KR100833367B1 - 더블유티1 상호작용 단백질 더블유티아이피 - Google Patents

Abstract

서열번호:2에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인간 WT1 상호작용 단백질(WTIP) 또는 그 것을 코드하는 유전자.

Description

더블유티1 상호작용 단백질 더블유티아이피{WT1-INTERACTING PROTEIN WTIP}

본 발명은, WT1 단백질과 상호작용하는 단백질(WT1 interacting protein) (WTIP) 및 그 것을 코드하는 유전자 및 이 단백질의 용도에 관한 것이다.

WT1(Wilm's tumor gene 1)유전자는, 소아신장종양인 Wilms 종양의 원인 유전자를 동정하는 과정에서 발견된 전사조절인자이고(Call K.M. et al., Cell Vol. 60, p. 509-520, 1990; Gessler M. et al., Nature Vol. 343, p. 774-778, 1990), 적어도 일부의 Wilms 종양에서는 암억제유전자로서 기능하고 있다. 또한, 거의 모든 백혈병 세포에서 발현레벨이 높인 값인 것이 발견되고, 백혈병 초기 진단시의 발현레벨과 예후가 상관하고, 백혈병의 미소잔존병변(MRD)의 마커로서 극히 유용한 것 등이 밝혀지고 있다(Inoue K. et al., Blood Vol. 84, p. 3071-3079, 1994).

정상조직에서는, 태생기(胎生期)의 신장에서 특히 발현이 높은 것 이외에, 정소, 난소, 비장, 간엽계 유래의 중피(中皮)에서 고발현하고 있다. 또한, 악성종양에서는 백혈병이나 악성중피종, 폐암 등의 고형 종양에서 발현이 높다. WT1 유전자는 당초 생각되어져 왔었던 암억제유전자라고 말하는 것 보다는, 기관발생·종양발생 등에 있어서 다채로운 기능을 갖는 유전자인 것이 밝혀지고 있다(Reddy J.C. et al., Biochem. Biophys. Acta 1287: p. 1-28, 1996; Davices R. 등 Cancer Res. Vol. 59, p. 1747-1751, 1999).

WT1 유전자는 엑손 내의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 주로 4종류의 단백질로 번역된다(도 1a). 엑손5인 17아미노산잔기(17AA), 및 3번과 4번의 Zine finger 사이에 있는 3아미노산잔기(KTS¹)가 삽입된 최장의 유전자 산물을 여기에서는 WT1(+/+)로 표기한다.

KTS를 함유하는 WT1(+/+)은 DNA결합능이 약하여, mRNA splicing protein과 결합하고, DNA결합능이 강한 WT1(+/-)은 전사조절인자로서 기능하는 것이 나타내고 있다.

WT1 단백질은 기능조절영역과 Zine finger를 포함하는 DNA 결합영역이 큰 2개의 영역으로 구성되어 있다. 기능조절영역 내에는 도 1a에 나타낸 바와 같이, 전사를 억제 또는 활성화하는 2개의 도메인이 있다. 이들의 영역에 결합하는 단백질에 의해서 기능조절이 행해지고 있는 것은 아닌가라는 관점에서, 여러 가지의 WT1 상호작용 단백질이 발견되었다. 그 중에서는, p 53 (Malheswran S. 등. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90, p. 5100-5104, 1993), 유비키친콘쥬게이팅 효소9 (Wany Z.Y. et al., J. Biol. Chem. Vol. 271, p. 24811-24816, 1996), par-4(Johnstone R.W. 등, Mol. Cell Biol. Vol. 16, p. 6945-6956, 1990), U2AF65 (Ravis R.C. et al., Geves. Rev. Vol. 12, p. 3217-3225, 1998), hsp70 (Maheswaran S. et al., Geves Rev. Vol. 12, p. 1108-1120, 1998) 등 다양한 단백질이 보여진다. 그러나, 백혈병세포 내에서의 특이적인 결합단백질의 보고는 아직 없다.

따라서, 본 발명은 WT1 단백질과 상호작용(결합)하는 신규한 단백질 및 그 것을 코드하는 유전자 및 그의 용도 등을 제공하려고 하는 것이다.

즉, 본 발명은 (1) 서열번호:2에 나타낸 아미노산서열을 갖는 WT1 상호작용 단백질, 또는 이 단백질 중의 아미노산에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입, 및/또는 부가한 아미노산서열을 갖고, 서열번호:2에 나타낸 아미노산서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 제공한다.

본 발명은, 또한 (2) 서열번호:1에 나타낸 염기서열을 갖는 DNA와 스트린전트(stringent) 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA가 코드하는 단백질이며, 서열번호:2에 나타낸 아미노산서열을 갖는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 제공한다.

본 발명은, 또한 (3) 서열번호:2에 있어서 제 449위치로부터 제 541위치까지의 아미노산서열을 함유해서 되는, WT1 상호작용 단백질을 제공한다.

