DE60016398T2

DE60016398T2 - Tumorsuppressorgen

Info

Publication number: DE60016398T2
Application number: DE60016398T
Authority: DE
Inventors: Renu Niihari-gun WADHWA; Takashi Misawa-shi SUGIHARA; Akiko Ohide
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1999-04-26
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: US7825220B2; US20100112591A1; US20020160498A1; JP4499926B2; US8124733B2; US20120156722A1; EP1176199A1; EP1176199B1; US7153935B2; WO2000065047A1; EP1176199A4; DE60016398D1; US20070072231A1; ATE283918T1; AU4314300A; US7642070B2; US20110008913A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der biologischen Wissenschaft, genauer auf das Gebiet der Krebs-Forschung. Im Besonderen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue Proteine, die in den Proliferations-Mechanismus von Zellen involviert sind. Die Proteine der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel als Ziel-Moleküle für die Entwicklung von Arzneistoffen gegen Krebs verwendet werden.
Hintergrund Fachgebiet
Von einem cytogenetischen und molekularbiologischen Standpunkt scheint eine nicht-zufällige Mutation am menschlichen Chromosom 1p in vielen malignen Tumoren vorzuliegen (Caron, H. (1995) Med Pediatr Oncol 24, 215-21; Schwab M. et al (1996) Genes Chromosomes Cancer 16, 211-29). Zum Beispiel wurden Deletionen in der Region von Chromosom 1p in verschiedenen Oncocyten gefunden (Neuroblastome [White, P. S. et al (1997) Eur J Cancer 33, 1957-61, Gros16; Ariyama T. et al (1995) Genomics 25, 114-23; Cheng, N. C. et al (1995) Oncogene 10, 291-7], Meningiome [Ishino, S. et al (1998) Cancer 83, 360-6], Phäochromocytome, medulläre Schilddrüsen-Karzinome, neuroendokrine Tumore [Moley, J. F. et al (1992) Cancer Res 52, 770-4], T-Zell-akute lymphoplastische Leukämie (T-ALL) [lolascon, A. et al (1997) Leukemia 11, 359-63], kolorektale Karzinome [Praml, C. et al (1995) Oncogene 11, 1357-62, Gros13; Bomme, L. et al (1998) Genes Chromosomes Cancer 21, 185-94; Di Vinci, A. et al (1998) Cancer 83, 415-22], Mesotheliome [Lee, W. C. et al (1996) Cancer Res 56, 4297-301], Hepatome [Chen, H. L. et al (1996) Cancer Genet Cytogenet 86, 102-6], Endometrium-Karzinome [Arlt, M. F. et al (1996) Hum Mol Genet 5, 1017-21] und Brustkrebse [Nagai, H. et al (1995) Cancer Res 55, 1752-7; Munn, K. E. et al (1995) Oncogene 10, 1653-7]. etc.). Zusätzlich wird angenommen, dass Mutationen in der 1p-Region mit Lymphknoten-Metastasen und Tumor-Größe korrelieren [Borg, A. et al (1992) Genes Chromosomes Cancer 5, 311-20; Tsukamoto, K. et al (1998) Cancer 82, 317-22]. Darüber hinaus wird vorgeschlagen, dass die genetische Mutation in Verbindung mit endodermalen Sinus-Tumoren (CESTs), entwickelt in kleinen Kindern unter vier Jahren, auf Chromosom 1p auftritt [Perlman, E. J. et al (1996) Genes Chromosomes Cancer 16, 15-20]. Diese Tatsachen weisen darauf hin, dass eine oder mehrere genetische Mutationen in Chromosom 1p mit malignen Tumoren verknüpft sind. Das auslösende Gen wurde allerdings noch nicht entdeckt.
Offenbarung der Erfindung
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Proteins, das in den Proliferations-Mechanismus der Zellen involviert ist, und des Gens, welches das Protein codiert, so wie der Methoden für die Herstellung und Anwendung der selben.
Die hier genannten Erfinder haben die Maus-RS-4-Zell cDNA-Genbank gemäß der Immundurchmusterungs-Methode unter Verwendung von Antikörpern gegen Protein p33 durchmustert, welches etwa 30 kDa groß und in der Triton X-100-unlöslichen Fraktion der immortalisierten Zell (NIH3T3)-Plasma-Membran P100-Fraktion enthalten ist. Unter Verwendung dieser dadurch erhaltenen cDNA als Sonde wurde eine menschliche Hoden-Genbank durchmustert und die Erfinder waren erfolgreich bei der Clonierung des neuen Gens, Gros1, aus der Genbank. Es existieren zwei Formen von menschlichen Gros1-cDNAs (SEQ ID NOs: 1 und 3): eine codiert ein Protein, bestehend aus 363 Aminosäuren (bezeichnet als ,menschliches Gros1-S-Protein', SEQ ID NO: 2), und die andere codiert ein Protein, bestehend aus 736 Aminosäuren (bezeichnet als ,menschliches Gros1-L-Protein', SEQ ID NO: 4).
Darüber hinaus wurde unter Verwendung der cDNAs, erhalten durch die obige Immundurchmusterungs-Methode, als eine Sonde eine Maus-Hoden-Genbank sowohl durchmustert als auch auf ESTs durchsucht, um erfolgreich Maus-Gros1-L-cDNA (SEQ ID NO: 5) und Maus-Gros1-S-cDNA (SEQ ID NO: 7) zu identifizieren. Sie codieren ein Protein, bestehend aus 747 Aminosäuren (SEQ ID NO: 6), beziehungsweise 542 Aminosäuren (SEQ ID NO: 8).
Es wurde gefunden, dass menschliche und Maus-Gros1s homolog sind zu dem in der Datenbank gefundenen neuen Basalmembran-assoziierten Proteoglycan, Leprecan, das aus Ratten-cDNA isoliert wurde (Wassenhove-McCarthy D. J. und McCarthy K. J. (1999) J. Biol. Chem. 274, 25004-25017). Zusätzlich wurden als ein Ergebnis der Motivsuche-Analyse von Aminosäure-Sequenzen gefunden, dass die Aminosäure-Sequenzen von Maus- und menschlichen Gros1-Ls die Leucin-Zipper-Struktur, die oft bei manchen Mitgliedern der Transkriptions-Faktoren beobachtet wird, umfassen.
Als ein Ergebnis der Chromosomen-Kartierung von menschlichem Gros1 wurde gefunden, dass das Gros1-Gen am kurzen Arm des menschlichen Chromosom 1 (1p) existiert, ein Bereich von dem vorgeschlagen wird, dass er nicht-zufällige Mutationen in vielen malignen Tumoren aufweist (Caron, H. (1995) Med Pediatr Oncol 24, 215-21; Schwab, M. et al (1996) Genes Chromosomes Cancer 16, 211-29).
Die Menge an Gros1-mRNA, die in Geweben, Zellen und jenen während der Entwicklungs-Stadien exprimiert wird, wurde durch Northern Blot-Analyse ermittelt. Als ein Ergebnis wurden in Menschen 4,4 kb- und 2,5 kb-Banden in Hoden, Ovar und Plazenta stark exprimiert, und schwach in den meisten anderen Geweben (4). Zusätzlich war die mRNA-Expression in kultivierten menschlichen Zellen höher als in obigen Geweben, und in menschlichen normalen kultivierten Zellen war die Expression der 2,5 kb-mRNA fast 10mal höher als die der 4,4 kb-mRNA (5). In der Maus wurden 3,5 kb- und 2,5 kb-Banden in den meisten Geweben schwach exprimiert, nicht exprimiert in Gehirn oder Milz; nur die 2,5 kb-Bande wurde im Hoden exprimiert. Dementsprechend wurde im Hoden und Oval nur die kürzere Form von den zwei Transkripten der Gros1-Gene nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die Expression während des Entwicklungsverlaufes am 11. Tag des Entwicklungsverlaufes dramatisch verschwindet (6).
Die hier genannten Erfinder führten eine Funktions-Analyse von Gros1 durch, indem sie das Gen, codierend das Maus-85 kDa-Protein (Gros1-L; SEQ ID NO: 6), in NIH3T3-Zellen einbrachten. Als ein Ergebnis war die Zell-Proliferation unterdrückt, und die Kolonie-Bildungs-Aktivität war vermindert in Zellen, die das Volllänge Gros1-L exprimierten im Vergleich zu jenen der Kontrolle und Gros1, dessen C-Ende entfernt wurde. Auf der anderen Seite war die Kolonie-Bildungs-Aktivität in Zellen, in denen Antisense-RNA von Gros1-L exprimiert wurde, 5fach erhöht.
Basierend auf diesen Analysen wird angenommen, dass Gros1-L-Protein von einem neuen Gen codiert wird, das in die Kontrolle der Zell-Proliferation involviert ist und in Beziehung steht zu der Entwicklung und dem Wachstum von Tumoren. Daher ist Gros1-L-Protein nützlich als Hilfsmittel für die Entwicklung von pharmazeutisch wirksamen Substanzen gegen Tumore.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Protein (Gros1-L), das involviert ist in die Zell-Proliferation, und die dieses codierenden Gene, sowie die Produktion und der Anwendung desselben. Genauer liefert die vorliegende Erfindung folgendes:

1. Eine DNA mit einer der nach folgenden Definition (a) bis (e): (a) eine DNA, die das Protein codiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder 6 besteht; (b) eine DNA, die die codierende Region der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 umfasst; (c) eine DNA, die ein Protein codiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder 6 besteht, in der eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt, deletiert, inseriert und/oder hinzugefügt sind, wobei das codierte Protein eine wachstumssupprimierende Aktivität aufweist; und (d) eine DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA, die aus der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 besteht, hybridisiert und ein Protein codiert, das wachstumssupprimierende Aktivität aufweist, und (e) eine DNA, codierend ein Teilpeptid von dem Protein, das aus der Aminosäuren-Sequenz von SEQ ID NO: 4 oder 6 besteht, wobei das Teilpeptid eine wachstumssupprimierende Aktivität aufweist.
2. Einen Vektor, in den DNA gemäß (1) inseriert ist.
3. Eine transformierte Zelle, die die DNA gemäß (1) oder den Vektor gemäß (2) enthält.
4. Ein Protein oder Peptid, das von der DNA gemäß (1) codiert wird.
5. Ein Verfahren zur Herstellung des Proteins oder Peptids gemäß (4), umfassend die Schritte des Züchtens der transformierten Zelle gemäß (3) und Sammeln des Proteins, das von der Zelle exprimiert wird, oder von deren Kulturüberstand.
6. Einen Antikörper, der das Protein gemäß (4) bindet.
7. Ein Polynucleotid, das mit einer DNA, die aus der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 besteht, oder dem komplementären Strang davon hybridisiert, und zumindest 15 Nucleotide umfasst.
8. Ein Verfahren zur Durchmusterung nach einer Verbindung, die an das Protein gemäß (4) bindet, umfassend die Schritte von: (a) Inkontaktbringen einer Probe mit dem Protein oder dem Teilpeptid davon; (b) Bestimmung der Bindungsaktivität der Probe mit dem Protein oder dem Teilpeptid davon; und (c) Selektieren der Testverbindung, die an das Protein oder das Teilpeptid davon bindet.
9. Ein Verfahren zur Durchmusterung nach einer Verbindung, die die Aktivität des Proteins gemäß (4) fördert oder inhibiert, umfassend die Schritte von: (a) Züchten von Zellen, die das Protein oder das Teilpeptid davon in der Anwesenheit einer Probe exprimieren; (b) Bestimmen der Proliferation der Zelle; und (c) Selektieren der Verbindung, die die Proliferation im Vergleich zur Proliferation, die in der Abwesenheit der Probe bestimmt wurde, fördert oder inhibiert.

Die vorliegende Erfindung liefert ein neues Protein Gros1; namentlich Gros1-L, involviert in den Zellproliferations-Mechanismus. SEQ ID NOs: 1 und 3 zeigen Nucleotidsequenzen der cDNA von den zwei Formen von menschlichem Gros1 (menschliches Gros1-S beziehungsweise menschliches Gros1-L), die von den Erfindern isoliert wurden, und SEQ ID NOs: 2 beziehungsweise 4 zeigen die Aminosäurensequenzen, die durch die cDNAs codiert werden. SEQ ID NOs: 5 und 7 zeigen Nucleotidsequenzen von der cDNA der zwei Formen von Maus-Gros1 (Maus-Gros1-L beziehungsweise Maus-Gros1-S), die von den vorliegenden Erfindern isoliert wurden, und SEQ ID NOs: 6 beziehungsweise 8 zeigen die Aminosäurensequenzen, die von den cDNAs codiert werden.
Wenn das Gros1-L-Protein exogen in NIH-3T3-Zellen exprimiert wurde, war die Zellproliferation inhibiert und die Kolonie-Bildungs-Aktivität vermindert. Im Gegensatz dazu war die Kolonie-Bildungs-Aktivität dramatisch erhöht, wenn die Expression von Gros1-L Protein durch die Einführung von Gros1-Antisense-cDNA in NIH-3T3-Zellen unterdrückt wurde. Daher wird erachtet, dass das Gros1-L-Protein in die Kontrolle der Zellproliferation involviert ist. Das wird auch durch die Tatsache unterstützt, dass das menschliche Gros1-L-Gen am kurzen Arm von Chromosom 1 (1p) liegt, ein Bereich, von dem gesagt wird, dass er mit malignen Tumoren assoziiert ist. Daher können die Gros1-Proteine der vorliegenden Erfindung einfach als Hilfsmittel verwendet werden, um Faktoren, die die Zellproliferation kontrollieren, aufzureinigen oder zu clonieren, so wie als Angriffspunkte für zum Beispiel die Durchmusterung nach Kandidaten-Verbindungen von Arzneistoffen, die für die Behandlung oder Prävention von Störungen in Verbindung mit Zellproliferation wie Tumoren nützlich sind. Darüber hinaus können die Gros1-Gene in der Behandlung angewendet werden, zum Beispiel Gentherapie für verschiedene Tumoren.
Die vorliegende Erfindung umspannt Proteine, die funktionell bevorzugterweise zu den Gros-1-L-Proteinen äquivalent sind. Solche Proteine beinhalten zum Beispiel homologe Proteine von anderen Organismen, die dem menschlichen oder Maus-Gros1-L-Protein entsprechen, so wie Mutanten von menschlichen oder Maus-Gros1-L-Proteinen.
