WO2006000213A9 - Peptide zur inhibition der interaktion von proteinkinase a und proteinkinase a-ankerproteinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Nukleinsäuresequenz, die für Peptide kodiert, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA)und Proteinkinase A-Ankerproteinen (AKAP) inhibiert, einen Wirtsorganismus, der die Nukleinsäuresequenz umfasst und gegebenenfalls die Peptide exprimiert sowie die Verwendung der Peptide sowie des Wirtsorganismus bei der Untersuchung von Krankheiten, die mit der AKAP PKA Interaktion assoziiert sind sowie die Verwendung der Peptide als pharmazeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten.

Description

Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die für Peptide kodieren, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase A-Ankerproteinen (AKAP) inhibieren, einen Wirtsorganismus, der die Nukleinsäuresequenz umfasst und die erfindungsgemäßen Peptide exprimiert sowie die Verwendung der Peptide sowie des Wirtsorganismus bei der Therapie und experimentellen Untersuchung von Krankheiten, die mit einer modifizierten AKAP-PKA-Interaktion assoziiert sind sowie die Verwendung der Peptide als pharmazeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten, insbesondere Diabetes insipidus, Ulcus duodeni, Hypertonie und Diabetes mellitus .

Die biologische Wirkung von Hormonen und Neurotransmittern wird über die Aktivierung von Signalkaskaden, welche den Phosphorylierungsstatus von Effektorproteinen verändern, vermittelt. An diesem reversiblen Prozess sind zwei Klassen von Enzymen beteiligt: Proteinkinasen und Phosphoproteinphosphatasen. Die Phosphorylierung erfolgt durch Kinasen, welche die Übertragung der endständigen Phosphatgruppe von ATP auf spezifische Serin- oder Threoninreste katalysieren, die Dephosphorylierung wird durch Phosphoproteinphosphatasen vermittelt. Ein Mechanismus zur Kontrolle und Regulation dieser Enzymaktivitäten ist die ^'Kompartimentierung dieser Enzyme durch die Assoziation mit Ankerproteinen, die in der Nähe ihrer Substrate lokalisiert sind. Die Proteinkinase A (PKA) ist eine der multifunktionellen Kinasen mit einer breiten Substratspezifität , welche durch die so genannten protein kinase A anchoring proteins (AKAPs) an subzellulären Strukturen verankert wird.

Bei vielen wichtigen zellulären Prozessen wie Kontraktion, Sekretion, Stoffwechsel, Gentranskription, Zellwachstum und -teilung erfolgt die Weiterleitung extrazellulärer Signale über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, das G-Protein G_s, Aktivierung einer Adenylylzyklase und Bildung des secondmessenger zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) . Die Effekte von cAMP werden durch die cAMP-abhängige PKA vermittelt .

Das Proteinkinase A (PKA) -Holoenzym besteht aus einem Dimer regulatorischer (R) Untereinheiten, an die jeweils eine katalytische (C) Untereinheit gebunden ist. Die Aktivierung der Kinase durch die Bindung von zwei Molekülen cAMP an jede R-Untereinheit induziert die Dissoziation der C-Untereinheiten, die die in ihrer Nähe befindlichen Substrate phosphorylieren. Entsprechend dem Vorhandensein von Typ I (RI) oder Typ II (RII) regulatorischen Untereinheiten wird das PKA-Holoenzym als Typ I- oder Typ II-PKA bezeichnet. Bei den RI-Untereinheiten existieren RIa und RIß, bei den RII -Untereinheiten RIIa und RII/3 und bei den C-Untereinheiten Ca, Cß und Cγ . Die unterschiedlichen PKA-Untereinheiten werden von verschiedenen Genen kodiert (Klussmann, 2004; Tasken und Aandahl, 2004) .

Die regulatorischen Untereinheiten zeigen ein unterschiedliches Expressionsmuster. Während RIa und RIIa ubiquitär in den Geweben vorkommen, ist die regulatorische Untereinheit RIß in erster Linie im Gehirn zu finden.

Die Assoziation der beiden R-Untereinheiten mit intrazellulären Kompartimenten wird durch AKAPs vermittelt. Bei den Ankerproteinen handelt es sich um eine Gruppe funktionell verwandter Moleküle, die durch die Interaktion mit Typ I bzw. Typ II der regulatorischen Untereinheiten

(RI bzw. RII) des PKA-Holoenzyms charakterisiert sind. Die ersten Ankerproteine wurden bei der affinitätschromatographischen Reinigung der R- Untereinheiten über cAMP-Sepharose isoliert. Diese assoziierten Proteine zeigten auch nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembran eine RII -Bindung. Auf dieser Beobachtung beruht auch die gebräuchlichste Methode

(RII-overlay) zur Detektion von AKAPs. Es handelt sich hierbei um einen modifizierten Western Blot, bei dem statt eines primären Antikörpers radioaktiv markierte RII-Untereinheiten als Sonde eingesetzt werden.

Zur funktionellen Bedeutung der RI-AKAP-Interaktion ist noch wenig bekannt. Auch wenn RIa hauptsächlich zytosolisch lokalisiert ist, zeigen verschiedene Studien eine Verankerung in vivo. Dabei scheint die dynamische Verankerung der Rlα-Untereinheiten im Gegensatz zur statischen Verankerung der RII-Untereinheiten von entscheidender Bedeutung für die Zelle zu sein. So wurde die Assoziation der RI-Untereinheiten mit der Plasmamembran von Erythrozyten und aktivierten T-Lymphozyten beschrieben. Bei der cAMP-vermittelten Inhibition der T-ZeIl- Proliferation durch die PKA Typ I könnte die Lokalisation des Enzyms möglicherweise auch durch AKAPs vermittelt werden. In ./cπoαTcout-Mäusen, die im Skelettmuskelgewebe keine regulatorischen Untereinheiten Typ II exprimieren, binden die Rlα-Untereinheiten an ein mit Kalziumkanälen assoziiertes AKAP und erhalten so die normale, cAMP- abhängige Kanalleitfähigkeit durch die korrekte Verfügbarkeit der katalytischen Untereinheiten der PKA.

In vivo konnte weiterhin gezeigt werden, dass die katalytischen Untereinheiten in der Zelle bevorzugt mit den RII-Untereinheiten assoziieren und Typ I-PKA-Holoenzym gebildet wird, wenn die Menge der freien katalytischen

Untereinheiten die Menge der freien RII-Untereinheiten übersteigt .

Die Spezifität in der PKA-Verankerung wird durch die targeting-Domäne erreicht, ein Strukturmotiv, das im Gegensatz zu der anchoring-Domäne weder in der Sequenz noch in der Struktur der AKAPs konserviert ist. So werden AKAPs durch Protein-Protein-Interaktionen an strukturelle Elemente in der Zelle und durch Protein-Lipid-Interaktionen an Membranen verankert .

In der Literatur sind verschiedene AKAPs beschrieben, die mit unterschiedlichen zellulären Kompartimenten assoziieren, so zum Beispiel mit den Zentrosomen, den Mito- chondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat , der Plasma- und Kernmembran und mit Vesikeln.

Die genauen Mechanismen der Verankerung sind bisher nur für einige AKAPs bekannt. So wird das herzmuskelspezifische Ankerprotein mAKAP durch eine Region mit drei spektrinartigen Wiederholungssequenzen an der perinukleären Membran der Kardiomyozyten verankert. Zwei Isoformen der AKAP15/18 werden durch Lipidmodifikationen (Myristoylierung und Palmitoylierung) an der Plasmamembran verankert. Drei polybasische Regionen in der targeting-Domäne des AKAP79 sind an der Lokalisation des Proteins an der inneren postsynaptischen Membran (PSD, postsynaptic density) beteiligt .

Die AKAPs wurden zuerst durch die Interaktion mit der PKA charakterisiert. Einige dieser Proteine können jedoch auch andere an der Signaltransduktion beteiligte Enzyme binden. Durch die gleichzeitige Verankerung von Enzymen, die gegensätzliche ' Reaktionen katalysieren, wie zum Beispiel Kinasen und Phosphatasen, können diese, auch als scaffolding (gerüstbildende) Proteine bezeichneten AKAPs ganze Signalkomplexe in der Nähe bestimmter Substrate lokalisieren und so zur Spezifität und Regulation der zellulären Antwort auf extrazelluläre Signale beitragen. AKAP79 war das erste AKAP, für das die Interaktion mit mehreren Enzymen nachgewiesen werden konnte. Dieses Protein bindet die Proteinkinase A, die Proteinkinase C und die Proteinphosphatase Calcineurin (PP2B) , wobei jedes Enzym in gebundenem Zustand inhibiert ist. Da unterschiedliche Signale für die Aktivierung jedes einzelnen Enzyms notwendig sind, können an dieser Stelle verschiedene second messenger wie cAMP, Kalzium und Phospholipide zusammentreffen. Weitere Beispiele sind das AKAP220, welches die PKA und die Proteinphosphatase PPl an den Peroxisomen lokalisiert und das AKAP Yotiao, das neben der PKA ebenfalls die Proteinphosphatase PPl bindet. Das AKAP CG-NAP bindet nicht nur die PKA und die Proteinphosphatase PPl, sondern auch noch die Rho-abhängige Kinase PKN (NGF (nerve growth factor) -aktivierte Proteinkinase) und die Proteinphosphatase PP2A.

Auch andere Proteine können mit AKAPs assoziieren, so bindet Ezrin, ein Mitglied der zytoskelett-assoziierten ERM-Familie Ezrin, Radixin und Moesin, das als AKAP identifiziert wurde, an ein Protein (EBP50/NHERF) , welches an der Regulation des Natrium-Protonen-Transportes in der apikalen Membran von Epithelzellen beteiligt ist. AKAPs vermitteln die Modulation der Leitfähigkeit der Ionenkanäle durch die Lokalisation der Proteinkinasen und -Phosphatasen in der Nähe bestimmter Kanaluntereinheiten, die wahrscheinlich durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert werden. Die Aktivität des NMDA-Rezeptors wird durch das AKAP Yotiao, welches auch die Proteinphosphatase PPl bindet, moduliert. Die in gebundenem Zustand aktive Phosphatase limitiert die Kanalleitfähigkeit des NMDA-Rezeptors, bis die PKA durch cAMP aktiviert wird und den Ionenkanal oder ein assoziiertes Protein phosphoryliert , wodurch die Leitfähigkeit rapide ansteigt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass myristoylierte Ht31-Peptide, die die Interaktion zwischen PKA und AKAP inhibieren, die cAMP- abhängige Inhibition der Interleukin 2-Transkription in Jurkat-T-Zellen aufheben und dass S-Ht31-Peptide die Spermienmotilität einschränken.

Auch bei den wichtigen komplexen biologischen Prozessen, wie die durch das Hormon GLP-I (glucagon-like peptide) -vermittelte Verstärkung der Insulinsekretion in den ß-Zellen des Pankreas und in RINm5F-Zellen (klonale ß-Zelllinie der Ratte) sind AKAPs beteiligt. Die Aktivierung der PKA durch GLP-I führt zur Phosphorylierung von L-Typ-Kalziumkanälen und begünstigt die Exozytose von Insulin aus sekretorischen Granula. Die Ht31-Peptid-vermittelte Inhibition der PKA-Verankerung führte zu einer deutlichen Verringerung der Insulinsekretion. Dabei wurden weder die cAMP-Bildung noch die Aktivität der katalytischen Untereinheiten der PKA durch die Peptide beeinflusst . Weiterhin konnte nach Expression des wildtypischen AKAP18α in RINm5F-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, welche AKAPlδα nicht exprimierten, eine Erhöhung der Insulinsektretion nach GLP-1-Applikation nachgewiesen werden.

Die vom antidiuiretischen Hormon Arginin-Vasopressin (AVP) - abhängige Umverteilung des Wasserkanals Aquaporin-2 aus intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran von HauptZeilen des renalen Sammelrohres, die molekulare Basis der Vasopressin-vermittelten Wasserrückresorption, ist ein weiteres Beispiel für einen Prozess, der die Interaktion der PKA mit AKAP-Proteinen erfordert (Klussmann et al . , 1999) . Wird die Interaktion unterbunden, kann die Umverteilung nicht stattfinden. Die Interaktion spielt jedoch auch bei zahlreichen anderen Vorgängen in einer Vielzahl unterschiedlicher Zelltypen eine wichtige Rolle, zum Beispiel erhöht die Interaktion die Herzmuskelkontraktilität (Hulme et al . , 2003).

Um die Wirkung der PKA-AKAP-Interaktion zu analysieren, ist es erforderlich, die Interaktion effizient und selektiv zu modifizieren, insbesondere zu inhibieren bzw. zu entkoppeln. Derzeit steht für die Entkopplung der PKA von AKAP-Proteinen ein Ht31 Peptid zur Verfügung. Das Peptid Ht31 kann an Stearat gekoppelt werden, um membranpermeabel vorzuliegen. Das Pepdid Ht31 entkoppelt PKA und AKAP jedoch in einer Weise, die für viele Untersuchungen oder gar für eine therapeutische Verwendung nicht ausreichend ist. Vor allem ist das Peptid Ht31 nicht in der Lage, selektiv mit den regulatorischen Untereinheiten RIIa oder RUß der PKA zu interagieren, so dass die Bedeutung der Untereinheiten für ausgewählte Prozesse nicht analysiert werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, die genannten Nachteile zu überwinden und insbesondere neue Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, die für Peptide kodieren, die die Interaktion von AKAP und PKA effizient und spezifisch modifizieren, insbesondere entkoppeln und die weiterhin als überexpremierende Stoffe in Wirtsorganismen eingesetzt werden können, um mit Hilfe dieser Wirtsorganismen - beispielsweise von Mäusen - modellhaft Krankheiten zu analysieren, die mit der AKAP-PKA- Interaktion assoziiert sind, vorzugsweise Diabetes insipidus, aber auch Ulcus duodeni, Hypertonie und Diabetes mellitus. Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid- sequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1 - 39, b) ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, c) ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein, d) ein Nukleinsäuremolekül, das infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und/oder e) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis d) ist.

Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden können, um Peptide gemäß Tab. 1 (SEQ ID Nr. 1 - 39) zu kodieren, die die Wechselwirkung von AKAP und PKA modifizieren, vorzugsweise inhibieren, besonders bevorzugt entkoppeln. Mit Vorteil eignen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Kodierung von Peptiden, die selektiv an regulatorische Untereinheiten der PKA binden, insbesondere an RIIa bzw. RIIjS. Weiterhin ermöglichen es die - durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten - Peptide, eine Modifizierung, Inhibition bzw. Entkopplung von AKAP und PKA in Abhängigkeit der verwendeten Spezies vorzunehmen. Die Nukleinsäuremoleküle bzw. die aus diesen abgeleiteten Peptide eignen sich mit Vorteil zur Herstellung transgener Organismen, beispielsweise von Mäusen, in denen die AKAP-PKA-Interaktion gewebs- und/oder zellspezifisch modifiziert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz , die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40 % homolog. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten Nukleinsäuresequenzen bzw. den mit diesen Nukleinsäuresequenzen hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die kodierten homologen Strukturen eine effiziente und selektive Entkoppelung der PKA-AKAP-Interaktion ermöglichen und eine hohe Affinität für die Bindung an RII-Untereinheiten von PKA besitzen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 % Homologie zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen auf.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine genomische DNA und/oder eine RNA; besonders bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor umfasst . Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, das durch mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 39, bzw. mindestens ein Polypeptid gemäß dieser Sequenzen. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, welches durch Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder Insertion modifiziert ist und funktionsanalog zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 39 ist und/oder ein Polypeptid, welches ein Polypeptid umfasst, das eine auseichende Homologie aufweist, um zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 39 oder deren Mutationen (Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder Insertionen) funktionsanalog zu sein.

Folgende erfindungsgemäße Peptide sind besonders bevorzugt:

SEQ ID Nr. 1 PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (Akapl8δ-wt)

SEQ ID Nr. 2 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP185 -L304T)

SEQ ID Nr. 3 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAP18Ö-L308D)

SEQ ID Nr. 4 PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18Ö-L314E)

SEQ ID Nr. 5 PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAPl8δ -P)

SEQ ID Nr. 6 PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18Ö-PP)

SEQ ID Nr. 7 PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPl8δ-phos)

SEQ ID Nr. 8 EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (Akapl8δ-RI)

SEQ ID Nr. 9 NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA

SEQ ID Nr. 10 VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL

SEQ ID Nr. 11 NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF

SEQ ID Nr. 12 TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA

SEQ ID Nr. 13 LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ

SEQ ID Nr. 14 QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL

SEQ ID Nr. 15 LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA SEQ ID Nr. 16 EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA

SEQ ID Nr. 17 ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH

SEQ ID Nr. 18 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS

SEQ ID Nr. 19 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS

SEQ ID Nr. 20 TDRGFPALSSEALVRVLVLDANDNS

SEQ ID Nr. 21 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP

SEQ ID Nr. 22 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV

SEQ ID Nr. 23 EKESLTEEEATEFLKQILNGVYYLH

SEQ ID Nr. 24 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH

SEQ ID Nr. 25 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP

SEQ ID Nr. 26 LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF

SEQ ID Nr. 27 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVDLYL

SEQ ID Nr. 28 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS

SEQ ID Nr. 29 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ

SEQ ID Nr. 30 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE

SEQ ID Nr. 31 ^" QMKAKRTKEAVEVLKKALDAISHSD

SEQ ID Nr. 32 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS

SEQ ID Nr. 33 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF

SEQ ID Nr. 34 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY

SEQ ID Nr. 35 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE

SEQ ID Nr. 36 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL

SEQ ID Nr. 37 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA

SEQ ID Nr. 38 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA

SEQ ID Nr. 39 DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT .

Die erfindungsgemäßen Peptide sind entweder (i) von

AKAP18 (delta) abgeleitet (SEQ ID Nr. 1 bis 7) oder aber (ii) von Proteinen, die nicht mit AKAP-Molekülen assoziiert sind (SEQ ID Nr. 8 bis 39) .

Gemeinsam ist den Peptiden gemäß (i) :

Akapl8δ-wt AKAP185-L304T AKAP185-L314E Akapl8δ-RI

dass sie die RIIalpha Untereinheiten der PKA so stark wie kein anderes, von natürlichen AKAPs abgeleitetes Peptid binden. Dies wird von uns durch die Bindung über Wasserstoffbrücken (H-Brücken) zwischen Peptid und RII- dimer erklärt (s. Abb. Wasserstoffbrücken durch gestrichelte Linien dargestellt) . Entsprechend ist den Peptiden die Mindestanzahl (8) an H-Brücken bildenden Aminosäuren gemein.

