTG codierenden Nucleinsäuren abgeleitet. In einer Ausführungsform sind zum Beispiel die diagnostischen Nucleinsäuren von SEQ ID NO:1 abgeleitet. Diagnostische Systeme der Erfindung sind zum Untersuchen der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nucleinsäure, codierend PTTG, in entweder genomischer DNA oder in transkribierter Nucleinsäure (wie beispielsweise mRNA oder cDNA), codierend PTTG, in allen Tumoren (z.B. Hypophysen und dergleichen) oder erkranktem Gewebe verwendbar. Diagnostische Systeme der Erfindung, die hier in Erwägung gezogen werden, können Gebrauch von bekannten Methodiken der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder RTPCR (reverse-Transkriptase-PCR) machen.
Ein geeignetes diagnostisches System schließt mindestens eine Nucleinsäure der Erfindung, vorzugsweise zwei oder mehrere Nucleinsäuren der Erfindung, als gesondert verpacktes) chemisches) Reagenz(ien) in einer Menge, ausreichend für mindestens einen Assay, ein. Instruktionen zur Verwendung des gepackten Reagenzes sind typischerweise ebenfalls eingeschlossen. Der Fachmann kann für die praktische Ausführung der wie hier beschriebenen Verfahren der Erfindung leicht Nucleinsonden der Erfindung und/oder Primer in Kombination mit geeigneten Puffern und Lösungen in Kit-Form einbringen.
Wie hier angewendet bezeichnet der Ausdruck „Verpackungsmaterial" eine oder mehrere physikalische Strukturen, die verwendet werden, um den Inhalt des Kits, wie beispielsweise Nucleinsäuresonden oder Primer der Erfindung und dergleichen, unterzubringen. Das Verpackungsmaterial wird nach bekannten Verfahren konstruiert, vorzugsweise, um eine sterile, Kontaminanten-freie Umgebung bereitzustellen. Das Verpackungsmaterial hat eine Markierung, welche anzeigt, daß die Nucleinsäuren der Erfindung zum Nachweisen einer speziellen Sequenz, codierend PTTG, einschließend die Nucleotidsequenz, angegeben in SEQ ID NO:1, oder eine Mutante davon, verwendet werden können, wodurch die Anwesenheit einer speziellen Pathologie (wie zum Beispiel Hypophysentumorgenese und dergleichen), oder eine Prädisposition dafür, diagnostiziert wird. Außerdem enthält das Verpackungsmaterial Instruktionen, die anzeigen, wie die Materialien in dem Kit angewendet werden, um sowohl eine spezielle Sequenz nachzuweisen als auch die Anwesenheit einer speziellen Pathologie, oder eine Prädisposition dafür, zu diagnostizieren.
Die Verpackungsmaterialien, die hier im Hinblick auf diagnostische Systeme angewendet werden, sind diejenigen, die gebräuchlicherweise in auf Nucleinsäure basierenden diagnostischen Systemen benutzt werden. Wie hier verwendet bezeichnet der Begriff „Verpackung" eine feste Matrix oder ein Material, wie beispielsweise Glas, Kunststoff, Papier, Folie und dergleichen, die imstande sind, eine isolierte Nucleinsäure, ein Oligonucleotid, oder einen Primer der vorliegenden Erfindung innerhalb fixierter Grenzen zu halten. So kann zum Beispiel eine Verpackung ein Glasröhrchen sein, das verwendet wird, um Milligramm-Mengen einer in Erwägung gezogenen Nucleinsäure, eines Oligonucleotids oder Primers, zu enthalten, oder sie kann eine Mikrotiterplattenvertiefung sein, in welche Mikrogramm-Mengen einer in Erwägung gezogenen Nucleinsäuresonde operativ fixiert worden sind.
„Instruktionen zur Verwendung" schließen typischerweise einen greifbaren Ausdruck ein, der die Reagenzkonzentration oder mindestens einen Parameter des Assayverfahrens, wie beispielsweise die zu vermischenden relativen Mengen von Reagenz und Probe, die Zeiträume der Aufrechterhaltung für Reagenz/Probe-Gemische, die Temperatur, Pufferbedingungen und dergleichen beschreibt.
Die Erfindung wird jetzt in größerer Ausführlichkeit durch Bezugnahme auf die folgenden nicht begrenzenden Beispiele beschrieben.
Wenn nicht anderweitig festgestellt wurde die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Standardverfahrensweisen durchgeführt, wie sie zum Beispiel bei Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren, ein Laborhandbuch) (2. Aufl.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA (1989); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (Grundlegende Methoden in der Molekularbiologie), Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1986); oder Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques (Methoden in der Enzymologie: Führer zu molekularen Klonierungstechniken), Bd. 152, S. L. Berger und A. R. Kimmert, Hrsg., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987) beschrieben sind.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: ISOLATION VON PTTG CDNA
Um die molekularen Mechanismen, beteiligt an Hypophysentumorgenese, aufzuklären, wurde PCR mit Differentialanzeige verwendet, um mRNAs, differentiell exprimiert in Hypophysentumorzellen, zu identifizieren (siehe z.B. Risinger et al., 1994, Molec. Carcinogenesis, 11:13-18; und Qu et al., 1996, Nature, 380:243-247). GC- und GH₄-Hypophysentumor-Zellinien (ATCC #CCL-82 bzw. #CCL-82.1) und eine osteogene Sarkom-Zellinie UM108 (ATCC #CRL-1663) wurden in DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum, gezüchtet. Hypophysen von normalen Sprague-Dawley-Ratten wurden frisch exzidiert. Die Gesamt-RNA wurde aus den kultivierten Zellen des Gewebes und dem Hypophysengewebe unter Verwendung des RNeasy^TM-Kits (Qiagen) entsprechend den Instruktionen des Herstellers extrahiert. Spurenweise DNA-Kontamination in RNA-Zubereitungen wurde durch Digestion mit DNase1 (GenHunter Corporation) entfernt. cDNA wurde aus 200 ng Gesamt-RNA unter Verwendung von MMLV reverser Transkriptase (GenHunter Corporation) und einem von den drei verankerten Primern (GenHunter Corporation) synthetisiert. Die erzeugte cDNA wurde in der PCR-Anzeige verwendet.
