JP4499926B2 - 腫瘍抑制遺伝子 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、生物科学分野、詳しくは癌研究の分野に関する。特に、細胞の増殖機構に関与する新規なタンパク質に関する。本発明のタンパク質は、例えば、癌に対する医薬品開発の標的分子として利用しうる。
背景技術
細胞遺伝学及び分子生物学的なアプローチにより多くの悪性腫瘍において、ヒト染色体１ｐ上にランダムではない遺伝子変異があることが示唆されている（Ｃａｒｏｎ，Ｈ．（１９９５）Ｍｅｄ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｏｎｃｏｌ ２４，２１５−２１；Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １６，２１１−２９）。例えば、染色体１ｐ領域における欠失が様々な癌細胞において、見いだされている（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ［Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３３，１９５７−６１，Ｇｒｏｓ１６；Ａｒｉｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２５，１１４−２３；Ｃｈｅｎｇ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０，２９１−７］，ｍｅｎｉｎｇｉｏｍａｓ［Ｉｓｈｉｎｏ，Ｓ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ ８３，３６０−６］，ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａｓ，ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｎｏｍａｓ、ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｔｕｍｏｒｓ［Ｍｏｌｅｙ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２，７７０−４］，Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｔ−ＡＬＬ）［Ｉｏｌａｓｃｏｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９７）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １１，３５９−６３］，ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒｓ［Ｐｒａｍｌ，Ｃ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１，１３５７−６２，Ｇｒｏｓ１３；Ｂｏｍｍｅ，Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２１，１８５−９４；Ｄｉ Ｖｉｎｃｉ，Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ ８３，４１５−２２］，ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ［Ｌｅｅ，Ｗ．Ｃ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６，４２９７−３０１］，ｈｅｐａｔｏ ｍａ［Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｌ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ ８６，１０２−６］，ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｒｃｏｎｏｍａ［Ａｒｌｔ，Ｍ．Ｆ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５，１０１７−２１］、ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒｓ［Ｎａｇａｉ，Ｈ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５，１７５２−７；Ｍｕｎｎ，Ｋ．Ｅ．ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １０，１６５３−７］．など）。また、１ｐ領域の変異はリンパ節転移や腫瘍の大きさとも相関していると言われている［Ｂｏｒｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ（１９９２）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ５，３１１−２０；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ，Ｋ．ｅｔ ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ ８２，３１７−２２］。さらに、４歳以下の小児において発生する内胚葉性生殖腺洞腫瘍（ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ ｓｉｎｕｓ ｔｕｍｏｒｓ；ＣＥＳＴｓ）における遺伝的変異も染色体１ｐ上にあることが示唆されている［Ｐｅｒｌｍａｎ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １６，１５−２０］。これらの事実から、染色体１ｐにおける一つまたは複数の遺伝子変異が悪性腫瘍に関係していることが考えられる。しかし、現在までのところその原因遺伝子は明らかになっていない。
発明の開示
本発明は、細胞の増殖機構に関与する新規なタンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子、並びにそれらの製造および用途を提供することを課題とする。
本発明者等は、不死化細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の原形質膜のＰ１００画分中のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００不溶画分に含まれる約３０ｋＤａのタンパク質（ｐ３３）に対する抗体を用いて、イムノスクリーニング法によりマウスＲＳ−４細胞ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。これにより得られたｃＤＮＡをプローブとして、さらに、ヒト精巣ライブラリーのスクリーニングを行い、該ライブラリーから新規遺伝子Ｇｒｏｓ１をクローニングすることに成功した。ヒトＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡは２種類（配列番号：１および３）存在し、それぞれ３６３アミノ酸のタンパク質（「ヒトＧｒｏｓ１−Ｓタンパク質」と命名した。配列番号：２）、および７３６アミノ酸のタンパク質（「ヒトＧｒｏｓ１−Ｌタンパク質」と命名した。配列番号：４）をコードしていた。
さらに、上記イムノスクリーニング法により得られたｃＤＮＡをプローブとして、マウス精巣ライブラリーのスクリーニングおよびＥＳＴ検索を行うことにより、マウスＧｒｏｓ１−Ｌ ｃＤＮＡ（配列番号：５）およびマウスＧｒｏｓ１−Ｓ ｃＤＮＡ（配列番号：７）を同定することに成功した。これらはそれぞれ７４７アミノ酸（配列番号：６）および５４２アミノ酸（配列番号：８）からなるタンパク質をコードしていた。
ヒトおよびマウスＧｒｏｓ１は、データーバンク上にラットｃＤＮＡより単離された新規のｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ，ｌｅｐｒｅｃａｎと相同性を有していることが明らかとなった（Ｗａｓｓｅｎｈｏｖｅ−ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｃ Ｃａｒｔｈｙ Ｋ．Ｊ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２５００４−２５０１７）。また、モチーフ検索によるアミノ酸配列の解析の結果、マウス、およびヒトのＧｒｏｓ１−Ｌのアミノ酸配列は部分的に転写因子に多く見られるロイシンジッパー構造を有していた。
ヒトＧｒｏｓ１の染色体マッピングを行った結果、Ｇｒｏｓ１遺伝子は、多くの悪性腫瘍において、ランダムではない遺伝子変異があることが示唆されている（Ｃａｒｏｎ，Ｈ．（１９９５）Ｍｅｄ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｏｎｃｏｌ ２４，２１５−２１；Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １６，２１１−２９）、ヒト第１染色体短腕（１ｐ）上に存在することが判明した。
また、Ｇｒｏｓ１の組織、細胞、発生過程においてのｍＲＮＡの発現量をノーザンブロット法により検出した。その結果、ヒトでは４．４ｋｂと２．５ｋｂのバンドが、精巣、卵巣、胎盤においては非常に高い発現を示し、これら組織をのぞくほとんどの組織で弱く発現していた（図４）。ヒト培養細胞においては、上記組織より高いｍＲＮＡの発現を示し、ヒト正常培養細胞においては、２．５ｋｂ ｍＲＮＡが４．４ｋｂのｍＲＮＡの１０倍近い発現量を示した（図５）。マウスにおいても３．５ｋｂと２．５ｋｂのバンドが、ほとんどの組織で弱く発現していたが、脳と脾臓では発現が見られず、精巣では２．５ｋｂのみが発現していた。精巣及び卵巣においてはＧｒｏｓ１遺伝子の二つの転写産物のうちの短いフォームのものしか検出されなかった。発生過程における発現は、発生過程１１日目において劇的に発現が消失することが示された。（図６）。
さらに、本発明者等はマウスの８５ｋＤａのタンパク質（Ｇｒｏｓ１−Ｌ；配列番号：６）をコードする該遺伝子をＮＩＨ３Ｔ３へ遺伝子導入することにより、Ｇｒｏｓ１の機能解析を進めた。その結果、対照やＣ末端を欠失したＧｒｏｓ−１に比べ、全長Ｇｒｏｓ１−Ｌを発現する細胞では細胞増殖が抑制され、コロニー形成率が減少した。一方、Ｇｒｏｓ１−ＬのアンチセンスＲＮＡを発現させた細胞では、コロニー形成率が５倍に上昇した。
これらの事実から、Ｇｒｏｓ１タンパク質は、細胞増殖の制御に関与する新規遺伝子であり、腫瘍の発生や発達に関与していると考えられ、Ｇｒｏｓ１タンパク質は、腫瘍に対する医薬品開発のためのツールとして有用である。
本発明は細胞増殖に関与する新規なタンパク質（Ｇｒｏｓ１）およびその遺伝子、並びにそれらの製造及び用途に関し、より具体的には、
１． 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ、
（ａ）配列番号：２、４、６、８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号：１、３、５、７のいずれかに記載の塩基配列のコード領域を含むＤＮＡ。
（ｃ）配列番号：２、４、６、８のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、配列番号：２、４、６、８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｄ）配列番号：１、３、５、７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、配列番号：２、４、６、８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡ。
２． 配列番号：２、４、６、８のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質の部分ペプチドをコードするＤＮＡ、
３． （１）または（２）に記載のＤＮＡが挿入されたベクター、
４． （１）もしくは（２）に記載のＤＮＡまたは（３）に記載のベクターを保持する形質転換細胞、
５． （１）または（２）に記載のＤＮＡによりコードされるタンパク質またはペプチド、
６． （４）に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、（５）に記載のタンパク質またはペプチドの製造方法、
７． （５）に記載のタンパク質に結合する抗体、
８． 配列番号：１、３、５、７のいずれかに記載の塩基配列からなるＤＮＡまたはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチド、
９． （５）に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
（ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
（ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法、
１０． （９）に記載の方法により単離されうる、（５）に記載のタンパク質に結合する化合物、
１１． （５）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
（ａ）被検試料の存在下で、該タンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞を培養する工程、
（ｂ）該細胞の増殖を検出する工程、
（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該増殖を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法、
１２． （１１）に記載の方法により単離されうる、（５）に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物、を提供するものである。
本発明は、細胞増殖機構に関与する新規なタンパク質Ｇｒｏｓ１を提供する。本発明者らにより単離された２種のヒトＧｒｏｓ１（ヒトＧｒｏｓ１−ＳおよびヒトＧｒｏｓ１−Ｌ）のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：１および３に、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：２および４に示す。また、本発明者らにより単離されたマウスＧｒｏｓ１（マウスＧｒｏｓ１−ＬおよびマウスＧｒｏｓ１−Ｓ）の２種のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号：５および７に、該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：６および８に示す。