본 발명은, 또한 (4) 서열번호:2에 있어서 제 449위치의 Glu로부터 제 541위치의 Met까지의 아미노산서열을 함유해서 되는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 WT1 단백질 기능조절제를 제공한다.

본 발명은, 또한 (5) 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 단백질의 부분 펩티드를 제공한다.

본 발명은, 또한, (6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질을 코드하는 유전자를 제공한다.

본 발명은, 또한 (7) 상기 (6)에 기재된 유전자를 함유해서 되는 벡터를 제공한다.

본 발명은, 또한 (8) 상기 (7)에 기재된 벡터를 유지하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명은, 또한 (9) 상기 (8)의 숙주세포를 배양하는 것을 포함하고, 상기 (1)로부터 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질의 제조방법을 제공한다.

본 발명은, 또한 (10) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질에 대한 항체를 제공한다.

본 발명은, 또한 (11) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질의 검출 또는 측정방법에 있어서,

(a) 상기 (10)에 기재된 항체와 이 단백질이 함유되는 것으로 예상되는 시료를 접촉시키고,

(b) 상기 항체와 이 단백질과의 면역 복합체의 생성을 검출 또는 측정하는 것, 또는 상기 항체를 사용해서 이 단백질을 발현하는 세포를 면역염색하는 것을 포함해서 이루어지는 방법을 제공한다.

본 발명은, 또한 (12) 서열번호:1에 나타낸 염기서열로부터 되는 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈하여, 적어도 15염기의 체인 길이를 갖는 DNA를 제공한다.

본 발명은, 또한 (13) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝방법에 있어서,

(a) 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 피검시료를 접촉시키는 공정,

(b) 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 피검시료와의 결합활성을 검출하는 공정, 및

(c) 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 선택하는 공정을 포함해서 되는 방법을 제공한다.

본 발명은, 또한 (14) 상기 (13)에 기재된 방법에 의해 단리될 수 있는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질에 결합하는 화합물을 제공한다.

본 발명은, 또한 (15) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물의 스크리닝방법에 있어서,

(a) 피검시료의 존재하에서, 이 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 공정,

(b) 이 세포의 증식을 검출하는 공정, 및

(c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우와 비교해서, 이 증식을 촉진 또는 억제하는 화합물을 선택하는 공정을 포함해서 되는 방법을 제공한다.

본 발명은, 또한 (16) 상기 (15)에 기재된 방법에 의해 단리될 수 있는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 제공한다.

본 발명은, 또한 (17) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 WT1 상호작용 단백질과 WT1 단백질과의 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물의 스크리닝방법에 있어서,

(a) 피검시료의 존재하에서, WT1 상호작용 단백질 및 WT1 단백질을 반응시키 는 공정,

(b) 양 단백질의 결합활성을 측정하는 공정, 및

(c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우와 비교해서, 이 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물을 선택하는 공정을 포함해서 되는 방법을 제공한다.

본 발명은, 또한 (18) 상기 (17)에 기재된 방법에 의해 단리될 수 있는, 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 WT1 상호작용 단백질과 WT1 단백질과의 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물을 제공한다.

도 1a는 WT1 단백질의 전장(全長)을 코드하는 cDNA의 구조를 나타낸 도이고,

도 1b는 WT1 단백질의 억제 도메인과 GST(글루타치온 S-트란스페라제)와의 융합 단백질(GST-WT2), 억제 도메인 및 활성화 도메인과 GST와의 융합 단백질(GST-WT3) 및 활성화 도메인과 GST와의 융합 단백질(GST-WT4)의 구조를 나타낸 도이다.

도 2는 K562 세포의 추출물과 도 1b에 나타낸 융합 단백질 또는 GST만과의 반응성을 나타낸 전기영동도이고, 도면대용 사진이다. K562 세포의 추출물 중에 WT1 단백질의 억제 도메인과 결합하는 약 115kDa의 단백질이 존재하는 것을 나타낸다.

도 3은 K562 세포의 무세포추출물(세포를 초음파 파쇄한 후의 원심분리 상징액)을 HiLoad 16/10 Q Sepharose High Performance를 사용해서 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 분리한 경우의 용출 프로필을 나타낸 도이다. West western blot법에 의해 획분번호 26~35에서 활성이 인지되었다.

도 4는, 도 3에 있어서 얻어진 활성획분을, MONO Q HR 5/5를 사용해서 음이온 교환 크로마토그라피에 의해 분리한 경우의 용출 프로필을 나타낸 도이다. west western blot법에 의해 획분번호 14~17에서 활성이 인지되었다.

도 5는 도 4에 있어서 얻어진 활성획분을, Phenyl Superrose HR 5/5를 사용해서 소수성 상호작용 크로마토그라피에 의해 분리한 경우의 용출 프로필을 나타낸 도이다. west western blot법에 의해 획분번호 13 및 14에서 활성이 인지되었다.