In der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck ,funktionell äquivalent', dass das betreffende Protein die Aktivität aufweist, Zellproliferation zu inhibieren, wie Gros1-L-Proteine. Ob das betreffende Protein eine Zellproliferations-inhibierende Aktivität aufweist oder nicht, kann beurteilt werden durch die Einführung der DNA, die das betreffende Protein codiert, in eine Zelle wie NIH-3T3, die das Protein exprimiert, und den Nachweis der Unterdrückung der Proliferation von den Zellen oder Reduktion der Kolonie-Bildungs-Aktivität.
Verfahren für die Herstellung der Proteine, die funktionell äquivalent sind zu einem gegebenen Protein, sind wohlbekannt für einen Fachmann und beinhalten bekannte Verfahren des Einbringens von Mutationen in das Protein. Zum Beispiel kann ein Fachmann Proteine herstellen, die funktionell äquivalent sind zu dem menschlichen oder Maus-Gros1-L-Protein, durch das Einbringen einer geeigneten Mutation in die Aminosäuresequenz des menschlichen oder Maus-Gros1-L-Proteins durch zielgerichtete Mutagenese (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995), Gene 152, 271-275; Zoller, MJ, und Smith, M. (1983), Methods Enzymol. 100, 468-500; Kramer, W. et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 9441–9456; Kramer W, und Fritz HJ. (1987) Methods. Enzymol. 154, 350–367; Kunkel, TA (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492; Kunkel (1988), Methods Enzymol. 85, 2763-2766). Aminosäure-Mutationen können auch in der Natur vorkommen. Das Protein der vorliegenden Erfindung schließt auch jene Proteine ein, die die Aminosäuresequenzen von menschlichen oder Maus-Gros1-L-Proteinen aufweisen, in denen eine oder mehrere Aminosäuren mutiert sind, vorausgesetzt, dass die resultierenden mutierten Proteine funktionell äquivalent zu dem menschlichen oder Maus-Gros1-L-Protein sind. Die Anzahl der Aminosäuren, die in einer solchen Mutante mutiert sein sollen, ist im Allgemeinen 10 Aminosäuren oder weniger, bevorzugt 6 Aminosäuren oder weniger und mehr bevorzugt 3 Aminosäuren oder weniger.
Von mutierten oder modifizierten Proteinen, Proteinen, die Aminosäurensequenzen aufweisen, die durch Deletion, Hinzufügen und/oder Ersatz einer oder mehrerer Aminosäure-Reste einer bestimmten Aminosäuresequenz modifiziert sind, ist bekannt, dass sie die ursprüngliche biologische Aktivität beibehalten (Mark, D. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M. J. & Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).
Der Aminosäure-Rest, der mutiert werden soll, ist bevorzugt in eine andere Aminosäure mutiert, in der die Eigenschaften der Aminosäure-Seitenkette konserviert sind. Beispiele für Eigenschaften von Aminosäure-Seitenketten sind hydrophobe Aminosäuren (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophile Aminosäuren (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T) und Seitenketten, die die folgenden funktionellen Gruppen oder Charakteristika gemeinsam haben: eine aliphatische Seitenkette (G, A, V, L, I, P); eine Hydroxyl-Gruppe enthaltende Seitenkette (S, T, Y); ein Schwefel-Atom enthaltende Seitenkette (C, M); eine Carbonsäure und Amid enthaltene Seitenkette (D, N, E, Q); eine Base enthaltende Seitenkette (R, K, H); und eine aromatische Gruppe enthaltene Seitenkette (H, F, Y, W) (Die eingeklammerten Buchstaben geben die Ein-Buchstaben-Codes für Aminosäuren an).
Ein Beispiel für ein Protein, in das ein oder mehrere Aminosäuren-Reste zu der Aminosäurensequenz von menschlichem oder Maus-Gros1-L-Protein (SEQ ID NO: 4 oder 6) hinzugefügt wurden, ist ein Fusionsprotein, das das humane oder Maus-Gros1-L-Protein enthält. Fusionsproteine sind Fusionen von menschlichem oder Maus-Gros1-L-Protein und anderen Peptiden oder Proteinen und sind in die vorliegende Erfindung eingeschlossen. Fusionsproteine können durch Methoden, die einem Fachmann wohlbekannt sind, hergestellt werden, wie durch Binden der DNA, die das menschliche oder Maus-Gros1-L-Protein der Erfindung codiert, mit DNA, die andere Peptide oder Proteine codiert, so dass die Rahmen passen, Inserieren der Fusions-DNA in einen Expressionsvektor und Expression dessen in einem Wirt. Es gibt keine Beschränkung im Bezug auf Peptide oder Proteine, die an das Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert sind.
Bekannte Peptide, die als Peptide verwendet werden können, die an das Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert sind, beinhalten zum Beispiel FLAG (Hopp, T. P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6xHis, enthaltend sechs His (Histidin)-Reste, 10x His, HA (Influenza-Agglutinin), menschliches c-myc-Fragment, VSP-GP-Fragment, p18HIV-Fragment, T7-Marker, HSV-Marker, E-Marker, SV40T-Antigen-Fragment, Ick-Marker, α-Tubulin-Fragment, B-Marker, Protein C-Fragment und ähnliche. Beispiele für Proteine, die an ein Protein der Erfindung fusioniert werden können beinhalten GST (Glutathion-S-Transferase), HA (Influenza-Agglutinin), die konstante Region von Immunglobulin, β-Galactosidase, MBP (Maltose-Bindungs-Protein) und dergleichen.
Fusionsproteine können hergestellt werden durch die Fusion von kommerziell erhältlicher DNA, die die vorstehend diskutierten Fusionspeptide oder -proteine codiert, mit der DNA, die das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, und Expression der hergestellten fusionierten DNA.
Ein alternatives Verfahren, das in dem Fachgebiet bekannt ist, für die Isolierung von funktionell equivalenten Proteinen ist zum Beispiel das Verfahren, in dem eine Hybridisierungs-Technik verwendet wird (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2. Aufl. 9.47–9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Ein Fachmann kann leicht eine DNA isolieren, die hohe Homologie zu einer ganzen oder einem Teil der DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 3 oder 5) aufweist, die das menschliche oder Maus-Gros1-L-Protein codiert, und funktionell äquivalente Proteine zu dem menschlichen oder Maus Gros1-L-Protein aus der isolierten DNA isolieren. Die Proteine der vorliegenden Erfindung beinhalten jene, die durch DNA codiert werden, die mit einer ganzen oder einem Teil der DNA-Sequenz hybridisiert, die das menschliche oder Maus-Gros1-Protein codiert, im Besonderen das menschliche oder Maus-Gros1-L-Protein codiert, und funktionell äquivalent zu dem menschlichen oder Maus Gros1-L-Protein sind. Diese Proteine beinhalten Säuger-Homologe, entsprechend dem Protein, das von Mensch oder Maus stammt (zum Beispiel ein Protein, das vom Affen-, Ratten-, Kaninchen- und Rinder-Gen codiert wird). Für die Isolierung einer cDNA, die hochgradig homolog ist zu der DNA, die das menschliche oder Maus-Gros1-L-Protein codiert, von Tieren ist es besonders wünschenswert, Gewebe von Ovar oder Hoden zu verwenden.
Die Hybridisierungs-Eigenschaft für die Isolierung einer DNA, die ein funktionell äquivalentes Protein zum menschlichen oder Maus-Gros1-Protein, im Besonderen das Gros1-L-Protein, codiert, kann von einem Fachmann routinemäßig ausgewählt werden. Zum Beispiel kann eine Hybridisierung durchgeführt werden durch Ausführung der Prä-Hybridisierung bei 68°C für 30 min oder länger unter Verwendung von ,Rapid-hyb Puffer' (Amersham LIFE SCIENCE), Zugabe einer markierten Sonde und Erwärmen bei 68°C für 1 Stunde oder länger. Der folgenden Wasch-Schritt kann zum Beispiel unter niedrig-stringenter Bedingung ausgeführt werden. Eine niedrig-stringente Bedingung ist zum Beispiel 42°C, 2X SSC, 0,1% SDS oder vorzugsweise 50°C, 2X SSC, 0,1 % SDS. Bevorzugter werden hochstringente Bedingungen verwendet. Eine hoch-stringente Bedingung ist zum Beispiel dreimaliges Waschen in 2X SSC, 0,01 % SDS bei Raumtemperatur für 20 min, dann dreimaliges Waschen in 1X SSC, 0,1% SDS bei 37°C für 20 min und zweimaliges Waschen in 1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 20 min. Wie auch immer, einige Faktoren wie Temperatur und Salzkonzentration können die Stringenz der Hybridisierung beeinflussen, und ein Fachmann kann die Faktoren passend auswählen, um die erforderliche Stringenz zu erzielen.
Anstatt einer Hybridisation kann ein Gen-Amplifikations-Verfahren, zum Beispiel das Polymerase-Kettenreaktions (PCR)-Verfahren verwendet werden, um eine DNA zu isolieren, die ein funktionell äquivalentes Protein zum menschlichen oder Maus-Gros1-Protein, im Speziellen Gros1-L-Protein, codiert, unter Verwendung von einem Primer, der basierend auf der Sequenz-Information der DNA (SEQ ID NO: 1, 3, 5 oder 7) sythetisiert wurde, die das menschliche oder Maus-Gros1-Protein, im Speziellen Gros1-L-Protein, codiert.
Proteine, die funktionell equivalent sind zum menschlichen oder Maus-Gros1-Protein, im Speziellen Gros1-L-Protein, codiert durch die DNA, die durch die obigen Hybridisierungs-Verfahren oder Gen-Amplifikations-Verfahren isoliert wurde, weisen normalerweise eine hohe Homologie zu der Aminosäure-Sequenz des menschlichen oder Maus-Gros1-Proteins auf. ,Hohe Homologie' bezieht sich typischerweise auf eine Homologie von 40% oder höher, bevorzugt 60% oder höher, mehr bevorzugt 80% oder höher, noch mehr bevorzugt 95% oder höher. Die Homologie eines Proteins kann bestimmt werden durch Befolgen des Algorithmus in, Wilbur, W. J. und Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730'.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung darf Variationen aufweisen in Aminosäuresequenz, Molekulargewicht, isoelektischem Punkt, der Anwesenheit oder Abwesenheit von Zuckerketten oder Form, abhängig von der Zelle oder dem Wirt, die/der verwendet wird für dessen Produktion, oder dem verwendeten Aufreinigungsverfahren. Trotzdem, so lange es eine Funktion äquivalent zu der vom menschlichen oder Maus-Gros1-Protein (SEQ ID NO: 2, 4, 6 oder 8), im Speziellen Gros1-L-Protein (SEQ ID NO: 4 oder 6) der vorliegenden Erfindung aufweist, ist es innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können als rekombinante Proteine oder natürliche Proteine hergestellt werden durch Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind. Ein rekombinantes Protein kann hergestellt werden durch Insertion von DNA, die das Gros1-L-Protein der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel die DNA, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5) codiert, in einen passenden Expressions-Vektor, Einbringen des Vektors in eine passende Wirtszelle, Sammeln der so erhaltenen Rekombinante, Erhalten des Extrakts davon und Aufreinigung des Proteins, indem der Extrakt einer Chromatographie ausgesetzt wird, zum Beispiel Ionen-Austausch-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie, Gelfiltration oder Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung einer Säule, an die Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung fixiert sind, oder durch Kombination von mehr als einer der vorher erwähnten Säulen.
Darüber hinaus, wenn das Gros1-L-Protein der vorliegenden Erfindung in Wirtszellen (zum Beispiel tierische Zellen und E. coli) als ein Fusionsprotein mit Glutathion-S-Transferase-Protein oder als ein rekombinantes Protein, angereichert mit mehreren Histidinen, exprimiert wird, kann das exprimierte rekombinante Protein durch die Verwendung einer Glutathion-Säule oder Nickel-Säule aufgereinigt werden.
Nach der Reinigung des Fusionsproteins ist es auch möglich, Regionen, anders als das erfindungsgemäße Protein, durch Schneiden mit Thrombin oder Faktor-Xa, wie erforderlich, auszuschließen.
Ein natürliches Protein kann durch Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, isoliert werden, zum Beispiel durch Inkontaktbringen der Affinitäts-Säule, in der Antikörper, die an das nachstehend beschriebene Gros1-L-Protein binden, gebunden sind, mit dem Extrakt von Geweben oder Zellen, die das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren. Die Antikörper können polyclonale Antikörper oder monoclonale Antikörper sein.
Die vorliegende Erfindung umspannt auch Teilpeptide des Gros1-L-Proteins der vorliegenden Erfindung. Das Teilpeptid hat eine Aminosäuresequenz, die spezifisch ist für das Protein der vorliegenden Erfindung, und besteht aus mindestens 7 Aminosäuren, vorzugsweise 8 Aminosäuren oder mehr und mehr bevorzugt 9 Aminosäuren oder mehr. Das Teilpeptid kann verwendet werden, zum Beispiel für die Herstellung von Antikörpern gegen das Protein der vorliegenden Erfindung, Durchmustern nach einer Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet und Durchmusterung nach Beschleunigern oder Inhibitoren des Proteins der vorliegenden Erfindung.
Ein Teilpeptid der Erfindung kann durch Gentechnik, durch bekannte Verfahren der Peptid-Synthese oder durch Verdauung des Proteins der Erfindung mit einer geeigneten Peptidase hergestellt werden. Für die Peptidsynthese können zum Beispiel Festphasen-Synthese oder Flüssigphasen-Synthese verwendet werden.