Ｇｒｏｓ１−Ｌタンパク質をＮＩＨ−３Ｔ３細胞において外来的に発現させると、その細胞増殖が抑制され、コロニー形成率が低下する。反対に、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において、Ｇｒｏｓ１アンチセンスｃＤＮＡの導入により、Ｇｒｏｓ１−Ｌタンパク質の発現を抑制すると、コロニー形成率は顕著に上昇する。このため、Ｇｒｏｓ１タンパク質は細胞増殖の制御に関与していると考えられる。このことは、ヒトＧｒｏｓ１遺伝子が、悪性腫瘍に関与しているとされる第１染色体短腕（１ｐ）上に存在するという事実からも裏付けられる。従って、本発明のＧｒｏｓ１タンパク質は、細胞増殖を制御する因子の精製やクローニングのためのツールとして、また細胞増殖が関与する腫瘍などの疾患の治療薬や予防薬の候補化合物のスクリーニングなどの標的として好適に利用しうる。また、Ｇｒｏｓ１遺伝子には、各種腫瘍などにおける遺伝子治療などの治療への応用が考えられる。
本発明は、Ｇｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質を包含する。このようなタンパク質には、例えば、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質に対応する他の生物のホモログタンパク質やヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質の変異体が含まれる。
本発明において「機能的に同等」とは、Ｇｒｏｓ１タンパク質と同様に、対象となるタンパク質が細胞増殖を抑制する活性を有することを指す。対象となるタンパク質が細胞増殖活性を有するか否かは、対象となるタンパク質をコードするＤＮＡを、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などの細胞に導入し、これを発現させ、該細胞の増殖の抑制やコロニー形成率の低下を検出することにより判定することができる。
あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製するための、当業者によく知られた方法としては、タンパク質に変異を導入する方法が知られている。例えば、当業者であれば、部位特異的変異誘発法（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｇｅｎｅ １５２，２７１−２７５、Ｚｏｌｌｅｒ，ＭＪ，ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００，４６８−５００、Ｋｒａｍｅｒ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，９４４１−９４５６、Ｋｒａｍｅｒ Ｗ，ａｎｄ Ｆｒｉｔｚ ＨＪ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４，３５０−３６７、Ｋｕｎｋｅｌ，ＴＡ（１９８５）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．８２，４８８−４９２、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．８５，２７６３−２７６６）などを用いて、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質のアミノ酸に適宜変異を導入することによりヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このような変異体における、変異するアミノ酸数は、通常、１０アミノ酸以内であり、好ましくは、６アミノ酸以内であり、さらに好ましくは３アミノ酸以内であると考えられる。
あるアミノ酸配列に対する１又は複数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質がその生物学的活性を維持することはすでに知られている（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１，５６６２−５６６６、Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．＆ Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８２）１０，６４８７−６５００、Ｗａｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，１４３１−１４３３、Ｄａｌｂａｄｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２）７９，６４０９−６４１３）。
また、変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質としては、疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ、Ｄ、Ｎ、Ｃ、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ、Ｔ、Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ、Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ、Ｎ、Ｅ、Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ離（Ｒ、Ｋ、Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ、Ｆ、Ｙ、Ｗ）を挙げることができる（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：２、４、６、または８）に１又は複数個のアミノ酸残基が付加されたタンパク質としては、例えば、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質を含む融合タンパク質が挙げられる。融合タンパク質は、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と他のペプチド又はタンパク質とが融合したものであり、本発明に含まれる。融合タンパク質を作製する方法は、本発明のヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質をコードするＤＮＡと他のペプチド又はタンパク質をコードするＤＮＡをフレームが一致するように連結してこれを発現ベクターに導入し、宿主で発現させればよく、当業者に公知の手法を用いることができる。本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチド又はタンパク質としては、特に限定されない。
本発明のタンパク質との融合に付される他のペプチドとしては、例えば、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐ，Ｔ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６，１２０４−１２１０）、６個のＨｉｓ（ヒスチジン）残基からなる６×Ｈｉｓ、１０×Ｈｉｓ、インフルエンザ凝集素（ＨＡ）、ヒトｃ−ｍｙｃの断片、ＶＳＶ−ＧＰの断片、ｐ１８ＨＩＶの断片、Ｔ７−ｔａｇ、ＨＳＶ−ｔａｇ、Ｅ−ｔａｇ、ＳＶ４０Ｔ抗原の断片、ｌｃｋ ｔａｇ、α−ｔｕｂｕｌｉｎの断片、Ｂ−ｔａｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃの断片等の公知のペプチドを使用することができる。また、本発明のタンパク質との融合に付される他のタンパク質としては、例えば、ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、ＨＡ（インフルエンザ凝集素）、イムノグロブリン定常領域、β−ガラクトシダーゼ、ＭＢＰ（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
市販されているこれらペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと融合させ、これれにより調製された融合ＤＮＡを発現させることにより、融合タンパク質を調製することができる。
また、あるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を調製する当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，９．４７−９．５８，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．ｐｒｅｓｓ，１９８９）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者であれば、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列（配列番号：１、３、５、または７）もしくはその一部を基に、これと相同性の高いＤＮＡを単離して、該ＤＮＡからヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質を単離することも通常行いうることである。このように、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質をコードするＤＮＡもしくはその一部からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡがコードするタンパク質であって、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質もまた本発明のタンパク質に含まれる。このようなタンパク質としては、例えば、ヒトやマウス以外の哺乳動物のホモログ（例えば、サル、ラット、ウサギ、ウシの遺伝子がコードするタンパク質）が挙げられる。ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質をコードするＤＮＡと相同性の高いｃＤＮＡを、動物から単離する場合、特に卵巣や精巣の組織を用いることが好ましいと考えられる。
ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを単離するためのハイブリダイゼーションの条件としては、当業者であれば適宜選択することができる。一例を示せば、「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用い、６８℃で３０分以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で１時間以上保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄は、例えば低ストリンジェントな条件で行うことができる。低ストリンジェントの条件とは、例えば４２℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられ、好ましくは５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳである。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、例えば２ＸＳＳＣ、０．０１％ ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行う。但し、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
また、ハイブリダイゼーションにかえて、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、５、または７）の配列情報を基に合成したプライマーを用いる遺伝子増幅法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を利用して単離することも可能である。
これらハイブリダイゼーション技術または遺伝子増幅技術により単離されるＤＮＡがコードするヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質と機能的に同等なタンパク質は、通常、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、通常、４０％以上の相同性、好ましくは６０％以上の相同性、さらに好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９５％以上の同一性を指す。タンパク質の相同性を決定するには、文献（Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０，７２６−７３０）に記載のアルゴリズムにしたがえばよい。
本発明のタンパク質は、後述するそれを産生する細胞や宿主あるいは精製方法により、アミノ酸配列、分子量、等電点又は糖鎖の有無や形態などが異なり得る。しかしながら、得られたタンパク質が、本発明のヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質（配列番号：２，４，６または８）と同等の機能を有している限り、本発明に含まれる。
本発明のタンパク質は、当業者に公知の方法により、組み換えタンパク質として、また天然のタンパク質として調製することが可能である。組み換えタンパク質であれば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ（例えば配列番号：１、３、５、または７に記載の塩基配列を有するＤＮＡ）を、適当な発現ベクターに組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のタンパク質に対する抗体をカラムに固定したアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製することが可能である。