도 6은, 도 5에 있어서 얻어진, 115kDa의 단백질을 함유하는 활성획분을 PVDF막에 전사하여, CBB(쿠마시·브릴리언트·블루)에 의한 단백질의 검출, 및 GST-WT3, GST-WT2 및 GST와의 반응에 의한 west western blot 검출을 행한 결과를 나타낸 전기영동도이고, 도면대용 사진이다. 115kDa의 단백질이 WT1의 억제 도메인과 결합하는 것이 나타났다.

도 7a는 WTIP의 전장의 구성을 나타내고,

도 7b는 WTIP의 N-말단측의 WW 도메인을 함유하는 폴리펩티드(WTIP 1-406 및 WTIP 1-178) 및 WW 도메인을 함유하지 않는 폴리펩티드(WTIP 1-98)에 있어서, 각각의 C-말단에 히스티딘(His) 택(tag)을 붙인 폴리펩티드의 구조를 나타낸다.

도 8은, 도 7에 나타낸 폴리펩티드를 전기영동한 후, 항-His 택 폴리펩티드항체, GST-WT3 및 GST와의 반응에 의해 검출한 결과를 나타내는 전기영동도이고, 도면대용 사진이다. WW도메인을 함유하는 WTIP 1-460 및 WTIP 1-178은 억제 도메인을 함휴하는 GST-WT3와 반응하지만, WW도메인을 함유하지 않는 WTIP 1-98은 반응하지 않고, 또한, 억제 도메인을 함유하지 않는 GST는 어느 WTIP단편과도 반응하지 않고, WTIP의 WW도메인과 WT1 단백질의 억제 도메인 중의 부분이 결합하는 것이 나타났다.

도 9는 세포 내에서 WT1과 WTIP가 결합하는 것을 나타내는 전기영동도이다.

WT1 단백질과 결합하는 신규한 단백질을 얻기 위하여, WT1을 고발현하고, 또한 WT1의 안티센스·올리고 DNA에 의해서 증식억제가 인지되는 (Yamagami T. et al., Blood Vol. 87, p. 2878-2885, 1996) 인간 백혈병세포주 K562를 사용해서, WT1 상호작용 단백질을 검색했다. WT1 조절영역과 글루타치온 S-트란스페라제 (GST)와의 융합단백질을 사용한 west western blot를 행한 결과, 융합 단백질과 결합하는 세포 내 단백질을 확인하기 위해, 칼럼 크로마토그라피와 SDS-PAGE로 이 것을 분리하여, 펩티드 매핑(peptide mapping)과 발현에 의한 스크리닝으로 유전자를 동정했다. 그 결과, 신규 유전자 WT1 상호작용 단백질(WTIP)의 cDNA를 클로닝하는 것이 가능했다.

따라서, 본 발명은, 서열번호:1에 나타낸 아미노산서열을 갖는 WT1 상호작용 단백질을 제공한다.

서열번호:1에 나타낸 서열 중, 1위치~1358위치의 염기산서열은 마우스 수족·신장 발생에 관여하는 포르민(formin)에 결합하는 단백질(formin binding protein)의 하나인 FBP11(Chan D.C. et al., EMBO J. 15: p. 1045-1054, 1996) 및 인간의 신경변성질환인 헌팅톤(huntington)병의 원인유전자로 보여지는 헌팅틴 (Huntingtin)에 결합하는 단백질의 하나인 HYPA(huntingtin yeast partner A)(Faber P.W. et al., Hum. Mol. Genet. Vol. 7, p. 1463-1467, 1998)에 대응하고, 그리고 서열번호:1의 1636위치~2980위치의 염기서열에 대응하는 아미노산서열은, 인간의 신장압 환자 혈청 중의 자기항체가 인식하는 자기항원으로서 동정된 NY-REN-6(Scanlan M. J. et al., Int. J. Cancer Vol. 83, p. 456-464, 1999)에 대응한다.

따라서, 서열번호:1 중의 제 1359위치~1635위치의 염기서열에 대응하는 아미노산서열을 함유하는, 전장 아미노산 서열 및 부분 아미노산 서열을 갖는 단백질은 신규하다. 따라서, 본 발명은 서열번호:1에 있어서 제 1359위치~제 1635위치의 염기서열에 대응하는 아미노산서열을 함유해서 되는 단백질을 제공한다.

본 발명은, 또한, 상기 단백질을 코드하는 유전자, 예를 들면 DNA 또는 RNA를 제공한다. 이 DNA는 특히 cDNA이다.

본 발명은 또한, 상기 DNA를 함유해서 되는 벡터, 예를 들면 발현벡터를 제공한다.

본 발명에 의하면, 또한, 서열번호:2 중의 제 141위치의 Gly로부터 217위치의 Asp까지의 WW도메인이 WT1 단백질과의 결합영역인 것이 명백해졌다. 따라서, 본 발명은, 서열번호:2의 제 141위치의 Gly로부터 217위치의 Asp까지의 아미노산서열을 함유해서 되는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 WT1 단백질 기능제어제를 제공한다. 본 발명에 의하면, 서열번호:2의 제 1위치(Met)~제 98위치(Gly)의 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드는, WT1 단백질과 결합하지 않지만, 제 1위치(Met)~제 178위치(Ala)의 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드는 WT1과 결합한다. 따라서, 본 발명의 하나의 태양에 의하면, 서열번호:2에 있어서 제 99위치(Gln)~제 178위치(Ala)이 아미노산서열을 갖든가 또는 함유해서 되는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 WT1 단백질 기능제어제를 제공한다.