Darüber hinaus bietet die vorliegende Erfindung DNA, die die Gros1-L-Proteine der vorliegenden Erfindung codiert. Die DNA der vorliegenden Erfindung kann für die in vivo- oder in vitro-Produktion des Proteins der vorliegenden Erfindung, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden, oder kann angewendet werden in der Gentherapie von Krankheiten, die genetischen Abnormalitäten in dem Gen, das das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, unterliegen. Jegliche Form der DNA der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, so lange sie das Protein der vorliegende Erfindung codiert. Im Speziellen kann cDNA, die aus mRNA, genomischer DNA und chemisch synthetisierter DNA synthetisiert wurde, verwendet werden. Die DNA der vorliegenden Erfindung beinhaltet eine DNA, umfassend eine gegebene Nucleotidsequenz, so wie deren degenerierte Sequenzen, so lange die resultierende DNA ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann durch Verfahren, die einem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel kann die DNA der vorliegenden Erfindung hergestellt werden durch: Herstellen einer cDNA-Genbank aus Zellen, die das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren und Durchführung einer Hybridisierung unter Verwendung einer Teilsequenz der DNA der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel SEQ ID NO: 3 oder 5) als Sonde. Eine cDNA-Genbank kann hergestellt werden, zum Beispiel durch das Verfahren, beschrieben in Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989); alternativ können kommerziell erhältliche cDNA-Genbanken verwendet werden. Eine cDNA-Genbank kann auch hergestellt werden durch: Extraktion von RNAs aus Zellen, die das Protein der vorliegenden Erfindung exprimieren, Synthese von Oligo-DNAs basierend auf der Sequenz der DNA der vorliegenden Erfindung (zum Beispiel SEQ ID NO: 3 oder 5), Ausführung einer PCR unter Verwendung der Oligos als Primer und Amplifikation von cDNAs, die das Protein der vorliegenden Erfindung codieren. Zusätzlich kann durch Sequenzieren der Nucleotide der erhaltenen cDNA die Translations-Region, die durch die cDNA codiert wird, bestimmt werden, und die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung kann erhalten werden. Darüber hinaus kann durch Durchmustern der genomischen DNA-Genbank unter Verwendung der erhaltenen cDNA als Sonde die genomische DNA isoliert werden. Spezifischer können mRNAs zuerst aus Zellen, Gewebe oder Organ (zum Beispiel Ovar, Hoden, Plazenta, etc.) hergestellt werden, in denen das Protein der Erfindung exprimiert wird. Bekannte Verfahren können für die Isolierung von mRNAs verwendet werden; zum Beispiel kann Gesamt-RNA durch Guanidin-Ultrazentrifugation (Chirgwin J. M. et al. Biochemistry 18:5294-5299 (1979)) oder das AGPC-Verfahren (Chomczynski P. und Sacchi N. Anal. Biochem. 162:156-159 (1987)) hergestellt werden. Zusätzlich kann mRNA aus Gesamt-RNA unter Verwendung von mRNA Purification Kit (Pharmacia) und dergleichen aufgereinigt werden, oder alternativ darf mRNA direkt durch QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia) aufgereinigt werden.
Die erhaltene mRNA wird verwendet, um cDNA unter Verwendung von reverser Transkriptase zu synthetisieren. cDNA kann unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits wie dem AMV Reverse Transkriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seiskagaku Kogyo) synthetisiert werden. Alternativ kann die cDNA gemäß dem 5'-RACE-Verfahren (Frohman M. A. et al. Poc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8998-9002 (1988); Belyavsky A. et al. Nucleic Acids Res. 17:2919-2932 (1989)), das einen Primer und desgleichen, wie hierin beschrieben, den 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) verwendet, synthetisiert und amplifiziert werden.
Ein erwünschtes DNA-Fragment wird aus den PCR-Produkten hergestellt und mit einer Vektor-DNA ligiert. Die rekombinanten Vektoren werden verwendet, um E.coli und dergleichen zu transformieren, und ein erwünschter rekombinanter Vektor wird aus einer selektierten Kolonie hergestellt. Die Nucleotidsequenz der erwünschten DNA kann durch konventionelle Verfahren wie Didesoxynucleotid-Ketten-Termination, überprüft werden.
Die Nucleotidsequenz einer DNA der Erfindung kann entworfen werden, um effizienter exprimiert zu werden, indem die Frequenz des Codon-Gebrauches in dem Wirt, der für die Expression verwendet werden soll, berücksichtigt wird (Grantham R. et al. Nucleic Acids Res. 9:43-74 (1981)). Die DNA der vorliegenden Erfindung kann durch einen kommerziell erhältlichen Kit oder ein konventionelles Verfahren verändert werden. Zum Beispiel kann die DNA durch Verdauung mit Restriktionsenzymen, Insertion eines synthetischen Oligonucleotids oder eines geeigneten DNA-Fragments, Zugabe eines Linkers oder Insertion des Anfangs-Codons (ATG) und/oder des Stopp-Codons (TAA, TGA oder TAG) verändert werden. Im Besonderen umspannt die DNA der vorliegenden Erfindung die DNA, umfassend die Nucleotidsequenz von Base A an Position 52 bis Base A an Position 2259 der SEQ ID NO: 3; die DNA von Base A an Position 12 bis Base G an Position 2252 der SEQ ID NO: 5; und die von Base A an Position 12 bis Base A an Position 1640 von SEQ ID NO: 3.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung eine DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die eine Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 aufweist, und ein Protein codiert, das funktionell equivalent ist zu dem Protein der vorstehend beschriebenen Erfindung.
Ein Fachmann kann die stringenten Bedingungen passend wählen. Zum Beispiel kann eine niedrig-stringente Bedingung verwendet werden. Bevorzugter kann eine hoch-stringente Bedingung verwendet werden. Diese Bedingungen sind die gleichen wie jene, die vorstehend beschriebenen wurden. Die vorstehende hybridisierende DNA ist vorzugsweise eine cDNA oder eine chromosomale DNA.
Die vorliegende Erfindung liefert auch einen Vektor, in den eine DNA der vorliegenden Erfindung inseriert ist. Ein Vektor der vorliegenden Erfindung ist nützlich, um eine DNA der vorliegenden Erfindung in einer Wirtszelle zu halten oder um das Protein der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Wenn die Wirtszelle E.coli ist und der Vektor in einer großen Menge in E.coli (z.B. JM109, DH5α, HB101 oder XL1Blue) amplifiziert und produziert wird, sollte der Vektor ,ori' enthalten, um in E.coli amplifiziert zu werden, und ein Markergen zum Selektieren der transformierten E.coli (z.B. eine Arzneistoff-Resistenz-Gen, selektiert durch einen Arzneistoff wie Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Chloramphenicol oder dergleichen). Zum Beispiel können M13-Serien-Vektoren, pUC-Serien-Vektoren, pBR322, pBluescript, pCR-Script, etc. verwendet werden. Zusätzlich können auch pGEM-T, pDIRECT und pT7 zum Subclonieren und Extrahieren der cDNA verwendet werden, so wie die vorstehend beschriebenen Vektoren. Wenn ein Vektor zum Herstellen des Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist ein Expressionsvektor besonders nützlich. Zum Beispiel soll ein Expressionsvektor, der in E. coli exprimiert werden soll, die vorstehenden Eigenschaften aufweisen, um in E. coli amplifiziert zu werden. Wenn E. coli wie JM109, DH5α, HB101 oder XL1 Blue als Wirtszelle verwendet werden, sollte der Vektor einen Promotor aufweisen, zum Beispiel IacZ-Promotor (Ward et al., Nature (1989) 341, 544-546; FASEB J (1992) 6, 2422-2427), araB-Promotor (Better et al., Science (1988) 240, 1041-1043) oder T7-Promoter oder dergleichen, der effizient das erwünschte Gen in E. coli exprimieren kann. In dieser Hinsicht können zum Beispiel pGEX-5X-1 (Pharmacia), ,QIAexpress system' (Qiagen), pEGFP und pET (in diesem Fall ist der Wirt vorzugsweise BL21, welcher T7-RNA-Polymerase exprimiert) an Stelle der vorstehenden Vektoren verwendet werden.
Zusätzlich kann der Vektor auch eine Signalsequenz für Polypeptid-Sekretion enthalten. Eine beispielhafte Signalsequenz, die das Protein lenkt, damit es in das Periplasma der E. coli abgesondert wird, ist die pe 1B-Signalsequenz (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Mittel für das Einbringen der Vektoren in die Ziel-Wirtszellen beinhalten zum Beispiel das Calcium-Chlorid-Verfahren und das Elektroporations-Verfahren.
Zusätzlich zu E. coli können zum Beispiel Expressionsvektoren, abstammend von Säugern (zum Beispiel pcDNA3 (Invitrogen) und pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18 (17), S. 5322), pEF, pCDM8), Expressionsvektoren, abstammend von Insektenzellen (zum Beispiel ,Bac-to-BAC baculovirus expression system' (GIBCO BRL), pBacPAK8), Expressionsvektoren, abstammend von Pflanzen (zum Beispiel pMH1, pMH2), Expressionsvektoren, abstammend von Tier-Viren (zum Beispiel pHSV, pMV, pAdexLcw), Expressionsvektoren, abstammend von Retroviren (zum Beispiel pZlpneo), Expressionsvektoren, abstammend von Hefe (zum Beispiel ,Pichia Expression Kit') (Invitrogen), pNV11, SP-Q01) und Expressionsvektoren, abstammend von Bacillus subtilis (zum Beispiel pPL608, pKTH50) verwendet werden für die Herstellung des Proteins der vorliegenden Erfindung.
Um den Vektor in tierischen Zellen wie CHO-, COS- oder NIH3T3-Zellen zu exprimieren, sollte der Vektor einen Promotor enthalten, der für Expression in solchen Zellen nötig ist, zum Beispiel den SV40-Promotor (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), den MMLV-LTR-Promotor, den EF1α-Promotor (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), den CMV-Promotor und dergleichen, und vorzugsweise ein Markergen für die Selektion der Transformanten (zum Beispiel ein Arzneistoff-Resistenz-Gen, selektiert durch einen Arzneistoff (z.B. Neomycin, G418)). Beispiele von bekannten Vektoren mit diesen Eigenschaften beinhalten zum Beispiel pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV und pOP13.
Zusätzlich können Verfahren verwendet werden, um ein Gen stabil zu exprimieren und gleichzeitig die Kopien-Zahl des Gens in der Zelle zu amplifizieren. Zum Beispiel kann ein Vektor, umfassend das komplementäre DHFR-Gen (zum Beispiel pCHO I), in CHO Zellen eingebracht werden, in denen der Nucleinsäure-synthetisierende Signalweg deletiert ist, und dann durch Methotrexat (MTX) amplifiziert werden. Darüber hinaus kann im Fall einer transienten Expression eines Gens das Verfahren, in dem ein Vektor, umfassend einen Replikations-Ursprung von SV40 (pcD, etc.), in COS Zellen, umfassend das SV40-T-Antigen-exprimierende Gen auf dem Chromosom, transfiziert wird, verwendet werden.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann ferner in vivo in Tieren exprimiert werden, zum Beispiel durch Insertion der DNA der vorliegenden Erfindung in einen geeigneten Vektor und Einbringen dessen in lebende Körper durch Verfahren wie das Retrovirus-Verfahren, das Liposomen-Verfahren, das kationische Liposomen-Verfahren und das Adenovirus-Verfahren. Auf solche Weise kann Gentherapie gegen Krankheiten, die einer Mutation des Gros1-L-Gens der vorliegenden Erfindung zugeschrieben werden, erzielt werden. Als ein Vektor, der Anwendung findet, können zum Beispiel Adenovirus-Vektor (zum Beispiel pAdex1cw) und Retrovirus-Vektor (zum Beispiel pZIPneo) erwähnt werden, aber er ist nicht darauf beschränkt. Allgemeine Genmanipulation wie Insertion von der DNA der vorliegenden Erfindung in einen Vektor kann gemäß konventionellen Verfahren (Molecular Cloning, 5. 61-5. 63) durchgeführt werden. Verabreichung in einen lebenden Körper kann entweder ein ex vivo-Verfahren oder in vivo-Verfahren sein.
Die vorliegende Erfindung liefert ferner eine Wirtszelle, in die der Vektor der vorliegenden Erfindung transfiziert wurde. Die Wirtszelle, in die der Vektor der Erfindung transfiziert wird, ist nicht speziell limitiert. Zum Beispiel können E. coli, verschiedene tierische Zellen und dergleichen verwendet werden. Die Wirtszellen der vorliegenden Erfindung können zum Beispiel als eine Produktionssystem zur Herstellung oder Expression des Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren zur Herstellung eines Proteins der Erfindung sowohl in vitro als auch in vivo. Für die in vitro-Produktion können eukaryontische Zellen oder prokaryontische Zellen als Wirtszellen verwendet werden.
Brauchbare eukaryontische Zellen können Tier-, Pflanzen- oder Pilz-Zellen sein. Beispielhafte Tier-Zellen beinhalten zum Beispiel Säuger-Zellen wie CHO- (J. Exp. Med. 108:945 (1995)), COS-, 3T3-, Myelom-, Baby-Hamster-Nieren (BHK)-, HeLa- oder Vero-Zellen, Amphibien-Zellen wie Xenopus-Oozyten (Valle et al. Nature 291:340-358 (1981)) oder Insekten-Zellen wie sf9-, sf21- oder Tn5-Zellen. CHO-Zellen, denen das DHFR-Gen fehlt (dhfr-CHO) (Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 77:4216-4220 (1980)), oder CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60:1275 (1968)) können auch verwendet werden. Von den Tier-Zellen sind CHO-Zellen besonders bevorzugt für die Massen-Expression. Ein Vektor kann in Wirtszellen transfiziert werden, durch zum Beispiel das Calcium-Phosphat-Verfahren, das DEAE-Dextran-Verfahren, kationische Liposomen-DOTAP (Boehringer, Mannheim), das Elektroporations-Verfahren, das Lipofections-Verfahren und so weiter.
Als Pflanzen-Zellen sind Pflanzen-Zellen mit Ursprung von Nicotiana tabacum bekannt als Protein-Produktionssysteme und können als Kallus-Kulturen verwendet werden. Als Pilz-Zellen sind Hefezellen wie Saccharomyces, einschließlich Saccharomyces cerevisiae, oder Fadenpilze wie Aspergillus, einschließlich Aspergillus niger, bekannt und können hierin verwendet werden.
Brauchbare prokaryontische Zellen beinhalten bakterielle Zellen wie E. coli, zum Beispiel JM109, DH5α und HB101. Andere bakterielle Systeme beinhalten Bacillus subtilis.
Diese Zellen werden durch eine erwünschte DNA transformiert, und die resultierenden Transformanten werden in vitro gezüchtet, um das Protein zu erhalten. Transformanten können unter Verwendung bekannter Verfahren gezüchtet werden. Kulturmedium für tierische Zellen schließt zum Beispiel DMEM, MEM, RPM11640 oder IMDM ein, kann mit oder ohne Serum-Anreicherung wie fetales Kälberserum (FCS) verwendet werden. Der pH-Wert des Kulturmediums liegt vorzugsweise zwischen etwa 6 und 8. Solche Zellen werden üblicherweise bei etwa 30 bis 40°C für etwa 15 bis 200 Std. gezüchtet, und das Kulturmedium kann, wenn nötig, ersetzt, durchlüftet oder gerührt werden.