Drei stromabwärts verankerte Primer AAGCT₁₁X (wo X A, G oder C sein kann) wurden in Verbindung mit 40 willkürlichen Primern stromaufwärts für die PCR-Anzeige verwendet. 120 Primer-Paare wurden verwendet, um die mRNA-Expression in Hypophysentumoren im Verhältnis zu normaler Hypophyse zu screenen. Ein Zehntel der cDNA, erzeugt aus der Reaktion mit reverser Transkriptase, wurde unter Verwendung von AmpliTaq-DNA-Polymerase (Perkin Elmer) in einem Gesamtvolumen von 20 µl, enthaltend 10 mM Tris, pH 8,4, 50 nM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 2 µM dNTPs, 0,2 µM von jedem Primer und 1 µl [³⁵S]dATP amplifiziert. PCR-Zyklen bestanden aus 30 Sekunden bei 94°C, 2 Minuten bei 40°C und 30 Sekunden bei 72°C für 40 Zyklen. Die Produkte wurden auf 6% Sequenzierungsgelen aufgetrennt und getrocknete Gele wurden für 24 bis 48 Stunden Kodak-Film ausgesetzt.
Nach der Entwicklung wurden die amplifizierten DNA-Fragmente aus Hypophysentumor und normaler Hypophyse verglichen. Banden, die einzigartig für Hypophysentumor waren, wurden aus dem Gel exzidiert, und die DNA wurde durch Kochen in 100 µl Wasser extrahiert und mit Ethanol in Gegenwart von Glycogen (GenHunter Corporation) ausgefällt. Die DNA wurde unter Verwendung der ursprünglichen Gruppe von Primern und unter den gleichen thermischen Zyklusbedingungen, außer daß die dNTP-Konzentration auf 20 µM erhöht wurde, reamplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden auf 1% Agarosegel laufen gelassen und mit Ethidiumbromid angefärbt. Die Banden wurden aus dem Gel exzidiert, eluiert (Qiagen), in TA-Vektoren (Invitrogen) kloniert und unter Verwendung von Sequenase (USB) sequenziert. Unter Verwendung von 120 Primerpaaren in dem vorstehend beschriebenen PCR-Assay wurden 11 DNA-Banden, die in Hypophysentumorzellen differentiell exprimiert zu werden schienen, identifiziert. Diese Banden wurden durch Northern-Blot-Analyse unter Verwendung der PCR-Produkte als Sonden weiter ausgewertet.
Für Northern-Blot-Analyse wurden 20 µg von der Gesamt-RNA auf 1% Agarosegel fraktioniert, auf Nylonmembran geblottet und mit statistisch geprimter Sonde unter Verwendung von Quickhyb-Lösungen (Stratagene) hybridisiert. Nach dem Waschen wurden die Membrane für 6 bis 72 Stunden Kodakfilmen ausgesetzt. Als Ergebnis des Northern-Blot-Assays wurden Hypophysentumor-spezifische Signale für 2 Banden nachgewiesen. DNA-Sequenzanalyse enthüllte, daß eine Sequenz homolog mit Insulin-induziertem Wachstums-Response-Protein war, während das andere 396-Basenpaare-Fragment (amplifiziert unter Verwendung von 5'AAGCTTTTTTTTTTTG 3' als dem verankerten Primer und 5'AAGCTTGCTGCTC 3' als einem willkürlichen Primer) keine Homologie mit bekannten Sequenzen in der Genbank zeigte. Dieses 396-bp-Fragment wies eine in hohem Maße exprimierte mRNA von etwa 1,3 kb in Hypophysentumor-Zellen, aber weder in normalen Hypophysen- noch in osteogenen Sarkom-Zellen nach.
BEISPIEL 2: CHARAKTERISIERUNG VON PTTG CDNA
Um diese Hypophysentumor-spezifische mRNA weiter zu kennzeichnen, wurde eine cDNA-Genbank konstruiert, indem mRNA, isoliert aus Ratten-Hypophysentumor-Zellen, verwendet wurde. Poly A+RNA wurde aus Hypophysentumor-GH₄-Zellen unter Verwendung des Messenger-RNA-Isolierungs-Kits (Stratagene) entsprechend den Instruktionen des Herstellers isoliert und wurde verwendet, um eine cDNA-Genbank in ZAP-Express-Vektoren (Stratagene) zu konstruieren. Die cDNA-Genbank wurde konstruiert, indem der ZAP-Express^TM-cDNA-Synthese- und Gigapack-III-Gold-Klonierungs-Kit (Stratagene) den Instruktionen des Herstellers folgend verwendet wurde. Die Genbank wurde unter Verwendung des diffenrentiell angezeigten 396-bp-PCR-Produkts (kloniert in den TA-Vektor) als Sonde gescreent. Nach tertiärem Screening wurden positive Klone durch in-vivo-Exzision unter Verwendung von Helferphage exzidiert.