본 발명에 의하면, 또한, 서열번호:2에 있어서 제 1위치(Met)~제 406위치(Glu)의 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드가 WT1 단백질과 결합한다. 따라서, 본 발명의 하나의 태양에 의하면, 서열번호:2의 제 99위치(Gln)~제 406위치(Glu)의 아미노산서열을 갖거나 또는 그 것을 함유해서 되는 폴리펩티드를 유효성분으로 하는 WT1 단백질 기능제어제를 제공한다. 또한, 일반적으로는, 본 발명은 서열번호:2에 있어서, 제 1위치(Met)~제 99위치(Gln) 중 어느 하나의 아미노산에서, 제 189위치(Glu)~제 406위치(Glu) 또는 제 957위치(Gln) 사이의 어느 하나의 아미노산까지의 폴리핍티드 또는 단백질을 유효성분으로 하는 WT1 단백질 기능제어제를 제공한다.

WTIP의 단리 및 그 것을 코드하는 cDNA의 클로닝은 실시예 1에 기재한다. 이 실시예에 있어서는, WTIP 및 그 것을 코드하는 DNA의 분리원으로서 인간 백혈병 세포모양 K562 (Japanese Cancer Research Resource Banks)를 사용했지만, WTIP를 생산하는 다른 세포를 사용할 수도 있다.

본 발명은, WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 포함한다. 이와 같은 단백질에는, 예를 들면, 인간 WT1 상호작용 단백질에 대응하는 다른 생물의 호모로그 단백질(homologue protein)이나 인간 WT1 상호작용 단백질의 변이체가 함유된다. 본 발명에 있어서 「기능적으로 동등」이라함은, 대상으로 되는 단 백질이 상기 WT1 상호작용 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖을 의미한다. 생물학적 활성으로서는, 예를 들면, WT1 단백질과의 결합활성이다.

어떤 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 조제하기 위한, 당업자에게 잘 알려진 방법으로서는, 단백질에 변이를 도입하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, 당업자라면, 부위 특이적 변이유발법(Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 82, 488-492, Kunkel (1988) Methods Enzymol. 85, 2763-2766) 등을 사용해서, 인간 WT1 상호작용 단백질의 아미노산에 적절한 변이를 도입하므로서 인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 조제할 수 있다.

또한, 아미노산의 변이는 자연계에서도 생길 수 있다. 이와 같이, 인간 WT1 상호작용 단백질의 아미노산서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 변이한 아미노산 서열을 갖고, 인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 또한 본 발명의 단백질에 포함된다.

본 발명의 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질로서는, 구체적으로는, 서열번호:2에 나타낸 아미노산서열 중 1 또는 2개 이상, 바람직하기는 2개 이상 30개 이하, 더욱 바람직하기는 2개 이상 10개 이하의 아미노산이 결실한 것, 서열번호:2에 나타낸 아미노산서열에 1 또는 2개 이상, 바람직하기는 2개 이상 30개 이하, 더욱 바람직하기는 2개 이상 10개 이하의 아미노산이 부가한 것, 서열번 호:2에 나타낸 아미노산 서열 중 1 또는 2개 이상, 바람직하기는 2개 이상 30개 이하, 더욱 바람직하기는 2개 이상 10개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것을 들 수 있다.

변이하는 아미노산잔기에 있어서는, 아미노산측쇄의 성질이 보존되어 있는 다른 아미노산으로 변이되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 아미노산측쇄의 성질로서는, 소수성 아미노산(A, I, L, M, F, P, W, Y, V), 친수성 아미노산(R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), 지방족 측쇄를 갖는 아미노산(G, A, V, L, I, P), 수산기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(S, T, Y), 황원자 함유 측쇄를 갖는 아미노산(C, M), 카본산 및 아미드 함유 측쇄를 갖는 아미노산(D, N, E, Q), 염기 함유 측쇄를 갖는 아미노산(R, K, H), 방향족 함유 측쇄를 갖는 아미노산(H, F, Y, W)을 들 수가 있다(괄호내는 어느 것도 아미노산의 1문자 표기를 나타낸다).

또한, 어떤 아미노산서열에 대한 1 또는 복수개의 아미노산잔기의 결실, 부가 및/또는 다른 아미노산에 의한 치환에 의해 수식된 아미노산서열을 갖는 단백질이 그의 생물학적 활성을 유지하는 것은 이미 알려져 있다(Mark, D.F. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1984) 81, 5662-5666, Zoller, M.J. & Smith, M.Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA (1982) 79, 6409-6413).