また、本発明のタンパク質をグルタチオンＳトランスフェラーゼタンパク質との融合タンパク質として、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えタンパク質として宿主細胞（例えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えタンパク質はグルタチオンカラムあるいはニッケルカラムを用いて精製することができる。
融合タンパク質の精製後、必要に応じて融合タンパク質のうち目的のタンパク質以外の領域を、トロンビンまたはファクターＸａなどにより切断し、除去することも可能である。
天然のタンパク質であれば、当業者に周知の方法、例えば、本発明のタンパク質を発現している組織や細胞の抽出物に対し、後述するＧｒｏｓ１タンパク質に結合する抗体が結合したアフィニティーカラムを作用させて精製することにより単離することができる。抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本発明は、また、本発明のタンパク質の部分ペプチドを包含する。本発明のタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなる部分ペプチドは、少なくとも７アミノ酸、好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは９アミノ酸以上のアミノ酸配列からなる。該部分ペプチドは、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体の作製、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングや、本発明のタンパク質の促進剤や阻害剤のスクリーニングに利用し得る。
本発明の部分ペプチドは、遺伝子工学的手法、公知のペプチド合成法、あるいは本発明のタンパク質を適切なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチド合成法としては、たとえば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。
また、本発明は、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供する。本発明のＤＮＡは、上述したような本発明のタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏやｉｎ ｖｉｔｒｏにおける生産に利用される他、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子の異常に起因する疾患の遺伝子治療などへの応用も考えられる。本発明のＤＮＡは、本発明のタンパク質をコードしうるものであれば、いかなる形態でもよい。即ち、ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであるか、ゲノムＤＮＡであるか、化学合成ＤＮＡであるかなどを問わない。また、本発明のタンパク質をコードしうる限り、遺伝暗号の縮重に基づく任意の塩基配列を有するＤＮＡが含まれる。
本発明のＤＮＡは、当業者に公知の方法により調製することができる。例えば、本発明のタンパク質を発現している細胞よりｃＤＮＡライブラリーを作製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）の一部をプローブにしてハイブリダイゼーションを行うことにより調製できる。ｃＤＮＡライブラリーは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法により調製してもよいし、市販のＤＮＡライブラリーを用いてもよい。また、本発明のタンパク質を発現している細胞よりＲＮＡを調製し、本発明のＤＮＡの配列（例えば、配列番号：１、３、５、または７）に基づいてオリゴＤＮＡを合成し、これをプライマーとして用いてＰＣＲ反応を行い、本発明のタンパク質をコードするｃＤＮＡを増幅させることにより調製することも可能である。
また、得られたｃＤＮＡの塩基配列を決定することにより、それがコードする翻訳領域を決定でき、本発明のタンパク質のアミノ酸配列を得ることができる。また、得られたｃＤＮＡをプローブとしてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ゲノムＤＮＡを単離することができる。
具体的には、次のようにすればよい。まず、本発明のタンパク質を発現する細胞、組織、臓器（例えば卵巣、精巣、胎盤など）から、ｍＲＮＡを単離する。ｍＲＮＡの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８，５２９４−５２９９）、ＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，Ｎ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）等により全ＲＮＡを調製し、ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等を使用して全ＲＮＡからｍＲＮＡを精製する。また、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによりｍＲＮＡを直接調製することもできる。
得られたｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡの合成は、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（生化学工業）等を用いて行うこともできる。また、本明細書に記載されたプライマー等を用いて、５’−Ａｍｐｌｉ ＦＩＮＤＥＲ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製）およびポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を用いた５’−ＲＡＣＥ法（Ｆｒｏｈｍａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，８９９８−９００２；Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７，２９１９−２９３２）にしたがい、ｃＤＮＡの合成および増幅を行うことができる。
得られたＰＣＲ産物から目的とするＤＮＡ断片を調製し、ベクターＤＮＡと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。目的とするＤＮＡの塩基配列は、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法により確認することができる。
また、本発明のＤＮＡにおいては、発現に使用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、より発現効率の高い塩基配列を設計することができる（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８１）９，ｐ４３−ｐ７４）。また、本発明のＤＮＡは、市販のキットや公知の方法によって改変することができる。改変としては、例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドや適当なＤＮＡフラグメントの挿入、リンカーの付加、開始コドン（ＡＴＧ）及び／又は終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡ、又はＴＡＧ）の挿入等が挙げられる。
本発明のＤＮＡは、具体的には、配列番号：１の塩基配列において５２位の塩基Ａから１１４０位の塩基ＣからなるＤＮＡ、配列番号：３の塩基配列において５２位の塩基Ａから２２５９位の塩基ＡからなるＤＮＡ、配列番号：５の塩基配列において１２位の塩基Ａから２２５２位の塩基ＧからなるＤＮＡ、および配列番号：７の塩基配列において１２位の塩基Ａから１６４０位の塩基ＡからなるＤＮＡ、を包含する。
本発明のＤＮＡはまた、配列番号：１、３、５、または７に示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、且つ上記本発明のタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするＤＮＡを含む。
ストリンジェントな条件としては、当業者であれば適宜選択することができるが、例えば低ストリンジェントな条件が挙げられる。またより好ましくは、高ストリンジェントな条件が挙げられる。これらの条件は、前記の通りである。上記のハイブリダイズするＤＮＡは、好ましくはｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡである。
また、本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されたベクターを提供する。本発明のベクターとしては、宿主細胞内において本発明のＤＮＡを保持したり、本発明のタンパク質を発現させるために有用である。
ベクターとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ベクターを大腸菌（例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１Ｂｌｕｅ）などで大量に増幅させ大量調製するために、大腸菌で増幅されるための「ｏｒｉ」をもち、さらに形質転換された大腸菌の選抜遺伝子（例えば、なんらかの薬剤（アンピシリンやテトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコール）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すれば特に制限はない。ベクターの例としては、Ｍ１３系ベクター、ｐＵＣ系ベクター、ｐＢＲ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔなどが挙げられる。また、ｃＤＮＡのサブクローニング、切り出しを目的とした場合、上記ベクターの他に、例えば、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＤＩＲＥＣＴ、ｐＴ７などが挙げられる。本発明のタンパク質を生産する目的においてベクターを使用する場合には、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、例えば、大腸菌での発現を目的とした場合は、ベクターが大腸菌で増幅されるような上記特徴を持つほかに、宿主をＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１、ＸＬ１−Ｂｌｕｅなどの大腸菌とした場合においては、大腸菌で効率よく発現できるようなプロモーター、例えば、ｌａｃＺプロモーター（Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１，５４４−５４６；ＦＡＳＥＢ Ｊ．（１９９２）６，２４２２−２４２７）、ａｒａＢプロモーター（Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４０，１０４１−１０４３）、またはＴ７プロモーターなどを持っていることが不可欠である。このようなベクターとしては、上記ベクターの他にｐＧＥＸ−５Ｘ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ」（Ｑｉａｇｅｎ社製）、ｐＥＧＦＰ、またはｐＥＴ（この場合、宿主はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現しているＢＬ２１が好ましい）などが挙げられる。
また、ベクターには、ポリペプチド分泌のためのシグナル配列が含まれていてもよい。タンパク質分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、ｐｅｌＢシグナル配列（Ｌｅｉ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９，４３７９）を使用すればよい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。
大腸菌以外にも、例えば、本発明のタンパク質を製造するために、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）や、ｐＥＧＦ−ＢＯＳ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９０，１８（１７），ｐ５３２２）、ｐＥＦ、ｐＣＤＭ８）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Ｂａｃ−ｔｏ−ＢＡＣ ｂａｃｕｌｏｖａｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ」（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）、ｐＢａｃＰＡＫ８）、植物由来の発現ベクター（例えばｐＭＨ１、ｐＭＨ２）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＨＳＶ、ｐＭＶ、ｐＡｄｅｘＬｃｗ）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、ｐＺＩｐｎｅｏ）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Ｐｉｃｈｉａ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ」（Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＮＶ１１、ＳＰ−Ｑ０１）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、ｐＰＬ６０８、ｐＫＴＨ５０）が挙げられる。
ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばＳＶ４０プロモーター（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７，１０８）、ＭＭＬＶ−ＬＴＲプロモーター、ＥＦ１αプロモーター（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９０）１８，５３２２）、ＣＭＶプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、Ｇ４１８など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、ｐＭＡＭ、ｐＤＲ２、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＯＰＲＳＶ、ｐＯＰ１３などが挙げられる。
さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を目的とする場合には、核酸合成経路を欠損したＣＨＯ細胞にそれを相補するＤＨＦＲ遺伝子を有するベクター（例えば、ｐＣＨＯＩなど）を導入し、メトトレキセート（ＭＴＸ）により増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、ＳＶ４０ Ｔ抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つＣＯＳ細胞を用いてＳＶ４０の複製機転を持つベクター（ｐｃＤなど）で形質転換する方法が挙げられる。
一方、動物の生体内で本発明のＤＮＡを発現させる方法としては、本発明のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、レトロウイルス法、リポソーム法、カチオニックリポソーム法、アデノウイルス法などにより生体内に導入する方法などが挙げられる。これにより、本発明のＧｒｏｓ１遺伝子の変異に起因する疾患に対する遺伝子治療を行うことが可能である。用いられるベクターとしては、例えば、アデノウイルスベクター（例えばｐＡｄｅｘｌｃｗ）やレトロウイルスベクター（例えばｐＺＩＰｎｅｏ）などが挙げられるが、これらに制限されない。ベクターへの本発明のＤＮＡの挿入などの一般的な遺伝子操作は、常法に従って行うことが可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，５．６１−５．６３）。生体内への投与は、ｅｘ ｖｉｖｏ法であっても、ｉｎ ｖｉｖｏ法であってもよい。
また、本発明は、本発明のベクターが導入された宿主細胞を提供する。本発明のベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。本発明の宿主細胞は、例えば、本発明のタンパク質の製造や発現のための産生系として使用することができる。タンパク質製造のための産生系は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの産生系がある。ｉｎ ｖｉｔｒｏの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、ＣＨＯ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９５）１０８，９４５）、ＣＯＳ、３Ｔ３、ミエローマ、ＢＨＫ（ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ）、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ、両生類細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞（Ｖａｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９１，３５８−３４０）、あるいは昆虫細胞、例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｔｎ５が知られている。ＣＨＯ細胞としては、特に、ＤＨＦＲ遺伝子を欠損したＣＨＯ細胞であるｄｈｆｒ−ＣＨＯ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，４２１６−４２２０）やＣＨＯ Ｋ−１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９６８）６０，１２７５）を好適に使用することができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にＣＨＯ細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、カチオニックリボソームＤＯＴＡＰ（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）由来の細胞がタンパク質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）が知られている。
原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、例えば、ＪＭ１０９、ＤＨ５α、ＨＢ１０１等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
これらの細胞を目的とするＤＮＡにより形質転換し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することによりタンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＩＭＤＭを使用することができる。その際、牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のｐＨは、約６〜８であるのが好ましい。培養は、通常、約３０〜４０℃で約１５〜２００時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
一方、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を産生させる系としては、例えば、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。これらの動物又は植物に目的とするＤＮＡを導入し、動物又は植物の体内でタンパク質を産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物、植物を包含する。
動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動物としては、ヤギ、ブタ、ヒツジ、マウス、ウシを用いることができる（Ｖｉｃｋｉ Ｇｌａｓｅｒ，ＳＰＥＣＴＲＵＭ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９３）。また、哺乳類動物を用いる場合、トランスジェニック動物を用いることができる。
例えば、目的とするＤＮＡを、ヤギβカゼインのような乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝子を含むＤＮＡ断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ移植する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的のタンパク質を得ることができる。トランスジェニックヤギから産生されるタンパク質を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい（Ｅｂｅｒｔ，Ｋ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４）１２，６９９−７０２）。
また、昆虫としては、例えばカイコを用いることができる。カイコを用いる場合、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを挿入したバキュロウィルスをカイコに感染させることにより、このカイコの体液から目的のタンパク質を得ることができる（Ｓｕｓｕｍｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１５，５９２−５９４）。
さらに、植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。タバコを用いる場合、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡを植物発現用ベクター、例えばｐＭＯＮ ５３０に挿入し、このベクターをアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のようなバクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ）に感染させ、本タバコの葉より所望のポリペプチドを得ることができる（Ｊｕｌｉａｎ Ｋ．−Ｃ．Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４，１３１−１３８）。
これにより得られた本発明のタンパク質は、宿主細胞内または細胞外（培地など）から単離し、実質的に純粋で均一なタンパク質として精製することができる。タンパク質の分離、精製は、通常のタンパク質の精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればタンパク質を分離、精製することができる。
クロマトグラフィーとしては、例えばアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーは、液相クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。本発明は、これらの精製方法を用い、高度に精製されたタンパク質も包含する。
なお、タンパク質を精製前又は精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グルコシダーゼなどが用いられる。
また、本発明は、本発明のタンパク質と結合する抗体を提供する。本発明の抗体の形態には、特に制限はなく、ポリクローナル抗体の他、モノクローナル抗体も含まれる。また、ウサギなどの免疫動物に本発明のタンパク質を免疫して得た抗血清、すべてのクラスのポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、さらにヒト抗体や遺伝子組み換えによるヒト型化抗体も含まれる。
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質は、その由来となる動物種に制限されないが哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラット由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、本明細書に開示される遺伝子配列又はアミノ酸配列を用いて得ることができる。
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質であってもよいし、また、タンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（Ｎ）末端断片やカルボキシ（Ｃ）末端断片が挙げられる。本明細書で述べる「抗体」とはタンパク質の全長又は断片に反応する抗体を意味する。
本発明のタンパク質又はその断片をコードする遺伝子を公知の発現ベクター系に挿入し、該ベクターで本明細書で述べた宿主細胞を形質転換させ、該宿主細胞内外から目的のタンパク質又はその断片を公知の方法で得て、これらを感作抗原として用いればよい。また、タンパク質を発現する細胞又はその溶解物あるいは化学的に合成した本発明のタンパク質を感作抗原として使用してもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的には、げっ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が使用される。
げっ歯目の動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。ウサギ目の動物としては、例えば、ウサギが使用される。霊長目の動物としては、例えば、サルが使用される。サルとしては、狭鼻下目のサル（旧世界ザル）、例えば、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。一般的方法としては、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は皮下に注射する。具体的には、感作抗原をＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに対し、所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に投与する。さらに、その後、フロイント不完全アジュバントに適量混合した感作抗原を、４〜２１日毎に数回投与することが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを常法により確認する。
ここで、本発明のタンパク質に対するポリクローナル抗体を得るには、血清中の所望の抗体レベルが上昇したことを確認した後、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出す。この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用してもよいし、必要に応じこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離して、これを使用してもよい。例えば、本発明のタンパク質をカップリングさせたアフィニティーカラムを用いて、本発明のタンパク質のみを認識する画分を得て、さらにこの画分をプロテインＡあるいはプロテインＧカラムを利用して精製することにより、免疫グロブリンＧあるいはＭを調製することができる。
モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物の血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を取り出し、細胞融合に付せばよい。この際、細胞融合に使用される好ましい免疫細胞として、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としては、好ましくは哺乳動物のミエローマ細胞、より好ましくは、薬剤による融合細胞選別のための特性を獲得したミエローマ細胞が挙げられる。