Tier- und Pflanzen-Wirte können für in vivo-Produktion verwendet werden. Zum Beispiel kann eine erwünschte DNA in einen tierischen oder Pflanzen-Wirt transfiziert werden. Codierte Proteine werden in vivo produziert und dann gewonnen. Diese Tier- und Pflanzen-Wirte sind in Wirtszellen der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Tiere, die für das vorstehend beschriebene Produktionssystem zur Anwendung kommen, schließen Säuger und Insekten ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Säuger wie Ziege, Schwein, Schaf, Maus und Rind können verwendet werden (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). Alternativ können Säuger transgene Tiere sein.
Zum Beispiel kann eine erwünschte DNA als ein Fusionsgen hergestellt werden, durch Fusion mit einem Gen wie dem Ziegen-β-Casein-Gen, das ein Protein codiert, das spezifisch in die Milch produziert wird. DNA-Fragmente, umfassend das Fusionsgen, werden in Ziegen-Embryonen injiziert, die dann in weibliche Ziegen eingepflanzt werden. Proteine werden aus der Milch, die von den transgenen Ziegen produziert wird (d.h. jene, die von den Ziegen geboren wurden, die die modifizierten Embryonen erhalten haben), gewonnen, oder von deren Nachkommen. Um die Menge der Milch zu erhöhen, die die Proteine enthält, die von transgenen Ziegen produziert werden, können entsprechende Hormone an sie verabreicht werden (Ebert K. M. et al. Bio/Technology 12:699-702 (1994)).
Alternativ können Insekten wie die Seidenraupe verwendet werden. Eine DNA, die ein erwünschtes Protein codiert und in Baculovirus inseriert wurde, kann verwendet werden, um Seidenraupen zu transfizieren, und das erwünschte Protein kann aus deren Körperflüssigkeit gewonnen werden (Susumu M. et al. Nature 315: 592-594 (1985)).
Als Pflanzen kann zum Beispiel Tabak verwendet werden. Bei der Verwendung von Tabak kann eine DNA, die ein erwünschtes Protein codiert, in einen Pflanzen-Expressionsvektor wie pMON530 inseriert werden, der in Bakterien wie Agrobacterium tumefaciens eingebracht wird. Dann wird das Bakterium verwendet, um eine Tabak-Pflanze wie Nicotiana tabacum zu transfizieren, und ein erwünschtes Polypeptid wird aus deren Blättern gewonnen (Julian K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. 24: 131-138 (1994)).
Ein Protein der vorliegenden Erfindung, das wie vorstehend gewonnen wurde, kann von innerhalb oder außerhalb (wie Medium) der Wirtszellen isoliert und als ein im Wesentlichen reines, homogenes Protein aufgereinigt werden. Das Verfahren für die Proteinisolation und -aufreinigung ist nicht auf ein spezielles Verfahren limitiert; in der Tat kann jedes Standard-Verfahren verwendet werden. Zum Beispiel können Säulenchromatographie, Filter, Ultrafiltration, Salz-Präzipitation, Lösungsmittel-Präzipitation, Lösungsmittel-Extraktion, Destillation, Immun-Präzipitation, SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, isoelektrischer Punkt-Elektrophorese, Dialyse und Rekristallisation passend selektiert und kombiniert werden, um das Protein zu isolieren und aufzureinigen.
Beispiele für Chromatographie beinhalten zum Beispiel Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gel-Filtration, Umkehrphasen-Chromatographie, Adsorptions-Chromatographie und dergleichen (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Hrsg. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Diese Chromatographien können durch Flüssig-Chromatographie wie HPLC und FPLC durchgeführt werden. Daher liefert die vorliegende Erfindung hochgereinigte Proteine, die durch die vorstehenden Verfahren hergestellt werden.
Ein Protein der vorliegenden Erfindung kann durch Behandlung mit einem geeigneten Protein-Modifizierungs-Enzym vor oder nach der Aufreinigung wahlweise modifiziert oder teilweise deletiert werden. Brauchbare Protein-Modifizierungs-Enzyme beinhalten, aber sind nicht limitiert auf, Trypsin, Chymotrypsin, Lysylendopeptidase, Protein-Kinase, Glucosidase und so weiter.
Die vorliegende Erfindung liefert einen Antikörper, der an das Gros1-L-Protein der Erfindung bindet. Der Antikörper der Erfindung kann in jeglicher Form wie monoclonale oder polyclonale Antikörper verwendet werden, und beinhaltet Antiserum, das durch Immunisierung eines Tieres wie eines Kaninchens mit dem Protein der Erfindung gewonnen wird, alle Klassen von polyclonalen und monoclonalen Antikörpern, menschliche Antikörper und humanisierte Antikörper, die durch genetische Rekombination hergestellt werden.
Ein Protein der Erfindung, das als ein Antigen verwendet wird, um einen Antikörper zu gewinnen, kann von jeglichen Tierarten abstammen, aber bevorzugt stammt es von einem Säuger wie einem Menschen, Maus oder Ratte, mehr bevorzugt von einem Menschen. Ein von Menschen stammendes Protein kann von den Nucleotid- oder Aminosäurensequenzen, die hierin offenbart werden, gewonnen werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Protein, das als ein Immunisierungs-Antigen zur Anwendung kommt, ein komplettes Protein oder ein Teilpeptid des Proteins sein. Ein Teilpeptid kann zum Beispiel das Amino (N)-terminale oder Carboxyl (C)-terminale-Fragment eines Proteins der vorliegenden Erfindung umfassen. Hierin ist ein Antikörper definiert als ein Protein, das mit entweder der vollen Länge oder einem Fragment eines Proteins der vorliegenden Erfindung reagiert.
Ein Gen, das ein Protein der Erfindung oder dessen Fragment codiert, darf in einen bekannten Expressionsvektor inseriert werden, der dann verwendet wird, um eine Wirtszelle, wie hierin beschrieben, zu transformieren. Das erwünschte Protein oder sein Fragment kann von außerhalb oder innerhalb der Wirtszellen durch jegliche Standard-Verfahren gewonnen werden und kann in der Folge als ein Antigen verwendet werden. Alternativ können Zellen, die das Protein oder dessen Lysate exprimieren, oder ein chemisch synthetisiertes Protein als das Antigen verwendet werden.
Jegliches Säugetier kann mit dem Antigen immunisiert werden, aber vorzugsweise wird die Kompatibilität mit den Eltern-Zellen, die für die Zellfusion verwendet werden, in Betracht gezogen. Im Allgemeinen werden Tiere der Rodentia, Lagomorpha oder Primaten verwendet.
Tiere der Rodentia schließen zum Beispiel Maus, Ratte und Hamster ein. Tiere der Lagomorpha beinhalten zum Beispiel Kaninchen. Tiere der Primaten beinhalten zum Beispiel Schmalnasenaffen (Alte-Welt-Affe) wie Macaca fascicularis, Rhesus-Affen, Mantelpavian und Schimpansen.
Verfahren für die Immunisierung von Tieren mit Antigenen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Intraperitoneale Injektion oder subcutane Injektion von Antigenen sind ein Standard-Verfahren für die Immunisierung von Säugern. Spezifischer können Antigene in einer geeigneten Menge von Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), physiologischer Kochsalzlösung, etc. verdünnt oder suspensiert werden. Wenn gewünscht, kann die Antigen-Suspension mit einer geeigneten Menge eines Standard-Adjuvans komplettes Freundsches Adjuvans gemischt werden, in Emulsion gebracht werden und dann an Säuger verabreicht werden. Vorzugsweise folgen einige Verabreichungen des Antigens, gemischt mit einer geeigneten Menge von inkomplettem Freundschem Adjuvans, alle 4 bis 21 Tage. Ein geeigneter Träger für die Immunisierung kann auch verwendet werden. Nach der Immunisierung wie vorstehend wird das Serum durch Standard-Verfahren auf eine Erhöhung der Menge der erwünschten Antikörper untersucht.
Polyclonale Antikörper gegen die Proteine der vorliegenden Erfindung können durch die Entnahme von Blut vom immunisierten Säuger, der auf die Zunahme der erwünschten Antikörper im Serum untersucht wurde, und durch Trennung des Serums vom Blut durch irgendeine konventionelle Methode hergestellt werden. Polyclonale Antikörper schließen Serum, das die polyclonalen Antikörper enthält, ein und die Fraktion, die die polyclonalen Antikörper enthält, kann aus dem Serum isoliert werden. Immunglobulin G oder M kann aus einer Fraktion, die nur das Protein der vorliegenden Erfindung erkennt, hergestellt werden, unter Verwendung von zum Beispiel einer Affinitäts-Säule, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung gekoppelt ist, und weiterer Aufreinigung dieser Fraktion durch Verwendung einer Protein A- oder Protein G-Säule.
Um monoclonale Antikörper herzustellen, werden immune Zellen von dem Säuger gewonnen, der mit dem Antigen immunisiert wurde, und auf den erhöhten Wert des erwünschten Antikörpers im Serum, wie vorstehend beschrieben, überprüft und einer Zellfusion unterzogen. Die immunen Zellen, die für die Zellfusion verwendet werden, werden vorzugsweise aus Milz gewonnen. Andere bevorzugte Eltern-Zellen, die mit der vorstehenden Immunocyte fusioniert werden sollen, beinhalten zum Beispiel Myelomzellen von Säugern und mehr bevorzugt Myelomzellen, die eine erworbene Eigenschaft für die Selektion von fusionierten Zellen durch Arzneistoffe aufweisen. Die vorstehenden Immunocyte und Myelomzellen können gemäß bekannten Verfahren fusioniert werden, zum Beispiel dem Verfahren nach Milstein et al. (Galfre, G. und Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
Resultierende Hybridome, die durch Zellfusion erhalten werden, können durch deren Züchten in einem Standard-Selektionsmedium wie HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthaltendes Medium) selektiert werden. Die Zellkultur wird üblicherweise für einige Tage bis einige Wochen im HAT-Medium fortgesetzt, die Zeit, die ausreichend ist, um allen anderen Zellen mit Ausnahme der erwünschten Hybridome (nicht-fusionierte Zellen) ein Sterben zu ermöglichen. Dann wird die limitierende Standard Verdünnung durchgeführt, um auf eine Hybridom-Zelle zu durchmustern, die den erwünschten Antikörper produziert, und diese zu clonieren. Zusätzlich zu dem vorstehenden Verfahren, in dem ein nicht-menschliches Tier mit einem Antigen für die Herstellung von Hybridomen immunisiert wird, kann ein Hybridom, das einen erwünschten menschlichen Antikörper produziert, der im Stande ist, an das Protein zu binden, durch das folgende Verfahren erhalten werden. Zuerst können menschliche Lymphocyten so wie jene, die durch EB-Virus infiziert sind, mit einem Protein, Protein exprimierenden Zellen oder deren Lysaten in vitro immunisiert werden. Dann werden die immunisierten Lymphocyten mit von Menschen stammenden Myelom-Zellen fusioniert, die fähig sind, sich unendlich zu teilen, so wie U266, um das erwünschte Hybridom zu erhalten (Ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patent-Anmeldung Nr. (JP-A) Sho 63-17688).
Die erhaltenen Hybridome werden in der Folge in die Abdominalhöhle einer Maus transplantiert, und die Bauchhöhlenflüssigkeit wird geerntet. Die erhaltenen monoclonalen Antikörper können zum Beispiel durch Ammonium-Sulfat-Präzipitation, eine Protein A- oder Protein G-Säule, DEAE-Ionenaustausch-Chromatographie oder eine Affinitäts-Säule, an die das Protein der vorliegenden Erfindung gekoppelt ist, aufgereinigt werden. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann nicht nur für Aufreinigung und den Nachweis des Proteins der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sondern auch als ein Kandidat für Agonisten und Antagonisten des Proteins der vorliegenden Erfindung. Zusätzlich kann dieser Antikörper in der Antikörper-Behandlung von Krankheiten, die zum Protein der vorliegenden Erfindung in Verbindung stehen, angewendet werden. Wenn der erhaltene Antikörper an den menschlichen Körper verabreicht werden soll (Antikörper-Behandlung), wird ein menschlicher Antikörper oder ein humanisierter Antikörper bevorzugt, um die Immunogenität zu verringern.
Zum Beispiel können transgene Tiere, die ein Repertoire an menschlichen Antikörper-Genen aufweisen, mit einem Antigen, das von einem Protein, Proteinexprimierenden Zellen oder deren Lysaten selektiert wurde, immunisiert werden. Antikörper produzierende Zellen werden dann von den Tieren gesammelt und mit Myelom-Zellen fusioniert, um Hybridome zu erhalten, von denen menschliche Antikörper gegen das Protein hergestellt werden können (vgl. WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO94-25585, WO96-33735 und WO96-34096).
Alternativ kann eine immune Zelle wie ein immunisierter Lymphocyt, der Antikörper produziert, durch ein Oncogen immortalisiert werden und für die Herstellung von monoclonalen Antikörpern verwendet werden.
Monoclonale Antikörper, die so erhalten werden, können auch rekombinant unter Verwendung von Gentechnik-Verfahren hergestellt werden (vgl. zum Beispiel Borrebaeck C. A. K. und Larrick J. W. Therapeutic Monoclonal Antibodies, publiziert im Vereinigten Königreich von MacMillan Publishers LTD (1990)). Eine DNA, die einen Antikörper codiert, kann von einer immunen Zelle wie einem Hybridom oder einem immunisierten Lymphocyt, der den Antikörper produziert, cloniert werden, in einen geeigneten Vektor inseriert werden und in Wirtszellen eingebracht werden, um einen rekombinanten Antikörper herzustellen. Die vorliegende Erfindung liefert auch rekombinante Antikörper, die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt werden.