Das resultierende pBK-CMV-Phagemid, enthaltend das Insert, wurde durch Southern-Blotting-Analyse identifiziert. Unidirektionale eingenistete Deletionen wurden in das DNA-Insert gemacht, indem der EXOIII/Mungobohnen-Nuclease-Deletions-Kit (Stratagene) den Instruktionen des Herstellers folgend verwendet wurde. Beide Stränge der Insert-DNA wurden unter Verwendung von Sequenase (USB) sequenziert.
Unter Verwendung des 396-bp-PCR-Fragments, beschrieben in Beispiel 1, als Sonde wurde ein cDNA-Klon von 974 bp isoliert und charakterisiert. Diese cDNA wurde als Pituitary-Tumor-Transforming-Gen (PTTG) bezeichnet. Die Sequenz von PTTG enthält einen offenen Leserahmen für 199 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2). Die Anwesenheit eines Stopcodons im Rahmen stromaufwärts des vorhergesagten Initiationscodons zeigt an, daß das PTTG den vollständigen ORF enthält. Die Nucleinsäure- und Proteinsequenzen sind nachstehend in Tabelle 1 bereitgestellt.
TABELLE 1: PTTG-NUCLEINSÄURE UND PROTEINSEQUENZEN
Dies wurde verifiziert, indem sowohl in-vitro-Transkription als auch in-vitro-Translation des Genprodukts demonstriert wurde, wie in Beispiel 3 beschrieben ist.
BEISPIEL 3: IN-VITRO-TRANSKRIPTION & -TRANSLATION VON PTTG
Sense- und Antisense-PTTG-mRNAs wurden in vitro unter Verwendung von T3- bzw. T7-RNA-Polymerase (Stratagene) transkribiert. Das überschüssige Templat wurde durch DNase-I-Digestion entfernt. Die in vitro transkribierte mRNA wurde in Kaninchen-Reticulumlysat (Stratagene) translatiert. Reaktionen wurden bei 30°C für 60 Minuten in einem Gesamtvolumen von 25 µl, enthaltend 3 µl in vitro transkribierte RNA, 2 µl ³⁵S-Methionin (Dupond) und 20 µl Lysat, ausgeführt. Translationsprodukte wurden durch SDS PAGE (15% auflösendes Gel und 5% Stackinggel) analysiert und dem Kodak-Film für 16 Stunden ausgesetzt.
Die Ergebnisse zeigen an, daß Translation von in vitro transkribierter PTTG-Sense-mRNA zu einem Protein von ungefähr 25 KD auf SDS-Page führt, wohingegen weder in der Reaktion ohne zugefügte mRNA noch, wenn PTTG-Antisense-mRNA benutzt wurde, ein Protein erzeugt wurde.
BEISPIEL 4: EXPRESSION VON PTTG MRNA
Eine Suche von GenBank und eine Proteinprofilanalyse (unter Verwendung einer BLAST-Programm-Suche von Datenbanken des nationalen Zentrums für Biotechnologie-Information) zeigte an, daß PTTG keine Homologie mit bekannten Sequenzen teilt, und sein codiertes Protein hochhydrophil ist und keine bekannten funktionellen Motive enthält. Das Gewebeexpressionsmuster von PTTG mRNA wurde durch Northern-Blot-Analyse untersucht. Ein Northern Blot von mehrfachem Rattengewebe wurde von Clontech gekauft. Ungefähr 2 µg von Poly A + RNA pro Bahn von acht verschiedenen Rattengeweben (Herz, Hirn, Milz, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Hoden) wurden auf einem denaturierenden Formaldehyd-1,2%-Agarosegel laufen gelassen, auf Nylonmembran überfuhrt und UV-vernetzt. Die Membran wurde zuerst mit der PTTG-cDNA-Sonde voller Länge hybridisiert und wurde gestrippt und mit einer Kontrollsonde von humaner β-Actin-cDNA rehybridisiert. Die Hybridisierung wurde bei 60°C für eine Stunde in ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Clontech) durchgeführt. Waschen geschah zweimal 15 Minuten bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05 % SDS und zweimal 15 Minuten bei 50°C in 0,1 % SSC, 0,1 % SDS. Die Einwirkungszeit für die PTTG-Sonde betrug 24 h und für die Actin-Sonde 2 Stunden.
Die Ergebnisse des Northern-Assay zeigen an, daß Hoden das einzige Gewebe, anders als Hypophysentumor-Zellen, ist, das PTTG mRNA exprimiert, und das Hoden-Expressionsniveau ist viel niedriger (2µg polyA + mRNA, 24 Stunden Einwirkung) als in Hypophysentumorzellen (20 µg Gesamt-RNA, 6 Stunden Einwirkung). Interessanterweise ist das Hodentranskript (etwa 1 Kb) kürzer als das Transkript in Hypophysentumoren (1,3 Kb), was anzeigt, daß die mRNA in dem Hoden diffentiell gespleißt wird und daß das 1,3 Kb-Transkript spezifisch für Hypophysentumorzellen ist.
BEISPIEL 5: ÜBEREXPRESSION VON PTTG DURCH NIH-3T3-FIBROBLASTENZELLEN
Da PTTG mRNA in Hypophysentumorzellen überexprimiert wird, wurde bestimmt, ob dieses Protein eine Wirkung auf Zellproliferation und -transformation ausübt. Ein eukaryotischer Expressionsvektor, enthaltend die gesamte Codierungsregion von PTTG, wurde stabil in NIH-3T3-Fibroblasten transfiziert.