Die folgenden Peptide sind ebenfalls von AKPA18 (delta) abgeleitet, zeichnen sich jedoch dadurch aus, daß sie trotz hoher Aminosäureähnlichkeit keine RII -Untereinheiten der PKA binden (Negativkontrollen; notfalls kann auf eine Patentierung verzichtet werden) . Gemein ist ihnen, daß sie aufgrund struktureller (1,2) oder aufgrund von Ladungsunterschieden (3,4) nicht mehr binden.

1 AKAP185-P

2 AKAP18δ-PP

3 AKAP18Ö-L308D

4 AKAP18δ-phos

Die erfindungsgemäßen Peptide, die von anderen Proteinen als AKAPs abgeleitet sind, besitzen eine definierte Größe, die überraschenderweise zu der Fähigkeit der Peptide, eine Interaktion zwischen AKAP und PKA zu modifizieren, beiträgt, da sie die Affinität der Peptide zu den RII (alpha) Untereinheiten der PKA beeinflusst. Die Peptide bestehen aus 25 Aminosäuren und sind dem gemäß 25mere. Werden die Peptide so ausgewählt, dass die kürzer oder länger sind (z.B. 17mere) , wird ihre Aktivität hierdurch geändert. Das gemeinsame strukturelle Merkmal der Länge der Peptide definiert zusammen mit dem funktionellen Merkmal der AKAP/PKA-Entkopplung die erfindungsgemäßen Strukturen. Diese erfindungsgemäßen Peptide sind charakterisiert durch die allgemeine Formel:

xxxxxxxxx [AVLISE] xx [AVLIF] [AVLI] xx [AVLI] [AVLIF] xx [AVLISE] xx

XX

wobei x eine beliebige Aminosäure repräsentiert; insbesondere ist durch x dabei repräsentiert jeweils eine beliebige der 20 biogenen Aminosäuren (im Ein-Buchstaben- Code dargestellt sind dies: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, Y) . Beansprucht ist jede Aminosäure, die im Alberts et al . (2004) Molekularbiologie der Zelle, S. 8, 73, 79 ff., 150 ff. oder 1717G₁ im Römpp (1999) Biotechnologie und Gentechnik, S. 45 ff, bzw. im Römpp (2000) Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, S. 28 ff, oder in einem anderen Standardwerk der Biologie offenbart ist. Diese besonders bevorzugten Peptide besitzen entweder eine positiv geladene Aminosäure (H, K oder R) in erster oder zweiter Position (Position ist die Nummer der Aminosäure vom N-terminus) oder Leucin in den Positionen 19, 18 oder 14 oder Serin in Position 4.

Ein funktionsanaloges Peptid ist ein Peptid, das in der Lage ist, die PKA-AKAP- Interaktion zu modifizieren, bevorzugt zu entkoppeln.

Die Erfindung betrifft auch einen Organismus, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül überexprimiert bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst und/oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid aufweist. Hierbei kann es sich zum Beispiel um eine transgene Maus oder Ratte bzw. um ein Rind, Pferd, Esel, Schaf, Kamel, Ziege, Schwein, Kaninchen, Meerschwein, Hamster, Katze, Affe oder Hund handeln, in der gewebs- und/oder zellspezifisch die PKA-AKAP-Interaktion gestört ist. Derartige Organismen, beispielsweise Mäuse, können insbesondere verwendet werden, um Pharmaka zu entwickeln, die die PKA-AKAP-Interaktion modifizieren, bevorzugt entkoppeln.

Mittels der erfindungsgemäßen Organismen können auch in vivo Stoffwechselprozesse untersucht werden, bei denen die PKA-AKAP-Interaktion eine Rolle spielt oder bei denen geklärt werden soll, ob bei einem bestimmten Ereignis die AKAP-PKA-Interaktion involviert ist.

Bevorzugt handelt es sich bei dem Organismus um eine transgene Maus, die das stark bindende Peptid AKAP18δ-L304T oder AKAP18<5-L314E spezifisch in den Hauptzellen von Sammelrohren der Niere überexprimiert . Vorteilhafterweise führt die Entkoppelung der PKA von AKAP-Proteinen dazu, dass in primär kultivierten Sammelrohrzellen die Vasopressin- induzierte Umverteilung von AQP2 verhindert wird, wodurch die Tiere insbesondere einen Diabetes insipidus aufweisen. Diese Erkrankung zeichnet sich durch großen Wasserverlust (Polyurie) aus, den beispielsweise humane Patienten durch die Aufnahme größerer Mengen Flüssigkeit zu kompensieren versuchen (Polydipsie) .

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen transgenen Organismen kann beispielsweise untersucht werden, wie die Entkoppelung der PKA bzw. von ausgewählten Untereinheiten von AKAP-Proteinen als therapeutisches Prinzip angesehen und genutzt werden kann. In der Folge derartiger Untersuchungen können dann vorteilhafterweise optimierte Substanzen (Pharmaka) analysiert werden, die ebenso wirken. Derart optimierte Substanzen wirken bevorzugt als Aquaretika und können daher mit Vorteil bei Patienten mit Ödemen, beispielsweise bei Herzinsuffizienz oder bei Lebercirrhose, eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen das Nukleinsäuremolekül , den Vektor, die Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist . Erkennungssubstanzen im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen wie Nukleinsäuremolekülen oder -Sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren Fragmenten wechselwirken können; insbesondere so wechselwirken, dass eine Detektion bzw. eine Manipulation dieser Strukturen möglich ist. Die Erkennungssubstanzen können insbesondere spezifische Nukleinsäuren sein, die an die genannten Nukleinsäuremoleküle oder Polypeptide binden, wie zum Beispiel Antisense-Konstrukte, cDNA oder mRNA- Moleküle bzw. deren Fragmente, aber auch Antikörper, Fluoreszenzmarker, markierte Kohlenhydrate oder Lipide bzw. Chelatoren. Es ist selbstverständlich auch möglich, dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nukleinsäuren bzw. Antikörper sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper. Die Erkennungssubstanzen können in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisensekonstrukt , insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül .

Die Antikörper im Sinne der Erfindung binden die erfindungsgemäßen Peptide spezifisch. Die Antikörper können auch modifizierte Antikörper sein (zum Beispiel oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper) . Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Antikörper- Fragmente, wie Fab, F (ab') ₂ und Fv, die bestimmte Epitop- Determinanten der Polypeptide binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:

(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigen- bindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;

(2) das Fab' -Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab' -Fragmente erhalten;

(3) F (ab') ₂, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F (ab') ₂ ist ein Dimer von zwei Fab' -Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;

(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und (5) Einzelketten-Antikörper ("SCA"), definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül , den erfindungsgemäßen Vektor, die erfindungsgemäße Wirtszelle, das errfindungsgemäße Polypeptid und/oder das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Aquaretika. Aquaretika im Sinne der Erfindung modifizieren die Wechselwirkung zwischen PKA und AKAP-Proteinen, insbesondere entkoppeln sie die Wechselwirkung zwischen diesen beiden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die erfindungsemäßen Erkennungsmoleküle als pharmazeutische Zusammensetzung einzusetzen, insbesondere die, die gegen das erfindungsgemäße Peptid oder die kodierende Nukleinsäure gerichtet sind.

Insbesondere die die erfindungsgemäßen Peptide, die erfindungsgemäßen Vektoren oder die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können bevorzugt bei Patienten mit Ödemen, insbesondere bei Herzinsuffizienz oder Leberzirrhose eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Nukleinsäuremoleküle können im Sinne der Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung auf der Nukleinsäureebene eingesetzt werden, wohingegen die erfindungsgemäßen Peptide, aber zum Teil auch die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, auf der Aminosäureebene eingesetzt werden können. Je nachdem, ob die Therapie in der Entkoppelung von AKAP und PKA - z.B. mittels der erfindungsgemäßen Peptide - bzw. in der Verhinderung der Entkoppelung zwischen AKAP und PKA - z.B. mittels der erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet gegen die Peptide - besteht, kann der Fachmann bevorzugt die erfindungsgemäßen Peptide bzw. die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, die zum Beispiel gegen diese Peptide oder andere Strukturen gerichtet sind, als pharmazeutische Zusammensetzung verwenden. Die erfidnungsgemäßen Peptide sind insbesondere für die Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar uns somit beispielsweise bei Ödemen. Die erfidnungsgemäßen Erkennungsmoleküle (z.B. Antikörper) sind insbesondere bei der Verhinderung der Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar z.B. bei Diabetes insipidus.

Selbstverständlich ist es möglich, dass die erfindungsgemäßen Peptide übliche Hilfsstoffe, bevorzugt Träger, Adjuvantien und/oder Vehikel umfassen. Bei den Trägern kann es sich beispielsweise um Füllmittel, Streckmittel, Bindemittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel, Adsorptionsmittel und/oder Gleitmittel handeln. In diesem Fall wird das Peptid insbesondere als Arzneimittel oder pharmazeutisches Mittel bezeichnet .

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Mittel als Gel, Puder, Pulver, Tablette, Retard-Tablette, Premix, Emulsion, Aufgussformulierung, Tropfen, Konzentrat, Granulat, Sirup, Pellet, BoIi, Kapsel, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet. Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen, gegebenenfalls Opakisierungsmitteln enthaltenden, Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, dass sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem bestimmten Teil des Intestinaltraktes gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen zum Beispiel Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.

Die Arzneimittel dieser Erfindung können beispielsweise zur oralen Verabreichung in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verwendet werden, die Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, die häufig verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesium- stearat, werden auch typischerweise zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform schließen verwendbare Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen oral verabreicht werden, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süßmittel und/oder Geschmacksstoffe und/oder Farbmittel zugesetzt werden.

Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel Kakaofett und höhere Ester (zum Beispiel Ci₄-Alkohol mit Ci₆-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe) .

Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.

Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, zum Beispiel Chlorfluorkohlenwasserstoffe, enthalten .

Lösungen und Emulsionen können neben den Wirkstoffen CHP und Gemcitabin die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol , Isopropylalkohol , Ethylcarbonat , Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol , 1,3-Butylen- glykol , Dimethylformamid, Öle, insbesondere Baumwollsaatöl , Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusöl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal , Tetrahydofurfurylalkohol , Polyethylenglycole und Fettsäureester des Sorbitans oder Gemische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen Applikation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.

Suspensionen können neben den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, zum Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylen- sorbit- und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Die Arzneimittel können in Form einer sterilen injizierbaren Zubereitung, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspension, vorliegen. Diese Suspension kann auch mit im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Netzmittel (wie zum Beispiel Tween 80) und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel als Lösung in 1, 3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Mannit, Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden üblicherweise sterile, nichtflüchtige Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein beliebiges mildes nichtflüchtiges Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate sind bei der Herstellung von Injektionsmitteln verwendbar, wie es natürliche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Formen sind. Diese Öllösungen oder Suspensionen können auch einen langkettigen Alkohol oder einen ähnlichen Alkohol enthalten als Verdünnungs- oder Dispergiermittel.

Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbesserte Zusätze, zum Beispiel Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, zum Beispiel Saccharin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Peptide sollen in den aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,01 bis 99,9, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 99 Gew.-I der Gesamtmischung vorhanden sein.

Die aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen können außer dem Peptid oder Strukturhomologen - z.B. Peptiden mit D-Aminosäuren - oder Funktionsanalogen - z.B. Peptidmimetika - weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten. Die Herstellung der oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.

Die genannten Zubereitungen können bei Mensch und Tier entweder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan), intracisternal , intravaginal, intraperitoneal, lokal (Puder, Salbe, Tropfen) und zur Therapie der genannten Krankheiten angewendet werden. Als geeignete Zubereitung kommen Injektionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen in Frage. Zur lokalen Therapie können ophtalmologische und dermatologische Formulierungen, Silber- und andere Salze, Ohrentropfen, Augensalben, Puder oder Lösungen verwendet werden. Bei Tieren kann die Aufnahme auch über das Futter oder Trinkwasser in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können die Arzneimittel oder die Kombinationsmittel in andere Trägermaterialien wie zum Beispiel Kunststoffe, (Kunststoffketten zur lokalen Therapie) , Kollagen oder Knochenzement eingearbeitet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Peptide in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5, bevorzugt von 0,5 bis 95, besonders bevorzugt von 20 bis 80 Gew.-% in einer pharmazeutischen Zubereitung eingebracht. Das heißt, die Peptide sind in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen, zum Beispiel Tabletten, Pillen, Granulaten und anderen, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-% der Gesamtmischung in einem bestimmten Verhältnis vorhanden. Die Wirkstoffmenge, das heißt die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die mit den Trägermaterialien kombiniert wird, um eine einzige Dosierungsform zu erzeugen, wird von dem Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten und der besonderen Verabreichungsart variieren • können. Nach Besserung des Zustandes des Patienten kann der Anteil der wirksamen Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis vorliegt, die die Krankheit zum Stillstand bringt. Anschließend kann die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf eine Höhe verringert werden, bei der der verbesserte Zustand beibehalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch eine Behandlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach beliebigem Wiederauftreten von ErkrankungsSymptomen benötigen. Demgemäß ist der Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre Zusammensetzung oder Kombination variabel und kann vom Fachmann aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst werden.

Dem Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Peptide mit einem Organismus, bevorzugt einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen in Kontakt gebracht werden können. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen Mittel in verschiedenen Dosierungen appliziert werden können. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Erkrankung möglichst effektiv bekämpft wird bzw. der Ausbruch einer solchen Krankheit in einer prophylaktischen Gabe verhindert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation können vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die orale Applikation in Form von Pulver, Tabletten, Saft, Tropfen, Kapseln oder ähnlichem, die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form von Injektionen, Infusionen und Lösungen sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen der erfindungsgemäßen Verbindungen prophylaktisch oder therapeutisch.

Die Eignung der gewählten Applikationsformen wie auch der Dosis, des Applikationsschemas, der Adjuvantswahl und dergleichen kann beispielsweise durch Entnahme von Serum-Alliquoten aus dem Patienten, d.h. dem Mensch oder dem Tier, und dem Testen auf das Vorhandensein von Krankheitsindikatoren im Verlauf des Behandlungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ und begleitend hierzu kann der Zustand der Niere, aber auch die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems, auf herkömmliche Weise begleitend bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die immunologische Konstitution des Patienten und insbesondere die Konstitution von stoffwechselwichtigen Organen, zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet werden. Wenn eine unzureichende therapeutische Effektivität erzielt wird, kann der Patient mit erfindungsgemäßen Mitteln ggf. mit anderen bekannten Medikamenten modifiziert weiterbehandelt werden, von denen eine Verbesserung der Gesamtkonstitution erwartet werden kann. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Träger oder Vehikeln des pharmazeutischen Mittels zu modifizieren oder den Verabreichungsweg zu variieren.

Neben der oralen Aufnahme kann es dann zum Beispiel vorgesehen sein, dass Injektionen beispielsweise intramuskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße ein weiterer bevorzugter Weg für die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen sind. Zeitgleich kann auch die Zufuhr über Katheter oder chirurgische Schläuche angewendet werden; beispielsweise über Katheter, die direkt zu bestimmten Organen wie den Nieren führen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer bevorzugten Ausführungsform in einer Gesamtmenge von bevorzugt 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische Menge, die verwendet wird, um die Symptome einer Störung oder respon-siven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern oder zu verbessern.

Selbstverständlich wird die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wirkungen und der Nebenwirkungen abhängen. Die tägliche Dosis von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Typischerweise werden insbesondere pharmazeutischen Mittel zur etwa 1- bis 10-maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ oder zusätzlich als kontinuierliche Infusion verwendet. Solche Verabreichungen können als chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart selbstverständlich variieren. Bevorzugt ist es, die Targetsdosis auf 2 bis 5 Applikationen zu verteilen, wobei bei jeder Applikation 1 bis 2 Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Selbstverständlich ist es möglich, den Wirkstoffgehalt auch höher zu wählen, beispielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000 mg/kg. Die Tabletten können auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen pro Tag auf 1 bis 3 vermindert. Der Wirkstoffgehalt der retardierten Tabletten kann 3 bis 3000 mg betragen. Wenn der Wirkstoff - wie ausgeführt - durch eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1- bis 10-mal pro Tag bzw. durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 1 bis 4000 mg pro Tag bevorzugt sind. Die bevorzugten Gesamtmengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen. Es kann erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen in Kontakt zu bringen, während in anderen Fällen die angegebene Wirkstoffmenge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das pharmazeutische Mittel in einer Einzelgabe von 1 bis 100, insbesondere von 2 bis 50 mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag kann auch die Menge der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können in den genannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zusammen mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser auch in der Veterinärmedizin gegeben werden. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird, und die gewöhn- lieh einer ganzen, einer halben Tagesdosis oder einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht. Die Dosierungseinheiten können demgemäß bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 oder mehrere Einzeldosen oder 0,5, 0,3 oder 0,25 einer Einzeldosis enthalten. Bevorzugt wird die Tagesdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen auf 2 bis 10 Applikationen verteilt, bevorzugt auf 2 bis 7, besonders bevorzugt auf 3 bis 5 Applikationen. Selbstverständlich ist auch eine Dauerinfusion der erfindungsgemäßen Mittel möglich.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden bei jeder oralen Applikation der erfindungsgemäßen Verbindungen 1 bis 2 Tabletten gegeben. Die erfindungsgemäßen Tabletten können mit dem Fachmann bekannten Überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt werden, dass sie den oder die Wirkstoffe nur bei bevorzugten, in einem bestimmten Teil des Wirts freigeben.

Bevorzugt ist es in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, dass die Peptidabschnitte gegebenenfalls miteinander assoziiert oder mit einem Träger verbunden in Liposomen eingeschlossen sind, wobei der Einschluss in Liposomen im Sinne der Erfindung nicht zwingend bedeuten muss, dass die Peptide im Inneren der Liposomen vorliegen, ein Einschluss im Sinne der Erfindung kann auch bedeuten, dass die Peptide mit der Membran der Liposomen assoziiert sind, beispielsweise so, dass diese auf der äußeren Membran verankert sind. Eine solche Darstellung der erfindungsgemäßen Peptide in oder auf den Liposomen ist vorteilhaft, wenn der Fachmann die Liposomen so auswählt, dass sie eine immunstimulierende Wirkung haben. Dem Fachmann sind aus der DE 198 51 282 verschiedene Möglichkeiten bekannt, die immunstimulierende Wirkung von Liposomen zu modifizieren. Bei den Lipiden kann es sich um einfache Lipide handeln, wie beispielsweise Ester und Amάde oder um komplexe Lipide wie zum Beispiel um Glycolipide wie Cerebroside oder Ganglio- side, um Sphingolipide oder um Phospholipide .