Darüber hinaus kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung ein Fragment eines Antikörpers oder modifizierten Antikörpers sein, so lange er an ein oder mehrere der Proteine der Erfindung bindet. Zum Beispiel kann das Antikörper-Fragment Fab, F(ab')₂, Fv oder Einzelketten-Fv (scFv) sein, in dem Fv-Fragmente von H- oder L- Ketten durch einen geeigneten Linker ligiert sind (Huston J. S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883 (1988)). Genauer, ein Antikörper-Fragment kann durch Behandlung eines Antikörpers mit einem Enzym wie Papain oder Pepsin erzeugt werden. Alternativ kann ein Gen, das das Antikörper-Fragment codiert, erstellt, in einen Expressionsvektor inseriert und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden (vgl. zum Beispiel Co M. S. et al. J. Immunol. 152:2968-2976 (1994); Better M. und Horwitz A. H. Methods Enzymol. 178:476-496 (1989); Pluckthun A. und Skerra A. Methods Enzymol. 178:497-515 (1989); Lamoyi E. Methods Enzymol. 121:652-663 (1986); Rousseaux J. et al. Methods Enzymol. 121:663-669 (1986); Bird R. E. und Walker B. W. Trends Biotechnol. 9:132-137 (1991)).
Ein Antikörper kann durch Konjugation mit einer Vielzahl von Molekülen wie Polyethylen-Glykol (PEG) modifiziert werden. Die vorliegende Erfindung liefert solche modifizierten Antikörper. Der modifizierten Antikörper kann durch chemische Modifizierung eines Antikörpers erhalten werden. Diese Modifikations-Verfahren sind in dem Fachbereich üblich.
Alternativ kann ein Antikörper der vorliegenden Erfindung als ein chimärer Antikörper zwischen einer variablen Region, die von einem nicht-menschlichen Antikörper stammt, und der konstanten Region, die von einem menschlichen Antikörper stammt, oder als ein humanisierter Antikörper, umfassend die Komplementaritätsbestimmende Region (CDR), die von einem nicht-menschlichen Antikörper stammt, die Gerüst-Region (FR), von einem menschlichen Antikörper stammend, und die konstante Region, erhalten werden. Solche Antikörper können durch die Verwendung von bekannten Methoden hergestellt werden.
Antikörper, die wie vorstehend erhalten wurden, können zur Homogenität aufgereinigt werden. Zum Beispiel kann die Separation und Aufreinigung des Antikörpers entsprechend den Separations- und Aufreinigungs-Verfahren, die für allgemeine Proteine verwendet werden, durchgeführt werden. Zum Beispiel kann der Antikörper durch die passend selektierte und kombinierte Verwendung von Säulen-Chromatographien wie Affinitäts-Chromatographie, Filter, Ultrafiltration, Aus-Salzen, Dialyse, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, isoelektrische Fokusierung und andere (Antibodies: A Laboratory Manual. Hrsg. Harlow und David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), jedoch ohne Beschränkung darauf, abgetrennt und isoliert werden.
Eine Protein A-Säule und Protein G-Säule kann als die Affinitäts-Säule verwendet werden. Beispielhafte Protein A-Säulen, die zur Verwendung kommen sollen, beinhalten zum Beispiel Hyper D, POROS und Sepharose F.F. (Pharmacia).
Beispielhafte Chromatographie, mit Ausnahme der Affinität, beinhalten zum Beispiel Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gel-Filtration, Umkehrphasen-Chromatographie, Adsorptions-Chromatographie und dergleichen (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Hrsg. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). Die Chromatographie-Methoden können durch Flüssigphasen-Chromatographie wie HPLC, FPLC ausgeführt werden.
Zum Beispiel können Messung der Absorption, enzym-verbundener Immunadsorptionstest (ELISA), Enzym-Immuntest (EIA), Radio-Immuntest (RIA) und/oder Immun-Fluoreszenz verwendet werden, um die Antigenbindungs-Aktivität des Antikörpers der Erfindung zu messen. Beim ELISA ist der Antikörper der vorliegenden Erfindung auf einer Platte immobilisiert, Protein der Erfindung wird auf die Platte aufgebracht, und dann wird eine Probe, die den erwünschten Antikörper enthält, wie Kultur-Überstand von Antikörper produzierenden Zellen oder gereinigte Antikörper aufgebracht. Dann wird ein Sekundär-Antikörper, der den Primär-Antikörper erkennt, und mit einem Enzym wie alkalischer Phosphatase markiert ist, aufgebracht, und die Platte wird inkubiert. Als nächstes wird nach dem Waschen ein Enzymsubstrat wie p-Nitrophenyl-Phosphat zu der Platte hinzugefügt, und das Absorptionsvermögen wird gemessen, um die Antigenbindungs-Aktivität der Probe zu bewerten. Ein Fragment des Proteins wie eine C-terminales oder N-terminales Fragment kann als ein Protein verwendet werden. BIAcore (Pharmacia) kann verwendet werden, um die Aktivität des Antikörpers gemäß der vorliegenden Erfindung zu beurteilen.
Die vorstehenden Verfahren ermöglichen den Nachweis oder die Messung des Proteins der Erfindung durch Aussetzen des Antikörpers der Erfindung einer Probe gegenüber, von der angenommen wird, dass sie das Protein der Erfindung enthält, und Nachweis oder Messen des Immun-Komplexes, der durch Antikörper und das Protein geformt wird.
Da das Verfahren für Nachweis oder Messung des Proteins gemäß der Erfindung ein Protein spezifisch nachweisen oder messen kann, kann das Verfahren für eine Vielzahl von Experimenten, in denen das Protein verwendet wird, nützlich sein.
Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Polynucleotid, das mit der DNA hybridisiert, die menschliches oder Maus-Gros1-Protein, im speziellen Gros1-L-Protein (SEQ ID NO: 3 oder 5), oder den komplementären Strang davon codiert und das mindestens 15 Nucleotide umfasst. Das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise ein Polynucleotid, das spezifisch mit der DNA hybridisiert, die das Protein der vorliegenden Erfindung codiert. Der Ausdruck ,spezifisch hybridisiert', wie hierin verwendet, bedeutet, dass Kreuz-Hybridisierung mit DNA, die andere Proteine codiert unter den üblichen Hybridisierungs-Bedingungen, bevorzugt unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen, nicht wesentlich auftritt. Solche Polynucleotide beinhalten Sonden, Primer, Nucleotide und Nucleotid-Derivate (zum Beispiel Antisense-Oligonucleotide und Ribozyme), die spezifisch mit DNA, die das Protein der Erfindung oder deren komplementären Strang codiert, hybridisieren. Darüber hinaus können solche Polynucleotide für die Herstellung eines DNA-Chips verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet ein Antisense-Oligonucleotid, das mit jeglichem Bereich innerhalb der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 hybridisiert. Dieses Antisense-Oligonucleotid ist vorzugsweise gegen mindestens 15 fortlaufende Nucleotide der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 gerichtet. Das vorstehend erwähnte Antisense-Oligonucleotid, das ein Start-Codon in den vorstehend erwähnten mindestens 15 fortlaufenden Nucleotiden enthält, ist noch mehr bevorzugt.
Derivate oder modifizierte Produkte der Antisense-Oligonucleotide können als Antisense-Oligonucleotide verwendet werden. Beispiele für solche modifizierten Produkte beinhalten niedrigere Alkyl-Phosphonat-Modifikationen wie vom Methyl-Phosphonat-Typ- oder Ethyl-Phosphonate-Typ-, Phosphorothioat-Modifikationen und Phosphoroamidat-Modifikationen.
Der Ausdruck ,Antisense-Oligonucleotide', wie hierin verwendet, bedeutet, dass nicht nur jene gänzlich komplementär sind, in denen die Nucleotide, die den jenen entsprechen, die eine bestimmte Region einer DNA oder mRNA darstellen, sondern auch jene, die eine Fehlpaarung eines oder mehrerer Nucleotide aufweisen, so lange die DNA oder mRNA und die Antisense-Oligonucleotide spezifisch mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 hybridisieren können.
Solche Polynucleotide sind enthalten als jene, die in der ,mindestens 15 fortlaufende Nucleotid-Sequenzregion' eine Homologie von mindestens 70% oder höher aufweisen, bevorzugt von 80% oder höher, mehr bevorzugt 90% oder höher und noch mehr bevorzugt 95% oder höher. Der Algorithmus, der hierin angegeben ist, kann verwendet werden, um die Homologie zu bestimmen. Solche Polynucleotide sind als Sonden für die Isolierung oder den Nachweis von DNA, die das Protein der Erfindung codiert, wie in einem späteren Beispiel angegeben, oder als ein Primer, der für Amplifikationen verwendet wird, nützlich.
Die Antisense-Oligonucleotid-Derivate der vorliegenden Erfindung wirken auf Zellen, die das Protein der Erfindung produzieren, durch Bindung an die DNA oder mRNA, codierend das Protein, Inhibierung ihrer Transkription oder Translation, Förderung des Abbaus der mRNA und Inhibition der Expression des Proteins der Erfindung, wodurch es zur Inhibition der Funktion des Proteins kommt.
Ein Antisense-Oligonucleotid-Derivat der vorliegenden Erfindung kann durch Mischung mit einem passenden Basis-Stoff, der inaktiv gegen die Derivate ist, in ein externes Präparat wie ein Einreibemittel oder eine Breipackung überführt werden. Die Derivate können auch, je nach Bedarf, in Tabletten, Puder, Granula, Kapseln, Liposomen-Kapseln, Injektionen, Lösungen, Nasentropfen und gefrier-getrocknete Agentien durch Zugabe von Excipienten, isotonischen Agentien, Lösungsmitteln, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln, Schmerzmitteln und dergleichen formuliert werden. Diese können durch die folgenden üblichen Verfahren hergestellt werden. Das Antisense-Oligonucleotid-Derivat wird dem Patienten durch direkte Verabreichung auf die leidende Stelle oder durch Injektion in ein Blutgefäß gegeben, so dass es die Stelle des Leidens erreicht. Ein Antisense-Einbettungsmedium kann auch verwendet werden, um die Haltbarkeit und Membran-Permeabilität zu erhöhen. Beispiele sind Liposom, poly-L-Lysin, Lipid, Cholesterin, Lipofectin oder Derivate von diesen.
Die Dosis vom Antisense-Oligonucleotid-Derivat der vorliegenden Erfindung kann entsprechend dem Zustand des Patienten passend angeglichen und in den gewünschten Mengen verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Dosis-Bereich von 0,1 bis 100 mg/kg, vorzugsweise 0,1 bis 50 mg/kg verabreicht werden.
Das Antisense-Oligonucleotid der Erfindung inhibiert die Expression des Proteins der Erfindung und ist dabei nützlich für die Unterdrückung der biologischen Aktivität des Proteins der Erfindung. Auch Expressions-Inhibitoren, umfassend das Antisense-Oligonucleotid der Erfindung, sind nützlich in dem Punkt, dass sie die biologische Aktivität des Proteins der Erfindung inhibieren können.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren für die Durchmusterung nach einer Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung. Dieses Durchmusterungs-Verfahren umfasst die Schritte von: (a) Inkontaktbringen des Proteins der vorliegenden Erfindung oder eines Teilpeptids davon mit einer Probe, (b) Nachweis der Bindungsaktivität zwischen dem Protein der vorliegenden Erfindung oder dem Teilpeptid davon und der Probe, und (c) Auswahl einer Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung oder das Teilpeptid davon bindet.
Das Protein der vorliegenden Erfindung, das für die Durchmusterung zur Anwendung kommen soll, darf ein rekombinantes Protein sein, oder ein Protein, das aus der Natur stammt, oder ein Teilpeptid davon. Jegliche Probe, zum Beispiel Zell-Extrakte, Zellkultur-Überstand, Produkte von fermentierenden Mikroorganismen, Extrakte eines Meeresorganismus, Pflanzen-Extrakte, gereinigte oder Roh-Proteine, Peptide, nicht-Peptid Verbindungen, synthetische micromolekulare Verbindungen und natürliche Verbindungen können verwendet werden. Das Protein der vorliegenden Erfindung, das mit einer Probe in Kontakt gebracht werden soll, kann zum Beispiel ein gereinigtes Protein, ein lösliches Protein, eine Form, die an einen Träger gebunden ist, oder ein Fusionsprotein, das mit anderen Proteinen fusioniert ist, sein. Als ein Verfahren für die Durchmusterung nach Proteinen, zum Beispiel die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden unter Verwendung des Proteins der vorliegenden Erfindung können viele Verfahren, die einem Fachmann wohlbekannt sind, verwendet werden. Solch eine Durchmusterung kann zum Beispiel durch ein Immun-Präzipitations-Verfahren insbesondere in der folgenden Art durchgeführt werden. Das Gen, das das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, wird durch Insertion des Gens in einen Expressionsvektor für fremde Gene, wie pSV2neo, pcDNA I und pCD8, in tierischen Zellen und so weiter exprimiert. Der Promotor, der für die Expression zur Verwendung kommen soll, darf jeglicher Promotor sein, der gewöhnlich verwendet wird, und schließt zum Beispiel den frühen SV40-Promotor (Rigby in Williamson (Hrsg.), Genetic Engineering, Bd. 3. Academic Press, London, S. 83-141 (1982)), den EF-1α-Promotor (Kim et al., Gene 91, S.217-223 (1990)), den CAG-Promotor (Niwa et al. Gene 108, S. 193-200 (1991)), den RSV LTR-Promotor (Cullen Methods in Enzymology 152, S. 684-704 (1987)), den SRα-Promotor (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8, S. 466 (1988)), den sehr frühen CMV-Promotor (Seed und Aruffo Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, S. 3365-3369 (1987)), den SV40-Promotor (Gheysen und Fiers J. Mol. Appl. Genet. 1, S. 385-394 (1982)), den späten Adenovirus-Promotor (Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 9, S. 946 (1989)), den HSV-TK-Promotor und so weiter, ein. Das Einbringen des Gens in tierische Zellen, um ein fremdes Gen zu exprimieren, kann gemäß jeglichen Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel das Elektroporations-Verfahren (Chu G. et al. Nucl. Acids Res. 15, 1311-1326 (1987)), das Calcium-Phosphat-Verfahren (Chen, C und Okayama, H. Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752 (1987), das DEAE-Dextran-Verfahren (Lopata, M. A. et al. Nucl. Acids Res. 12, 5707-5717 (1984)), Sussman, D. J. und Milman, G. Mol. Cell. Biol. 4, 1642-1643 (1985)), das Lipofectin-Verfahren (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B. T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993): Rabindran, S. K. et al. Science 259, 230-234 (1993)) und so weiter. Das Protein der vorliegenden Erfindung kann als ein Fusionsprotein, umfassend eine Erkennungs-Stelle (Epitop) von einem monoclonalen Antikörper durch Einbringen des Epitops des monoclonalen Antikörpers, dessen Spezifität aufgezeigt wurde, in das N- oder C-Ende des Proteins der vorliegenden Erfindung exprimiert werden. Ein kommerziell erhältliches Epitop-Antikörper-System kann verwendet werden (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)). Vektoren, die ein Fusionsprotein mit zum Beispiel β-Galaktosidase, Maltose-Bindungs-Protein, Glutathion-S-Transferase, Grün-fluoreszierendem Protein (GFP) und so weiter durch Verwendung ihrer multiplen Clonierungs-Stellen exprimieren können, sind kommerziell erhältlich.