Die gesamte Codierungsregion des PTTG wurde im Rahmen in eukaryotischen pBK-CMV-Expressionsvektor (Stratagene) kloniert und durch Calciumausfällung in NIH-3T3-Zellen transfiziert. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen 1:10 verdünnt und in Selektionsmedium, enthaltend 1 mg/ml G418, für zwei Wochen gezüchtet, woraufhin individuelle Klone isoliert wurden. Zellextrakte wurden von jeder Kolonie hergestellt und auf 15%-SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Nylonmembran geblottet. Ein polyklonaler Antikörper wurde unter Verwendung der ersten 17 Aminosäuren von PTTP als Epitop (Research Genetics) erzeugt. Der Antikörper wurde 1:5000 verdünnt und mit der vorstehenden Membran bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach dem Waschen wurde die Membran mit Meerrettich-Peroxidase-markiertem sekundären Antikörper für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Hybridisierungssignal wurde durch erhöhte Chemilumineszenz nachgewiesen (ECL-Nachweissystem, Amersham).
Expressionsniveaus des PTTG wurden durch Immunoblot-Analyse unter Verwendung des vorstehend beschriebenen speziellen polyklonalen Antikörpers, gerichtet gegen die ersten 17 Aminosäuren des Proteins, überwacht. Expressionsniveaus von individuellen Klonen variierten, und Klone, die höhere Proteinniveaus exprimierten, wurden für weitere Analyse verwendet.
BEISPIEL 6: AUSWIRKUNG VON PTTG-EXPRESSION AUF DIE ZELLPROLIFERATION
Ein nichtradioaktiver Assay der Zellproliferation wurde verwendet, um die Auswirkung von PTTG-Protein-Überexpression auf die Zellproliferation zu bestimmen (siehe z.B. Mosmann, T., 1983, J. Immunol. Meth., 65:55-63; und Carmichael et al., 1987, Cancer Res., 47:943-946). Die Zellproliferation wurde unter Verwendung des Kits CellTiter 96TM zum nichtradioaktiven Assay der Zellproliferation (Promega) entsprechend den Instruktionen des Herstellers untersucht. Fünftausend Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen eingeimpft (6 Vertiefungen für jeden Klon in jedem Assay) und bei 37°C für 24 bis 72 Stunden inkubiert. An jedem Zeitpunkt wurden 15 µl der Farbstofflösung in jede Vertiefung gegeben und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Einhundert µl der Solubilisierungs-/Stoplösung wurden dann in jede Vertiefung gegeben. Nach einer Stunde Inkubation wurde der Inhalt der Vertiefungen gemischt und die Extinktion bei 595 nm wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesers aufgezeichnet. Extinktion bei 595 nm korreliert direkt mit der Anzahl von Zellen in jeder Vertiefung.
Drei unabhängige Experimente wurden durchgeführt und die Ergebnisse sind in 1 gezeigt. In 1 ist die Zellwachstumsgeschwindigkeit als Extinktion bei 595 nm ausgedrückt. Die Fehlerbalken stellen SEM (n=6) dar. Die Ergebnisse (1) zeigen, daß die Wachstumsgeschwindigkeit von 3T3-Zellen, die PTTG-Protein exprimieren (untersucht durch zelluläre Umwandlung von Tetrazolium in Formazan), im Vergleich zu 3T3-Zellen, die den pCMV-Vektor allein exprimieren, um 25 bis 50% unterdrückt wurde, was anzeigt, daß PTTG-Protein die Zellproliferation hemmt.
BEISPIEL 7: PTTG-INDUKTION VON MORPHOLOGISCHER TRANFORMATION UND WEICHAGARWACHSTUM VON NIH-3T3-ZELLEN
Die transformierende Eigenschaft von PTTG-Protein wurde durch seine Fähigkeit demonstriert, Herde in Monoschichtkulturen zu erzeugen und verankerungsunabhängiges Wachstum in Weichagar zu zeigen, wie nachstehend in Tabelle 2 gezeigt ist.
TABELLE 2: KOLONIEBILDUNG DURCH NIH-3T3-ZELLEN, TRANSFIZIERT MIT PTTG-CDNA-KONSTRUKTEN
Da primäre Hypophysenzellen ein Gemisch von mehrfachen Zelltypen sind und sie in vitro nicht replizieren, wurden NIH-3T3-Zellen angewendet. Für den Weichagar-Assay wurden 60-mm-Gewebekulturplatten mit 5 ml Weichagar beschichtet (20% 2 × DMEM, 50% DMEM, 10% fetales Rinderserum, 20% 2,5%-Agar, geschmolzen und bei 45°C vereinigt). Siehe Schwab et al., 1985, Nature, 316:160-162. 2 ml Zellen, suspendiert im Medium, wurden dann mit 4 ml Agar-Gemisch vereinigt und 1,5 ml von diesem Gemisch wurden auf jede Platte gegeben. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 10⁴ Zellen/Schale aufgebracht und für 14 Tage inkubiert, bevor die Anzahl der Kolonien gezählt und photographiert wurde.
Die Ergebnisse zeigen an, daß parentale NIH-3T3-Zellen und 3T3-Zellen, transfiziert mit pCMV-Vektor, keine Kolonien auf weichem Agar erzeugen, wohingegen 3T3-Zellen, transfiziert mit PTTG, große Kolonien erzeugen. Zusätzlich wird fokale Transformation in Zellen beobachtet, die PTTG-Protein überexprimieren, aber Zellen, die pCMV-Vektor ohne das PTTG-Insert exprimieren, zeigten ähnliche Morphologie wie die parentalen 3T3-Zellen.