인간 WT1 상호작용 단백질의 아미노산서열(서열번호:2)에 1 또는 복수개의 아미노산잔기가 부가된 단백질로서는, 예를 들면, 인간 WT1 상호작용 단백질을 함유하는 융합단백질을 들 수가 있다. 융합단백질은, 인간 WT1 상호작용 단백질과 다른 펩티드 또는 단백질이 융합한 것이고, 본 발명에 포함된다. 융합단백질을 제작하는 방법은, 본 발명의 인간 WT1 상호작용 단백질을 코드하는 DNA와 다른 펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA를 프레임이 일치하도록 연결해서 이 것을 발현벡터에 도입하고, 숙주에서 발현시키면 좋고, 당업자에게 공지의 방법을 사용할 수 있다. 본 발명의 단백질과의 융합에 제공되는 다른 펩티드 또는 단백질로서는, 특히 한정되지 않는다.

본 발명의 단백질과의 융합에 제공되는 다른 펩티드로서는, 예를 들면, FLAG(Hopp, T.P. et al., Biotechnology (1988) 6, 1204-1210), 6개의 His(히스티딘)잔기로부터 되는 6 x His, 10 x His, 인플루엔자응집소(HA), 인간c-myc의 단편, VSV-GP의 단편, p18HIV의 단편, T7-tag, Hsv-tag, E-tag, SV40T 항원의 단편, 1ck Tag, α-tubulin의 단편, B-tag, Protein C의 단편 등의 공지의 펩티드를 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질과의 융합에 제공되는 다른 단백질로서는, 예를 들면, GST(글루타치온-S-트란스페라제), HA(인플루엔자 응집소), 이뮤노글로블린 정상영역, β-갈락토시다제, MBP(말토오스 결합 단백질) 등을 들 수가 있다.

시판되고 있는 이들 펩티드 또는 단백질을 코드하는 DNA를 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA와 융합시키고, 이 것에 의해 조제된 융합 DNA를 발현시킴으로써, 융합단백질을 조제할 수 있다.

또한, 어떤 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 조제하는 당업자에게 잘 알려진 다른 방법으로서는 하이브리다이제이션기술(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. press, 1989)을 이용하는 방법을 들 수가 있다.

즉, 당업자라면, 인간 WT1 상호작용 단백질을 코드하는 DNA서열(서열번호:1) 또는 그의 일부를 기초로 하여, 이 것과 상동성이 높은 DNA를 단리해서, 이 DNA로부터 인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 단리하는 것도 통상 행할 수 있는 것이다. 이와 같이, 인간 WT1 상호작용 단백질을 코드하는 DNA 또는 그의 일부로부터 되는 DNA와 하이브리다이즈하는 DNA를 코드하는 단백질에 있어서, 인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 또한 본 발명의 단백질에 포함된다.

이와 같은 단백질로서는, 예를 들면, 인간 이외의 포유동물의 호모로그(예를 들면, 원숭이, 마우스, 래트, 토끼, 소의 유전자를 코드하는 단백질)을 들 수가 있다. 인간 WT1 상호작용 단백질을 코드하는 DNA와 상동성이 높은 cDNA를, 동물로부터 단리하는 경우, 특히 심장, 태반, 정소 등의 조직을 사용하는 것이 바람직하다고 여겨진다.

인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 단리하기 위한 하이브리다이제이션의 조건으로서는, 당업자라면 적당히 선택할 수 있다. 하이브리다이제이션의 조건은, 예를 들면 스트린전트 조건을 들 수가 있다. 낮은 스트린전트 조건이라함은, 예를 들면 42℃, 2 x SSC, 0.1% SDS를 들 수가 있고, 바람직하기로는 50℃, 2 x SSC, 0.1% SDS이다.

또한, 더욱 바람직하기는, 높은 스트린전트 조건을 들 수가 있다. 여기서 높은 스트린전트 조건이라함은, 예를 들면 65℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS를 들 수가 있다. 이들의 조건에 있어서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 DNA를 얻을 수가 있다. 단, 하이브리다이제이션의 스트린전트(stringency)에 영향을 주는 요소로서는 온도 이외에도 염농도 등의 복수의 요소가 고려되며, 당업자라면 이들 요소를 적당히 선택하는 것으로 동일한 스트린전시를 실현하는 것이 가능하다.

또한, 하이브리다이제이션에 더해서, 인간 WT1 상호작용 단백질을 코드하는 DNA(서열번호:1)의 서열정보를 기초하여 합성한 프라이머를 사용하는 유전자 증폭법, 예를 들면 폴리머라제 연쇄반응(PCR)법을 이용해서 단리하는 것도 가능하다.

이들 하이브리다이제이션기술 또는 유전자증폭기술에 의래 단리되는 DNA를 코드하는 인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은, 통상, 인간 WT1 상호작용 단백질과 아미노산서열에 있어서 높은 상동성을 갖는다.