前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、例えば、ミルステインらの方法（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８１）７３，３−４６）等に準じて行うことができる。
細胞融合により得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えば、ＨＡＴ培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該ＨＡＴ培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常、数日〜数週間継続して行う。次いで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよびクローニングを行う。
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばＥＢウィルスに感染したヒトリンパ球をｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばＵ２６６と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる（特開昭６３−１７６８８号公報）。
次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、本発明のタンパク質をカップリングしたアフィニティーカラムなどにより精製することで調製することが可能である。本発明の抗体は、本発明のタンパク質の精製、検出に用いられる他、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。また、この抗体を本発明のタンパク質が関与する疾患の抗体治療へ応用することも考えられる。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型抗体が好ましい。
例えば、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるタンパク質、タンパク質発現細胞又はその溶解物を免疫して抗体産生細胞を取得し、これをミエローマ細胞と融合させたハイブリドーマを用いてタンパク質に対するヒト抗体を取得することができる（国際公開番号ＷＯ９２−０３９１８、ＷＯ９３−２２２７、ＷＯ９４−０２６０２、ＷＯ９４−２５５８５、ＷＯ９６−３３７３５およびＷＯ９６−３４０９６参照）。
ハイブリドーマを用いて抗体を産生する以外に、抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞を癌遺伝子（ｏｎｃｏｇｅｎｅ）により不死化させた細胞を用いてもよい。
このように得られたモノクローナル抗体はまた、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体として得ることができる（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，Ｃ．Ａ．Ｋ．ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ，Ｊ．Ｗ．，ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ又は抗体を産生する感作リンパ球等の免疫細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させる。本発明は、この組換え型抗体を包含する。
さらに、本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合する限り、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。例えば、抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、Ｆｖ又はＨ鎖とＬ鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３）が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６；Ｂｅｔｔｅｒ，Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ａ．Ｈ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４７６−４９６；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８９）１７８，４９７−５１５；Ｌａｍｏｙｉ，Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６５２−６６３；Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８６）１２１，６６３−６６９；Ｂｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１）９，１３２−１３７参照）。
抗体修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。本発明の「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。
また、本発明の抗体は、公知の技術を使用して非ヒト抗体由来の可変領域とヒト抗体由来の定常領域からなるキメラ抗体又は非ヒト抗体由来のＣＤＲ（相補性決定領域）とヒト抗体由来のＦＲ（フレームワーク領域）及び定常領域からなるヒト型化抗体として得ることができる。
前記のように得られた抗体は、均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製は通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムが挙げられる。例えば、プロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等が挙げられる。
アフィニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等が挙げられる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９６）。これらのクロマトグラフィーはＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また、本発明の抗体の抗原結合活性を測定する方法として、例えば、吸光度の測定、酵素結合免疫吸着検定法（Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、本発明の抗体を固相化したプレートに本発明のタンパク質を添加し、次いで目的の抗体を含む試料、例えば、抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。酵素、例えば、アルカリフォスファターゼ等で標識した抗体を認識する二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションし、次いで洗浄した後、ｐ−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。タンパク質としてタンパク質の断片、例えばそのＣ 末端からなる断片あるいはＮ 末端からなる断片を使用してもよい。本発明の抗体の活性評価には、ＢＩＡｃｏｒｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）を使用することができる。
これらの手法を用いることにより、本発明の抗体と試料中に含まれる本発明のタンパク質が含まれると予想される試料とを接触せしめ、該抗体と該タンパク質との免疫複合体を検出又は測定することからなる、本発明のタンパク質の検出又は測定方法を実施することができる。
本発明のタンパク質の検出又は測定方法は、タンパク質を特異的に検出又は測定することができるため、タンパク質を用いた種々の実験等に有用である。
本発明はまた、ヒトまたはマウスＧｒｏｓ１タンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号：１、３、５、または７）またはその相補鎖とハイブリダイズし、少なくとも１５塩基の鎖長を有するポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、好ましくは、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、他のタンパク質をコードするＤＮＡとのクロスハイブリダイゼーションが有意に生じないことを意味する。このようなポリヌクレオチドには、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡまたはその相補鎖と特異的にハイブリダイズし得るプローブやプライマー、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドやリボザイム等）が含まれる。また、このようなポリヌクレオチドは、ＤＮＡチップの作製に利用することもできる。
本発明は、例えば、配列番号：１、３、５、または７のいずれか一つに示される塩基配列中のいずれかの箇所にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは配列番号：１、３、５、または７のいずれか一つに示される塩基配列中の連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらに好ましくは、前記連続する少なくとも１５個以上のヌクレオチドが翻訳開始コドンを含む、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、それらの誘導体や修飾体を使用することができる。このような修飾体として、例えばメチルホスホネート型又はエチルホスホネート型のような低級アルキルホスホネート修飾体、ホスホロチオエート修飾体又はホスホロアミデート修飾体等が挙げられる。
ここでいう「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡの所定の領域を構成するヌクレオチドに対応するヌクレオチドが全て相補的であるもののみならず、ＤＮＡまたはｍＲＮＡとオリゴヌクレオチドとが配列番号：１、３、５、または７に示される塩基配列に特異的にハイブリダイズできる限り、１又は複数個のヌクレオチドのミスマッチが存在していてもよい。
このようなポリヌクレオチドは、少なくとも１５個の連続したヌクレオチド配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上の塩基配列上の相同性を有する。なお、相同性を決定するためのアルゴリズムは本明細書に記載したものを使用すればよい。このようなポリヌクレオチドは、後述の実施例に記載するように本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを検出若しくは単離するためのプローブとして、又は増幅するためのプライマーとして有用である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、本発明のタンパク質の産生細胞に作用して、該タンパク質をコードするＤＮＡ又はｍＲＮＡに結合することにより、その転写又は翻訳を阻害したり、ｍＲＮＡの分解を促進したりして、本発明のタンパク質の発現を抑制することにより、結果的に本発明のタンパク質の作用を抑制する効果を有する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は、それらに対して不活性な適当な基剤と混和して塗布剤、パップ剤等の外用剤とすることができる。
また、必要に応じて、賦形剤、等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、無痛化剤等を加えて錠剤、散財、顆粒剤、カプセル剤、リポソームカプセル剤、注射剤、液剤、点鼻剤など、さらに凍結乾燥剤とすることができる。これらは常法にしたがって調製することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体は患者の患部に直接適用するか、又は血管内に投与するなどして結果的に患部に到達し得るように患者に適用する。さらには、持続性、膜透過性を高めるアンチセンス封入素材を用いることもできる。例えば、リポソーム、ポリ−Ｌ−リジン、リピッド、コレステロール、リポフェクチン又はこれらの誘導体が挙げられる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド誘導体の投与量は、患者の状態に応じて適宜調整し、好ましい量を用いることができる。例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与することができる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは本発明のタンパク質の発現を阻害し、従って本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することにおいて有用である。また、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する発現阻害剤は、本発明のタンパク質の生物学的活性を抑制することが可能である点で有用である。
また、本発明は、本発明のタンパク質を利用する、本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法を提供する。このスクリーニング方法は、（ａ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、（ｂ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、（ｃ）本発明のタンパク質またはその部分ペプチドに結合する化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いられる本発明のタンパク質は組換えタンパク質であっても、天然由来のタンパク質であってもよい。また部分ペプチドであってもよい。被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。被検試料を接触させる本発明のタンパク質は、例えば、精製したタンパク質として、可溶型タンパク質として、担体に結合させた形態として、また、他のタンパク質との融合タンパク質として、被検試料に接触させることができる。