BEISPIEL 8: BESTIMMUNG VON PTTG-TUMORERZEUGENDER WIRKUNG IN VIVO
Um zu bestimmen, ob PTTG in vivo tumorerzeugend ist, wurden PTTG-transfizierte 3T3-Zellen subkutan in thymuslose nackte Mäuse injiziert. 3 × 10⁵ Zellen von mit entweder PTTG oder pCMV-Vektor allein transfizierten Zellen wurden in PBS resuspendiert und subkutan in nackte Mäuse injiziert (5 für jede Gruppe). Die Tumore wurden aus den Tieren am Ende der 3. Woche exzidiert und gewogen. Alle injizierten Tiere entwickelten große Tumore (1-3 Gramm) innerhalb von 3 Wochen. Die Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 3 angegeben. Keine Maus, injiziert mit nur mit dem Vektor transfizierten Zellen, entwickelte Tumore.
TABELLE 3: IN-VIVO-TUMORGENESE DURCH NIH-3T3-ZELLEN, TRANSFIZIERT MIT PTTG-CDNA-EXPRESSIONSVEKTOR
Die Ergebnisse zeigen klar an, daß PTTG in vivo ein potentes transformierendes Gen ist.
BEISPIEL 9: HUMANE KARZINOM-ZELLINIEN EXPRIMIEREN PTTG
Die Expression von PTTG in verschiedenartigen humanen Zellinien wurde untersucht, indem ein Northern Blot von mehrfachen humanen Krebszellinien (Clontech) angewendet wurde. Die getesteten speziellen Zellinien sind in der nachstehend in Tabelle 4 angegeben.
TABELLE 4: GETESTETE ZELLINIEN VON HUMANEM KARZINOM
Etwa 2 µg polyA-RNA von jeder der 8 Zellinien, angegeben vorstehend in Tabelle 1, wurden auf jeder Bahn eines denaturierenden Formaldehyd-1,2%-Agarosegels plaziert, durch denaturierende Gelelektrophorese getrennt, um Intaktheit zu sichern, durch Northern Blotting auf eine Ladungs-modifizierte Nylonmembran überführt und durch UV-Strahlung fixiert. Die Bahnen 1 bis 8 enthielten RNA von Promyelozytenleukämie HL-60, HeLa-Zellinie S3, humaner chronischer Promyelozytenleukämie K-562, Lymphoblastenleukämie MOLT-4, Burkitt-Lymphom Raji, kolorektalem Adenokarzinom SW 480, Lungenkarzinom A 549 bzw. Melanom G361. Markerlinien für RNA-Größe bei 9,5, 7,5, 4,4, 2,4 und 1,35 kb wurden in Tinte auf dem linken Rand des Blots angezeigt und als Größenbestimmungsstandards benutzt, und eine Kerbe wurde aus der unteren linken Ecke der Membran geschnitten, um Orientierung bereitzustellen. Radiomarkierte humane β-Actin-cDNA wurde als Kontrollsonde zum Anpassen verschiedenartiger Ansätze von polyA RNAs benutzt. Eine einzelne Kontrollbande bei 2,0 kb in allen getüpfelten Bahnen ist bestätigend.
Die Blots wurden mit der Ratten-PTTG-cDNA-Sonde voller Länge (SEQ ID No: 1; 974 bp) bei 60°C für 1 h in ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Clontech) sondiert, wie von Sambrook et al. beschrieben ist. Siehe Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Molekulares Klonieren: Ein Laborhandbuch), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Die Blots wurden dann zweimal für 15 min bei Raumtemperatur in 2 × SSC, 0,05% SDS und zweimal für 15 min bei 50°C in 0,1% SSC, 0,1% SDS gewaschen. Eine ausführlichere Beschreibung der verbleibenden experimentellen Verfahrensweisen kann bei Pei & Melmed gefunden werden. Siehe Pei & Melmed, Endocrinology 4: 433-441 (1997).
Alle Zellen, die durch Northern-Blot-Analyse wie vorstehend beschrieben getestet wurden, bewiesen die Expression von humanem PTTG, einschließend unter anderem Lymphom, Leukämie, Melanom und Lungenkarzinome.
BEISPIEL 10: KLONIEREN VON HUMANER PTTG CDNA
Eine cDNA-Genbank von humaner fetaler Leber (Clontech, Palo Alto, CA) wurde gescreent, wie von Maniatis et al. beschrieben ist, wobei ein radioaktiv markiertes cDNA-Fragment der gesamten Ratte-PTTG-Codierungsregion als Sonde verwendet wurde. Siehe Maniatis et al., Molecular cloning (Molekulares Klonieren), Cold Spring Harbor Press, 1989. Die cDNA-Inserts von positiven Klonen wurden in Plasmid-pBluescript-SK (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert und der Sequenzanalyse unter Verwendung des Sequenase-Kits (US Biochemical Corp., Cleveland, OH) unterworfen. Die Sequenz der Nucleinsäure wird nachstehend in Tabelle 5 bereitgestellt.
TABELLE 5: PTTG-NUCLEINSÄURESEQUENZEN
Der offene Leserahmen von 606 bp ist durch Unterstreichen angezeigt.
Ein vollständiger offener Leserahmen, enthaltend 606 bp, wurde in den positiven Klonen gefunden. Die Homologie zwischen den Nucleotidsequenzen des offenen Leserahmens und der Codierungsregion von Ratten-PTTG oder PTTG (alte Nomenklatur) beträgt 85%. Die abgeleitete Aminosäuresequenz ist nachstehend in Tabelle 6 angegeben.
TABELLE 6: PTTG-AMINOSÄURESEQUENZ
Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des humanen PTTG-translatierten Produkts dieses offenen Leserahmens und der des Ratten-PTTG-Proteins enthüllt 77% Identität und 89% Homologie. Die aus diesen Klonen erhaltenen cDNAs stellen humane Homologien des Ratten-PTTG dar. Keine anderen cDNA-Fragmente mit höherer Homologie wurden aus der Genbank nachgewiesen.