Beispielsweise ist es möglich, einzelne oder Gruppen von

Aminosäuren in den Peptiden auszutauschen, ohne dass die

Aktivität der Peptide in Bezug auf die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe nachteilig beeinflusst wird. Für den Austausch derartiger Aminosäuren sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Genetik verwiesen.

Im Stand der Technik sind verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung von Peptiden offenbart. Peptide, die von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend mit solchen Verfahren entwickelt werden, sind von der erfindungemäßen Lehre mit erfasst . Eine Möglichkeit des Generierens von funktionsanalogen Peptiden ist beispielsweise in PNAS USA 1998, Oct. 13; 9521:12179-84, WO 99/6293 und/oder WO 02/38592 beschrieben; diese Lehren sind in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen. Das heißt, sämtliche Peptide, Peptidfragmente oder Strukturen, die Peptide umfassen, die mit den genannten Verfahren - von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend - generiert werden, sind Peptide im Sinne der Erfindung, sofern sie die erfindungsgemäße Aufgabe lösen. Die erfidnungsgemäßen Peptide sind auch Leitstrukturen für die Entwicklung von Peptidmimetika.

Dem Fachmann ist weiterhin bekannt, dass einzelne Aminosäuren analoge physikochemische Eigenschaften aufweisen, die mit Vorteil dazu führen, dass diese Aminosäuren untereinander ausgetauscht werden können. Hierzu gehören beispielsweise die Gruppe der Aminosäuren (a) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin; bzw. die Aminosäuren (b) Serin und Threonin, die Aminosäuren (c) Asparagin und Glutamin, die Aminosäuren (d) Asparaginsäure und Glutaminsäure; die Aminosäuren (e) Lysin und Arginin sowie die Gruppe der aromatischen Aminosäuren (f) Phenylalanin, Tyrosin und/oder Tryptophan. Aminosäuren innerhalb ein und derselben Gruppe (a-f) können untereinander ausgetauscht werden. Weiterhin ist es möglich, dass Aminosäuren durch modifizierte Aminosäuren oder spezifische Enantiomere ausgetauscht werden. Weitere Modifikationen sind gemäß der Lehre nach der WO 99/62933 oder WO 02/38592 möglich, die in den Offenbarungsgehalt der erfindungsgemäßen Lehre mit aufgenommen sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid einen Linker und/oder einen Spacer, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: α-Aminocarbonsäuren sowie deren Homo- und Heterooligomere, α, ω-Aminocarbonsäuren sowie deren verzweigte Homo- oder Heterooligomere, sonstige Aminosäuren sowie die linearen und verzweigten Homo- oder Heterooligomere (Peptide); Amino-oligoalkoxy-alkylamine ; Maleinimidocarbonsäure-Derivate; Oligomere von Alkylaminen; 4-Alkylphenyl-Derivate; 4-Oligoalkoxyphenyl- oder 4-Oligo- alkoxyphenoxy-Derivate; 4-Oligoalkylmercaptophenyl- oder 4-Oligoalkylmercaptophenoxy-Derivate,- 4 -Oligoalkylamin- phenyl- oder 4-Oligoalkylaminyphenoxy-Derivate; (Oligo- alkylbenzyl) -phenyl- oder 4-Oligoalkylbenzyl) -phenoxy- Derivate sowie 4-Oligoalkoxybenzyl) -phenyl- oder 4-Oligo- alkoxybenzyl) -phenoxy-Derivate; Trityl-Derivate; Benzyl- oxyaryl- oder Benzyloxyalkyl-Derivate; Xanthen-3-yl-oxyal- kyl-Derivate; (4 -Alkylphenyl) - oder ω- (4-Alkylphenoxy) - alkansäure-Derivate; Oligoalkyl-Phenoxyalkyl- oder Oligo- alkoxy-phenoxyalkyl-Derivate; Carbamat-Derivate; Amine; Trialkylsilyl- oder Dialkyl-alkoxysilyl -Derivate; Alkyl- oder Aryl-Derivate und/oder Kombinationen davon,- weitere mögliche Strukturen werden in der EP 1 214 350 beschrieben, die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen sind.

Bevorzugt können synthetische Peptide oder Fragmente hiervon durch chemische Crosslinker multimerisiert werden oder an ein Trägermolekül wie BSA, Dextran, KLH oder andere gekoppelt werden. Die hierzu verwendeten chemischen Crosslinker sind in "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996 aufgelistet, die in den Offenbarungsgehalt der erfindungsgemäßen Lehre mit aufgenommen sind. Bevorzugte Crosslinker sind homobifunktionale Crosslinker, bevorzugt: NHS-Ester, wie DSP, DTSSP, DSS, BS, DST, Sulfo-DST, BSOCOES, SuIfo-BSOCOES, EGS, Sulfo-EGS, DSG oder DSC, homobifunktionale Imidoester, wie DMA, DMP, DMS oder DTBP, homobifunktionale SuIfhydryl-reaktive Crosslinker, wie DPDPB, BMH oder BMOE, Difuorobenzenderivate, wie DFDNB oder DFDNPS, homobifunktionale photoreaktive Crosslinker, wie BASED, homobifunktionale Aldehyde, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, Bis-Epoxide, wie 1,4 -Butan- dioldiglycidylether, homobifunktionale Hydrazide, wie Adipinsäuredihydrazide oder Carbohydrazide, Bis-diazonium- derivate, wie o-Tolidin, bisdiazotisiertes Benzidin oder Bisallkylhaloid.

Bevorzugt sind auch heterobifunktionale Crosslinker, insbesondere aminreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie SPDP, LC-SPDP, SuIfo-LC-SPDP, SMPT, Sulfo-LC-SMPT, SMCC, Sulfo- SMCC, MBS, Sulfo-MBS, SIAB, SuIfo-SIAB, SMPB, Sulfo-SMBP, GMBS, Sulfo-GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX oder NPIA, carbonylreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie MPBH, M₂C₂H oder PDPH, aminreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie NHS-ASA, SuIfo-NHS-ASA, SuIfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSAB, Sulfo-HSAB, SANPAH, SuIfo-SANPAH, ANB-NOS, SAND, SADP, Sulfo-SADP, Sulfo-SAPB, SAED, Sulfo-SAMCA, p-Nitrophenyldiazopyruvat oder PNP-DTP, Sulfhydryl und photoreaktive Crosslinker, wie ASIB, APDP, Benzophenon-4- iodoacetamid oder Benzophenon-4-maleimid, carbonylreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ABH, carboxylatreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ASBA, argininreaktive Crosslinker, wie APG, trifunktionale Crosslinker, wie 4- Azido-2-nitrophenylbiozytin-4-nitrophenylester, SuIfo-SEBD, TSAT und/oder TMEA.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide und rekombinant hergestellte Strukturen, durch Peptidbrücken mit einer Länge von 0 bis 50 Aminosäuren verbunden. Dies beinhaltet auch rekombinante Proteine, die aus zwei N-terminalen und einer C-terminalen Sequenz bestehen oder Hexamere bestehend aus drei N-terminalen Sequenzen und drei C-terminalen Sequenzen, oder Multimere der zuvor aufgeführten rekombinanten Strukturen, wobei zwischen den N- und den C- terminalen Sequenzen je eine Peptidbrücke von 0 bis 50 Aminosäuren vorhanden sein kann. Die Peptide können zum Zwecke der Aufreinigung, Solubilisierung bzw. der Konformationsveränderung mit spezifischen Fusionsanteilen entweder am N- oder am C-Terminus versehen sein, wie zum Beispiel CBP (Calmodulin-Bindungsprotein) , His-Tag und/oder andere. Ähnliche Konstrukte können auch von DNA, die zum therapieren verwendet wird, kodiert werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül , einen erfindungsgemäßen Vektor, eine erfindungsgemäße Wirtszelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, ein erfindungsgemäßes Erkennungsmolekül und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gegebenenfalls zusammen mit einer Information - zum Beispiel einem Beipackzettel oder eine Internetadresse, die auf Homepages mit weiteren Informationen verweist, etc. - über die Handhabung bzw. über die Kombination der Inhalte des Kits umfasst. Die Information zur Handhabung der Inhalte des Kits kann beispielsweise ein Therapieschema für Ödeme, Herzinsuffizienz, Leberzirrhose, Hyperinsulinismus, Hypertonie, Ulcus duodeni umfassen. Die Information kann jedoch auch Angaben darüber umfassen, wie die erfindungsgemäßen Stoffe und Erzeugnisse innerhalb einer Diagnose von Krankheiten, die mit der AKAP-PKA- Interaktion oder deren Entkoppelung assoziiert sind, einzusetzen sind. Der erfindungsgemäße Kit kann auch in der Grundlagenforschung verwendet werden. Innerhalb der Grundlagenforschung ist der Kit bevorzugt einsetzbar, um zu detektieren, ob ein Stoffwechselphänomen mit der Wechselwirkung bzw. mit der nicht vorhandenen Wechselwirkung von AKAP und PKA assoziiert ist. Insbesondere ist es möglich, mit Hilfe des erfindunggemäßen Kits zu bestimmen, welche Untereinheiten von AKAP und/oder PKA für die Interaktion dieser beiden Moleküle oder für das NichtZustandekommen der Interaktion zwischen diesen verantwortlich sind.

Die erfindungsgemäßen Erzeugnisse, wie beispielsweise Peptide, Vektoren, Nukleinsäuremoleküle, können andere vorteilhafte Nukleinsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate bzw. Lipide umfassen. Es kann beispielsweise bevorzugt sein, dass die Peptide mit einem Fettrest, wie zum Beispiel einem Stearat, so modifiziert werden, dass diese gut membranpermeabel sind. Mit derartigen Peptiden können an Zellkulturen Versuche durchgeführt werden. Solche Peptide können als Werkzeuge eingesetzt werden, um die PKA besonders effizient von AKAP-Proteinen in Zellen, Zellkulturen, Gewebekulturen, Organkulturen oder Organismen zu entkoppeln. Die Peptide im Sinne der Erfindung werden in Zellkulturen insbesondere zur Beantwortung der Frage herangezogen werden können, ob ein bestimmter Prozess von der Verankerung der PKA an AKAP-Proteine abhängt. Aufgrund der vorteilhaften hohen Affinität für die humanen RIIa- Untereinheiten der PKA eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide insbesondere für Untersuchungen an humanen Systemen. Durch den Vergleich mit Peptiden, die die PKA mit anderer Affinität binden, werden weiterhin quantitative Aussagen möglich sein, die definieren, bis zu welchem Grad eine PKA-AKAP- Interaktion notwendig ist, um den Ablauf eines physiologischen Prozesses zu gewährleisten. Insbesondere die erfindungsgemäßen Kits können verwendet werden, um diesen Ablauf des physiologischen Prozesses zu studieren. Von Vorteil ist es hierbei, dass die erfindungsgemäßen Peptide, die die RII -Untereinheiten der PKA stärker binden als die typischen PKA-Bindungεdomänen von AKAP185. Da die erfindungsgemäßen Peptide vorteilhafterweise RIIa- bzw. RII/3-spezifisch sind, können zum Beispiel mit dem Kit besonders detaillierte Erkenntnisse über die Interaktion gewonnen werden. Die Entkoppelung der einen oder der anderen regulatorischen Untereinheiten der PKA von AKAP-Proteinen kann insbesondere AufSchluss darüber geben, welche PKA, TypIIα oder TypII_/ß, an dem jeweiligen zu untersuchenden Prozess beteiligt ist. Insbesondere das Peptid A18δRIIßRnl bindet selektiv RUß Untereinheiten der PKA.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Modifikation, insbesondere eine Inhibition, bevorzugt eine Entkoppelung, einer AKAP-PKA- Interaktion bzw. der Interaktion von AKAP bzw. PKA-Untereinheiten umfassend die Schritte:

a) Bereitstellung eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, eines erfindungsgemäßen Vektors, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle und/oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids und b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.

Bevorzugt ist es, dass die Interaktion an einer regulatorischen R-Untereinheit analysiert bzw. modifiziert wird, besonders bevorzugt an einer RIIa- und/oder RII₁S- Untereinheit .

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinmoleküls, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, eines erfindungsgemäßen Organismus, eines erfindungsgemäßen Polypeptids, eines erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküls, einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder eines erfindungsgemäßen Kits zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Bruchstücken oder Teilbereichen der erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren. Weiterhin kann es vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren um weitere Aminosäuren oder Nukleotide zu erweitern. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Peptide mit Lipid- oder Kohlenhydrat-Strukturen zu modifizieren.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Zelle - beispielsweise als Zellkultur - oder der Organismus als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP- PKA- Interaktion verwendet, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus . Weitere bevorzugte Modelle sind Zellkulturen, oder Gewebe, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder Peptide umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch die AKAP-PKA-Modifikation die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQP2 modifiziert, insbesondere verhindert .

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform werden das Polypeptid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung als Wasserverlust-verursachende Mittel verwendet, insbesondere als Aquaretika.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Interaktion der RIIa- oder RII/3-Untereinheit des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert.

In einer weiteren bevorzugten Verwendung sind die Untereinheiten humanem oder murinem Ursprungs.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf dieses beschränkt zu sein.

Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen

Material und Methoden

Herstellung von Peptidbibliotheken, die von der Sequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP185 abgeleitet sind, auf Membranen

Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden bei Fluka (Steinheim) oder Sigma Aldrich (München) gekauft und ohne weitere Reinigungsschritte benutzt. Fmoc-geschützte Aminosäurepentafluorophenylester wurden bei Novabiochem Merck Biosciences GmbH (Darmstadt) gekauft. Peptidbibliotheken wurden durch automatische SPOT-Synthese auf Whatman 50 Zellulosemembranen gemäß Standardprotokollen mittels Fmoc-Chemie und AutoSpot-Robot ASS 222 (Intavis Bioanalytical Instruments AG, Köln) synthetisiert. Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten wurden durch eine Mischung aus Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) abgespalten (Frank, 1992; Kramer und Schneider- Mergener, 1998). Zur Kontrolle wurden Spots (ca. 50 nmol Peptid pro Spot) aus der Zellulosemembran herausgeschnitten, von der Membran durch Behandlung mit 0,05m NaOH abgespalten und mit HPLC und MALDI -TOF-Massenspektrometrie analysiert .

Detektion membranassoziierter Peptide im RII -overlay-Experiment mit regulatorischen RIIa- und RII₁S- Untereinheiten der PKA als Sonde

Material

1. Regulatorische RIIa- (human) und RUß- (Ratte) Untereinheiten der PKA erhalten von Prof. Dr. Friedrich W. Herberg, Universität Kassel

2. Katalytische Untereinheiten der PKA, Promega, Mannheim, Bestellnr. : V5161

3. [γ³²P]ATP 5000 Ci/mmol Amersham Biosciences, Braunschweig, Bestellnr. : AA0018

4. Sephadex G 50, medium Pharmacia, Bestellnr.: 17-0043-01

5. Phosphat-gepufferte Saline (PBS) NaCl 8 g KCl 0, 2 g

Na₂HPO₄ 1, 44 g

KH₂PO₄ 0, 24 g in 800 ml H₂O lösen, auf pH 7,4 einstellen und mit H₂O auf 1 1 auffüllen.

6. Tris-gepufferter Saline mit Tween 20 Tris-HCl 10 mM NaCl 150 mM Tween 20 0, 05% pH 7,5

Radioakive Markierung der regulatorischen Untereinheit von PKA

1. Reaktionsansatz

Endkonzentration Stammlsg . im Ansatz

RIlQf oder RUß 15 μg 2, 7 μg/μl 5, 6 μl

Katalytische 2 μg 0, 9 μg/μl 2 μl Untereinheit der PKA

KaIiumphosphatpuffer, 25 mM 1 M 12 ,5 μl pH 7,0 cAMP 10 μM 1 mM 5 μl

MgCl₂ 10 mM 0, 5 M 10 μl

DTT 0,5 mM 50 mM 5 μl

[γ³²P] ATP/ATP 0,1 μM radioaktiv: 3,3 x 10^a cpm/ml = 75 μCi 5 μCi/μl 15 μl nicht radioaktiv: 10 μM 5 μl

H₂O 434,9 μl

10 min Inkubation bei 0 ⁰C (auf Eis) . 2. Einstellung der ATP-Konzentration

Die ATP-Konzentration wurde durch Zugabe von nicht radioaktivem ATP auf 10 μM eingestellt (Zugabe von 5 μl einer 1 πiM Lösung) . Der Ansatz wurde weitere 50 min auf Eis inkubiert .

3. Stoppen der Reaktion und Überprüfung der Reaktion

Die Reaktion wurde durch Zugabe von Dextranblau und Abtrennung freier Nukleotide gestoppt. Das freie ATP wurde über eine Sephadex G50-Säule abgetrennt.

Abtrennung der markierten RII -Untereinheit der PKA von freien Nukleotiden über Sephadex G50-Säulen

Nicht eingebaute Nukleotide wurden von den RII -Untereinheiten durch die Fraktionierung über Sephadex G 50-Säulen getrennt .

1. Quellen des Sephadex G 50 -Materials : 20 g wurden in 400 ml PBS über Nacht bei Raumtemperatur gequollen. Nicht abgesetztes Material wurde anschließend mit einer Pasteurpipette entfernt. Das gequollene Material wurde in 50 ml Falcon Röhrchen aliquottiert und bei 4 ⁰C gelagert . Zur Konservierung wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt.

2. Das Material wurde in eine mit einer Glaskugel verschlossene 10 ml sterile Einmalpipette gegossen. Zum Setzen des Säulenbettes liefen etwa 50 ml PBS, das 1 mg/ml BSA (bovines Serumalbumin) enthielt, durch. Bis zur Benutzung der Säule wurde sie oben mit Parafilm verschlossen.

3. Die markierten RII-Untereinheiten (500 μl) wurden mit Dextranblau (70 μl einer 20 mg/ml Lösung) auf die Säule aufgetragen (Gesamtvolumen = 570 μl) .