本発明のタンパク質を用いて、例えば該タンパク質に結合するタンパク質をスクリーニングする方法としては、当業者に公知の多くの方法を用いることが可能である。このようなスクリーニングは、例えば、免疫沈降法により行うことができる。具体的には、以下のように行うことができる。本発明のタンパク質をコードする遺伝子を、ｐＳＶ２ｎｅｏ，ｐｃＤＮＡ Ｉ，ｐＣＤ８などの外来遺伝子発現用のベクターに挿入することで動物細胞などで当該遺伝子を発現させる。発現に用いるプロモーターとしてはＳＶ４０ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｒｉｇｂｙ Ｉｎ Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ（ｅｄ．），Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．３．Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐ．８３−１４１（１９８２）），ＥＦ−１ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋｉｍら Ｇｅｎｅ ９１，ｐ．２１７−２２３（１９９０）），ＣＡＧ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｎｉｗａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ １０８，ｐ．１９３−２００（１９９１）），ＲＳＶ ＬＴＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｕｌｌｅｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２，ｐ．６８４−７０４（１９８７），ＳＲ α ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８，ｐ．４６６（１９８８）），ＣＭＶ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓｅｅｄ ａｎｄ Ａｒｕｆｆｏ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４，ｐ．３３６５−３３６９（１９８７）），ＳＶ４０ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｇｈｅｙｓｅｎ ａｎｄ Ｆｉｅｒｓ Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１，ｐ．３８５−３９４（１９８２）），Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｋａｕｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９，ｐ．９４６（１９８９）），ＨＳＶ ＴＫ ｐｒｏｍｏｔｅｒ等の一般的に使用できるプロモーターであれば何を用いてもよい。動物細胞に遺伝子を導入することで外来遺伝子を発現させるためには、エレクトロポレーション法（Ｃｈｕ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５，１３１１−１３２６（１９８７））、リン酸カルシウム法（Ｃｈｅｎ，Ｃ ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７，２７４５−２７５２（１９８７））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｌｏｐａｔａ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２，５７０７−５７１７（１９８４）；Ｓｕｓｓｍａｎ，Ｄ．Ｊ．ａｎｄ Ｍｉｌｍａｎ，Ｇ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４，１６４２−１６４３（１９８５））、リポフェクチン法（Ｄｅｒｉｊａｒｄ，Ｂ．Ｃｅｌｌ ７，１０２５−１０３７（１９９４）；Ｌａｍｂ，Ｂ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５，２２−３０（１９９３）；Ｒａｂｉｎｄｒａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９，２３０−２３４（１９９３））等の方法があるが、いずれの方法によってもよい。特異性の明らかとなっているモノクローナル抗体の認識部位（エピトープ）を本発明のタンパク質のＮ末またはＣ末に導入することにより、モノクローナル抗体の認識部位を有する融合タンパク質として本発明のタンパク質を発現させることができる。用いるエピトープー抗体系としては市販されているものを利用することができる（実験医学 １３，８５−９０（１９９５））。マルチクローニングサイトを介して、β−ガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク質、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などとの融合タンパク質を発現することができるベクターが市販されている。
融合タンパク質にすることにより本発明のタンパク質の性質をできるだけ変化させないようにするために数個から十数個のアミノ酸からなる小さなエピトープ部分のみを導入して、融合タンパク質を調製する方法も報告されている。例えば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、インフルエンザ凝集素 ＨＡ、ヒトｃ−ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−ＧＰ）、Ｔ７ ｇｅｎｅ１０ タンパク質（Ｔ７−ｔａｇ）、ヒト単純ヘルペスウイルス糖タンパク質（ＨＳＶ−ｔａｇ）、Ｅ−ｔａｇ（モノクローナルファージ上のエピトープ）などのエピトープとそれを認識するモノクローナル抗体を、本発明のタンパク質に結合するタンパク質のスクリーニングのためのエピトープ−抗体系として利用できる（実験医学 １３，８５−９０（１９９５））。
免疫沈降においては、これらの抗体を、適当な界面活性剤を利用して調製した細胞溶解液に添加することにより免疫複合体を形成させる。この免疫複合体は本発明のタンパク質、それと結合能を有するタンパク質、および抗体からなる。上記エピトープに対する抗体を用いる以外に、本発明のタンパク質に対する抗体を利用して免疫沈降を行うことも可能である。本発明のタンパク質に対する抗体は、例えば、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を適当な大腸菌発現ベクターに導入して大腸菌内で発現させ、発現させたタンパク質を精製し、これをウサギやマウス、ラット、ヤギ、ニワトリなどに免疫することで調製することができる。また、合成した本発明のタンパク質の部分ペプチドを上記の動物に免疫することによって調製することもできる。
免疫複合体は、例えば、抗体がマウスＩｇＧ 抗体であれば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳｅｐｈａｒｏｓｅやＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いて沈降させることができる。また、本発明のタンパク質を、例えば、ＧＳＴなどのエピトープとの融合タンパク質として調製した場合には、グルタチオン−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂなどのこれらエピトープに特異的に結合する物質を利用して、本発明のタンパク質の抗体を利用した場合と同様に、免疫複合体を形成させることができる。
免疫沈降の一般的な方法については、例えば、文献（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐｐ．５１１−５５２，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８））記載の方法に従って、または準じて行えばよい。
免疫沈降されたタンパク質の解析にはＳＤＳ−ＰＡＧＥが一般的であり、適当な濃度のゲルを用いることでタンパク質の分子量により結合していたタンパク質を解析することができる。また、この際、一般的には本発明のタンパク質に結合したタンパク質は、クマシー染色や銀染色といったタンパク質の通常の染色法では検出することは困難であるので、放射性同位元素である^３５Ｓ−メチオニンや^３５Ｓ−システインを含んだ培養液で細胞を培養し、該細胞内のタンパク質を標識して、これを検出することで検出感度を向上させることができる。タンパク質の分子量が判明すれば直接ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから目的のタンパク質を精製し、その配列を決定することもできる。
また、本発明のタンパク質を用いて、該タンパク質に結合するタンパク質を単離する方法としては、例えば、ウエストウエスタンブロッティング法（Ｓｋｏｌｎｉｋ，Ｅ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９９１）６５，８３−９０）を用いて行うことができる。すなわち、本発明のタンパク質と結合する結合タンパク質を発現していることが予想される細胞、組織、臓器（例えば卵巣、精巣、胎盤などの組織や培養細胞など）よりファージベクター（λｇｔ１１，ＺＡＰなど）を用いたｃＤＮＡライブラリーを作製し、これをＬＢ−アガロース上で発現させフィルターに発現させたタンパク質を固定し、精製して標識した本発明のタンパク質と上記フィルターとを反応させ、本発明のタンパク質と結合したタンパク質を発現するプラークを標識により検出すればよい。本発明のタンパク質を標識する方法としては、ビオチンとアビジンの結合性を利用する方法、本発明のタンパク質又は本発明のタンパク質に融合したペプチド又はポリペプチド（例えばＧＳＴなど）に特異的に結合する抗体を利用する方法、ラジオアイソトープを利用する方法又は蛍光を利用する方法等が挙げられる。
また、本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、細胞を用いた２−ハイブリッドシステム（「ＭＡＴＣＨＭＡＲＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」，「Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ」，「ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ」（いずれもＣｌｏｎｔｅｃｈ社製）、「ＨｙｂｒｉＺＡＰ Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ」（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、文献「Ｄａｌｔｏｎ Ｓ，ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ Ｒ（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８，５９７−６１２」、「Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ．，ａｎｄ Ｓｔｅｒｎ ｇｌａｎｚ，Ｒ．，Ｔｒｅｎｄｓ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９４）１０，２８６−２９２」）を用いて行う方法が挙げられる。
２−ハイブリッドシステムにおいては、本発明のタンパク質をＳＲＦ ＤＮＡ結合領域またはＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域と融合させて酵母細胞の中で発現させ、本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される細胞より、ＶＰ１６またはＧＡＬ４転写活性化領域と融合する形で発現するようなｃＤＮＡライブラリーを作製し、これを上記酵母細胞に導入し、検出された陽性クローンからライブラリー由来ｃＤＮＡを単離する（酵母細胞内で本発明のタンパク質と結合するタンパク質が発現すると、両者の結合によりレポーター遺伝子が活性化され、陽性のクローンが確認できる）。さらに、単離したｃＤＮＡを大腸菌に導入して発現させ、該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を調製することもできる。
レポーター遺伝子としては、ＨＩＳ３遺伝子の他、Ａｄｅ２遺伝子、ＬａｃＺ遺伝子、ＣＡＴ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子等を用いることができる。
本発明のタンパク質と結合する化合物のスクリーニングは、アフィニティクロマトグラフィーを用いて行うこともできる。例えば、本発明のタンパク質をアフィニティーカラムの担体に固定し、ここに本発明のタンパク質と結合するタンパク質を発現していることが予想される被検試料を適用する。この場合の被検試料としては、例えば細胞抽出物、細胞溶解物等が挙げられる。被検試料を適用した後、カラムを洗浄し、本発明のタンパク質に結合したタンパク質を調製することができる。
得られたタンパク質は、そのアミノ酸配列を分析し、それを基にオリゴＤＮＡを合成し、該ＤＮＡをプローブとしてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、該タンパク質をコードするＤＮＡを得ることができる。
本発明において、結合した化合物を検出又は測定する手段として表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーを使用することもできる。表面プラズモン共鳴現象を利用したバイオセンサーは本発明のタンパク質と被検化合物との間の相互作用を微量のタンパク質を用いてかつ標識することなく、表面プラズモン共鳴シグナルとしてリアルタイムに観察することが可能である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。したがって、ＢＩＡｃｏｒｅ等のバイオセンサーを用いることにより本発明のタンパク質と被検化合物との結合を評価することが可能である。