BEISPIEL 11: GEWEBEVERTEILUNG VON HUMANER PTTG MRNA
Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von Triazol Reagent (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) aus normalen menschlichen Hypophysen (Zoion Research Inc. Worcester, MA) und frischen menschlichen Hypophysentumoren, gesammelt bei der Operation und eingefroren in flüssigen Stickstoff, hergestellt. 20 mg Gesamt-RNA wurden für 1%-Agarosegel-Elektrophorese verwendet. RNA-Blots (Clontech, Palo Alto, CA), abgeleitet von normalen erwachsenen und fetalen Geweben ebenso wie von bösartigen Tumorzellinien, wurden mit radioaktiv markiertem menschlichen cDNA-Fragment, enthaltend die vollständige Codierungsregion, hybridisiert. Die RNA, isoliert aus jeder Zellinie, wurde auf eine Nylonmembran (Amersham, Arlington Heights, IL) überführt und mit radioaktiv markierter Sonde bei 55°C über Nacht in 6 × SSC, 2 × Denhardt-Lösung, 0,25% SDS hybridisiert. Die Membrane wurden zweimal bei Raumtemperatur für jeweils 15 Minuten und dann für 20 Minuten bei 60°C in 0,5 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und autoradiographiert. Die Autoradiographie wurde unter Verwendung von Kodak BIOMEX-MR-Film (Eastman Kodak, Rochester, NY) mit einem intensivierenden Screen ausgeführt. Die Blots wurden durch Waschen für 20 Minuten in destilliertem Wasser bei 95°C für nachfolgendes Sondieren gestrippt.
Die Ergebnisse aus der Northern-Blot-Analyse zeigten an, daß PTTG in der Leber, aber nicht im Hirn, in der Lunge und Niere von menschlichem fetalen Gewebe exprimiert wird. Außerdem wird PTTG von normalem menschlichen erwachsenen Gewebe stark in den Hoden exprimiert, mäßig im Thymus exprimiert und schwach im Dickdarm und Dünndarm exprimiert. Keine Expression wurde durch Northern-Analyse in Hirn, Herz, Leber, Lunge, Muskel, Eierstock, Plazenta, Niere und Bauchspeicheldrüse nachgewiesen.
Die Expression von PTTG in verschiedenen menschlichen Karzinomzellinien wurde ebenfalls durch Northern Blots analysiert. In jeder untersuchten Karzinomzelle wurde PTTG hoch exprimiert gefunden. Die getesteten menschlichen Tumorzellinien sind in der nachstehenden Tabelle 7 aufgeführt.
TABELLE 7: GETESTETE MENSCHLICHE TUMORZELLINIEN
BEISPIEL 12: EXPRESSION VON MENSCHLICHEM PTTG IN NORMALER HYPOPHYSE UND IN HYPOPHYSENTUMOREN
RT-PCR wurde wie folgt durchgeführt. 5 µg Gesamt-RNA wurden mit 100 U RNase-freier DNase I bei Raumtemperatur für 15 Minuten behandelt. DNase I wurde durch Inkubation bei 65°C für 15 Minuten inaktiviert. Die Probe wurde dann für reverse Transkription unter Verwendung von oligo-dT-Primer und reverser Transkriptase Superscript II (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) verwendet. Nach reverser Transkription wurde die Probe der PCR-Amplifikation mit PCR SuperMix (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) unterworfen, wobei hPTTG-spezifische Primer und menschliche Cyclophilin-A-spezifische Primer als interne Kontrolle verwendet wurden.
Northern-Blot-Analyse zeigte an, daß das Niveau der Expression von PTTG in normaler Hypophyse ebenso wie in Hypophysentumoren ziemlich niedrig ist. Daher wurde vergleichende RT-PCR verwendet, um die Expression von PTTG in normaler Hypophyse und in Hypophysentumoren quantitativ zu untersuchen. Die Ergebnisse dieser Untersuchung zeigten, daß in den meisten getesteten Hypophysentumoren, die hormoninaktive Tumore, GH-sekretierende Tumore und Prolactinomas einschließen, das Expressionsniveau von PTTG höher war als das in normaler Hypophyse.
BEISPIEL 13: STABILE TRANSFEKTION VON MENSCHLICHEM PTTG IN NIH-3T3-ZELLEN
Die vollständige Codierungsregion von hPTTG cDNA wurde im Leserahmen in den Säugerexpressionsvektor pBK-CMV (Stratagene, La Jolla, CA) subkloniert und in NIH-3T3-Fibroblastenzellen durch Lipofectamin (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) entsprechend dem Protokoll des Herstellers transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen seriell verdünnt und in Selektionsmedium, enthaltend 1 mg/ml G418, für 2 Wochen gezüchtet. Individuelle Klone wurden isoliert und in Selektionsmedium aufbewahrt. Gesamt-RNA wurde aus hPTTG-transfizierten Zellinien ebenso wie aus Kontrollzellen, in denen der leere Vektor pBK-CMV transfiziert worden war, isoliert. Northern Blot wurde durchgeführt, um die Überexpression von hPTTG in transfizierten Zellinien zu bestätigen. Diese Zellinien wurden im nachfolgenden Cellproliferationsassay ebenso wie im in-vitro- und in-vivo-Transformationsassay verwendet.
BEISPIEL 14: ZELLPROLIFERATIONSASSAY
Ein Zellproliferationsassay wurde unter Verwendung des Kits zum Assay von nichtradioaktiver Cellproliferation CellTiter 96 (Promega Medicine, WI) entsprechend dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. 5000 Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen eingeimpft und bei 37°C für 24-72 Stunden inkubiert. Acht Vertiefungen wurden für jeden Klon in jedem Assay verwendet. Zu jedem Zeitpunkt wurden 15 µl Farbstofflösung in jede Vertiefung gegeben und die Zellen wurden bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 µl Solubilisierungs-/Stop-Lösung in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Extinktion wurde bei 595 nm unter Verwendung eines ELISA-Plattenlesers bestimmt.