4. Nachdem die Probe in die Matrix eingewandert war, wurde mit PBS aufgefüllt.

5. Kurz bevor das Dextranblau eluierte, wurde begonnen Fraktionen zu sammeln (2 Fraktionen je 1,5 ml, die weiteren Fraktionen je 1 ml) .

6. Zur Bestimmung der Inkorporation von ³²P wurde 1 % (5,7 μl) der Probe vor der Säule (das entspricht 1 % der eingesetzten Radioaktivität) und 3 μl jeder Fraktion eingesetzt.

7. Die Fraktionen des ersten Peaks, welcher die Sonde enthielt, wurden vereinigt. Die Einbaurate wurde in % errechnet und die spezifische Aktivität (cpm/μg Protein) bestimmt.

RII-overlay

1. Proteine (40 μg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt und durch das semi dry-Elektroblotverfahren auf eine PVDF-Membran (PVDF, Polyvinylidenfluorid) übertragen. Die membranassoziierten Proteine wurde mit Ponceau S gefärbt, um die Markerproteine auf der Membran zu identifizieren. Entfärbt wurde mit TBS. 2. Die Membran wurde in Blotto/BSA für 16 h bei 4 ⁰C inkubiert :

10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.4

0,15 M NaCl 8,766 g/l

5 % (w/v) Magermilchpulver 50 g/l

0,1 % (w/v) BSA 1 g/l

(0,01 % antifoam (Sigma) )

0, 02 % NaN₃ 0,2 g/l

3. Das Blotto/BSA wurde durch frisches ersetzt und ³²P markierte RII -Untereinheiten dazugegeben (10⁵ cpm/ml) . Es wurde für 4-6 h bei Raumtemperatur inkubiert.

4. Die Membran wurde 4 x 15 min in Blotto/BSA und 2 x 10 min in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.4 , 0,15 M NaCl gewaschen.

5. RI I -bindende Proteine wurden durch Exposition auf eine Phosphoimagerplatte detektiert.

Ergebnisse

Es wurde eine Peptidbibliothek, abgeleitet von der wildtypischen Aminosäuresequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP18Ö (PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY; Henn et al . , 2004) auf einer Membran synthestisiert . Dazu wurde jede Aminosäure der wildtypischen Sequenz mit den 20 möglichen Aminosäuren substituiert. Figur 1 zeigt die Detektion der Peptide mittels der RII-overlay-Methode. Als Sonde wurden in diesem Fall radioaktive PKA RIIa- und Rllß-Untereinheiten gleichzeitig eingesetzt. In allen späteren Experimenten wurden entweder RIIc.- oder RII/3-Untereinheiten als Sonde eingesetzt. Das Ergebnis zeigt deutliche Unterschiede in der Bindungsfähigkeit der einzelnen Peptide an die R-Untereinheiten (unterschiedliche Signalintensitäten) .

Figur 2 zeigt eine Wiederholung des Experiments mit ausgewählten Peptiden (AKAP185-L304T, AKAP18δ-L308D, AKAP185-L314E) deren Bindungsfähigkeit an RIIa- bzw. Rlljß-Untereinheiten aber separat in unterschiedlichen RII -overlay-Experimenten getestet wurde. Als Kontrollen wurden die Peptide Ht31, Ht31-P, AKAP18Ö-RI und AKAP18δ-wt (wildtypische Sequenz) auf den gleichen Membranen synthetisiert und dem RII -overlay-Experiment unterzogen. Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. Die Quantifizierung spricht für eine stärkere Bindung von AKAP18Ö-L304T und AKAP18δ-L314E sowohl an RIIa- als auch an RII/3-Untereinheiten, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-L308D dagegen schwächer. Das bekannte Peptid Ht31 bindet beide regulatorische Untereinheiten etwa 5fach schwächer als das AKAP18δ-wt und etwa 5-6fach schwächer als AKAP18δ-L304T und AKAP18δ-L314E . Die Bindung von Ht31 an die hier verwendeten regulatorischen RI ICK- und RII/3-Unter- einheiten ist nur unwesentlich stärker als die Bindung der Untereinheiten an Ht31-P, das die AKAP-PKA-Interaktion nicht hemmt (Klussmann et al . , 1999; Alto et al . , 2003). Damit sind die Peptide AKAP18δ-wt, AKAP18δ-L304T und und AKAP18δ-L314E wesentlich effizientere Inhibitoren einer AKAP-PKA-Interaktion als Ht31.

Alto et al. (2003) entwickelten ein Peptid, AKAP₁₃, das die

Interaktion zwischen der murinen Rllα-Untereinheit der PKA mit 5fach höherer Affinität bindet (K_D = 0,45 nM) als das Peptid Ht31 (KD = 2,2 nM) . In unseren RII -overlay-Experimenten binden die Peptide AKAPis und Ht31 sowohl die humane RIIa- als auch die RII/3-Untereinheit der PKA aus der Ratte kaum, die von uns identifizierten Peptide AKAP18δ-wt und AKAP18Ö-L304T und und AKAP185-L314E dagegen stark. Dieses Ergebnis spricht für Speziesunterschiede zwischen den murinen und humanen Rllα-Untereinheiten, die zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für die gleichen Peptide führen.

Identifizierung von Peptiden, die spezifisch RII/3-Unter- einheiten der PKA binden

Um Peptide zu finden, die entweder RIIa- oder Rlljß-Untereinheiten der PKA binden und damit spezifisch die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der Typ IIa bzw. der Typ 11ß PKA hemmen, wurden anhand von dreidimensionalen Strukturmodellen der PKA-Untereinheiten aus der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAP18δ Peptide abgeleitet, die die AKAP-Bindungstasche blockieren könnten. Die Peptide (1-19) wurden parallel auf zwei Membranen synthetisiert und anschließend in RII -overlay-Experimenten auf ihre Bindungsfähigkeit an RIIa- oder RII/3- Untereinheiten der PKA getestet (Figur 3A) . Die quantitative Auswertung zeigte u. a. einen deutlichen Unterschied der Bindung der beiden PKA-Untereinheiten an das Peptid 7, dessen Sequenz neben derer der anderen Peptide in der Figur 3B aufgelistet ist.

Ausgehend von der Sequenz des Peptids 7 wurden zwei Peptidbibliotheken auf Membranen synthetisiert und RII- overlay-Experimenten mit RIIa- bzw. RII/3-Untereinheiten als Sonden unterzogen. Figur 4 zeigt, dass einige Peptide RIIa- binden, aber nicht RII/3-Untereinheiten (zum Beispiel die Peptide 10/11 und 10/12) und umgekehrt (zum Beispiel Peptid 21/4) . Darüber hinaus weisen einige Peptide eine stärkere Bindung an Rllα-Untereinheiten als an RII/3-Untereinheiten auf. Bei anderen ist es umgekehrt. Sie binden Rllα-Unter- einheiten schwächer als an RII/3-Untereinheiten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass wir mit den genannten Peptiden AlδδRIIαHsl und 2 und A18δRII/SRnl die ersten Blocker gefunden haben, die selektiv die Interaktion von RIlQ!- bzw. RII/3-Untereinheiten der PKA mit AKAP- Proteinen identifiziert haben.

Tab. 1 A

Nr . A ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . B ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . C ASDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . D ASDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . E ARDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . F ARDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . G ANDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . H ASDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . I ASDAKTVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . J ANDAKTERLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . K ANDAKTERLSQRLVENAVLKAVQQY

Nr . L ANDAKTQRLSQRLVENAVLKAVQQY

Nr . M PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY

Nr . N PEDAELVRLSKRLVENAVLQAVQQY

Nr . O PEDAELVRLSKRLVENAVLNGVQQY

Nr . P PEDAELVRLSKRLVENAVLNGQQQY

Nr . Q PEDAELVRLSKRLVENAVLNGNQQY

Nr . R PEDAELVRLSKRLVENAVKNGNQQY

Nr . S PEDAELVRLSKRLVENAVKNGAQDY

Nr . T PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (Akapl8δ-wt )

Nr . U PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18Ö-L304T)

Nr . V PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-L308D)

Nr . W PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18δ-L314E)

Nr . X PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAP18δ- P)

Nr . Y PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18Ö- PP)

Nr . Z PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18δ-phos)

Nr . AA EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (Akapl8δ-RI )

Nr . BB ANDARLVRLSKRLRENAVLKAVQQY (AlβδRIIαHsl (14/14))

Nr . CC ANDARLVRLSKRLYENAVLKAVQQY (Al8δRIIαHs2 (14/19)) Nr . DD ANDARLVRLSKRLVENAVLKFVQQY (AlSδRIIßRnl (21/4))

Nr . EE ANDARLVRLNKRLVENAVLKAVQQY (A18δRIIαRn2 (10/11))

Nr . FF ANDARLVRLPKRLVENAVLKAVQQY (A18δRIlαRn3 (10/12))

Nr . GG ANDARLVRLSKRDVENAVLKAVQQY (A18δRIIαRn4 (13/02))

Nr . HH YQEQLEEEVAKVIVSMSIAFAQQTE (AKAP450_l)

Nr . I I NLQKIVEEKVAAALVSQIQLEAVQE (AKAP450 2)

Tab. 1

SEQ ID Nr. 1 PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-wt)

SEQ ID Nr. 2 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18Ö-L304T)

SEQ ID Nr. 3 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L308D)

SEQ ID Nr. 4 PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18Ö-L314E)

SEQ ID Nr. 5 PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAP185-P)

SEQ ID Nr. 6 PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18Ö-PP)

SEQ ID Nr. 7 PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPl8δ-phos)

SEQ ID Nr. 8 EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (AKAP18ö-RI)

SEQ ID Nr. 9 NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA

SEQ ID Nr. 10 VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL

SEQ ID Nr. 11 NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF

SEQ ID Nr. 12 TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA

SEQ ID Nr. 13 LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ

SEQ ID Nr. 14 QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL

SEQ ID Nr. 15 LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA

SEQ ID Nr. 16 EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA

SEQ ID Nr. 17 ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH

SEQ ID Nr. 18 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS

SEQ ID Nr. 19 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS

SEQ ID Nr. 20 TDRGFPALSSEALVRVLVLDANDNS

SEQ ID Nr. 21 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP

SEQ ID Nr. 22 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV

SEQ ID Nr. 23 EKESLTEEEATEFLKQILNGVYYLH

SEQ ID Nr. 24 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH

SEQ ID Nr. 25 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP

SEQ ID Nr. 26 LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF SEQ ID Nr. 27 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVDLYL

SEQ ID Nr. 28 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS

SEQ ID Nr. 29 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ

SEQ ID Nr. 30 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE

SEQ ID Nr. 31 QMKAKRTKEAVEVLKKALDAISHSD

SEQ ID Nr. 32 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS

SEQ ID Nr. 33 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF

SEQ ID Nr. 34 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY

SEQ ID Nr. 35 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE

SEQ ID Nr. 36 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL

SEQ ID Nr. 37 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA

SEQ ID Nr. 38 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA

SEQ ID Nr. 39 DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT .

Tab. 2

Rllα-Bindung Rllß-Bindung

Peptid K_D [nM] K_D [nM]

AKAP18δwt 0,4 - 1 ,5 1 - 6

AKAP188L304T 0,3 - 0,9 35

AKAP185L314E 0,2 - 1 ,3 22

AKAP185L308D keine Bindung keine Bindung

AKAP188-P keine Bindung keine Bindung

AKAP185-PP keine Bindung keine Bindung

Ht31 15 35

Ht31-P keine Bindung keine Bindung

AKAPis keine Bindung keine Bindung

AKAPis-P keine Bindung keine Bindung

Tabelle 2. Bindungskonstanten für die Interaktion von humanen RIIa- und Rllß-Untereinheiten aus der Ratte mit den angegebenen Peptiden, die aus der wildtypischen' RII- Bindungsdomäne von AKAPlδδ (AKAP18δwt) abgeleitet wurden. Die Werte wurden durch surface plasmon resoπaπce-Messungen erhalten. L, Leuzin, T, Threonin, D, Aspartat, P, Prolin, IS, in silico. 304, 308 und 314 bezeichnen die Position der entsprechenden Aminosäuren in AKAP185. Weitere Peptide, die AKAP-PKA-Interaktionen hemmen

Neben den in den Abbildungen 1-4 beschriebenen Peptiden konnten weitere identifizieren werden, die als Hemmer von AKAP-PKA-Interaktionen wirken. Zum Nachweis dieser Eigenschaft wurden die unten aufgeführten Peptide auf einer Zellulosemembran synthetisiert (SPOT-Syntheseverfahren) und einem RII-overlay unterzogen (Abb. 5) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA- Untereinheiten gebunden haben. Die Peptide wurden in sechs Blöcken synthetisiert. Die Peptide der Reihe A Positionen 1-17 sind Positivkontrollen und in allen Blöcken identisch. Die Namen der unten aufgeführten Peptide sind aus ihren Koordinaten in den Blöcken 1-6 abgeleitet, beispielsweise ist das Peptid 1.B13 (Sequenz: YIALNEDLRSWTAADTAAQISQRKL) im Block 1 in der Reihe B an der Position 13 zu finden.

Die Abb. 5. zeigt die Identifizierung von Peptiden, die AKAP-PKA-Interaktionen hemmen. Kandidatenpeptide wurden auf einer Membran synthetisiert und mit radioaktiv markierten regulatorischen RIID-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Peptidsequenzen sind in der beigefügten Liste (Tab. 3) aufgeführt :

Tab. 3. Sequenz der Peptide

LSRYNDQASSSRI IERI FSGAVTRG 2ACA HUMAN EASEFHSRYITTVIQRI FYAVNRSW 2ACC HUMAN QSEYSWRKMLSGIAAFLLGL I FLLV 2DOB HUMAN LLLLFWLGWLGMLAGAWI IVRAPR 4F2 HUMAN LYFHLAPKAEVGVIAKALVRLLRSH A3B2 HUMAN VKQNVKMSESQAALPSALKTLQQKL A4E1 HUMAN DPGALGRLGAWALLFFLVTTLLASA AAAT HUMAN

3QEVEGMNILGLWFAIVFGVALRK AAAT HUMAN EPTTGMDPKARRFLWMLILDLIKTG ABC2 HUMAN RLRGISWKDEARWKWALEKLELTK ABC2 HUMAN

LIQSLESNPLTKIAWRAAKPLLMGK ABCR HUMAN AYTTQSLASVAYLINTLANMVLQML ABI2 HUMAN TLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPEI ABM2 HUMAN RYGAAEPHTIAAFLGGAAAQEVI KI ABP1 HUMAN NKDDDES PGLYGFLHVIVHS AKGFK ABR HUMAN PTTHAMSPRLRHVLLELLPRLLGSP ACHE HUMAN

PGSAQEKSIERRFLNGLFSKLQPRD AD13 HUMAN HFDPTTAFRAPDVARALLRQIQVSR AGRN HUMAN HYKETWKALEALVAKGLVQALGLSN AKA1 HUMAN QKLYLDRNLIAAVAPGAFLGLKALR ALS HUMAN KEIKSYLKRIFQLVRFLFPELPEEG ALS2 HUMAN AISPWKTYQLVYFLDKILQKSPLPP AMPB HUMAN

JGAAGDEAREAAAVRALVARLLGPG ANAG HUMAN

; ARSGHEQwEMLLDRAAPiLSKTK ANK3 HUMAN SRTSSPVKSSLFLAPSALKLSTPSS ANK3 HUMAN TSYPWSWARVGPAVELALAQVKARP ANPA HUMAN

TIDRETSGNLEQLLLAWKS IRS I P ANX5 HUMAN AVQNRFHGDAQVALLGLASVIKNTP ANX9 HUMAN PFRIYQTTTERPFIQKLFRPVAADG APG5 HUMAN RDRASYEARERHVAERLLMHLEEMQ ARH 1 HUMAN EKLKSRPAHLGVFLRYIFSQADPSP ARHB HUMAN NNTEKTVKKIKAFVEQVANWLYSS ARRS HUMAN EINVERDEKLIKVLDKLLLYLRIVH ARS2 HUMAN ELLQSETDKWRAVAIALRNLSLDR ARVC HUMAN LVASSQSVREAKAASHVLQTVWSYK ARVC HUMAN EFKTLSEESIEKVLKNIFNISLQRK ARY1 HUMAN

EFKTLTEEΞVEEVLKNI FKI SLGRN ARY2 HUMAN

VINLIGQTPISRLVALLVRGLGTEK ASB8 HUMAN

!SAAMAAS SVS WLS SLFLKL YRKP AT7A HUMAN PRSVRDTILSRALILKILMSAAI 11 ATC4 HUMAN EWTGYTAFFVGILVQQIADLIIRKT ATHL HUMAN ADDQGQHPLLKMLLHLLAFSSAATG ATIP HUMAN

".LGGAWAFVLRDVIYTLIHYINQRP ATM HUMAN STDEYYYYALAIWMS IVS IVSSLY ATY3 HUMAN APQRKTTNPLDLAVMRLAALEQNVE BA2A HUMAN MGALARALLLPLLAQWLLRAAPELA BAE2 HUMAN

TTLLRLPQKVFDAWEAVARASLIP BAE2 HUMAN DASYSLILEVQTAIDNVLIQSDVPI BBS7 HUMAN EKEEVPEGMEEAAVASWLPARELQ BC13 HUMAN SHELRSKILSLQLLLSILQNAGPIF BIG1 HUMAN SHREAWTNLLLLFLTKVLKISDNRF BIG1 HUMAN HQSNKGYSLASLLAKVAAGKEKS SN BIR6 HUMAN LIQTSSTEQLRTIIRYLLDTLLSLL BIR6 HUMAN RGNLPTSGNISGFIRRLFLQLMLED BIR6 HUMAN VTFHLPHHVLKSIASAIVNELKKIN BIR6 HUMAN

3AVYKGS LDERPVAVKVF S FANRQN BMR2 HUMAN

LTKISLKNNLDHLLASLLFEEYISY BP28 HUMAN LVQLVDTLGAEKFLWILLILLFEQY BP28 HUMAN RLTSLKKTLATTLAPRVLLPAIKKT BP28 HUMAN PISGQTYSVEDAVLKGWDPEFRIR BPA1 HUMAN WAKQHQQRLASALAGLIAKQELLEA BPEA HUMAN HKAELKPLRADYLIARWTVLEKLI BPL1 HUMAN ASTLILTPTSKDVLSNLVMISRGKE BRC2 HUMAN ENREKVNDQAKLIVGIWGLLLAAL C166 HUMAN YRNGKVLHPLEGAWIIFKKEMDPV C166 HUMAN NITDLGAYKLAEALPSLAASLLRLS C2TA HUMAN