また、タンパク質に限らず、本発明のタンパク質に結合する化合物（アゴニスト、およびアンタゴニストを含む）を単離する方法としては、例えば、固定した本発明のタンパク質に、合成化合物、天然物バンク、もしくはランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを作用させ、本発明のタンパク質に結合する分子をスクリーニングする方法や、コンビナトリアルケミストリー技術によるハイスループットを用いたスクリーニング方法（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ ＮＣ；Ｆａｒｒｅｌｌ ＦＸ；Ｃｈａｎｇ Ｒ；Ｋａｓｈｙａｐ ＡＫ；Ｂａｒｂｏｎｅ ＦＰ；Ｍｕｌｃａｈｙ ＬＳ；Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＬ；Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ；Ｊｏｌｌｉｆｆｅ ＬＫ；Ｄｏｗｅｒ ＷＪ．，Ｓｍａｌｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ｐｏｔｅｎｔ ｍｉｍｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｒｍｏｎｅ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＮＩＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ）Ｊｕｌ ２６ １９９６，２７３ ｐ４５８−６４、Ｖｅｒｄｉｎｅ ＧＬ．，Ｔｈｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｎａｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１１−１３、Ｈｏｇａｎ ＪＣ Ｊｒ．，Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ（ＥＮＧＬＡＮＤ）Ｎｏｖ ７ １９９６，３８４ ｐ１７−９）が当業者に公知である。
スクリーニングにより単離され得る化合物は、本発明のタンパク質の機能異常などに起因する疾患や癌などの細胞増殖性疾患などの治療や予防において、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤の候補となる。本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、本発明のタンパク質に結合する活性を有する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。
また、本発明は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。本発明のＧｒｏｓ１タンパク質は細胞増殖を抑制する活性を有することから、この活性を指標に、本発明のＧｒｏｓ１タンパク質の活性を促進または阻害する化合物をスクリーニングすることが可能である。
このスクリーニング方法は、（ａ）被検試料存在下で、Ｇｒｏｓ１タンパク質を発現する細胞を培養する工程、（ｂ）該細胞の増殖を検出する工程、（ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該増殖を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む。
スクリーニングに用いられるＧｒｏｓ１タンパク質としては、細胞の増殖を抑制する活性を有する限り特に制限はない。例えば、ヒトまたはマウスのＧｒｏｓ１−Ｌタンパク質が挙げられるが、これらタンパク質と機能的に同等なタンパク質を用いることが可能である。また、Ｇｒｏｓ１タンパク質は、細胞が内因的に発現するものであっても、外来的に発現するものであってもよい。
被検試料としては特に制限はなく、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物、精製若しくは粗精製タンパク質、ペプチド、非ペプチド性化合物、合成低分子化合物、天然化合物が挙げられる。また、上記の本発明のタンパク質に結合する化合物のスクリーニングで得られた化合物を被検化合物として用いることも可能である。
このスクリーニングにより単離される化合物は、本発明のタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの候補になる。「アゴニスト」とは、本発明のタンパク質に結合することにより、その機能を活性化する分子を指す。また、「アンタゴニスト」とは、本発明のタンパク質に特異的に結合することによってその機能を抑制する分子を指す。さらに、生体内において、本発明のタンパク質と相互作用する分子（ＤＮＡやタンパク質を含む）との相互作用を阻害する化合物の候補となる。
細胞増殖の検出は、例えば、実施例に記載のようにコロニー形成率を測定することにより検出するほか、細胞の増殖速度の決定、細胞周期の測定などにより行うことができる。
これらスクリーニングにより単離された化合物は、本発明のタンパク質の活性を促進または阻害するための薬剤の候補となり、本発明のタンパク質が関与する疾患（例えば癌など）の治療への応用が考えられる。
なお、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる、Ｇｒｏｓ１タンパク質の活性を促進または阻害する化合物の構造の一部を、付加、欠失及び／又は置換により変換される物質も、本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物に含まれる。
本発明のスクリーニング方法を用いて得られる化合物をヒトや哺乳動物、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、マントヒヒ、チンパンジーの医薬として使用する場合には、単離された化合物自体を直接患者に投与する以外に、公知の製剤学的方法により製剤化して投与を行うことも可能である。例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（ＴＭ）、ＨＣＯ−５０と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
例えば、本発明のタンパク質と結合する化合物や本発明のタンパク質の活性を阻害する化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１から１００ｍｇ、好ましくは約１．０から５０ｍｇ、より好ましくは約１．０から２０ｍｇである。
非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．０１から３０ｍｇ、好ましくは約０．１から２０ｍｇ、より好ましくは約０．１から１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］ Ｇｒｏｓ１ ｃＤＮＡのクローニングとシークエンス
マウス正常細胞（ＣＭＥＦ）および不死化細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の原形質膜のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００不溶画分に含まれるタンパク質の比較により、ＮＩＨ３Ｔ３に存在する約３０ｋＤａのタンパク質（ｐ３３）が、ＣＭＥＦには含まれていないことが判明している（Ｗａｄｈｗａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９９１）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２５６，２４３−５４）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりこのタンパク質を単離し、常法により抗ｐ３３ポリクローナル抗体を作製した。この抗体を用いたイムノスクリーニングにより、ＲＳ−４細胞 ｃＤＮＡライブラリー（Ｗａｄｈｗａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，６６１５−２１）から、新規の遺伝子Ｇｒｏｓ１−Ｌを得た。この遺伝子の配列はＤＮＡ配列データーバンク内に相同性を見いだせない新規物質であった。また、ヒト精巣ライブラリー（ｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｃａｔ＃．１０４１９−０１８）をベースにして作製した；Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｆｏｃｕｓ １２，４７；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ．，１９９０，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．；Ｌｉ，Ｗ．−Ｂ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６，７２２）から^３２ＰラベルしたマウスＧｒｏｓ１プローブを用いスクリーニングを行ったところ、２種類のクローン（ヒトＧｒｏｓ１−ＬおよびＧｒｏｓ１−Ｓ）を得た。得られたマウスＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡ断片の塩基配列を用いてＥＳＴデータを検索し、オーバーラップしたクローンを繋ぎ合わせることで、マウスＧｒｏｓ１−Ｓを同定した（図１）。このＥＳＴには、マウスＧｒｏｓ１−Ｌや他のＥＳＴと比べ９４ｂｐの欠失が認められ、欠失のない型（マウスＧｒｏｓ１−Ｌ）に比べ短いタンパク質（マウスＧｒｏｓ１−Ｓ）が生じると予想された。
マウスＧｒｏｓ１−Ｌ ｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号：５に、ＥＳＴ検索を用いたクローニングより得られたマウスＧｒｏｓ１−Ｓ ｃＤＮＡの全塩基配列を配列番号：７に示す。また、それらの塩基配列から導出されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号：６および８に示す。得られたそれぞれの全長ｃＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列データーバンク内にラットｃＤＮＡより単離された新規のｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ，（ｌｅｐｒｅｃａｎ）と８５．９％の相同性を有していることが明らかとなった。イムノスクリーニングで得られたｃＤＮＡ（マウスＧｒｏｓ１−Ｌ）は７４７アミノ酸からなる８５ｋＤａを、ＥＳＴ検索を用いたクローニングより得られたｃＤＮＡは５４２アミノ酸からなる６１．５ｋＤａのマウスＧｒｏｓ１−Ｓタンパク質をコードし（図２）、タンパク質データーバンク内においてもラットｌｅｐｒｅｃａｎと９０．９％のホモロジーを有していた。また、マウスＧｒｏｓ１と８３．９％の相同性を持つ上記ヒト３．０ＫｂクローンｃＤＮＡ（配列番号：１）と２．７ｋｂクローンのｃＤＮＡ（配列番号：３）に関してもＤＮＡ配列データーバンク内にラットｌｅｐｒｅｃａｎと８１．９％の相同性を有していることが明らかとなった。また、得られた３．０ＫｂクローンｃＤＮＡ（配列番号：１）は３６３アミノ酸（配列番号：２）からなる４１ｋＤａのヒトＧｒｏｓ１−Ｓを、２．７ｋｂクローンのｃＤＮＡ（配列番号：３）は７３６アミノ酸（配列番号：４）からなる８３ｋＤａのヒトＧｒｏｓ１−Ｌタンパク質をコードし（図３）、タンパク質データーバンク内においてもｌｅｐｒｅｃａｎと８３．０％のホモロジーを有していた。しかし、ＤＮＡ配列の一致は見られなかったものの、モチーフ検索によるアミノ酸配列の解析の結果、マウス、およびヒトのＧｒｏｓ１−Ｌのアミノ酸配列は部分的に転写因子に多く見られるロイシンジッパー構造を有していた。
［実施例２］ 組み換えＧｒｏｓ１の調製
マウスＧｒｏｓ１−Ｌ ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームのうち、１８３−１０５５番目のｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩサイトを有するセンスプライマー（配列番号：９）およびＨｉｎｄＩＩＩサイトを有するアンチセンスプライマー（配列番号：１０）を用いてＰＣＲ反応（９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ ３分、２５サイクル）を行い、得られたＰＣＲ産物を、Ｒａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ベーリンガーマンハイム）を用いてｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙベクター（プロメガ）に挿入した。大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（東洋紡）とベクターとの混合液を４２℃で１分間処理した後、アンピシリンプレートに撒き、一日培養後、コロニーを拾いクローニングした。ヒスチジン融合タンパク質を調製するために、クローニングしたｐＧＥＭ−Ｔ／Ｇｒｏｓ１ベクターをＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、同様の部位で切断したｐＱＥ３０（キアゲン）に上記と同様の方法でライゲーションし、コロニーを拾いプラスミドを回収した。大腸菌Ｍ１５（キアゲン）を、５８０ｎｍでの吸光度が０．６になるまで培養後、回収したプラスミドで形質転換し、ＩＰＴＧ ０．２ｍＭを用いて３７℃で３時間誘導してタンパク質を産生させた。この大腸菌の溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ヒスチジン抗体および、後述するＧｒｏｓ１抗体を用いたウェスタンブロッティングにより検出した。その結果４０ｋＤａのタンパク質が合成されていることが確認された。組み換えタンパク質の大きさは予想されたものと同じであった。また、抗ｐ３３ポリクローナル抗体を用いて、同様にウェスタンブロッティングを行ったところ、シグナルは検出されなかった。
［実施例３］ ノーザンブロット解析