본 발명의 단백질에는, 인간 WT1 상호작용 단백질과 기능적으로 동등하고, 또한 서열번호:2에 나타낸 아미노산서열과 높은 상동성을 갖는 단백질도 포함된다. 높은 상동성이라함은, 통상 70% 이상의 상동성, 바람직하기로는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하기는 90% 이상, 더더욱 바람직하기는 95% 이상의 동일성을 가리킨다. 단백질의 상동성을 결정하는데는, 문헌(Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80, 726-730)에 기재된 알고리즘(algorism)에 따르면 좋다.

본 발명의 단백질은, 후술하는 것을 생산하는 세포나 숙주 또는 정제방법에 의해, 아미노산서열, 분자량, 등전점 또는 당쇄(糖鎖)의 유무나 형태 등이 다를 수 있다. 그렇지만, 얻어진 단백질이, 본 발명의 인간 WT1 상호작용 단백질(서열번 호:2)과 동등한 기능을 갖고 있는 한, 본 발명에 포함된다. 예를 들면, 본 발명의 단백질을 원핵세포, 예를 들면 대장균으로 발현시킨 경우, 본래의 단백질의 아미노산서열의 N말단에 메티오닌잔기가 부가된다. 또한, 진핵세포, 예를 들면 포유동물세포로 발현시킨 경우, N말단의 시그날서열은 제거된다. 본 발명의 단백질은 이와 같은 단백질도 포함한다.

본 발명의 단백질은, 당업자에게 공지된 방법에 의해, 재조합 단백질로서, 또한 천연의 단백질로서 조제하는 것이 가능하다. 재조합 단백질이라면, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA(예를 들면, 서열번호:1에 기재된 염기서열을 갖는 DNA)를, 적당한 발현벡터에 병합시키고, 이 것을 적당한 숙주세포에 도입해서 얻은 형질전환체를 회수하여 추출물을 얻은 후, 이온교환, 역상, 겔여과 등의 크로마토그라피, 또는 본 발명의 단백질에 대한 항체를 칼럼에 고정한 어피니티 크로마토그라피에 제공하거나 또는 또한 이들의 칼럼을 복수 조합시킴으로써 정제하여 조제하는 것이 가능하다.

또한, 본 발명의 단백질을 글루타치온 S 트란스페라제 단백질과의 융합단백질로서 또는 히스티딘을 복수 부가시킨 재조합단백질로서 숙주세포(예를 들면, 동물세포나 대장균 등) 내에서 발현시킨 경우에는, 발현시킨 재조합 단백질은 글루타치온 칼럼 또는 니켈 칼럼을 사용해서 정제할 수 있다.

융합단백질의 정제 후, 필요에 따라서 융합단백질 중 목적하는 단백질 이외의 영역을, 트롬빈 또는 팩터 Xa 등에 의해 절단하여 제거하는 것도 가능하다.

천연단백질이라면, 당업자에게 주지의 방법, 예를 들면 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 조직이나 세포의 추출물에 대하여, 후술하는 WT1 상호작용 단백질에 결합하는 항체가 결합한 어피니티 칼럼을 작용시켜서 정제함으로써 단리할 수 있다. 항체는 폴리클로날 항체이어도 또는 모노클로날 항체이어도 좋다.

본 발명은, 또한 본 발명의 단백질의 부분펩티드를 포함한다.

본 발명의 단백질에 특이적인 아미노산서열로부터 되는 부분 펩티드는, 적어도 7 아미노산, 바람직하기는 8 아미노산 이상, 더욱 바람직하기는 9 아미노산 이상의 아미노산서열로 이루어진다. 이 부분 펩티드는, 예를 들면 본 발명의 단백질에 대한 항체의 제작, 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝이나, 본 발명의 단백질의 촉진제나 저해제의 스크리닝에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 리간드에 대한 안타고니스트(antagonist)로 될 수 있다.

본 발명의 단백질의 부분펩티드로서는, 예를 들면 서열번호:2에 나타낸 아미노서열로부터 되는 단백질의 활성중심으로부터 되는 부분펩티드를 들 수가 있다. 또한, 소수성 플롯트해석에서 추정되는 소수성 영역이나 친수성 영역의 하나 또는 복수의 영역을 갖는 부분펩티드를 들 수가 있다. 이들 부분펩티드는 하나의 소수성 영역의 일부 또는 전부를 포함하고 있어도 좋고, 하나의 친수성 영역의 일부 또는 전부를 포함하고 있어도 좋다.

본 발명의 부분펩티드는 유전자공학적 방법, 공지의 펩티드합성법, 또는 본 발명의 단백질을 적당한 펩티다제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 펩티드 합성법으로서는, 예를 들면 고상 합성법, 액상 합성법 중 어느 것에 의해서도 좋다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA에 관한 것이다. 본 발 명의 DNA는, 상기한 바와 같은 본 발명의 단백질의 in vivo나 in vitro에 있어서 생산에 이용되는 것 외에, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 코드하는 유전자의 이상(異常)에 기인하는 질환의 유전자치료 등의 응용도 고려된다.