Von einem Fusionsprotein, das durch Einbringen von nur kleinen Epitopen, bestehend aus einigen bis ein Dutzend Aminosäuren, so dass die Eigenschaft des Proteins der vorliegenden Erfindung durch die Fusion nicht verändert wird, hergestellt wurde, wurde auch berichtet. Epitope wie Polyhistidin (His-Marker), Influenza-Aggregat-HA, menschliches c-myc, FLAG, Vesikuläres Stomatitis-Virus-Glycoprotein (VSV-GP), T7-Gen 10-Protein (T7-Marker), menschliches Herpes simplex-Virus-Glycoprotein (HSV-Marker), E-Marker (ein Epitop auf monoclonalem Phagen) und dergleichen und monoclonale Antikörper, die diese erkennen, können als das Epitop-Antikörper-System für die Durchmusterung nach Proteinen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, verwendet werden (Experimental Medicine 13, 85-90 (1995)).
Bei Immun-Präzipitation wird ein Immunkomplex durch die Zugabe dieser Antikörper zu einem Zell-Lysat, das durch Verwendung eines geeigneten Detergens hergestellt wurde, gebildet. Der Immunkomplex besteht aus dem Protein der vorliegenden Erfindung, einem Protein, umfassend die Bindungsfähigkeit mit dem Protein, und einem Antikörper. Immun-Präzipitation kann auch durch Verwendung von Antikörpern gegen das Protein der vorliegenden Erfindung, neben der Verwendung von Antikörpern gegen die vorstehenden Epitope, durchgeführt werden. Ein Antikörper gegen das Protein der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, zum Beispiel durch Einbringung eines Gens, das das Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in einen geeigneten E. coli-Expressionsvektor, der das Gen in E.coli exprimiert, Aufreinigung des exprimierten Proteins und Immunisierung von Kaninchen, Mäusen, Ratten, Ziegen, Hausgeflügel und dergleichen gegen das Protein. Der Antikörper kann auch durch Immunisierung der vorstehenden Tiere gegen ein synthetisiertes Teilpeptid des Proteins der vorliegenden Erfindung hergestellt werden.
Ein Immunkomplex kann präzipitiert werden, zum Beispiel durch Protein-A-Sepharose oder Protein-G-Sepharose, wenn der Antikörper ein Maus-IgG-Antikörper ist. Wenn das Protein der vorliegenden Erfindung als ein Fusionsprotein mit einem Epitop wie GST hergestellt wird, kann ein Immunkomplex in der gleichen Weise wie bei der Verwendung des Antikörpers gegen das Protein der vorliegenden Erfindung, durch Verwendung einer Substanz, die spezifisch an diese Epitope bindet, wie Glutathion-Sepharose-4B, geformt werden.
Immunpräzipitation kann durch folgende Verfahren oder gemäß zum Beispiel den Verfahren in der Literatur (Harlow, E. und Lane, D.: Antibodies S. 511-552, Cold Spring Harbor Laboratory publications, New York (1988)) durchgeführt werden.
SDS-PAGE wird gewöhnlich für die Analyse von immunpräzipitierten Proteinen verwendet, und das gebundene Proteine kann durch das Molekulargewicht des Proteins durch Verwendung von Gelen mit einer geeigneten Konzentration analysiert werden. Da das Protein, das an das Protein der vorliegenden Erfindung gebunden ist, schwierig durch ein übliches Färbungsverfahren wie Coomassie-Färbung oder Silber-Färbung nachzuweisen ist, kann die Nachweisempfindlichkeit für das Protein durch Züchtung von Zellen in Kulturmedium, enthaltend radioaktive Isotope, ³⁵S-Methionin oder ³⁵S-Cystein, Markierung von Proteinen in den Zellen und Nachweis der Proteine verbessert werden. Das Ziel-Protein kann direkt aus dem SDS-Polyacrylamid-Gel aufgereinigt werden, und seine Sequenz kann bestimmt werden, wenn das Molekulargewicht eines Proteins aufgedeckt wurde.
Als ein Verfahren für die Isolierung von Proteinen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, kann unter Verwendung des Proteins zum Beispiel Western Blot-Analyse (Skolnik, E. Y. et al., Cell (1991) 65, 83-90) verwendet werden. Im Speziellen kann ein Protein, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, erhalten werden durch Herstellung einer cDNA-Genbank aus Zellen, Geweben, Organen (zum Beispiel Gewebe wie Ovar, Hoden und Plazenta oder kultivierte Zellen), von denen erwartet wird, dass sie ein Protein, das an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, exprimieren durch Verwendung eines Phagen-Vektors (λgt11, ZAP, etc.), Exprimierung des Proteins auf LB-Agarose, Fixierung des Proteins, das auf einem Filter exprimiert wird, Reagierenlassen des gereinigten und markierten Proteins der vorliegenden Erfindung mit dem vorstehenden Filter, und Bestimmung der Plaques, die Proteine exprimieren, gebunden an das Protein der vorliegenden Erfindung, gemäß der Markierung. Das Protein der Erfindung kann durch Benützung der Bindung zwischen Biotin und Avidin oder durch Benützung eines Antikörpers, der spezifisch an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, oder eines Peptids oder Polypeptids (zum Beispiel GST), das an das Protein der vorliegenden Erfindung fusioniert ist, markiert werden. Verfahren, die Radioisotope oder Fluoreszenz und dergleichen verwenden, dürfen auch verwendet werden.
Alternativ kann in einer anderen Ausführungsform des Durchmusterungs-Verfahrens der vorliegenden Erfindung ein Zwei-Hybrid-System, das Zellen benutzt, verwendet werden (,MATCHMAKER Two-Hybrid system', ,Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit', ,MATCHMAKER one-Hybrid system' (Clontech); ,HybriZAP Two-Hybrid Vector System' (Stratagene); die Referenzen ,Dalton S, und Treisman R (1992) Cell 68, 597-612', ,Fields S. und Sternglanz R. Trends Genet. (1994) 10:286-292').
In dem Zwei-Hybrid-System wird das Protein der Erfindung an die SRF bindende Region oder GAL4 bindende Region fusioniert und in Hefezellen exprimiert. Eine cDNA-Genbank wird aus Zellen hergestellt, von denen angenommen wird, dass sie ein Protein exprimieren, das an das Protein der Erfindung bindet, so dass die Genbank, wenn exprimiert, an die VP16- oder GAL4-Transkriptions-Aktivierungs-Region fusioniert wird. Die cDNA-Genbank wird dann in die vorstehenden Hefezellen eingebracht und die cDNA, die aus der Genbank stammt, wird aus den als positiv nachgewiesenen Clonen isoliert (wenn ein Protein, bindend an das Protein der Erfindung, in Hefezellen exprimiert wird, aktiviert die Bindung der beiden ein Reporter-Gen, das positive Clone nachweisbar macht). Ein Protein, das durch die cDNA codiert wird, kann durch Einbringen der cDNA, die vorstehend isoliert wurde, in E. coli und Expression des Proteins hergestellt werden.
Als ein Reporter-Gen können zum Beispiel neben dem HIS3-Gen das Ade2-Gen, IacZ-Gen, CAT-Gen, Luciferase-Gen und dergleichen verwendet werden.
Eine Verbindung, die an das Protein der vorliegenden Erfindung bindet, kann unter Verwendung von Affinitäts-Chromatographie durchmustert werden. Zum Beispiel kann das Protein der Erfindung auf einem Träger einer Affinitäts-Säule immobilisiert werden, und eine Test-Probe, enthaltend das Protein, das fähig ist, an das Protein der Erfindung zu binden, von dem erwartet wird, dass es exprimiert wird, wird auf die Säule aufgetragen. Eine Test-Probe hierin kann zum Beispiel Zell-Extrakte, Zell-Lysate, etc. sein. Nach dem Laden der Test-Probe wird die Säule gewaschen, und die Proteine, die an das Protein der Erfindung gebunden sind, können hergestellt werden.
Die Aminosäuresequenz des erhaltenen Proteins wird analysiert, eine Oligo-DNA wird basierend auf der Sequenz synthetisiert, und cDNA-Genbanken werden unter Verwendung der Oligo-DNA als eine Sonde zum Erhalt einer DNA, die das Protein codiert, durchmustert.
Ein Biosensor, der das Oberflächenplasmonresonanz-Phänomen verwendet, kann als ein Mittel für den Nachweis oder die Quantifizierung der gebundenen Verbindung in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wenn solch ein Biosensor verwendet wird, kann die Interaktion zwischen dem Protein der Erfindung und einer Test-Verbindung in Echt-Zeit als ein Oberflächenplasmonresonanz-Signal beobachtet werden, wobei von nur eine winzige Menge an Protein ohne Markierung verwendet wird (zum Beispiel BIAcore, Pharmacia). Daher ist es möglich, die Bindung zwischen dem Protein der Erfindung und einer Test-Verbindung unter Verwendung eines Biosensors wie BIAcore zu bewerten.
Die Verfahren zur Durchmusterung nach Molekülen, die binden, wenn das immobilisierte Protein der vorliegenden Erfindung synthetischen, chemischen Verbindungen oder natürlichen Substanz-Banken oder einer zufälligen Phagen-Peptid-Präsentations-Genbank oder den Verfahren der Durchmusterung unter Verwendung von hohen Durchgängen basierend auf kombinatorischen chemischen Methoden (Wrighton Nc, Farrel FX, Chang R, Kashyap AK, Barbone FP, Mulcahy LS, Johnson DL, Barret RW, Jolliffe LK, Dower WJ; Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 S. 458-64, Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384, S. 11-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 S. 17-9), ausgesetzt wird, um nicht nur Proteine, sondern auch chemische Verbindungen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung (einschließlich Agonist und Antagonist) binden, sind einem Fachmann wohlbekannt.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch eine Verbindung, die durch die Durchmusterung isoliert wurde, als Kandidat für Arzneistoffe, die die Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung fördern oder hemmen, für die Behandlung oder Verhinderung von Krankheiten, die zum Beispiel der funktionellen Abnormalität des Proteins der vorliegenden Erfindung oder Zellproliferations-Krankheiten, wie Krebs, zugeschrieben werden. Es ist in dem Fachbereich bekannt, dass solche Verbindungen durch Zufügen, Deletion und/oder Ersetzen umgewandelt werden könnten.
Darüber hinaus liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchmusterung nach einer Verbindung, die die Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung fördert oder hemmt. Da das Gros1-L-Protein der vorliegenden Erfindung die Aktivität der Hemmung der Zellproliferation aufweist, kann nach einer Verbindung, die diese Aktivität des Gros1-L-Proteins der vorliegenden Erfindung fördert oder hemmt, durchmustert werden, indem diese Aktivität als ein Index verwendet wird.
Dieses Durchmusterungs-Verfahren beinhaltet die Schritte von: (a) Züchten der Zellen, die Gros1-L-Protein in Gegenwart der Probe exprimieren, (b) Nachweis der Proliferation der Zellen und (c) Selektion einer Verbindung, die die Proliferation im Vergleich zu der Proliferation, die in der Abwesenheit der Probe nachgewiesen wird, fördert oder hemmt.
Jegliche Gros1-L-Proteine können zur Durchmusterung verwendet werden, so lange sie die Aktivität der Inhibition der Zellproliferation umfassen. Zum Beispiel kann menschliches oder Maus-Gros1-L-Protein verwendet werden, und Proteine, die funktionell equivalent sind zu diesen Proteinen, können auch verwendet werden. Gros1-L-Proteine können endogen oder exogen durch Zellen exprimiert werden.
Jegliche Proben, zum Beispiel Zell-Extrakte, Zellkultur-Überstand, Produkte eines fermentierenden Mikroorganismus, Extrakte eines Meeresorganismus, Pflanzen-Extrakte, gereinigte oder Roh-Proteine, Peptide, nicht-Peptid Verbindungen, synthetische mikromolekulare Verbindungen, natürliche Verbindungen, können verwendet werden. Eine Verbindung, die durch die obige Durchmusterung nach Verbindungen, die an das Protein der vorliegenden Erfindung binden, erhalten wurde, kann auch als die Verbindung verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch, dass eine Verbindung, die durch diese Durchmusterung isoliert wurde, ein Kandidat für Agonisten oder Antagonisten des Proteins der vorliegenden Erfindung sein kann. Der Ausdruck ,Agonist' bezeichnet Moleküle, die die Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung durch Bindung daran aktivieren. Desgleichen bezeichnet der Ausdruck ,Antagonist' Moleküle, die die Funktion des Proteins der vorliegenden Erfindung durch Bindung daran hemmen. Darüber hinaus kann eine Verbindung, die durch diese Durchmusterung isoliert werden könnte, ein Kandidat für Verbindungen sein, die die in vivo-Interaktion des Proteins der vorliegenden Erfindung mit Molekülen (einschließlich DNAs und Proteine) inhibieren.
Zellproliferation kann zum Beispiel durch Bestimmung der Geschwindigkeit der Zellproliferation, Messung des Zellzyklus und dergleichen so wie durch Messung der Kolonie-Bildungs-Aktivität, wie in den Beispielen beschrieben, nachgewiesen werden.
Die Verbindung, die durch die Durchmusterung isoliert wurde, kann ein Kandidat für Arzneistoffe sein, die die Aktivität des Proteins der vorliegenden Erfindung fördern oder inhibieren, und kann in der Behandlung von Krankheiten (zum Beispiel Krebs, etc.), die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung in Beziehung stehen, angewendet werden.