Kontroll- und hPTTG überexprimierende NIH-3T3-Zellen wurden verwendet, um diesen Assay durchzuführen. Die Ergebnisse zeigten an, daß das Wachstum von Zellen, transfiziert mit dem PTTG exprimierenden Vektor, im Vergleich zu Zellen, transfiziert mit dem leeren Vektor, um 30-45% unterdrückt wurde. Diese Ergebnisse zeigen klar, daß das PTTG-Protein die Zellproliferation hemmt.
BEISPIEL 15: ASSAY DER TRANSFORMATION IN VITRO UND IN VIVO
(a) Assay der Transformation in vitro
Kontroll- und hPTTG-transfizierte Zellen wurden für Verankerungs-unabhängiges Wachstum in Weichagar getestet. 3 ml Weichagar (20% von 2 × DMEM, 50% DMEM, 10% fetales Rinderserum und 20% 2,5% iges Agar, geschmolzen und gemischt bei 45°C) wurden in 35-mm-Gewebeschalen gegeben. 10000 Zellen wurden mit 1 ml Weichagar gemischt und auf jede Schale gegeben und für 2 Wochen inkubiert, bis Kolonien gezählt und photographiert werden konnten.
(b) Assay der Transformation in vivo
5 × 10⁵ Zellen, enthaltend entweder einen leeren Vektor oder hPTTG exprimierende Zellen, wurden in nackte Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden zwei Wochen nach der Injektion getötet und die Tumore, erzeugt nahe den Injektionsstellen, wurden untersucht.
Wenn die NIH-3T3-Zellen, stabil transfiziert mit dem PTTG exprimierenden Vektor, in einem Assay mit Verankerungsunabhängigen Wachstum getestet wurden, verursachten diese Zellen große Koloniebildung auf Weichagar, was Transformierungsfähigkeit von PTTG-Protein vermuten läßt.
Wenn die NIH-3T3-Zellen in nackte Mäuse injiziert wurden, verursachten sie in vivo Tumorerzeugung innerhalb von 2 Wochen nach der Injektion. Diese Werte zeigen an, daß menschliches PTTG wie sein Ratten-Homologes ein potentes Transformierungsgen ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER SEQUENZEN
SEQ ID NO: 1 ist die Nucleinsäuresequenz (und die abgeleitete Aminosäuresequenz) von cDNA, codierend das Ratten-PTTG-Protein der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID NO: 2 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz des Ratten-PTTG-Proteins der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID NO: 3 ist die Nucleinsäuresequenz von cDNA, codierend ein menschliches PTTG-Protein der vorliegenden Erfindung.
SEQ ID NO: 4 ist die abgeleitete Aminosäuresequenz eines menschlichen PTTG-Proteins der vorliegenden Erfindung.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes, reines Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die Hypophysentumor erzeugende Eigenschaft induziert, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 oder durch Varianten davon codiert ist, welche Varianten mindestens 60% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und imstande sind, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 oder durch Varianten davon codiert ist, welche Varianten mindestens 70% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und imstande sind, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 oder durch Varianten davon codiert ist, welche Varianten mindestens 90% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und imstande sind, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren.
Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 oder durch Varianten davon codiert ist, welche Varianten mindestens 95% Identität mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 haben und imstande sind, unter stringenten Bedingungen mit ihnen zu hybridisieren.
Polypeptid nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Variantennucleotid unter mäßig stringenten Bedingungen, äquivalent dem Hybridisieren in 50% Formamid, 5 × Denhart-Lösung, 5 × SSPE, 0,2% SDS bei 42°C, mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 hybridisiert.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 1-4, wobei das Variantennucleotid unter Bedingungen hoher Stringenz mit den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 hybridisiert und Hybride erzeugt, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz, codiert durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No:1.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend SEQ.ID No: 2 und biologisch aktive Varianten davon, welche Varianten mindestens 70% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend SEQ.ID No: 2 und biologisch aktive Varianten davon, welche Varianten mindestens 80% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend SEQ.ID No: 2 und biologisch aktive Varianten davon, welche Varianten mindestens 90% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden.
Polypeptid nach Anspruch 1, umfassend SEQ.ID No: 2 und biologisch aktive Varianten davon, welche Varianten mindestens 95% Identität mit SEQ.ID No: 2 haben und an den Antikörper des anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gens (PTTG) binden.
Polypeptid nach Anspruch 8, umfassend SEQ.ID No: 2.
Polypeptid nach Anspruch 1, welches von Säugerursprung ist.
Polypeptid nach Anspruch 13, welches aus der Gruppe, bestehend aus Polypeptiden von Menschen-, Ratten-, Mäuse-, Schweine-, Schafs-, Hunde- und Rinderursprung, ausgewählt ist.
Zusammensetzung, umfassend das Polypeptid nach Anspruch 1 und einen Träger.
Isoliertes, gereinigtes Polynucleotid, bestehend aus den Nucleotiden 293 bis 899 von SEQ.ID No:1.
Polynucleotid nach Anspruch 16, umfassend eine Nucleinsäure, codierend das Peptid von SEQ.ID No: 2.
Polynucleotid, umfassend die Antisense-Nucleinsäure des Polynucleotids nach Anspruch 16.
Polynucleotid nach Anspruch 18, weiterhin umfassend eine nachweisbare Markierung oder einen Marker.