DFRKKARQS IQGILEAAFSΞELTRS C3AR HUMAN SIGLQNFEIAKDFWKVIDRLSRDE CA16 HUMAN VKPSSTRGGVLFAITDAFQKVIYLG CA1 E HUMAN RLGEQNFHKARRFVEQVARRLTLAR CA26 HUMAN SIGYTNFTLEKNFVINWNRLGAIA CA26 HUMAN IYDERGARQLGLALGPALGLLGDPF CA35 HUMAN

5S FAWHMNRS I VLLLKVLAQLRDHS CABI HUMAN YKTSTVSADLANLLKRIATIVPRTE CABI HUMAN HSGFIETEELKNFLKDLLEKANKTV CABV HUMAN TNTQVEGDDEAAFLERLARREERRQ CALD HUMAN

FQLQRPPQNLLRLLRKAVERSSLMG CANB HUMAN LYLRQNSMGLFSALRHALAKESLVG CANC HUMAN DKVTQKQFQLKEIVLELVAQVLEHK CAQ2 HUMAN EGFHLLGQPLSHLARRLLDTVWNKG CARF HUMAN ELYLRKRHHEPGVADRLIRLLQETS CARF HUMAN LIRSLYEMQEERLARKAARGLNVGH CARF HUMAN RLLDLATVKANGLAAFLLQHVQELP CARF HUMAN EGFS FNPLKI EVFVQTLLHLAAKSF CB80 HUMAN RITQDAQLKSSKWHKAVLQLNEEG CBG HUMAN VKKAPDAEELDKVARLAAKALASVS CBP4 HUMAN