본 발명의 DNA는, 본 발명의 단백질을 코드할 수 있는 것이라면 어떠한 형태이어도 좋다. 즉, mRNA로부터 합성된 cDNA이든가, 게놈 DNA이든가, 화학적 합성 DNA이든가 등을 불문한다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드할 수 있는 한, 유전암호의 축중(縮重)에 기초한 임의의 염기서열을 갖는 DNA가 포함된다.

본 발명의 DNA는, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포로부터 cDNA 라이브러리를 제작하여, 본 발명의 DNA서열(예를 들면, 서열번호:1)의 일부를 프로브로 해서 하이브리다이제이션을 행함으로써 조제할 수 있다. cDNA 라이브러리는, 예를 들면 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)에 기재된 방법에 의해 조제해도 좋고, 시판 중인 DNA 라이브러리를 사용해도 좋다. 또한, 본 발명의 단백질을 발현하고 있는 세포에서 RNA를 조제하고, 본 발명의 DNA서열(예를 들면, 서열번호:1)에 기초해서 올리고 DNA를 합성하고, 이 것을 프라이머로서 사용해서 PCR반응을 행하여, 본 발명의 단백질을 코드하는 cDNA를 증폭시킴으로써 조제하는 것도 가능하다.

또한, 얻어진 cDNA의 염기서열을 결정함으로써, 그 것을 코드하는 번역영역을 결정할 수 있고, 본 발명의 단백질의 아미노산서열을 얻을 수 있다. 또한, 얻어진 cDNA를 프로브로 해서 게놈DNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 게놈DNA를 단 리할 수 있다.

구체적으로는, 다음과 같이 하면 좋다. 우선, 본 발명의 단백질을 발현하는 세포, 조직, 장기(예를 들면 난소, 정소, 태반 등)로부터 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는, 공지의 방법, 예를 들면, 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J.M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법 (Chomczynski, P. and Sacchi, N. Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의해 전RNA를 조제하고, mRNA 정제킷트 (pharmacia)를 사용해서 전RNA로부터 mRNA를 정제한다. 또한, QuickPrep mRNA 정제킷트(Pharmacia제)를 사용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수도 있다.

얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용해서 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化學工業) 등을 사용해서 행할 수도 있다. 또한, 본 명세서에 기재된 프라이머 등을 사용해서, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech제) 및 폴리머라제 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 이용한 5'-RACE법(Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932)에 따라서 cDNA의 합성 및 증폭을 행할 수 있다.

얻어진 PCR산물로부터 목적으로 하는 DNA단편을 조제하여, 벡터DNA와 연결한다. 또한, 이 것에서 재조합 벡터를 제작하여, 대장균 등에 도입해서 콜로니를 선택해서 소망의 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA의 염기서열은, 공지의 방법, 예를 들면 디데옥시누클레오티드 체인 터미네이션법에 의해 확인할 수가 있다.

또한, 본 발명의 DNA에 있어서는, 발현에 사용하는 숙주의 코돈 사용빈도를 고려해서, 더욱 발현효율이 높은 염기서열을 설계할 수 있다(Grantham, R. et al., Nucleic Acids Research (1981) 9, r 43-74). 또한, 본 발명의 DNA는 시판 중인 킷트나 공지의 방법에 의해서 개변할 수 있다. 개변으로서는, 예를 들면 제한효소에 의한 소화, 합성 올리고누클레오티드나 적당한 DNA단편의 삽입, 링커의 부가, 개시 코돈(ATG) 및/또는 종지 코돈 (TAA, TGA 또는 TAG)의 삽입 등을 들 수가 있다.

본 발명의 DNA는, 또한 서열번호:1에 나타낸 염기서열로부터 되는 DNA와 스트린전트 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA이고, 또한 상기 본 발명의 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 코드하는 DNA를 포함한다.

스트린전트 조건으로서는, 당업자라면 적당히 선택할 수 있지만, 예를 들면 낮은 스트린전트 조건을 들 수 있다. 낮은 스트린전트 조건이라함은, 예를 들면 42℃, 2 x SSC, 0.1% SDS를 들 수 있고, 바람직하기는 50℃, 2 x SSC, 0.1% SDS이다. 또한, 더욱 바람직하기는 높은 스트리전트 조건을 들 수가 있다. 높은 스트린전트 조건이라함은, 예를 들면 65℃, 2 x SSC 및 0.1% SDS를 들 수가 있다. 이들의 조건에 있어서, 온도를 높일수록 높은 상동성을 갖는 DNA를 얻을 수가 있다. 상기 하이브리다이즈하는 DNA는 바람직하기는 천연유래의 DNA, 예를 들면 cDNA 또는 염색체 DNA 이어도 좋다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 벡터로서는, 숙주세포내에 있어서 본 발명의 DNA를 보유하기도 하고, 본 발명의 단백질을 발현시키기 위하여 유용하다.