Polynucleotid nach Anspruch 18, das unter stringenten Bedingungen, die Hybride erzeugen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind, mit mRNA hybridisiert.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 16-20, welches eine RNA ist.
Polynucleotid nach einem der Ansprüche 16-20, welches eine DNA ist.
Zusammensetzung, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 16-22.
Vektor, umfassend das Polynucleotid nach einem der Ansprüche 16-22.
Zusammensetzung, umfassend den Vektor nach Anspruch 24 und einen Träger.
Wirtszelle, tragend den Vektor nach Anspruch 24.
Zusammensetzung, umfassend die Wirtszelle nach Anspruch 26 und einen Träger.
Diagnostischer Kit für ein Säuger-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, umfassend mindestens ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 16-22 und Instruktionen für seine Markierung zur Verwendung in dem Nachweis einer Pituitary-Tumor-Transforming Gen codierenden DNA.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen nach Anspruch 1, umfassend Kultivieren der Wirtszellen nach Anspruch 26 in einem Expressionsmedium und unter wirksamen Expressionsbedingungen; Exprimierenlassen eines Proteins des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen und Ansammeln in dem Medium; und Abtrennen des Mediums, umfassend das Protein des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, von den Zellen.
Verfahren nach Anspruch 29, weiterhin umfassend Abtrennen des Proteins des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen von dem Medium und allen verbliebenen Komponenten.
Isolierter Antikörper des diagnostischen Kits für ein anti-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, der selektiv ein isoliertes, reines Polypeptid, bestehend aus einer Aminosäuresequenz, die Hypophysentumor erzeugende Eigenschaft induziert, gebunden ist, wobei die Aminosäuresequenz durch die Nucleotide 293 bis 899 von SEQ.ID No: 1 codiert ist.
Antikörper nach Anspruch 31, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 31, welcher ein polyklonaler Antikörper ist.
Zusammensetzung, umfassend den Antikörper nach entweder Anspruch 32 oder Anspruch 33 und einen Träger.
Transgener nichtmenschlicher Säuger, tragend mindestens ein nichtnatives Polynucleotid, welches ein Polypeptid, wie nach einem der Ansprüche 1 bis 14 definiert, exprimiert.
Transgener nichtmenschlicher Säuger nach Anspruch 35, tragend ein mutiertes Polynucleotid, welches eine mutierte Aminosäuresequenz, identifiziert als mutierte SEQ.ID No:2, exprimiert.
Transgener nichtmenschlicher Säuger nach entweder Anspruch 35 oder Anspruch 36, welcher ein knock-out-Lebewesen ist.
Transgener nichtmenschlicher Säuger nach Anspruch 37, welcher eine transgene Maus ist.
Verfahren zum Identifizieren von Nucleinsäure des diagnostischen Kits für ein Säuger-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, umfassend Inkontaktbringen der Nucleinsäure einer Säugerprobe mit dem Antisense-Polynucleotid nach Anspruch 18 in markierter Form unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die Hybride erzeugen, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind; Nachweisen der Anwesenheit einer Markierung in der hybridisierten Nucleinsäure der Probe; und Identifizieren der Anwesenheit einer Säugernucleinsäure in der Anwesenheit der Markierung in der Nucleinsäure der Säugerprobe.
Verfahren zum Isolieren von Nucleinsäure des diagnostischen Kits für ein Säuger-Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, umfassend das Verfahren nach Anspruch 39; und Abtrennen der markierten hybridisierten Nucleinsäure von der unmarkierten Nucleinsäure aus der Säugerprobe.
Verfahren zum Bestimmen der Anwesenheit von Peptid des diagnostischen Kits für ein menschliches Pituitary-Tumor-Transforming-Gen in einer Probe, umfassend Inkontaktbringen einer menschlichen Probe mit dem Antikörper nach einem der Ansprüche 31-33 und Zulassen der Bildung eines Komplexes zwischen dem Antikörper und einem Peptid des diagnostischen Kits für ein menschliches Pituitary-Tumor-Transforming-Gen, vorhanden in der Probe; Nachweisen der Anwesenheit eines Komplexes Antikörper-Peptid des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming-Gen; und Bestimmen, daß ein menschliches PTTG-Peptid, wenn ein Komplex Antikörper-Peptid des diagnostischen Kits für ein Pituitary-Tumor-Transforming Gen, in der Probe vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 41, wobei der Antikörper eine nachweisbare Markierung trägt und der Nachweisschritt durch Nachweisen der Antikörper-Markierung nach Abtrennung des markierten Komplexes von unmarkiertem und markiertem Antikörper ausgeführt wird.
Verwendung einer einsträngigen Nucleotidsequenz, die unter in hohem Maße stringenten Bedingungen mit der SEQ.ID No: 1 einer Nucleinsäure hybridisiert und welche Hybride erzeugt, die in 0,018 M NaCl bei 65°C stabil sind, in einem diagnostischen in-vitro-Test für Tumore.
In-vitro-Verfahren zum Nachweisen einer pathologischen Masse, verbunden mit der Expression eines Pituitary-Tumor-Transforming-Gens, umfassend Nachweisen einer transkribierten oder mutanten Nucleinsäure einer Sequenz des Polynucleotids nach einem der Ansprüche 16-22 in einer Zelle, die von einem Patienten erhalten worden ist.
Kit zum diagnostischen Nachweis eines Pituitary-Tumor-Transforming-Gens, umfassend den Antikörper nach einem der Ansprüche 31-33; und Instruktionen für seinen Gebrauch.
Kit nach Anspruch 45, weiterhin umfassend ein Polypeptid eines Pituitary-Tumor-Transforming-Gens, selektiv gebunden durch den Antikörper.