MEQVAHQTIVMQFILΞLAKSLKVDP CC37 HUMAN

FKITRYWNSLSNLVASLLNSVRSIA CCAC HUMAN HIPTPGAALSWQAAIDAARQAKLMG CCAC HUMAN

NWLTEVQDTANKALLALFTAEMLLK CCAC HUMAN 95 PNSSKQTVLSWQAAIDAARQAKAAQ CCAD HUMAN

96 RTLLWTFIKSFQALPYVALLIAMIF CCAF HUMAN

97 VRHKYNFDNLGQALMSLFVLASKDG CCAG HUMAN

98 LRVISRAPGLKLWETLISSLKPIG CCAI HUMAN

99 NYMFTTVFVLEAVLKL VAFGLRRFF CCAI HUMAN

100 VGNLGLLFMLLFFIYAALGVELFGK CCAI HUMAN

101 VHHKYNFDNLGQALMSLFVLASKDG CCAI HUMAN

102 FKITKYWTSLSNLVASLLNSIRSIA CCAS HUMAN

103 HNQPLWLTRLQDIANRVLLSLFTTE CCAS HUMAN

104 VKS KEEAQHVQRVLAQLLRREAALT CD93 HUMAN

105 RVAQDLGLELAELVPRLFRVASKTH CDA1 HUMAN

106 VFSRRGGLGARDLLLWLLLLAAWEV CDA1 HUMAN

107RIAQDLGLELEΞLVPRLFRVASKRH CDA2 HUMAN

108 RRGRGAWTRLLSLLLLAAWEVGSGQ CDA2 HUMAN

109 RIAQDLGLELAΞLVPRLFRVASKRH CDAD HUMAN

110 RIAQDLGLELAΞLVPRLFRVASKGR CDA5 HUMAN

111 RIAQDLGLELAELVPRLFRMASKDR CDA6 HUMAN

112 PTSNQQVKPLGLVLRKLLDREETPE CDA9 HUMAN

113 RIAQDLGLELAΞLVQRLFRVASKRH CDAA HUMAN

1 14 ALLATQAGSAGGAVNKLVPRSVGAG CDAB HUMAN

1 15RIAQDLGLELAΞLVQRLFRVASKTH CDAB HUMAN

1 16 VIIGPRGPGSQRLLLSLLLLAAWEV CDAC HUMAN

1 17 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDB2 HUMAN

1 18 HYSVAEETESGSFVANLLKDLGLEI CDB2 HUMAN

1 19 TDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDBE HUMAN

120 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDB9 HUMAN

121 TDHGSPALSSEALVRVLVLDANDNS CDBC HUMAN

122 SDHGSPALSSEALVRVWLDANDNS CDBD HUMAN

123 TDRGFPALSSEAL VRVL VLDANDNS CDBF HUMAN

124 PPQRHPQRSEQVLLLTLLGTLWGAA CDG6 HUMAN

125 TPRFLKEELEVKILENAAPSSRFPL CDG6 HUMAN

126 RGPAGQRRMLFLFLLSLLDQVLSEP CDGF HUMAN

127 SGGGSDEGLASAAARGLVEKVRQLL CDN5 HUMAN

128 TRMAAESRRVLLLAGRLAAQSLDTS CENB HUMAN

129MGSEDHLGVIPRAIHDIFQKIKKFP CENE HUMAN

130KRGPLLTALSAΞAVASALHKLHQDL CEP2 HUMAN

131 EYHYVQEKASKLAAASLLLALYMKK CGB3 HUMAN

132 YIDENQDRYIKKLAKWVAIQSVSAW CGL1 HUMAN

133 ANPVEIRRGVMLAVDAVIAELKKQS CH60 HUMAN

134 PVAVRLQMSERNILSRLANRAPEPT CHD4 HUMAN

135 ARERERLAHSRRAAARAVAAATAAV CIK4 HUMAN

136 LKTISVIPGLKTIVGALIQSVKKLS CIN9 HUMAN

137 LSRFEGMRWVNALLGAI PS IMNVL CIN4 HUMAN

138 LYILTPFNPLRKIAIKILVHSLFSM CIN1 HUMAN

139 LYILTPFNPIRKLAIKILVHSLFNM CIN2 HUMAN 140 LSRFEGMRVWNALVGAIPSIMNVL CIN5 HUMAN

141 LYILTPLNPVRKIAIKILVHSLFSM CIN3 HUMAN

142 LKTITVIPGLKTIVGALIQSVKKLS CIN4 HUMAN

143 LKTISVISGLKTIVGALIQSVKKLA CIN5 HUMAN

144 LYVLSPFHPVRRAAVKILVHSLFNM CIN5 HUMAN

145 LYILSPFNLIRRIAIKILIHSVFSM CIN8 HUMAN

146 EEQLRLRERELTALKGAL KEΞVASR CING HUMAN

147 NYGKFEKGYL I FWRFLFGLVNQER CIS1 HUMAN

148 RGALLAGALAAYAAYLVLGALLVAR CIW6 HUMAN

149 AQKVTRQEREEALVRGVFMKWKPK CJ11 HUMAN

150MLRYDVYGGENEVIPEVLRKSHSHF CJ24 HUMAN

151 ERQSAEVQGSLALVSRALEAAERAL CK13 HUMAN

152 RSGYIEANELKGFLSDLLKKANRPY CLB2 HUMAN

153 VRRKLGEDWIFLVLLGLLMALVSWS CLC1 HUMAN

154 AYIVNYFMYVLWALLFAFLAVSLVK CLC5 HUMAN

155 LIHSVSDAFSGWLLMLLIGLLSGSL CLC5 HUMAN

156 YFPLKTLWRSFFAALVAAFTLRS IN CLC5 HUMAN

157 RKKGRESYIETELIFALAKTSRVSE CLH2 HUMAN

158 FAGSWRSGLAFLAVIKAIDPSLVDM CLMN HUMAN

159 5YFGSDVKVAYQLATRLLAHESTQR CLR2 HUMAN

160 SPERFLSPLLGLFIQAVAATLATPP CLR2 HUMAN

161 LQEQLYVRRAALAARSLLDVLPFDD CLR3 HUMAN

162 WQERFLSPLLGRFLEGVAAVLATPA CLR3 HUMAN

163 YFSQDVRVTARLLAHLLAFESHQQG CLR3 HUMAN

164 LGSVIDISGLQRAVKEALΞAVLPRV CN2A HUMAN

165 SFMEHIAMPIYKLLQDLFPKAAELY CN2A HUMAN

166 WVS FTSLGSLPSALRPLLSGLVGGA CN3B HUMAN

167 HVIYQRVDKAVGLAEAALGLARANN CN93 HUMAN

168 TDMKDMRLEAEAWNDVLFAVNNMF CNC9 HUMAN

169 PKIVGRTKDVKEAVRKLAYQVLAEK CND3 HUMAN

170 YGPTNFAP I INHVARFAAQAAHQGT CNE1 HUMAN

171 LAHLRARLKELAALEAAAKHEELVE CNG4 HUMAN

172 EEGGTPEQGVHRALQRLAHLLQADR CNRC HUMAN

173 WKGGSASTWLTAFALRVLGQVNKYV C05 HUMAN

174 DVLPNFFYHSNQWRMAALEVYVRR C0A1 HUMAN

175RQVQAEVPGSPIFVMRLAKQSRHLE COA1 HUMAN

176 SSQFHMATNSSMFLKQAFEGEYPKL C0G5 HUMAN

177VRRLERKYSSIPVIQGIVNEVRQSM C0G8 HUMAN

178 TDPDLPPGYVQSLIRRWNNVNIVI C0H1 HUMAN

179 3DVKS KTEALKKVI IMILNGEKLPG COPB HUMAN

180TFTLSTIKTLEEAVGNIVKFLGMHP COPG HUMAN

181 LLFGAWAGVLGTALSLLIRAELGQP C0X1 HUMAN

182 RF I FNRWLENEAVRAAAVSALAKF CPG2 HUMAN

183 RREEATRQGELPLVKEVLLVALGSR CPSA HUMAN

184NATLFTAAEIAPFVEILLTNLFKAL CSE1 HUMAN 185 SVNWKHKDAAIYLVTSLASKAQTQK CSE1 HUMAN

186 QRREGGGRNIGGIVGGIVNFISEAA CSS2 HUMAN

187 IEKESQRKSIDPALSMLIKS IKTKT CT06 HUMAN

188 LDVIYWFRQI I AWLGVI WGVL PLR CT24 HUMAN

189 HRLLSTEWGLPS IVKSLIGAARTKT CT45 HUMAN

190 NKSGNRSEKEVRAAALVLQTIWGYK CTD1 HUMAN

191 RHLTQQDPLSEAIVEKLIQS IQKVF CTDB HUMAN

192 RFVKLAVMGLTVALGAAALAWKSA CTEO HUMAN

193 SVKRGNMVRAARALLSAVTRLLILA CTN1 HUMAN

194 SVKRGTMVRAARALLSAVTRLLILA CTN2 HUMAN

195 ARENAGPAIVISFLIAALASVLAGL CTR1 HUMAN

196 VSSSAPSVYSVQALSLLAEVLASLL CU05 HUMAN

197 VYRSDEKEKAVPLISRLLYYVFPYL CU05 HUMAN

198RGPHGQLSPALPLASSVLMLLMSTL CV03 HUMAN

199 TLRFLHASALLALASGLLAVLLAGL CV03 HUMAN

200 FPNPRRRLRLQDLADRWDASEDEH CYA3 HUMAN

201 LHYYSEREGLQDIVIG11KTVAQQI CYG1 HUMAN

202 WKGAPTTSLISVAVTKIIAKVLEDN D7A1 HUMAN

203 YVASAFTLAVNI IAKKIVLKEQTGS DCOR HUMAN

204 LLRILTDALVPYLVGQWAGAQALQ DCUP HUMAN

205 AEKTDEEEKEDRAAQSLLNKLIRSN DD19 HUMAN

206 DEERRQL I QLRD I LKS ALQVEQKED DDF2 HUMAN

207 LGHPAAFGRATHAWRALPESLGQH DDH1 HUMAN

208 ASFQRKWFEVAFVAEELVHSEIPAF DEP5 HUMAN

209 KVAFTGSTEVGKLIKEAAGKSNLKR DHA1 HUMAN

210 KIAFTGSTEVGKLIQEAAGRSNLKR DHA2 HUMAN

211 EAIKFINRQEKPLALYAFSNSRQW DHA8 HUMAN

212 PRALLAALWALEAAGTAALRIGAFN DHP1 HUMAN

213 RLVSSPPSGVPGLALLALLALLALR DIAC HUMAN

214 RWLKGDVSLKD I IDPAFRAS WI AQ DIAC HUMAN

215 FQLPSRQPAL S S FLGHLAAQVQAAL DIS1 HUMAN

216 RSLTSEREGLEGLLSKLLVLSSRNV DIS1 HUMAN

217 LIGPKVRITLMKFLPSVFMDAMRDN DJCD HUMAN

218 QRPRAPRSALWLLAPPLLRWAPPLL DLG4 HUMAN

219 RQRLLGRSWSVPVIRHLFAPLKEYF DM3A HUMAN

220 KRKLEDLSSEWKAVNRLLQELRAKQ DMD HUMAN

221 LPARVPRPGLSEALSLLLFAWLSR DMK HUMAN

222 QRELQEALGARAALEALLGRLQAER DMN HUMAN

223 SARLRMVETLSNLLRSWALSPPDL DNL1 HUMAN

224 ELAEHLNASLAFFLSDLLSLVDRGF D0C6 HUMAN

225 5PFRQQHFLAGLLLTELALALEPEA DOC6 HUMAN

226 LRAHGTHPAISTLARSAIFSVTYPS DOC6 HUMAN

227 IYEPPRYMSVNQAAQQLLEIVQNQR DPH5 HUMAN

228 HIYLYHHAQAHKALFGIFIPSQRRA DPOE HUMAN

229 FNWRQAHMQARFVILRVLLEAGEGL DPP3 HUMAN 230 3VILGKWAILAILLGIALLFSVLLT DSC3 HUMAN

231 PNTELNVSRLEAVLSTIFYQLNKRM DTNA HUMAN

232RLDEEHRLIARYAARLAAESSSSQP DTNA HUMAN

233 LTSVLGILASSTVLFMLFRPLFRWQ DUFF HUMAN

234 PQELYESSHIESAINVAIPGIMLRR DUS6 HUMAN

235 SRELYESARIGGALSVALPALLLRR DUS9 HUMAN

236 DYYKKQVAQLKTLITMLIGQLSKGD DYH9 HUMAN

237 RDFVEEKLGSKYWGRALDFATSFE DYH9 HUMAN

238 IGVKFLINEATTLADLLALRLHRVE DYHB HUMAN

239EGKKKQTNYLRTLINELVKGILPRS DYHC HUMAN

240 GPSGSGKSMAWRVLLKALERLEGVE DYHC HUMAN

241 KLVAEDIPLLFSLLSDVFPGVQYHR DYHC HUMAN

242 LLSATELDKIRQALVAIFTHLRKIR DYHC HUMAN

243 WRRFRWAIILFIILFILLLFLAIFI DYSF HUMAN

244 PVRREVTDKEQEFAARAAKQLEYQQ E4L3 HUMAN

245 FPGDILMRMLKMLILPLI ISSLITG EAA2 HUMAN

246 KLMVDFFNILNEIVMKLVIMIMWYS EAA2 HUMAN

247FPGEILMRMLKLIILPLIISSMITG EAA3 HUMAN

248 PFMSAVSGRAYPAAITILETAQKIA EDD HUMAN

249 RNTFAERLSAVEAIANAISWSSNG EDD HUMAN

250 NAAQTPRIPSRLLAILLFLLAMLLT EFA5 HUMAN

251 ΪLKELPMRNLQEILHGAVRFSNNPA EGFR HUMAN

252 MVETQQLMRVYGALMWALGKWGTP EHD2 HUMAN

253 HGIVSWDTFSVAFIKKIASFVNKSA ELM1 HUMAN

254 HGIVSWDMVSITFIKQIAGYVSQPM ELM2 HUMAN

255 VMNQQLQTKAMALLTALLQGAS PVE ELM3 HUMAN

256 ESRVQQQEDEITVLKAALADVLRRL EML4 HUMAN

257 jQFGVGFYSAFLVADKVIVTSKHNN ENPL HUMAN

258 ELSSQLPERLSLVIGSILGALAFLL EPB6 HUMAN

259 MYRTHTRRALQTVAQLILELIEKQE EPPL HUMAN

260 SGRAAALRQWSAVTALVEAAERQP EPPL HUMAN

261 RLQALRLEREEYVLLKALALANSDS ERR1 HUMAN

262 GESAGGESVSVLVLSPLAKNLFHRA EST1 HUMAN

263 TPQKNNYNSIAAILIGVLLTSMLVA EV2B HUMAN

264 ALRPAPALLAPAVLLGAALGLGLGL EVC HUMAN

265NILVTTTQLIPALAKVLLYGLGIVF EYA1 HUMAN

266 NVLVTTTQLIPALAKVLLYGLGSVF EYA2 HUMAN

267 PADEKLQEKAWGAWPLVGKLKKFY F49B HUMAN

268 VEQRKKLSSLLΞFAQYLLAHSMFSR FACA HUMAN

269 NRLGIESPRSEKLARELLKELRTQV FACC HUMAN

270QQRAQTMVQVKAVLGHLLAMSRSSS FACC HUMAN

271 SGQSKLNSWIQGVLSHILSALRFDK FACC HUMAN

272 ETRRGAYLNALKIAKLLLTAIGYGH FAFX HUMAN

273 SQAYDNLSLSDHLLRAVLNLLRREV FAFX HUMAN

274 WWPVLPKGELEVLLEAAIDLSKKG FAFX HUMAN 275 WWPVLPKGELEVLLEAAIDLSVKG FAFY HUMAN

276RSNDKVYENVTGLVKAVIEMSSKIQ FAK1 HUMAN

277 ARTSSAEYNVNNLVSPVLFQEALWH FAS HUMAN

278 FRYMAQGKHIGKVVVQVLAEEPAVL FAS HUMAN

279 AVTIHPVTGSISVLNP AFLGLSRKL FAT2 HUMAN

280PGPAPLRLLEWRVAAGAAVRIGSVL FCP1 HUMAN

281 MEEWDRYPRIGDILQKLAPFLKMYG FGD1 HUMAN

282 SGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRR FGR1 HUMAN

283 PSHSLLRLPLLQLLLLWQAVGRGL FK10 HUMAN

284 DVFIWLGRKSPRLVRAAALKLGQEL FLIH HUMAN

285 HRLLQQLVLSGNLIKEAVRRLQRAV FRT2 HUMAN

286LPHGSGLGTSSILAGTALAALQRAA FUK HUMAN

287 PESTARMQGAGKALHELLLSAQRQG G45G HUMAN

288 PKVDKWSRFLFPLAFGLFNIVYWVY GAAT HUMAN

289RLFTNLKDTSSKVIQSVANYAKGDL GAK HUMAN

290EΞLREVQLEELEAARDLVSKEGFRR GAL1 HUMAN

291 RPFLPYFNVSQQFATFVLKGSFSEI GALC HUMAN

292 NHGMWQTISVEELARNLVIKVNRDA GAS6 HUMAN

293 AGEDPKVTRAKFFIRDLFLRISTAT GBAF HUMAN

294 PSVFGSNPKAHIAAKTVFHLAHRHG GBF1 HUMAN

295 HGRLIFITVLFSII IWWWISMLLR GC5D HUMAN

296 NVLKDKMEKLKRLLQVAARKSQVTL GCC1 HUMAN

297 TINKFDKNFSAHLLDLLARLS IYST GCP2 HUMAN

298 I INNDTTITLAIWD KLAPRLSQLK GCP5 HUMAN

299 JLLTEKAAPVMNVIHSIFSLVLKFR GCP6 HUMAN

300 IAKQELIAHAREAASRVLSALSDRQ GCP6 HUMAN

301 SYESMSEPPIAHLLRPVLPRAFAFP GCP6 HUMAN

302 JSAVEIVGLSKSAVRWLLELSKKNI GDE HUMAN

303 LRLETAPNISKDVIRQLLPKAPPLR GD F8 HUMAN

304 VLGDIHTTLLSAVIPNAFRLVKRKP GDL1 HUMAN

305 KDHAGVMGESNRLLSALIRHSKSKD GDS1 HUMAN

306 FNQLTQSASEQGLAKAVASVARLVI GEM4 HUMAN

307 JRQKLARFNAREFATLIIDILSEAK GIT1 HUMAN

308 KPVYYALEGSVAIAGAVIRWLRDNL GLPK HUMAN

309 VGILSRRLQEALAAKEAADAELGQL GOA3 HUMAN

310FLRRYPIARVFVIIYMALLHLWVMI GOA5 HUMAN

311 VLGLFWLLFASWLILLLSWVGHVK GPBA HUMAN

312 QASWVRPGVLWDVALVAVAALGLAL GPIX HUMAN

313 FRLVSRRDYASEAIKGAWGIDLGT GR75 HUMAN

314 EDFKAKKKELEE I VQP 11 SKLYGSA GR78 HUMAN

315 JQPKRYKGFS IDVLDALAKALGFKY GRD1 HUMAN

316 FQGKKNMTLAGRLAGPLFQTLIVAW GRIP HUMAN

317 QKGHKSQREELDAILFIFEKILQLL GRIP HUMAN

318 VKTQMQHGL I S IAARTVI THLVNHL GRIP HUMAN

319 VPTWDTIRDEEDVLDELLQYLGVTS GRIP HUMAN 320 HEHIERRRKLYLAALPLAFEALIPN GRLF HUMAN

321 SVWSEKGQVEVFALRRLLQWEEPQ GRWD HUMAN

322 MRPEDRMFHIRAVILRALSLAFLLS HA2Q HUMAN

323 SHTRGPEQQVKAILSELLQRENRVL HAPI HUMAN

324AMSKSRNPRLQTAAQELLEDLRTLE HBP2 HUMAN

325 ALGHKRNSGVPAFLTPLLRNIIISL HD HUMAN

326 ENEDKWKRLSRQIADIILPMLAKQQ HD HUMAN

327 FGDAALYQSLPTLARALAQYLWVS HD HUMAN

328 GLLKLQERVLNNWIHLLGDEDPRV HD HUMAN

329 NLSSRETSSLESFVRRVANIARTNA HED1 HUMAN

330 ΪLPRPPMLLALLLATLLAAMLALLT HEXB HUMAN

331 DQRKMLLVGSRKAAEQVIQDALNQL HIP1 HUMAN

332 GIALAYGSLLLMALLPIFFGALRSV HM13 HUMAN

333 PNWKLKVSNLKMVLRSLVEYSQDVL H0K2 HUMAN

334 ΪDQLAQLNTVFQAL PTAAWGATLRA HPS6 HUMAN

335 LLSSGRPKAVLQAVGQLVQKEQWDR HPS6 HUMAN

336 QKHAQQQKWNKL I QFL I SLVQSNR HSF1 HUMAN

337 AKHAQQQQVIRKI VQF IVTLVQNNQ HSF2 HUMAN

338 LNAARR YLGIEDLAGKVFVTSGLGG HUTU HUMAN

339 FEKMISGMYLGEIVRHILLHLTSLG HXK3 HUMAN

340 IPANLSQNLEAAAATQVAVSVPKRR I4G1 HUMAN

341 IFHKNVFHYLMAFLRELLKNSAKNH I5P2 HUMAN

342 FEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKG ICE9 HUMAN

343 KNSEATLPIAVRFAKTLLANSSPFN IF HUMAN

344 SGKVSADNTVGRFLMSLVNQVPKIV IF35 HUMAN

345 NPKIWNVHSVLNVLHSLVDKSNINR IF3I HUMAN

346 LHGVMEYDLSLRFLENALAVSTKYH IF3X HUMAN

347 ENGMYGKRKLLELIGHAVAHLKKAD IFT2 HUMAN

348 YRRKDEPDKAIELLKKALEYIPNNA IFT2 HUMAN

349 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE IKAP HUMAN

350QLVKLLGASELPIVTPALRAIGNIV IMA2 HUMAN

351 SSNVENQLQATQAARKLLSREKQPP IMA2 HUMAN

352PLLSHQEVKVQTAALRAVGNIVTGT IMA4 HUMAN

353 MRKEEPSNNVKLAATNALLNSLEFT IMB1 HUMAN

354 PPEHTSKFYAKGALQYLVPILTQTL IMB1 HUMAN

355 PYYDLFMPSLKHIVENAVQKELRLL IMB3 HUMAN

356 TAAEEARQMAAVLLRRLLSSAFDEV IMB3 HUMAN

357 JIAYRSRKRLETFLSLLVQNLAPAE INPP HUMAN

358 FVEPHKNMEVMGFLHGI FERLKQFL IP11 HUMAN

359LPVPQGPNPWWLQQVFQLIQKVL IP13 HUMAN

360 NRERQKLMREQNILKQIFKLLQAPF IP3R HUMAN

361 NRERQKLMREQNILAQVFGILKAPF IP3S HUMAN

362 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF IP3T HUMAN

363 NRERQKLMREQNILKQVFGILKAPF IP3T HUMAN

364 ETIQGLGAASAQFVSRLLPVLLSTA IP04 HUMAN 365 HPAQEHFPKLLGLLFPLLARERHDR IPO4 HUMAN

366 LLRNPSSPRAKΞLAVSALGAIATAA IPO4 HUMAN

367 LMASPTRKPEPQVLAALLHALPLKE IPO4 HUMAN

368 SKALLKNRLLPPLLHTLFPIVAAEP IPO4 HUMAN

369 YMQAVNRERERQWMAVLEALTGVL IPO4 HUMAN

370DQYRQKEYVAPRVLQQAFNYLNQGV IPO8 HUMAN

371 ILADLNLSVSPFLLGRALWAASRFT IPO9 HUMAN

372 LGFENLVFSIFΞFVHALLENSKFKS IPO9 HUMAN

373 PERWTNIPLLVKILKLI INELSNVM IPO9 HUMAN

374RTSEFTAAFVGRLVSTLISKAGREL IPO9 HUMAN

375 LYNYASNQREEYLLLRLFKTALQEE IQG 1 HUMAN

376 NRGARGQNALRQILAPWKEIMDDK IQG1 HUMAN

377 YQDLLQLQYEGVAVMKLFDRAKVNV IQG1 HUMAN

378 LYNYASNQREEYLLLKLFKTALEEE IQG2 HUMAN

379 NRGARGQNTLRQLLAPWKEI IDDK IQG2 HUMAN

380 WS PRKLPSSASTFLSPAFPGSQTHS IRA1 HUMAN

381 WLGGGWPDAIVLAEEALDKAQEVL IRBP HUMAN

382 ΪKPLERKLILVQVI PWARMIYEMF IRF6 HUMAN

383WRYMLLIFSLAFLASWLLFGIIFWV IRKC HUMAN

384 WRWMMLVFSAS FWHWLVFAVLWYV IRKD HUMAN

385 ALVI FEMPHLRDVALPALGAVLRGA IRR HUMAN

386 VGWI IAISLLVGILIFLLLAVLLWK ITA9 HUMAN

387 SNSIYPWSEVQTFLRRLVGKLFIDP ITAG HUMAN

388 PIWIIVGSTLGGLLLLALLVLALWK ITAH HUMAN

389 QGFTYTATAIQNWHRLFHASYGAR ITAX HUMAN

390 ARPRPRPLWVTVLALGALAGVGVGG ITB3 HUMAN

391 LWLLS VMGAI LLI GLAALL I WKLL ITB3 HUMAN

392 MAGPRPSPWARLLLAALISVSLSGT ITB4 HUMAN

393 AARQRQEIAAARAADALLKAVAASS JPH4 HUMAN

394 LSTLRYADRAKRIVNHAWNEDPNA K13A HUMAN

395 SNINKSLTTLGLVISSLADQAAGKG K13A HUMAN

396 LSTLRYADRAKHIVNNAWNEDPNA K13B HUMAN

397 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY K13B HUMAN

398STSFRGGMGSGGLATGIAGGLAGMG K1CR HUMAN

399 ΪFDVNIVEEELGIISRAVKHLFKSI K21A HUMAN

400 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE K406 HUMAN

401 SLVHRLTRDAPLAVLRAFKVLRTLG K406 HUMAN

402 YLSVKQPVKLQEAARSVFLHLMKVD K406 HUMAN

403 KNVMEFLAPLKPVAIRIVRNAHGNK K682 HUMAN

404 GMRRGNMGHLTRIANAWQNLERGP K685 HUMAN

405 RQDVLHWLNEEKVIQRLVELIHPSQ K685 HUMAN

406 EELVSIPWKVLKWAKVIRALLRIL K830 HUMAN

407 5FIATPFIKLFQLIYYLWAILKNI K830 HUMAN

408 TE I LQHPERARDALRVLLHLVE KSL KA43 HUMAN

409 RQDWNWLNEEKIVQRLIEQIHPSK KB15 HUMAN 410 ALHLATEMEELGLVTHLVTKLRANV KBF2 HUMAN

411 NSQWRQDMSISLAALELLSGLAKVK KC19 HUMAN

412EKGFYTERDASRLIFQVLDAVKYLH KCC1 HUMAN

413 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH KCC4 HUMAN

414 LQEFNARRKLKAAVKAWASSRLGS KCC4 HUMAN

415 YALKRSFKELGLLLMYLAVGIFVFS KCF1 HUMAN

416 LLRLASTPDLRRFARSALNLVDLVA KCV2 HUMAN

417 STYFDMNLFLDIILKTVLENSGKRR KE34 HUMAN

418 RGGWRQYWSSSFLVDLLAVAAPW KE72 HUMAN

419 SALESTEEKLHDAASKLLNTVEETT KF11 HUMAN

420QENEPTVGVIPRVIQLLFKEIDKKS KF4A HUMAN

421 ELSNHQKKRATEILNLLLKDLGEIG KF5C HUMAN

422 EATAFGLGKEDAVLKVAVKMLKSTA KFMS HUMAN

423 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS KFP3 HUMAN

424 MEGKLHDPQLMGI I PRIARDI FNHI KINN HUMAN

425 SSAIIDHIFASKAWNAAIPAYHLR KIST HUMAN

426 YLEVGLSGLSSKAAKDVLGFLRWR KNC1 HUMAN

427 LEKLGYMDLASRLVTRVFKLLQNQI LCAP HUMAN