Darüber hinaus ist bekannt, dass solch eine Verbindung, die die Aktivität des Gros1-Proteins fördert oder hemmt, durch Zufügen, Deletion und/oder Ersetzen umgewandelt werden kann, auch in den Verbindungen enthalten sind, die durch das Durchmusterungs-Verfahren der vorliegenden Erfindung erhalten werden können. Wenn solch eine Verbindung als ein pharmazeutisch wirksamer Stoff für Menschen und andere Säuger wie Mäuse, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühner, Katzen, Hunde, Schafe, Schweine, Rinder, Affen, Paviane, Schimpansen verabreicht wird, kann die isolierte Verbindung direkt verabreicht werden oder kann in eine Dosierungsform unter Verwendung von bekannten pharmazeutischen Herstellungsverfahren formuliert werden. Zum Beispiel, entsprechend dem Bedarf, kann der Arzneistoff oral als Zucker-umhüllte Tabletten, Kapseln, Elixiere und Mikrokapseln eingenommen werden, oder nicht-oral in der Form von Injektionen von sterilen Lösungen oder Suspensionen mit Wasser oder jeglichen anderen pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeiten. Zum Beispiel können die Verbindungen mit pharmakologisch verträglichen Trägern oder Medium, im Besonderen mit sterilisiertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, Pflanzenöl, Emulgatoren, suspendierenden Agentien, grenzflächenaktiven Substanzen, Stabilisatoren, Geschmacks-gebenden Agentien, Excipienten, Vehikeln, Konservierungsstoffen, Bindemittel und dergleichen in einer Einheits-Dosis-Form gemischt werden, die für allgemein akzeptierte Arzneistoff-Anwendung nötig ist. Die Menge an aktiven Inhaltsstoffen in diesen Formulierungen macht eine passende Dosierung innerhalb des angezeigten Bereiches erforderlich.
Beispiele für Zusätze, die zu Tabletten und Kapseln gemischt werden können, sind Bindemittel wie Gelatine, Maisstärke, Tragant-Gummi und Gummi-arabicum; Excipienten wie kristalline Cellulose; Quellmittel wie Maisstärke, Gelatine und Alginsäure; Gleitmittel wie Magnesium-Stearat; Süßstoffe wie Saccharose, Lactose oder Saccharin; Geschmacksstoffe wie Pfefferminze, Gaultheria adenothrix-Öl und Kirsche. Wenn die Einheits-Dosis-Formulierung eine Kapsel ist, kann auch ein flüssiger Träger wie Öl weiter in die vorstehenden Inhaltsstoffe einbezogen werden. Sterile Zusammensetzungen für Injektionen können gemäß normalen Arzneistoff- Anwendungen unter Verwendung von Vehikeln wie destilliertes Wasser, das für Injektionen verwendet wird, formuliert werden.
Physiologische Kochsalzlösung, Glucose und andere isotone Flüssigkeiten einschließlich Adjuvantien wie D-Sorbit, D-Mannose, D-Mannit und Natrium-Chlorid können als wässrige Lösungen für Injektionen verwendet werden. Diese können in Verbindung mit passenden Solubilisationsmitteln wie Alkohol, im Besonderen Ethanol, Polyalkohole wie Propylenglykol und Polyethylenglykol, nicht-ionische grenzflächenaktive Substanzen wie Polysorbat 80 (TM) und HCO-50 verwendet werden.
Sesamöl oder Sojabohnen-Öl kann als eine ölige Flüssigkeit verwendet werden und kann in Verbindung mit Benzyl-Benzoat oder Benzyl-Alkohol als Solubilisationismittel verwendet werden und kann mit einem Puffer wie Phosphat-Puffer und Natrium-Acetat-Puffer formuliert werden; ein Schmerzmittel wie Procain-Hydrochlorid; ein Stabilisator wie Benzyl-Alkohol, Phenol; und ein Antioxidans. Die hergestellte Injektion kann in eine geeignete Ampulle gefüllt werden.
Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, dürfen verwendet werden, um das Arzneistoff an Patienten zu verabreichen, zum Beispiel als intraarterielle, intravenöse, percutane Injektionen und auch als intranasale, transbronchiale, intramusculäre oder orale Verabreichungen. Die Dosierung und Art der Verabreichung variieren entsprechend dem Körpergewicht und Alter eines Patienten und der Verabreichungsmethode; ein Fachmann kann sie jedoch routinemäßig selektieren. Wenn die besagte Verbindung durch eine DNA codiert wird, kann die DNA in einen Vektor für Gentherapie inseriert und der Vektor verabreicht werden, um die Therapie durchzuführen. Die Dosis und Art der Verabreichung variiert entsprechend dem Körpergewicht, Alter und den Symptomen eines Patienten, aber ein Fachmann kann sie passend auswählen.
Zum Beispiel ist, obwohl es einige Unterschiede entsprechend den Symptomen gibt, die Dosis einer Verbindung, die mit dem Protein der vorliegenden Erfindung bindet und dessen Aktivität reguliert, etwa 0,1 mg bis etwa 100 mg pro Tag, bevorzugt etwa 1,0 mg bis etwa 50 mg pro Tag und mehr bevorzugt etwa 1,0 mg bis etwa 20 mg pro Tag, wenn sie oral an einen normalen Erwachsenen (Gewicht 60 kg) verabreicht wird.
Bei parenteraler Verabreichung in der Form einer Injektion an einen normalen Erwachsenen (Gewicht 60 kg), ist es, obwohl es einige Unterschiede entsprechend dem Patienten, Zielorgan, den Symptomen und der Art der Verabreichung gibt, praktisch, eine Dosis von etwa 0,01 mg bis etwa 30 mg pro Tag intravenös zu verabreichen, bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 20 mg pro Tag und mehr bevorzugt etwa 0,1 bis etwa 10 mg pro Tag. Darüber hinaus ist es auch im Fall von anderen Tieren möglich, eine entsprechende Menge, umgerechnet auf 60 kg Körpergewicht, zu verabreichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Angleichung für die Maus-Gros1-Sequenz und die EST-Sequenz.
2 zeigt die Spleiß-Form für cDNA von Maus-Gros1.
3 zeigt die Spleiß-Form für cDNA von menschlichem Gros1.
4 zeigt eine Foto, das das Ergebnis der Northern-Analyse in Mausgeweben unter Verwendung der Maus-Gros1-cDNA-Sonde zeigt.
5 zeigt Fotos, die das Ergebnis der Northern-Analyse in menschlichen Zellen unter Verwendung der Maus-Gros1-cDNA-Sonde zeigen.
6 zeit ein Foto, das das Ergebnis der Northern-Analyse in menschlichen Geweben unter Verwendung der Maus-Gros1-cDNA-Sonde zeigt.
7 zeigt ein Foto, das das Ergebnis der Western-Analyse für menschliches GFP-Gros1L und GFP-Gros1S, exprimiert in COS7, zeigt.
8 zeigt Fotos, die die Lokalisation von menschlichem GFP-Gros1L und menschlichem GFP-Gros1S in Zellen zeigen.
9 zeigt Fotos, die das Ergebnis der Northern-Analyse in NIH3T3-Zellen darstellen, in die Maus-Gros1L, mutiertes Gros1 und Gros1-Antisense eingebracht wurden.
10 zeigt das Ergebnis der Analyse der Kolonie-Bildungs-Aktivität von NIH3T3-Zellen, in die Maus-Gros1L, mutiertes Gros1 und Gros1-Antisense eingebracht wurden.
Beste Art der Ausführung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird in Details durch folgende Beispiele illustriert, ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1: Clonierung und Sequenz von Gros1-cDNA
Es ist bekannt, dass der Vergleich der Proteine, die in den Triton X-100 unlöslichen Fraktionen der Plasmamembran von normalen Maus-Zellen (CMEF) und immortalisierten Zellen (NIH3T3) enthalten sind, deutlich machte, dass das Protein (p33), etwa 30 kDa groß, das in NIH3T3 vorhanden ist, nicht in CMEF enthalten ist (Wadhwa, R. et al (1991) Mutat. Res. 256, 243-54). Dieses Protein wurde durch SDS-PAGE isoliert und ein polyclonaler anti-p33-Antikörper wurde durch ein Standard-Verfahren hergestellt. Ein neues Gen, Gros1-L, wurde aus einer RS-4-ZellcDNA-Genbank (Wadhwa, R. et al (1993) J. Biol. Chem. 268, 6615-21) durch Immun-Durchmusterung unter Verwendung dieses Antikörpers erhalten. Die Sequenz dieses Gens war neu, und keine homologen Sequenzen wurden in der DNA-Sequenz-Datenbank gefunden. Durchmusterung der menschlichen Hoden-Genbank (hergestellt basierend auf pCMV-SPORT (GIBCO BRL Cat#. 10419-018); D'Alessio et al., 1990, Focus 12, 47; Kriegler, M., 1990, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, Stockton Press, New York, NY.; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.; Li, W.-B. et al., 1994, BioTechniques 16, 722) unter Verwendung von einer ³²P-markierten Maus-Gros1-Sonde identifizierte zwei Arten von Clonen (menschliches Gros1-L und Gros1-S). Maus-Gros1-S wurde durch Durchsuchen der EST-Daten unter Verwendung der Nucleotidsequenzen der erhaltenen Maus-Gros1-cDNA-Fragmente und Verbindungen von überlappenden Clonen identifiziert (1). Dieser EST enthielt eine 94 bp-Deletion im Vergleich zu Maus-Gros1-L oder anderen ESTs, und es wurde vorausgesagt, dass er ein Protein (Maus-Gros1-S), das kürzer als die nicht-deletierte Form (Maus-Gros1-L) ist, erzeugt.
SEQ ID NOs: 5 und 7 zeigen die Volllängen-Nucleotidsequenz der Maus-Gros1-L-cDNA beziehungsweise die Volllängen-Nucleotidsequenz von Maus-Gros1-S-cDNA, die durch Clonierung unter Verwendung von EST-Suche erhalten wurden. Aminosäure-Sequenzen, die von diesen Nucleotidsequenzen abgezogen wurden, sind in SEQ ID NOs: 6 beziehungsweise 8 gezeigt. Es wurde gezeigt, dass jede der erhaltenen Volllängen-cDNA-Sequenzen 85,9% Homologie mit dem neuen Basal-Membran-assoziierten Proteoglycan (Leprecan), das aus Ratten-cDNA isoliert wurde, in der DNA-Sequenz-Datenbank teilt. Die cDNA, die durch Immun-Durchmusterung (Maus-Gros1-L) erhalten wurde, und die cDNA, die durch Clonierung unter Verwendung von EST-Suche erhalten wurde, codierten ein Maus-Gros1-S, ein 85 kDa-Protein, bestehend aus 747 Aminosäuren, beziehungsweise ein 61,5 kDa-Protein, bestehend aus 542 Aminosäuren (2), das 90,9% Homologie mit dem Ratten-Leprecan in der Protein-Datenbank aufweist. Darüber hinaus wurde für die vorstehende menschliche 3,0 Kb-Clon-cDNA (SEQ ID NO: 1) und die cDNA von einem 2,7 kb-Clon (SEQ ID NO: 3), die 83,9% Homolgie mit dem Maus-Gros1 aufweist, gezeigt, dass sie eine 81,9% Homologie mit dem Ratten-Leprecan in der DNA-Sequenz-Datenbank aufweisen. Die erhaltene 3,0 Kb-Clon-cDNA (SEQ ID NO: 1) codierte menschliches Gros1-S von 41 kDa, bestehend aus 363 Aminosäuren (SEQ ID NO: 2), und die 2,7 kb-Clon-cDNA (SEQ ID NO: 3) codierte menschliches Gros1-L von 83 kDa, bestehend aus 736 Aminosäuren (SEQ ID NO: 4) (3), beide weisen 83% Homologie mit dem Leprecan in der Protein-Datenbank auf. Obwohl keine passende DNA-Sequenzen gefunden wurden, zeigte die Analyse der Aminosäuresequenzen durch Motiv-Suche, dass die Aminosäuresequenzen in Maus- und menschlichem Gros1-L teilweise die Leucin-Zipper-Struktur umfassen, die oft in Transkriptionsfaktoren gefunden wird.
Beispiel 2: Herstellung von rekombinanten Gros1
Die cDNA an Position 183-1055 innerhalb des offenen Leserahmens der Maus-Gros1-L-cDNA wurde durch PCR-Reaktion (94°C für 1 min, 55°C für 1 min und 72°C für 3 min, 25 Zyklen) unter Verwendung eines Sense-Primers, umfassend die BamHI-Stelle (SEQ ID NO: 9), und eines Antisense-Primers, umfassend die HindIII-Stelle (SEQ ID NO: 10), amplifiziert, und das erhaltene Produkt wurde in den pGEM-T easy vector (Promega) unter Verwendung des Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim) inseriert. Die Mischungslösung von kompetenten E. coli JM109-Zellen (TOYOBO) und dem Vektor wurde bei 42°C für 1 min behandelt, auf eine Ampicillin-Platte ausgebreitet und für einen Tag gezüchtet, und die Kolonien zur Clonierung wurden gesammelt. Um das Histidin-markierte Protein herzustellen, wurde der clonierte pGEM-T/Gros1-Vektor an den BamH I-Hind III-Stellen geschnitten, mit pQE30 (Quiagen) ligiert und an den selben Restriktions-Stellen auf die gleiche Weise wie vorstehend verdaut, und Kolonien wurden gesammelt, um Plasmide zu erhalten.
E. coli M15 (Quiagen) wurde gezüchtet, bis das Absorptionsvermögen bei 580 nm 0,6 erreicht hatte, wobei an diesem Punkt die Zellen durch die gesammelten Plasmide transformiert wurden, und Proteine wurden durch Induktion bei 37°C für 3 Stunden mit 0,2 mM IPTG produziert. Das Lysat dieser E. coli wurde durch das SDS-PAGE-Verfahren aufgetrennt, und der Nachweis wurde mittels Western-Blot-Analyse mit dem Histidin-Antikörper und Gros1-Antikörper, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass ein 40 kDa-Protein synthetisiert wurde. Die Größe des rekombinanten Proteins war, wie vorhergesagt. Durch Western-Blot-Analyse konnten keine Signale nachgewiesen werden, wenn der polyclonale anti-p33-Antikörper in der gleichen Weise verwendet wurde.