マウス、ヒトの様々な組織のｍＲＮＡをレーンあたり２μｇのせたメンブレン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐａｌｏ ａｌｔｏ，ＣＡ）を購入し、ノーザンブロット解析を行った。プローブはマウスＧｒｏｓ１−Ｌプラスミドの遺伝子断片をプローブとして用いた。ハイブリダイゼーション条件は「Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ」（Ａｍｅｒｓｈａｍ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥ社製）を用い、６８℃で３０分プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、６８℃で２時間保温することによりハイブリダイゼーションを行った。その後、２ＸＳＳＣ，０．０１％ ＳＤＳ中、室温で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、３７℃で２０分の洗浄を３回、次いで、１ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中、５０℃で２０分の洗浄を２回行った。検出はオートラジオグラフィーによって行った。また、ノーザンブロット解析により、ヒトでは４．４ｋｂと２．５ｋｂのバンドが、精巣、卵巣、胎盤をのぞく、ほとんどの組織で弱く発現していた。一方、精巣、卵巣、胎盤においては非常に高い発現を示していた（図４）。また、ヒト培養細胞においては組織よりも高いｍＲＮＡの発現を示していた。さらに、ヒト正常培養細胞においては、２．５ｋｂ ｍＲＮＡが４．４ｋｂのｍＲＮＡの１０倍近い発現量を示した（図５）。マウスにおいても３．５ｋｂと２．５ｋｂのバンドが、脳と脾臓と精巣をのぞくほとんどの組織で弱く発現していた。脳と脾臓では発現が見られず、精巣では２．５ｋｂのみが発現していた。精巣及び卵巣においてはＧｒｏｓ１ ｍＲＮＡのうちの短いタイプのものしか検出されなかった。発生過程における発現は発生過程１１日目において劇的に発現が消失することが示された（図６）。
［実施例４］ 染色体上の配置
ヒトＧｒｏｓ１に特異的なセンスプライマー（配列番号：１１）及びアンチセンスプライマー（配列番号：１２）を用い、ラディエーションハイブリッドパネルを用いて、決定した。その結果ヒトでは染色体１ｐ３１に存在することが示された。また、マウスでは染色体４番に存在することが推定された。
［実施例５］ Ｇｒｏｓ１タンパク質に結合する特異抗体の作製
Ｇｒｏｓ１の遺伝子配列から予測される組換えタンパク質に対する抗体を作製した。具体的には、実施例２において作製したヒスチジンタグを付けた組換えマウスＧｒｏｓ１−Ｌタンパク質をニッケルカラムで精製後、ウサギに免疫し、４回に分けて段階的に血清を抽出し、最終的には全採血を行った。この血清をプロテインＡカラムにより精製しポリクローナル抗体を調製した。この抗体を用いて、ヒスチジンを融合させた組換えヒトＧｒｏｓ１−Ｌタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いたゲル上での分離し、ウェスタンブロッティング法によって検出することによって、この抗Ｇｒｏｓ１ポリクローナル抗体がＧｒｏｓ１タンパク質を認識することを確認した。
［実施例６］ ウェスタンブロット解析
上記の抗Ｇｒｏｓ１ポリクローナル抗体を用いてヒト正常肺繊維芽細胞 ＭＲＣ−５の溶解物を用いてウェスタンブロットを行ったところ、ｃＤＮＡ配列から予想される約８３ｋＤａおよび約４１ｋＤａのバンドが検出された。２つのバンドが検出されたことは、ノーザン解析で約４．４および約２．５ｋｂの２種の転写産物が検出された事実と一致している。興味深いことに、ノーザン解析で長い方のバンドしか検出されなかったＨｅＬａ細胞は、ウェスタン解析では８３ｋＤａのバンドしか検出されなかった。また、ＮＩＨ３Ｔ３細胞においても、抗Ｇｒｏｓ１抗体により約８５ｋＤａのバンドが検出された他、６１．５、４１、３４、および３２ｋＤａのバンドも検出された。約８５ｋＤａのバンドはマウスＧｒｏｓ１−Ｌに、６１．５ｋＤａのバンドはマウスＧｒｏｓ１−Ｓに対応しており、その他のバンドは内因的に切断されたり修飾されたタンパク質である可能性が考えられる。ＣＯＳ７細胞においては、６０、４０、および３４ｋＤａのバンドが検出された。ヒトＧｒｏｓ１−ＬまたはＳをコードするｃＤＮＡを発現ベクターに組込み、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクションした。発現ベクターとしては、ヒト精巣ライブラリースクリーニングの際に用いたｐＣＭＶ−ＳＰＯＲＴ Ｖｅｃｔｏｒ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）をそのまま使用した。抗Ｇｒｏｓ１抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果、それぞれのｃＤＮＡ配列に対応する８３ｋＤａまたは４１ｋＤａのバンドが検出された。また、後述のＧＦＰ−Ｇｒｏｓ１融合タンパク質をコードするこのプラスミドをトランスフェクションしたＣＯＳ７細胞では、Ｇｒｏｓ１−ＬまたはＧｒｏｓ１−Ｓに対応するサイズ（それぞれ１１５および７２ｋＤａ）のタンパク質が作られていることが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のウェスタンブロット解析により確認された。
［実施例７］ 細胞内での局在
ヒトＧｒｏｓ１−ＬおよびＳに対応する２種類のオープンリーディングフレームを持つように設計されたセンス（配列番号：１３）及びアンチセンス（配列番号：１４、１５）プライマーを用い２種類のヒトＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡの遺伝子をＰＣＲにて増幅した。これらの遺伝子をｐＥＧＦＰ−Ｃ１（クローンテック）中のＧＦＰ ＯＲＦのＣ末端領域に挿入し、ヒトＧｒｏｓ１−Ｓの融合タンパク質を発現する「ＧＦＰＣ１／７−３．０」、およびヒトＧｒｏｓ１−Ｌの融合タンパク質を発現する「ＧＦＰＣ１／７−２．７」を作成した。ＧＦＰ−Ｇｒｏｓ１融合タンパク質をコードするこれらのプラスミドおよび対照のＧＦＰのみをコードするプラスミドをカバーガラス上で生育しているＣＯＳ７細胞にＴｆｘ−５０（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞はエピフルオレッセンス光学系のオリンパスＢＨ−２顕微鏡で観察した。その結果、２種類のＧｒｏｓ１全配列を融合させたタンパク質はそれぞれ細胞質内に局在していた（図７，８）。
［実施例８］ 増殖抑制活性
スクリーニングにより単離されたマウスＧｒｏｓ１−ＬのＮ末端３６９アミノ酸のみをコードするＧｒｏｓ１ミュータントｃＤＮＡ／ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをＥｃｏＲＩで切り出し、実施例２と同様の方法で、ＥｃｏＲＩで制限酵素処理したＳＲα発現ベクター（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）８，４６６−４７２）にライゲーションした。その結果、センス向きとアンチセンス向きの両方のクローンを得た。一方、マウスのＧｒｏｓ１の全長をコードする遺伝子を単離するために、まず、マウスのＧｒｏｓ１とホモロジーのあったＥＳＴクローンＡＡ４９８９２ＡをＧｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ社より購入した。次に、ＳｃａＩ−ＮｏｔＩ部位でそのＥＳＴクローンを、またＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡ／ｐＢｕｌｅｓｃｒｉｐｔを同様の部位で制限酵素処理し、これらの遺伝子断片を実施例２と同様の方法でライゲーションを行い、マウスＧｒｏｓ１−Ｌ遺伝子を得た。さらに、このＧｒｏｓ１−Ｌ遺伝子断片をＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩで制限酵素処理し、同様の部位で制限酵素処理したＳＲα発現ベクターに実施例２と同様の方法でライゲーションした。その結果、マウスのＧｒｏｓ１−Ｌを発現するＳＲα／Ｇｒｏｓ１−Ｌセンスクローンを単離した。
これらのベクターをＮＩＨ３Ｔ３細胞に遺伝子導入し、６つのＧ４１８耐性のクローンを得、それぞれのＧｒｏｓ１の発現をノーザンブロットによって確認した（図９）。これらの中で特に高い発現をしているセンス向きのクローン、および内因性のＧｒｏｓ１転写産物がノーザン解析でほとんど検出されないアンチセンス向きのクローンをコロニー形成試験に供した。
１０ｃｍディッシュに各クローン５００細胞を播き、３日おきに培地を交換して２週間培養した。その後、４％ホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、メチレンブルーで染色後、コロニー数を数えた。実験は３連で行った。
その結果、センス向きのＧｒｏｓ１−Ｌをトランスフェクションしたクローンではコロニー形成が著しく遅れたのに対し、アンチセンス向きのＧｒｏｓ１−Ｌをトランスフェクションしたクローンでは対照に比べ、約５倍高いコロニー形成能を示した（図１０、表１）。また、センス向きのＧｒｏｓ１−ミュータントではコロニー形成の低下が見られなかった（表１の「欠失コロニー」）。この結果から、Ｇｒｏｓ１ タンパクは増殖抑制活性をもつことが示された。

産業上の利用の可能性
多くの悪性腫瘍において、ヒト染色体１ｐ上にランダムではない遺伝子変異があることが、細胞遺伝学及び分子生物学的なアプローチにより示唆されてきた。これらの事実から、染色体１ｐにおける一つまたは複数の遺伝子変異が悪性腫瘍に重要であると考えられている。本発明のヒトＧｒｏｓ１遺伝子は染色体１ｐ領域に存在し、腫瘍を抑制する活性を持つことから、これらの疾患の原因遺伝子である可能性を持つ。そのため、本発明のタンパク質や遺伝子、または本発明のタンパク質の活性を促進する化合物は、細胞増殖に関与する新たな因子の精製やクローニング、さらには様々な腫瘍に対する治療や予防を行うための医薬品の開発のための有用なツールとして利用しうる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、マウスＧｒｏｓ１シーケンスとＥＳＴシーケンスのアライメントを示す図である。
図２は、マウスＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡのスプライシングフォームを示す図である。
図３は、ヒトＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡのスプライシングフォームを示す図である。
図４は、マウスＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡプローブを用いた、マウス組織ノーザン解析の結果を示す写真である。
図５は、マウスＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡプローブを用いた、ヒト細胞ノーザン解析の結果を示す写真である。
図６は、マウスＧｒｏｓ１ ｃＤＮＡプローブを用いた、ヒト組織ノーザン解析の結果を示す写真である。
図７は、ＣＯＳ７に発現させたヒトＧＦＰ−Ｇｒｏｓ１ＬとＧＦＰ−Ｇｒｏｓ１Ｓのウェスタン解析の結果を示す写真である。
図８は、ヒトＧＦＰ−Ｇｒｏｓ１ＬとヒトＧＦＰ−Ｇｒｏｓ１Ｓの細胞内での局在性を示す写真である。
図９は、マウスＧｒｏｓ１Ｌ、Ｇｒｏｓ１ミュータント、およびＧｒｏｓ１アンチセンスを遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞のノーザン解析の結果を示す写真である。
図１０は、マウスＧｒｏｓ１Ｌ、Ｇｒｏｓ１ミュータント、およびＧｒｏｓ１アンチセンスを遺伝子導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞のコロニー形成能の解析結果を示す写真である。

Claims (8)

1. 下記（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載のDNA：
   （ａ）配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA；
   （ｂ）配列番号：３または５に記載の塩基配列のコード領域を含むDNA；
   （ｃ）配列番号：４または６に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、細胞増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするDNA；および
   （ｄ）配列番号：３または５に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、細胞増殖を抑制する活性を有するタンパク質をコードするDNA。
2. 請求項１記載のDNAが挿入されたベクター。
3. 請求項１に記載のDNAまたは請求項２に記載のベクターを保持する形質転換細胞。
4. 請求項１に記載のDNAによりコードされるタンパク質。
5. 請求項３に記載の形質転換細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から発現させたタンパク質を回収する工程を含む、請求項４に記載のタンパク質の製造方法。
6. 請求項４に記載のタンパク質に結合する抗体。
7. 請求項４に記載のタンパク質に結合する化合物のスクリーニング方法であって、
   （ａ）該タンパク質またはその部分ペプチドに被検試料を接触させる工程、
   （ｂ）該タンパク質またはその部分ペプチドと被検試料との結合活性を検出する工程、
   （ｃ）該タンパク質またはその部分ペプチドに結合する活性を有する化合物を選択する工程、を含む方法。
8. 請求項４に記載のタンパク質の活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法であって、
   （ａ）被検試料の存在下で、該タンパク質またはその部分ペプチドを発現する細胞を培養する工程、
   （ｂ）該細胞の増殖を検出する工程、
   （ｃ）被検試料非存在下で検出した場合と比較して、該増殖を促進または抑制する化合物を選択する工程、を含む方法。

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