428 EAPAYHLILEGILILWIIRLLFSKT LCB1 HUMAN

429 KTPSσiKLTINKLLDMAAQIAEGMA LCK HUMAN

430 ARGYVQDPFAALLVPGAARRAPLIH LCM2 HUMAN

431 DSLYFRLKTAGRLARAAVWΞVDFPD LCM2 HUMAN

432 PLPSLRFLEELRLAGNALTYIPKGA LGR5 HUMAN

433 FWKAFWNITEMEVLSSLANMASATV LIPS HUMAN

434 VT I TLDLRQVFQVAYVI I KAANAPR LMA1 HUMAN

435 ERTNTRAKSLGEFIKELARDAEAVN LMA2 HUMAN

436 ETQKEIAEDELVAAEALLKKVKKLF LMA2 HUMAN

437 QSQAHQQRGLFPAVLNLASNALITT LMA2 HUMAN

438 NSARDAVRNLTEWPQLLDQLRTVE LMA4 HUMAN

439 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ LMA4 HUMAN

440 5QPLPWELRLGLLLSVLAATLAQAP LMB2 HUMAN

441 ALDEKVRERLRMALERVAVLEEELE LPA3 HUMAN

442 DNTKSQLAMSANFLGSVLTLLQKQH LPC4 HUMAN

443 LLGGIKVKLLRGLLPNLVDNLVNRV LPC4 HUMAN

444 KGNKSSYHRLSELVEHVFPLLSKEQ LPN2 HUMAN

445 KNHKΞTYERLGΞWELLFPPVARGP LPN3 HUMAN

446 TVLDQQQTPSRLAVTRVIQALAMKG LPRC HUMAN

447 PGPLPSLPLEPSLLSGWQALRGRL LR10 HUMAN

448 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVDLYL LR1B HUMAN

449 AAKYRDHVTATQLIQKIINILTDKH LRBA HUMAN

450 VSNMS ITERLEHALEKAAPLLRE I F LRBA HUMAN

451 LSLLLLVTSVTLLVARVFQKAVDQS LYN HUMAN

452 DHLSQSKVIETQLAKPLFDALLRVA LYST HUMAN

453 SQAELVQKGSELVALRVALREARAT LZT2 HUMAN

454 SRHHHGSSIAGGLVKGALSVAASAY M 172 HUMAN 455 GMAAGLYSELFTLLVSLVNRALKSS M18A HUMAN

456 AWFSYI ATLLYWHAVFSLIRWKS MAL HUMAN

457 PPLNTIRDVSLKIAEKIVKDAYQEK MAOX HUMAN

458 TFNDDIQGTASVAVAGLLAALRITK MAOX HUMAN

459 KRKTTAAGGESALAPSVFKQAKD KV MAP2 HUMAN

460KGKIKVIKKEGKAAEAVAAAVGTGA MAPB HUMAN

461 FHPAVRNSSEVKFAVQAFAALNSNN MC3A HUMAN

462RRLGGLASQEPGAIIELFNSVLQFL MC3A HUMAN

463 PPAAARAGGSPTAVRSILTKERRPE MCDL HUMAN

464 RFSWDMAALGGVLGALLLLALLGL MCDL HUMAN

465 RGTVARGAGAGVWKDAAAPSQPLR MCDL HUMAN

466 AAFMKKYIHVAKIIKPVLTQESATY MCM3 HUMAN

467 DLRRKNEKRANRLLNNAFEELVAFQ MCM3 HUMAN

468 PFPSWRFPGLLLAAMVLLLYSFSDA MCP HUMAN

469 DVSTLHVQKI ISAISELLERLKSYG MDN1 HUMAN

470 LATHRSTAKLLSVLAQVFTELAQKG MDN 1 HUMAN

471 SLRNFYSHSLSGAVSNVFKILQPNT MDN 1 HUMAN

472 VTS IAKAPAVQDLLTRLLQALHIDG MDN1 HUMAN

473 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL MED4 HUMAN

474 RLRHWWAIALTTAVTSAFLLAKVIL MENT HUMAN

475 MNMAKTSQTVATFLDELAQKLKPLG MEPD HUMAN

476 KDYTKVDRSAAYAARWVAKSLVKGG METK HUMAN

477 KDYTKVDRSAAYAARWVAKSLVKAG METL HUMAN

478 VS PLKHFVLAKKAITAI FDQLLEFV MFN1 HUMAN

479 ΪYFPMIFRKAREFIEILFGISLTEV MGC3 HUMAN

480RKPRFMSAWAQVIIASILISVQLTL MGR1 HUMAN

481 LKTAADRQAEDQVLRKLVDLVNQRD MIL1 HUMAN

482 YLMVMIGMFSFIIVAILVSTVKSKR MIR1 HUMAN

483 SSQPLTLEHVRYFLYQLLRGLKYMH MK07 HUMAN

484 GARLALDEHVQFLVYQLLRGLKYIH MK11 HUMAN

485 VKKPAGPSISKPAAKPAAAGAPPAK MLEY HUMAN

486 RGERLHMFRVGGLVFHAIGQLLPHQ MLL2 HUMAN

487 WYVLVI ISDLMTI IGSILKMEIKAK MLN2 HUMAN

488 SGKPRRKSNLPIFLPRVAGKLGKRP MLPH HUMAN

489 KQKHFNEREASRWRDVAAALDFLH MNK1 HUMAN

490 KHLERRDAESLKLLKEAIWEEKQGT M0C3 HUMAN

491 VYRKMPEHVLGRIAVAWKGLTYLW MPK5 HUMAN

492DLIFLRGIMESPIVRSLAKVIMVLW MPP2 HUMAN

493 STATNPQNGLSQILRLVLQELSLFY MPP4 HUMAN

494 ARRRLWGFSESLLIRGAAGRSLYFG MPPB HUMAN

495 YYAKAFSKDLPRAVEILADIIQNST MPPB HUMAN

496 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA MRIP HUMAN

497 AVSSAHRAASLEAVSYAIDTLKAKV MS2L HUMAN

498DEKKRRLMGLPSFLTEVARKELENL MSH5 HUMAN

499 SPSLQEKLKSFKAALIALYLLVFAV MSRE HUMAN 500 SVRPLEFTKVKTFVSRIIDTLDIGP MTN3 HUMAN

501 SVRPQNFELVKRFVNQIVDFLDVSP MTN4 HUMAN

502 EEPYRRRNQILSVLAGLAAMVGYAL MTX1 HUMAN

503 VQLRRGL VGSRPWTRWIKAQGLV MU5B HUMAN

504 LVDKGTEDKWDWRNLVFHLKKGY MX1 HUMAN

505 KITINSHTTAGEWEKLIRGLAMED MY10 HUMAN

506 AGKQGLGPPSTPIAVHAAVKSKSLG MYCD HUMAN

507 VS S TVGAAAVSALAGGALNGVFGRR MYCT HUMAN

508 GKTVNTKRVIQYFATIAVTGEKKKE MYH4 HUMAN

509 VTKGQTVQQVYNAVGALAKAVYDKM MYH 1 HUMAN

510 VTKGQTVEQVSNAVGALAKAVYEKM MYH2 HUMAN

51 1 VTKGQTVQQVYNAVGALAKAIYEKM MYH4 HUMAN

512 GKTVNTKRVIQYFATIAVTGEKKKD MYH8 HUMAN

513 VTKGQTVQQVYNAVGALAKAVYEKM MYH8 HUMAN

514 EQLKRNSQRAAEALQSVLDAEIRSR MYHD HUMAN

515 QAAVQLALRAGQI IRKALTEEKRVS MYO2 HUMAN

516 IVWRRFKWVIIGLLFLLILLLFVAV MYOF HUMAN

517 PLDDLDREDEVRLLKYLFTLIRAGM N 107 HUMAN

518 IVLKNHHSRLSDLVNTAILIALNKR N 133 HUMAN

519 HEAQLSEKISLQAIQQLVRKSYQAL N 155 HUMAN

520 QGMSRVASVSQNAIVSAAGNIARTI N 155 HUMAN

521 YRRAAEKWEVAEWLEVFYKLLRDY N205 HUMAN

522 LFTFQKHVFSPIFI IGAFVAIFLGR NAH7 HUMAN

523 TSGRRWREISASLLYQALPSSPDHE NAL1 HUMAN

524 AEKQPPFTLIRSLLRKVLLPESFLI NAL5 HUMAN

525 AENMS ITAKLERALEKVAPLLREIF NBEA HUMAN

526 STVKIQNPMILKWATLLKNSTPSA NBEA HUMAN

527 KGGVGKS TFSAHLAHGLAEDENTQ I NBP1 HUMAN

528 FIQEFPGSPAFAALTSIAQKILDAT NBP2 HUMAN

529 WRGPKKNALIKQFVSDVAWGELDYL NBP2 HUMAN

530 SARDLQNLMSWRFIMDLVSSLSRTY NEP HUMAN

531 SKLPKDQQDAKHILEHVFFQWEFK NGD5 HUMAN

532EPEPITASGSLKALRKLLTASVEVP NIBA HUMAN

533 GRVLYREDTSPAVLGLAARYVRAGF NID2 HUMAN

534 RTKRLHWSRLLFLLGMLI IGSTYQH NKX1 HUMAN

535 YKFGSRHSAESQILKHLLKNLFKIF NNMT HUMAN

536 IVDNGVAPPARRLLRLWRFAPQVE NPHN HUMAN

537 ;PVSARVIKALQWDHAFGMLMEGL NPP3 HUMAN

538 SPESDAPGPVYAAASLAVSWVLRSV NPR1 HUMAN

539 SPPALPLASSFTALLQAAYESQALR NPR1 HUMAN

540TMPHLSMQQVLLAAKQVLLYLRSTV NPR1 HUMAN

541 TQDMRLTFTLALFIAKAALQILKPE NPR1 HUMAN

542 VLQQRLGELERQLLRKVAELEDEKS NPX2 HUMAN

543 ISPLIQKSAANWLFDIFVNILTHN NRDC HUMAN

544 VQGNVTSTESMDFLKYWDKLNFKP NRDC HUMAN 545 GFKLLWILLLATLVGLLLQRLAARL NRM2 HUMAN

546 VYVRDLGHVALYVVAAVVSVAYLGF NRM2 HUMAN

547 RKPGNVLKTLEPILITIIAMSALGV NRP1 HUMAN

548 DYVPIGPRFSNLVLQALLVLLKKAP NSF HUMAN

549 YMIHHGDWFSGKAVGLLVLHLSGMV NSMA HUMAN

550 ILWSGWASNSNYALIGALRAVAQTI NU1M HUMAN

551 IRFLKGMGYSTHAAQQVLHAASGNL NUB1 HUMAN

552 KQIQRTKRGLEILAKRAAETWDPE NUB1 HUMAN

553 ELLNMYVGESERAVRQVFQRAKNSA NVL HUMAN

554 RLS LVAGAYVAGL I SALVRTVSAFT O9Q1 HUMAN

555 WRRLPGAGLARGFLHPAATVEDAAQ ODBB HUMAN

556 IVFNAHIKGVETIANDWSLATKAR 0DP2 HUMAN

557 DFLNNPFKQENVLARMVASRITNYP 0FD1 HUMAN

558 NLRRDVYIRIASLLKTLLKTEEWVL 0FU2 HUMAN

559AAETLLSSLLGLLLLGLLLPAΞLTG 0S9 HUMAN

560 KRENPQLKQIEGLVKELLEREGLTA OS9 HUMAN

561 KRVAYARVPSKDLLFS IVEEETGKD OTOF HUMAN

562 TVPVFFNQAERRAVLQAARMAGLKV OXRP HUMAN

563 VGGATRVPRVQEVLLKAVGKEELGK OXRP HUMAN

564 DQKAYKEGKLQKALEDAFLAIDAKL P2CG HUMAN

565TKYKMGGD IANRVLRSLVEASSSGV P2G4 HUMAN

566 NRPSIPYAFSKFLLPIWRYLADQN P4R1 HUMAN

567HRSPQLLLELDNVISVLFQNSKERG P52K HUMAN

568 HRHMRTiREVRTLVTRViTDVYYVD P531 HUMAN

569 AEQFAPPDIAPPLLIKLVEAIEKKG P85A HUMAN

570 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA PARC HUMAN

571 VAMGEMEADVQALVRRAARQLAESG PARC HUMAN

572 VELLTNQVGEKMVWQALRLLYLLM PARC HUMAN

573 HPPYLVSKELMSLVSGLLQPVPERR PASK HUMAN

574 STMSPLGSGAFGFVWTAVDKEKNKE PASK HUMAN

575 TSRRRNVTFSQQVANILLNGVKYES PAST HUMAN

576 LFTLDEQSGLLTVAWPLARRANSW PC16 HUMAN

577KVTDHGKPTLSAVAKLIIRSVSGSL PC17 HUMAN

578 5HINAATGTSASLVYRLVSKAGDAP PCH9 HUMAN

579 NGETLVFEESNWFI INVI KLVWRYG PCL1 HUMAN

580KADVNLSHSERGALQDALRRLLGLF PCN2 HUMAN

581 NQRKAAHSAELEAVLLALARIRRAL PCN2 HUMAN

582 ISVQLKKTSEVDLAKPLVKFIQQTY PD6I HUMAN

583 NRS IAQMREATTLANGVLASLNLPA PD6I HUMAN

584 PAKTMQGSEWNVLKSLLSNLDEVK PD6I HUMAN

585 VTEFNSQTSAKIFAARILNHLLLFV PDA2 HUMAN

586 RLALFPGVALLLAAARLAAASDVLE PDA3 HUMAN

587 YQGGRTGEAIVDAALSALRQLVKDR PDA6 HUMAN

588 F S EMLAAS FS I AWAYAI AVSVGKV PEND HUMAN

589 RHKIPVPIPIEVIVTIIATAISYGA PEND HUMAN 590 ELLSKYIGASEQAVRDIFIRAQAAK PEX1 HUMAN

591 GPGPPQLLVSRALLRLLALGSGAWV PEX6 HUMAN

592 EFFTHLD KRSLPALTNIIKILRHDI PH4H HUMAN

593 FES I GKFGLALAVAGGWNS AL YNV PHB HUMAN

594 MDRSSKRRQVKPLAASLLEALDYDS PHFE HUMAN

595 TVTWGNYGKSYSVALYLVRQLTSSE PIA4 HUMAN

596 TTAKRRLKQSVHLARRVLQLEKQNS PIBF HUMAN

597 RETAEPFLFVDEFLTYLFSRENS IW PIG2 HUMAN

598 LVSTLVPLGLVLAVGAVAVGVARAR PIGR HUMAN

599 EVARGKRAALFFAAVAIVLGLPLWW PIGS HUMAN

600FTSFDQVAQLSSAARGLAASLLFLL PKD1 HUMAN

601 GAWARWLLVALTAATALVRLAQLGA PKD1 HUMAN

602 LHAAVTLRLEFPAAGRALAALSVRP PKD1 HUMAN

603 RMVASQAYNLTSALMRILMRSRVLN PKD1 HUMAN

604 ESSTNREKYLKSVLRELVTYLLFLI PKD2 HUMAN

605 LLHSRNEGTATYAAAVLFRISEDKN PLAK HUMAN

606 RQFRTGKVTVEKVIKILITIVEEVE PLE1 HUMAN

607 RQFRTGRITVEKIIKIIITWEEQE PLE1 HUMAN

608 5PGPRFLLLLPLLLPPAAS ASDRPR PLO3 HUMAN

609 DILKPGGGTSGGLLGGLLGKVTS VI PLUN HUMAN

61 O VLRGLDITLVHDIVNMLIHGLQFVI PLUN HUMAN

611 LGQVPLIVGILLVLMAWLASLIYR PM17 HUMAN

612 PDKRQILLQEEKLLLAVLKTSLIGM PMS2 HUMAN

613 5LNPSLMAPSQFAAGG ALLSLNPGT P021 HUMAN

614 ITLGYTQADVGLILGVLFGKVFSQK P05L HUMAN

615 ITLGYTQADVGLILGVLFGKVFSQT P05M HUMAN

616 LFSKYTNSKIPYFLLFLIFLITVYH PP3A HUMAN

617 DFVDRGFYΞVETFLLLLALKVRYPD PP4C HUMAN

618 LLLARAASLSLGFLFLLFFWLDRSV PPAP HUMAN

619 LVQIIKKTESDAALHPLLQEIYRDM PPAR HUMAN

620QTWLSALRPSGPALSGLLSLEAEEN PPCS HUMAN

621 SMEGVTFLQAKQIALHALSLVGEKQ PPO4 HUMAN

622 WGTTTTTPSPSAIKAAAKSAALQV PRCC HUMAN

623 NDLTRNRFFENPALWELLFHS IHDA PRES HUMAN

624 PPSGIHLSASRTLAPTLLYSSPPSH PS11 HUMAN

625 KRLFNVDRHVGMAVAGLLADARSLA PSA3 HUMAN

626 RSNFGYNIPLKHLADRVAMYVHAYT PSA3 HUMAN

627 VLYEDEGFRSRQFAALVASKVFYHL PSD1 HUMAN

628 HLLRYGEPTLRRAVPLALAL I SVSN PSD2 HUMAN

629 5YGHMWS QNATNLVS S LLTLLKQLE PTN5 HUMAN

630 KSLLDPKVAARLAVAEALTNLVFAL PUR4 HUMAN

631 AQVGLGVGTSLLALGVI I IVLMYRR PXB1 HUMAN

632 TRLLSMKGTLQKFVDDLFQVILSTS PXB1 HUMAN

633 LWPLPGRDLLLVARGLAGKLSAGV PXB3 HUMAN

634 5ELSARQMHLARFLRMLLRLADEFG RA51 HUMAN 635 IDLVSKLLYSRGLLIDLLIKSNVSR RAE1 HUMAN

636 IDLVSKLLYSQGLLIDLLIKSDVSR RAE2 HUMAN

637 AI FTGHSAWEDVAWHLLHESLFGS RBB7 HUMAN

638 EHPAIRTLSARAAAAFVLANENNIA RBP6 HUMAN

639 MARGGRGRRLGLALGLLLALVLAPR RCN 1 HUMAN

640 FEEYLRALDVNVALRKIANLLKPDK RET1 HUMAN

641 MEDYLQALNISLAVRKIALLLKPDK RET5 HUMAN

642 HSYVSVKAKVSSIAQEILKWAEKI RGE5 HUMAN

643 RLLWRLPAPVLWLRYLFTFLNHLA RHG4 HUMAN

644 PKPWPKTNVKALVPNLLRAIEAGI RHG5 HUMAN

645 YPRKFNETQIKQALRGVLESVKHNL RHG5 HUMAN

646 KKNFESLSEAFSVASAAAVLSHNRY RIB2 HUMAN

647 VSTTVAKAMAREAAQRVAESSRLEK RIP2 HUMAN

648 DPVLRKKNGATPFILAAIAGSVKLL RN5A HUMAN

649 AHKATNKSSETLALLEILKHIAITE RP1 HUMAN

650 LNYVASQPKLAPFVIQALIQVIAKI RP17 HUMAN

651 YGDNHFDNVLQAFVKMLLSVSHSDL RP17 HUMAN

652 WVSVLLKKTEKAFLAHLASAVAELR RPL1 HUMAN

653 FMKL VGMPYLHEVLKPVI SRVFEEK RSG4 HUMAN

654 QHADPQTSRSLLLLAKAVQSIGNLG RSG4 HUMAN

655 INLKRTWEKLLLAARAIVAIENPAD RSSA HUMAN

656 SQGMVGQLAARRAAGWLEMIREGK RU V2 HUMAN

657 EQGKRNFSKAMSVAKQVFNSLTEYI RYR1 HUMAN

658 IDEASWMKRLAVFAQPIVSRARPEL RYR1 HUMAN

659 NYLSRNFYTLRFLALFLAFAINFIL RYR1 HUMAN

660 QAGKGEALRIRAILRSLVPLEDLVG RYR1 HUMAN

661 RVRRLRRLTAREAATAVAALLWAAV RYR1 HUMAN

662 TAAAGATARWAAAGRALRGLSYRS RYR1 HUMAN

663 VEKSPHEQEIKFFAKILLPLINQYF RYR1 HUMAN

664 ARNFYNMRMLALFVAFAINFILLFY RYR2 HUMAN

665 DTPS IEKRFAYSFLQQLIRYVDEAH RYR2 HUMAN

666 EQGQRNFSKAIQVAKQVFNTLTEYI RYR2 HUMAN

667 ΪEHFPYEQEIKFFAKWLPLIDQYF RYR2 HUMAN

668EESGMAWKEILNLLYKL LAALIRGN RYR3 HUMAN

669 HYLARNFYNLRFLALFVAFAINFIL RYR3 HUMAN

670QTGKGEAIRIRSILRSLVPTEDLVG RYR3 HUMAN

671 TEKSPRDQEIKFFAKVLLPLVDQYF RYR3 HUMAN

672 TLYQQARLHERGAAEMVLQMISASK RYR3 HUMAN

673 FLSGQGLAGIFAALAMLLSMASGVD S292 HUMAN

674 SNSLAYYNMANGAVIHLALKERGGR S3A1 HUMAN

675 jQLLSGHPPAS EAVASVLS FLYDKK S3T2 HUMAN

676QISLEGYEKALEFATLAARLSTVTG S3T2 HUMAN

677 HTSTLAAMKLMTALVNVALNLS INM SA2 HUMAN

678 APPVAAGVGAVLAAGALLGLVAGAL SBN1 HUMAN

679 DMVKSKWGLALAAWTVLSSLLMSV SCAP HUMAN 680 GMTWSHGLSVSKVLHKAFVEVTEEG SCC2 HUMAN

681 AGKSGGSAGEITFLEALARSESKRD SEN6 HUMAN

682 iLQKYiERiiTRFAPMLVPYiwQNQ SGT1 HUMAN

683 DAQLDYHRQAVQILDELAE KLKRRM SH31 HUMAN

684 FKKDPPLAAVTTAVQELLRLAQAHP SKIW HUMAN

685 RGLGVHHSGILPILKEIVEMLFSRG SKIW HUMAN

686 RRIDLSNNQIAEIAPDAFQGLRSLN SLT1 HUMAN

687 SSAGPVRPELWLLLWAAAWRLGASA SLT1 HUMAN

688VTVLFALVLSGALIILVASPLRALR SM4A HUMAN

689 PGGMNRKTQETAVAMHVAANS IQNR SMF1 HUMAN

690TSTWLDDVEERLFVATALLPEETET SNE1 HUMAN

691 INSQLARHTSPSVISDLFTDIKKGH SNE2 HUMAN

692 QHVDQRRQGLEDFLRKVLQNALLLS SNXA HUMAN

693 PD I PEWRKD I GNVI KRALVKVTS VP S0R3 HUMAN

694 LQHRHRLPDLQAILRRILNEEETSP SP90 HUMAN

695 HNNRRLQAESESAATRLLLASKQLG SPA1 HUMAN

696 RAAPRGPGAELQAAGSLVWGVRAAP SPA1 HUMAN

697 RNVFFS PMS I S SALAMVFMGAKGST SPB8 HUMAN

698 QLAKQKAQEAEKLLNNVISKLLPTN SPC2 HUMAN

699 SLLDKHSQI INKFVNSVINTLKS TV SPC2 HUMAN

700 IQSLTMYPRLGGFVMNILSRLIMKQ SPK HUMAN

701 VHPAISS INLTTALGSLANIARQRP SPK HUMAN

702 PFYDPEGGSITQVARWIERIARKG SP01 HUMAN

703 PLKLSRTPALLALALPLAAALAFSD SP01 HUMAN

704 MVGPAPRRRLRPLAALALVLALAPG SPUF HUMAN

705 KTGSFKIRGALNAVRSLVPDALERK SRR HUMAN

706 KHGPGRWWLAAVLIGLLLVLLGIG ST14 HUMAN

707 SNRGLTKENLVFLAQKLFNNS SSHL ST5B HUMAN

708 DASKALLGRLTTLIELLLPKLEEWK STA2 HUMAN

709 KGVDLRNAQVTELLQRLLHRAFWE STA2 HUMAN

710 PAAGLGPGHARHVLRSLVNQSVQDG STRC HUMAN

71 1 PDNTGRGYVLRRILRRAVRYAHEKL SYA HUMAN

712 RRPIMSNHTATHILNFALRSVLGEA SYA HUMAN

713 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP SYM HUMAN

714 YHQLLEKVRIRDALRSILTISRHGN SYM HUMAN

715 FLKGVLVFLEQALIQYALRTLGSRG SYS HUMAN

716 WEVGVYAAGALALLGIAAVSLWKLW SYTC HUMAN

717 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP SYTC HUMAN

718 TRPWLLDPKILKFWFIVAVLLPVR T10D HUMAN

719 TWKDRFPGYLMNFASILFMIALTFS T16B HUMAN

720 EWKLHPHELNNLLSKVLIYLRSAN T172 HUMAN

721 YALAVRQDVINTLLPKVLTRI IEGL T172 HUMAN

722 MADPDVLTEVPAALKRLAKYVIRGF T2EA HUMAN

723 FSQGKMYGYVDTLLTMLAMLLKVAM T3C3 HUMAN

724 KLQEIMMHVIWAALAFAAIQLLGML T4S8 HUMAN 725 DTEFAKQTSLDAVAQAWDRVKRIH TAB1 HUMAN

726 LEFAIMRIEALKLARQIALASRSHQ TAC2 HUMAN

727 RANTHIRDFLQVFIYRLFWKSKDRP TAF1 HUMAN

728 DIERPTYTNLNRLISQIVSSITASL TBA8 HUMAN

729 QTI IAGWREATKAAREALLSSAVDH TCPB HUMAN

730 LDTYLGKYWAIKLATNAAVTVLRVD TCPQ HUMAN

731 MFGAFS INPAMMAAAQAALQSSWGM TDBP HUMAN

732 QKLYIPRSTATAALGAAARLATSRS TDR5 HUMAN

733 EEEEKVSQPEVGAAIKI IRQLMEKF TE2I HUMAN

734 LSKKLIYFQLHRALKMIVDPVEPHG TF1 B HUMAN

735 JSRGTTAGSSGDALGKALASIYSPD TFE2 HUMAN

736LPSIPAQPISADIASRLLRKLKGPV TFR2 HUMAN

737 NLHKVLQGRLPAVAQAVAQLAGQLL TFR2 HUMAN

738 QRDAWGPGAAKSAVGTAILLELVRT TFR2 HUMAN

739 EAFSHFTKIITPAITRWDFAKKLP THB2 HUMAN

740 EGQSQQFSVSENLLKEAIRAI FPSR THYG HUMAN

741 PASLGKWKKEPELAAFVFKTAWLV TIAM HUMAN

742 RLPSSWALFSPLLAGLALLGVGPVP TIP HUMAN

743 AIKKKLVQRLEHAAKQAAASATQTI TLN1 HUMAN

744 JQLLRGVGAAATAVTQALNELLQHV TLN1 HUMAN

745 QQLAAFS KRVAGAVTEL I QAAEAMK TLN2 HUMAN

746 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV TLN2 HUMAN

747 KVLNLAYNKINKIADEAFYGLDNLQ TLR5 HUMAN

748 ΪREKFKSRGVGELARLALVISELEG TM26 HUMAN

749 QGHQFLREREEHLLEQLAKLEQELT TM26 HUMAN

750LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF TMS3 HUMAN

751 RKARGYLRLVPLFVLLALLVLASAG TMS6 HUMAN

752 YAHPQQKVAVYRALQAALAESGGSP TRAD HUMAN

753 YVNYVLSEKSSTFLMKAAAKWESK TRF1 HUMAN

754 AAPAPGAPLLPLLLPALAARLLPPA TRFM HUMAN

755 THIKAPEQQVKNILNELFQRENRVL TRIO HUMAN

756 PHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYL TRKB HUMAN

757 QHALRNRRLLRKVIKAAALEEHNAA TSC1 HUMAN

758 KSDRLISLQSASWYDLLTIALGRR TT7B HUMAN

759 QMKAKRTKEAVEVLKKALDAI SHSD TTC6 HUMAN

760LARQINHPELHMVLSNLAAVLMHRE TTCJ HUMAN

761 VAPHGRGPGLLPLLAALAWFSRPAA TTCJ HUMAN

762 HSRTSWVPWLGVLTALVTAAALAL TYO3 HUMAN

763 PLPLPPPPRLGLLLAALASLLLPES TYO3 HUMAN

764 WSWLLGAAMVGAVLTALLAGLVSLL TYRO HUMAN