Beispiel 3: Northern-Blot-Analyse
Northern-Blot-Analyse wurde durchgeführt, indem eine Membran gekauft wurde, auf der 2 μg mRNA von verschiedenen Maus und menschlichen Geweben pro Bahn aufgetragen waren (Clontech laboratories, Palo alto, CA). Das Gen-Fragment des Maus-Gros1-L-Plasmids wurde als eine Sonde verwendet. Die Bedingung für die Hybridisierung war wie folgt: ,Rapid-hyb buffer' (Amersham LIFE SCIENCE) wurde verwendet, und nach Prähybridisierung bei 68°C für 30 min wurden die markierten Sonden zugefügt, und die Lösung wurde bei 68°C für 2 Stunden inkubiert, um die Hybridisierung durchzuführen. Das Waschen wurden 3 mal in 2X SSC, 0,01% SDS bei Raumtemperatur für 20 min durchgeführt, dann 3 mal in 1X SSC, 0,1% SDS bei 37°C für 20 min und zweimal in 1X SSC, 0,1% SDS bei 50°C für 20 min. Der Nachweis erfolgte durch Autoradiographie. Northern-Blot-Analyse zeigte, dass die 4,4 kb- und 2,5 kb-Banden in den meisten Geweben in Menschen schwach exprimiert wurden, mit Ausnahme von Hoden, Ovar und Plazenta. Im Gegensatz dazu wurde in Hoden, Ovar und Plazenta sehr starke Expression beobachtet (4). In menschlichen gezüchteten Zellen wurde eine höhere Expression von mRNA beobachtet als in Geweben. Darüber hinaus war in menschlichen, normalen gezüchteten Zellen die Expressionsmenge der 2,5 kb-mRNA beinahe 10 mal höher als jene für die mRNA von 4,4 kb (5). In der Maus wurden die 3,5 kb- und 2,5-kb Banden in den meisten Geweben schwach exprimiert, mit Ausnahme von Gehirn, Milz und Hoden. In Gehirn oder Milz wurde keine Expression beobachtet, und in Hoden wurde nur die 2,5 kb-Bande exprimiert. In Hoden und Ovar wurde nur die kurze Form der Gros1-mRNAs nachgewiesen. Es wurde gezeigt, dass die Expression am 11. Tag während des Entwicklungsprozesses dramatisch verschwindet (6).
Beispiel 4: Lokalisation auf den Chromosomen
Die Lokalisation der Gene der vorliegenden Erfindung wurde durch Verwendung eines Sense-Primers (SEQ ID NO: 11) und eines Antisense-Primers (SEQ ID NO: 12), spezifisch für menschliches Gros1, mit einer Strahlungs-Hybrid-Platte bestimmt. Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass sie bei Menschen am Chromosom 1p31 vorhanden sind. Für die Maus wurde abgeleitet, dass sie am Chromosom 4 vorhanden sind.
Beispiel 5: Herstellung von Antikörpern, die spezifisch an die Gros1-Proteine binden
Antikörper gegen das rekombinante Protein, abgeleitet von der Gensequenz von Gros1, wurden hergestellt. Im Speziellen wurde das rekombinante Maus-Gros1-L-Protein mit der Histidin-Markierung, hergestellt in Beispiel 2, durch eine Nickel-Säule aufgereinigt; Kaninchen wurden immunisiert, um das Serum viermal stufenweise zu extrahieren; und schließlich wurden Ausblutungen durchgeführt. Polyclonale Antikörper wurden durch Aufreinigung dieses Serums unter Verwendung der Protein A-Säule hergestellt. Es wurde durch Auftrennung des rekombinanten Histidin-markierten menschlichen Gros1-L-Proteins auf dem Gel durch SDS-PAGE und Nachweis durch Western-Blot-Analyse bestätigt, dass dieser polyclonale anti-Gros1-Antikörper Gros1-Protein erkennt.
Beispiel 6: Western-Blot-Analyse
Western Blot-Analyse des Lysates von menschlichen, normalen Lungen-Fibroblastzellen, MRC-5, mit den vorstehenden polyclonalen Gros1-Antikörpern wies eine Bande von etwa 83 kDa und eine weitere von etwa 41 kDa nach, die von der cDNA-Sequenz erwartet wurden. Die Tatsache, dass zwei Banden nachgewiesen wurden, stimmt überein mit der Tatsache, dass zwei Formen von Transkripten, eine von etwa 4,4 beziehungsweise die andere von etwa 2,5 kb, in der Northern-Analyse nachgewiesen wurden. Interessanterweise wurde in HeLa-Zellen, in denen durch Northern-Analyse nur die lange Bande nachgewiesen wurde, durch Western-Analyse nur die 83 kDa-Bande nachgewiesen. Auf der anderen Seite wurde in NIH3T3-Zellen durch anti-Gros1-Antikörper nicht nur die Bande von etwa 85 kDa nachgewiesen, sondern es wurden auch Banden mit der Größe von 61,5, 41, 34 und 32 kDa nachgewiesen. Die Banden von etwa 85 kDa und 61,5 kDa entsprechen Maus-Gros1-L beziehungsweise Maus-Gros1-S, und die anderen Banden entsprechen vermutlich Proteinen, die gespalten oder endogen modifiziert wurden. In COS7-Zellen wurden 60, 40 und 34 kDa-Banden nachgewiesen. Die cDNAs, die entweder menschliches Gros1-L oder -S codieren, wurden in Expressionsvektoren inseriert und in COS7 Zellen transfiziert. Als Expressionsvektor wurde pCMV-SPORT-Vektor (GIBCO BRL), verwendet für das Durchmustern der menschlichen Hoden-Genbank, verwendet. Als ein Ergebnis der Western-Blot-Analyse unter Verwendung von anti-Gros1-Antikörper wurde entweder eine 83 kDa-Bande oder 41 kDa-Bande, entsprechend der cDNA-Sequenz, nachgewiesen. In COS7-Zellen, in welche dieses Plasmid, codierend nachstehend beschriebene GFP-Gros1-Fusionsprotein, transfiziert wurde, wurde die Produktion von Proteinen entsprechend den Größen von Gros1-L oder Gros1-S (115 kDa beziehungsweise 72 kDa) durch Western Blot-Analyse nach SDS-PAGE bestätigt.
Beispiel 7: Lokalisation der Gene in der Zelle
Zwei Formen von menschlicher Gros1-cDNA wurden durch PCR unter Verwendung von Sense (SEQ ID NO: 13)- und Antisense (SEQ ID NO: 14, 15)-Primern, die so konstruiert waren, dass sie zwei Typen von offenen Leserahmen, entsprechend dem menschlichen Gros1-L und S, umfasst, amplifiziert. ,GFPC1/7–3.0', die das Fusionsprotein von menschlichem Gros1-S exprimiert, und ,GFPC1/7–2.7', die das Fusionsprotein von menschlichem Gros1-L exprimiert, wurden durch Insertion dieser Gene an die C-terminale Region des GFP-ORF in pEGFP-C1 (Clontech) hergestellt. Mit der Verwendung von Tfx-50 (Promega) wurden diese Plasmide, codierend das GFP-Gros1-Fusionsprotein, und die Kontroll-Plasmide, codierend nur das GFP, in COS7-Zellen, die auf Deckgläsern wuchsen, transfiziert. Die Zellen wurden mit 4% Formaldehyd fixiert, 24 Stunden nach der Transfektion, und dreimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit einem Olympus BH-2-Epifluoreszenz-Mikroskop betrachtet. Als ein Ergebnis wurden die zwei Formen von Proteinen, die mit unterschiedlichen Formen von Gros1-Volllänge-Sequenzen fusioniert waren, beide im Cytoplasma lokalisiert (7 und 8).
Beispiel 8: Proliferations-unterdrückende Aktivität
Mutierte Gros1-cDNA/pBluescript, codierend nur die 369 Aminosäuren am N-Terminus von Maus-Gros1-L, das durch Durchmusterung isoliert wurde, wurde mit EcoRI geschnitten und in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 mit SRα-Expressionsvektor (Mol. Cell. Biol. (1988) 8, 466-472) ligiert und mit dem Restriktionsenzym EcoRI behandelt. Als ein Ergebnis wurden zwei Clone in Sensebeziehungsweise Antisense-Richtungen erhalten. Um ein Gen, codierend das Volllängen-Maus-Gros1, zu isolieren, wurde der EST-Clon AA49892A, der Homologie mit Maus-Gros1 aufweist, von Genome System gekauft. Der EST-Clon und Gros1-cDNA/pBluescript wurden beide mit den Restriktionsenzymen ScaI und NotI behandelt, und die Gen-Fragmente wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 ligiert, um das Maus-Gros1-L-Gen zu erhalten. Dieses Gros1-L-Gen-Fragment wurde weiter mit Restriktionsenzymen an der EcoRI-NotI-Stelle behandelt und in den SRα-Expressionsvektor, der mit Restriktionsenzymen an der gleichen Stelle in der gleichen Weise wie in Beispiel 2 behandelt wurde, ligiert. Als ein Ergebnis wurde der SRα/Gros1-L-Sense-Clon, der Maus-Gros1-L exprimiert, isoliert.
Sechs G418-resistente Clone wurden durch Einbringen der obigen Vektoren in NIH3T3 Zellen erhalten, und Expression von Gros1 in jedem einzelnen Vektor wurde durch Northern Blot-Analyse bestätigt (9). Von diesen wurde ein Clon in Sense-Richtung mit besonders hoher Expression und ein Clon in Antisense-Richtung, in dem endogenes Gros1-Transkript durch Northern Blot-Analyse selten nachgewiesen wurde, dem Kolonie-Bildungs-Aktivitäts-Test unterzogen.
500 Zellen von jedem Clon wurden in eine 10 cm-Schale ausgesät und für 2 Wochen mit einem Mediumwechsel alle drei Tage gezüchtet. Die Zellen wurden mit PBS, enthaltend 4% Formaldehyd, fixiert und mit Methylenblau gefärbt, um die Zahl der Kolonien zu zählen. Die Experimente wurden dreimalig durchgeführt.
Als ein Ergebnis war die Kolonie-Bildung in Clonen, die mit Gros1-L in der Antisense-Richtung transfiziert wurden, etwa 5 mal höher als die Kontrolle, während die Kolonie-Bildung in Clonen, transfiziert mit Gros1-L in Sense-Richtung, extrem verzögert war (10, Tabelle 1). Im Gros1-Mutanten in der Sense-Richtung wurde keine Verringerung der Kolonie-Bildung beobachtet (,defekte Kolonien' in Tabelle 1). Durch die vorstehenden Ergebnissen wurde gezeigt, dass Gros1-Protein eine Aktivität besitzt, die Proliferation unterdrückt.
Tabelle 1
Industrielle Anwendbarkeit
Die Anwesenheit von nicht-zufälligen Mutationen am menschlichen Chromosom 1p in vielen malignen Tumoren wurde durch cytogenetische und molekularbiologische Methoden vorgeschlagen. Die Tatsachen weisen darauf hin, dass eine oder mehrere Gen-Mutationen am Chromosom 1p für maligne Tumoren wichtig sind. Da das menschliche Gros1-Gen der vorliegenden Erfindung an der Chromosom 1p-Region vorhanden ist und die Aktivität, Tumore zu unterdrücken, aufweist, kann dieses Gen ein auslösendes Gen für diese Krankheiten sein. Daher können die Proteine oder Gene der vorliegenden Erfindung so wie eine Verbindung, die die Aktivität von den Proteinen der vorliegenden Erfindung, unterstützt, als nützliche Mittel zum Aufreinigen und zur Clonierung von neuen Faktoren, die in die Zell-Proliferation involviert sind, verwendet werden und können darüber hinaus für die Entwicklung von Arzneimitteln zur Behandlung oder Prävention von verschiedenen Tumoren verwendet werden.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

DNA mit einer der nachfolgenden Definitionen (a) bis (e): (a) DNA, die ein Protein codiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder 6 besteht; (b) DNA, die die codierende Region der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 umfasst; (c) DNA, die ein Protein codiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder 6 besteht, in der eine oder mehrere Aminosäuren ersetzt, deletiert, inseriert und/oder hinzugefügt sind, wobei das codierte Protein eine wachstumssupprimierende Aktivität aufweist; (d) DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer DNA, die aus der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 besteht, hybridisiert und ein Protein codiert, das wachstumssupprimierende Aktivität aufweist; und (e) DNA, die ein Teilpeptid des Proteins codiert, das aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder 6 besteht, wobei das Teilpeptid eine wachstumssupprimierende Aktivität aufweist.
Vektor, in den die DNA gemäß Anspruch 1 inseriert ist.
Transformierte Zelle, die die DNA gemäß Anspruch 1 oder den Vektor gemäß Anspruch 2 enthält.
Protein oder Peptid, das von der DNA gemäß Anspruch 1 codiert wird.
Verfahren zur Herstellung des Proteins oder Peptids gemäß Anspruch 4, umfassend die Schritte des Züchtens der transformierten Zelle gemäß Anspruch 3 und Sammeln des exprimierten Proteins von der Zelle oder von deren Kulturüberstand.
Antikörper, der das Protein gemäß Anspruch 4 bindet.
Polynucleotid, das mit einer DNA, die aus der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3 oder 5 besteht, oder den komplementären Strang hiervon hybridisiert und zumindest 15 Nucleotide umfasst.
Verfahren zur Durchmusterung nach einer Verbindung, die das Protein gemäß Anspruch 4 bindet, umfassend die Schritte: (a) Inkontaktbringen einer Probe, die eine oder mehrere Testverbindungen enthält, mit dem Protein oder dem Teilpeptid hiervon; (b) Bestimmen der Bindungsaktivität der Probe mit dem Protein oder dem Teilpeptid hiervon; und (c) Selektieren der Verbindung, die die Fähigkeit zur Bindung an das Protein oder das Teilpeptid hiervon ausweist, aus der Probe.
Verfahren zur Durchmusterung nach einer Verbindung, die die Aktivität des Proteins gemäß Anspruch 4 fördert oder inhibiert, umfassend die Schritte: (a) Züchten von Zellen, die das Protein oder das Teilpeptid hiervon exprimieren, in Anwesenheit einer Probe, die eine oder mehrere Testverbindungen enthält, die gemäß dem Verfahren nach Anspruch 8 identifiziert wurden; (b) Bestimmen der Proliferation der Zelle; und (c) Selektieren der Verbindung, die die Proliferation der Zellen im Vergleich zur Proliferation, die in Abwesenheit der Probe bestimmt wurde, fördert oder inhibiert.
Arzneimittel umfassend die DNA gemäß Anspruch 1, das Protein oder Peptid gemäß Anspruch 4 oder den Antikörper gemäß Anspruch 6.