765 LLHDDRGPVLEALVARAIRNIEMTQ U520 HUMAN

766 RGGGQ 11 PTARRWYS AFLMATPRL U5S1 HUMAN

767LFYQDKLKSLHQLLEVLLALLDKDV UB24 HUMAN

768 YGSGPKRFPLVDVLQYALEFASSKP UB25 HUMAN

769 NRKFVDPSAALDLLKGAFRSSEEQQ UB28 HUMAN 770 KIEKVFSKLLYPIVRGAALSVLKYM UB35 HUMAN

771 RFLNLLMNDAIFLLDEAIQYLSKIK UB4A HUMAN

772DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT UBA1 HUMAN

773 GIPPVMRAQSKRIVGQI IPAIATTT UBAL HUMAN

774 PVDKVAAMREFRVLHTALHSSSSYR ULSB HUMAN

775 AARFAKTKEEVEAAKAAALLAKQAE UXD2 HUMAN

776 HLPEKQDTFAEKLVTQIIKNLQVKI V13A HUMAN

777 MLNRQDPFTVHMAARI IAKLAAWGK VATH HUMAN

778 ALIEGKNKTVSTLVIQAANVSALYK VG R2 HUMAN

779 EVITDNLPGSIRAWNIFL VAKALL VIAA HUMAN

780 VRWLQESRRSRKLILFIVFLALLLD VMT2 HUMAN

781 FVIATTRQRLFQFIGRAAEGAEAQG VP18 HUMAN

782 WIEMGSRLDARQLIPALVNYSQGGE VP18 HUMAN

783 MRDVNKKFSVRYFLNLVLVDEEDRR VP26 HUMAN

784 NSFKMKMSVILGI IHMLFGVSLSLF VPP1 HUMAN

785 NSYKMKMSVILGIVQMVFGVILSLF VPP4 HUMAN

786 MQREGGPSQIGDALGFAVRYLTSEM VWF HUMAN

787 KDTPSGISKVRKILFTLAKQSKALG WD10 HUMAN

788 LVGLKNGQILKIFVDNLFAIVLLKQ WD10 HUMAN

789 SFEQGGSEFVPVWSRLVLRSMSRR WD10 HUMAN

790 I PADPEAGGIGRWNGAFMVLKGHR WD22 HUMAN

791 RQNKDERYS I KDLLNHAF FQEETGV WNK1 HUMAN

792 RKTSKSKLKAGKLLNPLVRQLKWA WNK2 HUMAN

793 RTDKNERFTIQDLLAHAFFREERGV WNK4 HUMAN

794 TAFGADTEGSQWIIGYLLQKVISNL XPO4 HUMAN

795 LGLNDETMVLSVFIGKIITNLKYWG XP07 HUMAN

796 LNYLATRPKLATFVTQAL I QLYAR I XPO7 HUMAN

797 AMFVEYRKQLKLLLDRLAQVSPELL XPOT HUMAN

798 QNWQTTRFMEVEVAIRLLYMLAEAL XPOT HUMAN

799 FPAATSGRMVEAFARRALWDAGLNY XPP2 HUMAN

800 LLKASHVRDAVAVIRYLVWLEKNVP XPP2 HUMAN

801 S I LTQPHLYS PVLI S QLVQMAS QLR Y310 HUMAN

802 ISIGTIYFRAHKLVLAAASLLFKTL Y478 HUMAN

803 RDVLRVQGVSLTALRLLLADAYSGR Y711 HUMAN

804 QLEGLENATARNLLGKLINILLAVM Y779 HUMAN

805 PPLIVDRERLKKLLDLLVDKSNNLA YC40 HUMAN

806 EDTKEKRTIIHQAIKSLFPGLETKT YI97 HUMAN

807 DQKTNLPEYLQTLLNTLAPLLLFRA 2294 HUMAN

808 RSREHGTLWSL 11 AKL ILSRS ISSD Z294 HUMAN

809 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS Z297 HUMAN

810 GRNKMDPPRSSIFLQEVITTVYGYK ZAN HUMAN

811 VDLAYSNYHVKQFLEALLRNSAAPS ZBT8 HUMAN

812 iKLRSLRVNVGQLLAMIVPDLDLQQ ZCW3 HUMAN

813 ELQKQAELMEFEIALKALSVLRYIT ZM10 HUMAN

814DALHMLTDLSAIILTLLALWLSSKS ZNT4 HUMAN 8151MDDEENYSΆASKAVRQVLHQLKRLG I ZW 10JH U M AN

Bildlegenden

Figur 1 .

Identifizierung von Peptiden, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der PKA hemmen. Eine Bibliothek von Peptiden, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAP18Ö abgeleitet wurden, wurde auf einer Membran synthetisiert. Die Membran wurde mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- und RII/3-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Aminosäuresequenzen der Peptide lassen sich anhand der angegebenen Kürzel (Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAPlδδ; horizontal: die 20 Aminosäuren, die für die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden.

Figur 2

Identifizierung von Peptiden, abgeleitet von AKAP18Ö, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit den regulatorischen RIIa- und RII/3-Untereinheiten der PKA hemmen. A. Peptide, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAP185 abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (obere Reihe) oder Rllß-Untereinheiten (untere Reihe) der PKA inkubiert (RII -overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII- Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für

AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. B: Die

Aminosäuresequenzen der Peptide (Einbuchstabenkodierung) , die in A angegeben sind.

Figur 3A

Peptide, abgeleitet von AKAP185, die RIIa- und RII/3-Unter- einheiten der PKA unterschiedlich stark binden. A. Die Peptide 1-19, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAPlδδ abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (obere Reihe) oder RII/3- Untereinheiten (untere Reihe) der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. Das Peptid 7 ist aufgrund des großen Unterschieds in der Bindung an die beiden RII-Untereinheiten durch rote Schrift hervorgehoben. B: Die Aminosäuresequenzen der Peptide (Einbuchstabenkodierung) , die in A mit 1-19 bezeichnet sind.

Figur 4

Unterschiedliche Peptide, abgeleitet von AKAP185, binden RIIa- und RII/3-Untereinheiten der PKA unterschiedlich stark. Zwei Bibliotheken von Peptiden, die von dem Peptid 7 aus Figur 3 abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (linke Seite) oder RII/3- Untereinheiten der PKA (rechte Seite) inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII -Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Aminosäuresequenzen der Peptide lassen sich anhand der angegebenen Kürzel (Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz des Peptids 7; horizontal: die 20 Aminosäuren, die für die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden. Horizontale und vertikale Reihen sind zusätzlich durch arabische Zahlen beschriftet. Diese Koordinaten erleichtern die Zuordnung, so bedeutet zum Beispiel 10/11: Reihe 10 Peptid 11. Die unten aufgelisteten Peptide werden entsprechend ihrer Bindung an RIIa mit AlδδRIIαHsl und 2 bzw. entsprechend ihrer Bindung an RIIjS mit A18δRII|SRnl bezeichnet.

Fig. 5: Identifizierung von Peptiden, die AKAP-PKA- Interaktionen hemmen. Kandidatenpeptide wurden auf einer Membran synthetisiert und mit radioaktiv markierten regulatorischen RIID-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) .

Fig. 6. Einfluß von Wasserstoffbrücken auf die Bindung zwischen Peptiden und RII (alpha) -Untereinheiten der PKA. (A, B) Vergleichende schematische Darstellung der Interaktion zwischen RII (alpha) und den Peptiden AKAP18 (delta) -wt oder AKAP18 (delta) -L314E sowie zwischen RII (alpha) , Ht31 oder AKAi₃. RHalpha ist als Rechteck und durch ausgewählte Aminosäuren, die Peptide sind anhand ihrer Aminosäure-Sequenz dargestellt. Aminosäuren als Partner einer Wasserstoffbrückenbindung, sind durch eine unterbrochene Linie miteinander verbunden. Aminosäuren der Peptide, die sich in Positionen für hydrophobe Molekülkontakte befinden sind grün unterlegt (Pos. der Aminosäuren von AKAP18 (delta) -wt im Vergleich zum Protein sind angegeben) . (C, D) Um den Einfluß der Aminosäuren für die Bindungsstärke zu untersuchen, wurden Alanin- substituierte Peptide auf Membranen synthetisiert, mittels RII overlay auf RII (alpha) -Bindung überprüft und densitometrisch quantifiziert. Die Peptide, ausgehend von AKAP18 (delta) -L314E, wurden in allen möglichen Kombinationen für die Aminosäuren, die Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können (vgl. A) substitutiert . Die Quantifizierung für alle Peptide, sortiert nach der Affinität ist in C dargestellt. Die Quantifizierung für alle Einzelsubstitutionen (wie angegeben) , sowie representative „Spots" aus einem RII Overlay (darüber) sind in D dargestellt.

Referenzen

Alto, N. M., Soderling, S. H., Hoshi , N., Langeberg, L. K., Fayos, R., Jennings, P. A., Scott, J. D. Bioinformatic design of A-kinase anchoring protein-in silico: a potent and selective peptide antagonist of type II protein kinase A anchoring. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100, 4445-4450, 2003.

Bregman, D. B., Bhattacharyya, N., Rubin, C. S. High affinity binding protein for the regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase U-B. J. Biol . Chem. 264, 4648-4656, 1989.

Burns-Hamuro, L. L., Ma, Y., Kammerer, S., Reineke, U., Seif, C, Cook, C, Olson, G. L., Cantor, C. R., Braun, A., Taylor, S. S. Designing isoform-speeific peptide disruptors of protein kinase A localization. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 100, 4072-4077, 2003.

Frank, R. Spot-synthesis : an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support . Tetrahedron 48, 9217-9232, 1992.

Fräser, I. D., Tavalin, S. J., Lester, L. B., Langeberg, L. K., Westphal, A. M., Dean, R. A., Marrion, N. V., Scott, J. D. A novel lipid-anchored A-kinase Anchoring Protein facilitates cAMP-responsive membrane events. EMBO J. 17, 2261-2272, 1998.

Henn, V., Edemir, B., Stefan, E., Wiesner, B., Lorenz, D., Theilig, F., Schmitt, R., Vossebein, L., Tamma, G., Beyermann, M., Krause, E., Herberg. F. W., Valenti, G., Bachmann, S., Rosenthal, W., Klussmann, E. Identification of a novel A-kinase anchoring protein 18 isoform and evidence for its role in the Vasopressin- induced aquaporin-2 Shuttle in renal principal cells. J. Biol . Chem. JBC published March 22, 2004 as doi : 10.1074/jbc .M312835200

Hulme J. T., Lin, T. W., Westenbroek, R. E., Scheuer, T., Catterall, W. A. Beta-adrenergic regulation requires direct anchoring of PKA to cardiac CaVl.2 Channels via a leucine zipper interaction with A kinase-anchoring protein 15. Proc . Natl. Acad. Sei. USA 100,13093- 13098, 2003.

Klussmann, E., Marie, K., Wiesner, B., Beyermann, M., Rosenthal, W. Protein kinase A anchoring proteins are required for vasopressin-mediated translocation of aquaporin-2 into cell membranes of renal principal cells. J. Biol. Chem. 274, 4934-4938, 1999.

Klussmann, E. Protein kinase A. Online pharmacology reference database. Elsevier Science Inc., Amsterdam, The Netherlands. Im Druck.

Kramer, A. , Schneider-Mergener, J. Synthesis and Screening of peptide libraries on continuous cellulose membrane Supports. Meth. Mol. Biol^'. 87, 25-39, 1998.

Tasken, K, Aandahl, E. M. Localized effects of cAMP mediated by distinet routes of protein kinase A. Physiol. Rev. 84, 137-167, 2004.

Claims

Patentansprüche

1. Proteinkinase A/Proteinkinase A-Ankerprotein- Entkoppler, dadurch gekennzeichnet, dass die Entkoppler entweder (i) von einem AKAPl8δ oder (ii) von einem von AKAP185 verschiedenem Protein abgeleitet sind und gemäß

(i) mindestens 8 H-Brücken bildende Aminosäuren oder gemäß (ii) die allgemeine Formel (1) aufweisen xxxxxxxxx [AVLISE] xx [AVLIF] [AVLI] xx [AVLI] [AVLIF] xx [AVLISE] xxxx ( 1 ) , wobei X eine beliebige der 20 biogenen Aminosäuren sein kann.

2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid- sequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 - 39, b) ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, c) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein, d) ein Nukleinsäuremolekül, das infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und/oder d) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis d) ist.

3. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nukleotidsequenz mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 % homolog zu einer der unter a) angegebenen Nukleotidsequenz ist.

4. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3 , dadurch gekennzeichnet, dass es eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA ist.

5. Vektor umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

6. Wirtszelle umfassend den Vektor gemäß Anspruch 5.

7. Organismus umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5 und/oder eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6.

8. Organismus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus eine transgene Maus oder Ratte ist, wobei die Maus oder Ratte vorzugsweise durch das Vorhandensein des Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, des Vektors gemäß Anspruch 5 und/oder der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 Diabetes insipidus entwickelt.

9. Polypeptid, kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.

10. Polypeptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Polypeptid eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID 1 bis 39 umfasst, b) das Polypeptid nach a) durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einem Polypeptid nach a) ist und/oder c) das Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einem Polypeptid nach a) oder b) funktionsanalog zu sein.

11. Erkennungsmolekül gerichtet gegen ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10.

12. Erkennungsmolekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisense-Konstrukt ist, insbesondere ein RNA- Interferenzmolekül .

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, ein Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10 und/oder ein Erkennungsmolekül gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Aquaretika ist.

15. Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, ein Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10, ein Erkennungsmolekül gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14 umfasst .

16. Verfahren zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition einer AKAP-PKA- Interaktion umfassend die Schritte a) Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Vektors nach Anspruch 5, einer Wirtszelle nach Anspruch 6 und/oder eines Polypeptids nach Anspruch 1, 9 oder 10 und b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem ZielOrganismus .

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation an einer regulatorischen RII-Untereinheit der PKA erfolgt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die RII-Untereinheiten RIIa- und/oder Rllß-Untereinheiten sind.

19. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Vektors nach Anspruch 5, einer Wirtszelle nach Anspruch 6, eines Organismus nach Anspruch 7 oder 8, eines Polypeptids nach Anspruch 1, 9 oder 10, eines Erkennungsmoleküls nach Anspruch 11 oder 12, einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 und/oder eines Kits nach Anspruch 15 zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion.

20. Verwendung nach dem vohergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion in einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus durchgeführt wird.

21. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus nach Anspruch 7 oder 8 als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP-PKA-Interaktion verwendet wird, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus.

22. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Modifikation die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQPII modifiziert wird, insbesondere verhindert wird.

23. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10 und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14 als Wasserverlust-verursachende Mittel eingesetzt werden, insbesondere als Aquaretika.

24. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion der RIIa- oder Rllß-Untereinheiten des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert wird.

25. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Untereinheiten humanem oder murinem Ursprungs sind.