벡터로서는, 예를 들면 대장균을 숙주로 하는 경우에는, 벡터를 대장균(예를 들면, JM109, DH5α, HB101, XL1Blue)등으로 대량으로 증폭시켜 대량 조제하기 위하여, 대장균으로 증폭되기 위하여 「ori」를 갖고, 또한 형질전환된 대장균의 선발유전자(예를 들면, 어떤 약제(암피실린이나 테트라사이클린, 가나마이신, 클로람페니콜)에 의해 판별될 수 있는 약제내성유전자)를 가지면 특히 제한은 없다.

벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수가 있다. 또한, cDNA의 서브클로닝, 잘라내는 것을 목적으로 한 경우, 상기 벡터 외에, 예를 들면, pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 들 수가 있다. 본 발명의 단백질을 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현벡터가 유용하다.

발현 벡터로서는, 예를 들면 대장균에서의 발현을 목적으로 한 경우는, 벡터가 대장균으로 증폭되는 상기 특징을 갖는 것 외에, 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는, 대장균으로 효율 좋게 발현시킬 수 있는 프로모터, 예를 들면 1acZ프로모터(Ward 등, Nature (1989)341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB프로모터 (Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043), 또는 T7프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결이다. 이와 같은 벡터로서는, 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia 제), 「QIAexpress system」(Qiagen 제), pEGFP, 또는 pET (이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수가 있다.

또한, 벡터에는, 폴리펩티드 분비를 위한 시그날서열이 함유되어 있어도 좋다. 단백질분비를 위한 시그날서열로서는, 대장균의 페리플라즘에 생산시키는 경우, pelB 시그날 서열(Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 좋다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 염화칼슘법, 일렉트로포레이션(electroporation)법을 사용해서 행할 수 있다.

대장균 이외에도, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 제조하기 위하여, 포유동물 유래의 발현벡터(예를 들면, pcDNA3 (Invitrogen 제)나, pEGF-BOS (Nucleic Acids, Res. 1990, 18(17), p5322), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovirus expression system」(GIBCO BRL 제), pBacPAK8), 식물 유래의 발현벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면, pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현벡터(예를 들면, pZIpneo), 효모 유래의 발현벡터(예를 들면, 「Pichia Expression Kit」(In vitrogen 제), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현벡터(예를 들면, pPL608, pKTH50)을 들 수가 있다.

CHO세포, COS세포, NIH3T3세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포내에서 발현시키기 위하여 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터 (Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR 프로모터, EF1α프로모터 (Mizushima 등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV 프로모터 등을 갖고 있는 것이 불가결이고, 세포로의 형질전환을 선발하기 위한 유전자(예를 들면, 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제내성 유전자)를 가지면 또한 바 람직하다. 이와 같은 특성을 가지는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수가 있다.

또한, 유전자를 안정적으로 발현시키고, 또한 세포내에서의 유전자의 카피수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산합성경로를 결손한 CHO세포에 그 것을 상보하는 DHFR유전자를 갖는 벡터(예를 들면, pCHOI 등)을 도입하여, 메토트렉세이트 (MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수가 있고, 또한, 유전자의 일과성의 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체상에 갖는 COS세포를 사용해서 SV40의 복제기능을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수가 있다.

복제개시점으로서는, 또한, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소파필로마바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수도 있다. 또한, 숙주세포계에서 유전자카피수 증폭을 위하여, 발현 벡터는 선택마커로서, 아미노글리코시드 트란스페라제 (APH)유전자, 티미딘키나제(TK)유전자, 대장균키산틴구아닌 포스포리보실 트란스페라제(Ecogpt)유전자, 디히드로엽산환원효소(dhfr)유전자 등을 함유할 수 있다.

한편, 동물의 생체내에서 본 발명의 DNA를 발현시키는 방법으로서는, 본 발명의 DNA를 적당한 벡터에 병합하고, 레토로바이러스법, 리포좀법, 카티오닉리포좀법, 아데노바이러스법 등에 의해 생체내에 도입하는 방법 등을 들 수가 있다. 이 것에 의해, 본 발명의 유전자의 변이에 기인하는 질환에 대한 유전자치료를 행하는 것이 가능하다. 사용되는 벡터로서는, 예를 들면 아데노바이러스 벡터(예를 들면 pAdex1cw)나 레토로바이러스 벡터(예를 들면 pZIPneo) 등을 들 수가 있지만, 이들 에 제한되는 것은 아니다. 벡터로의 본 발명의 DNA의 삽입 등의 일반적인 유전자 조작은, 통상의 방법에 따라서 행하는 것이 가능하다(Molecular Cloning, 5.61-5.63). 생체내로의 투여는, ex vivo법이어도, in vivo법이어도 좋다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 벡터가 도입된 숙주세포에 관한 것이다. 본 발명의 벡터가 도입되는 숙주세포로서는 특히 제한은 없고, 예를 들면 대장균이나 여러가지의 동물세포 등을 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 숙주세포는, 예를 들면 본 발명의 단백질의 제조나 발현을 위한 생산계로서 사용할 수가 있다. 단백질 제조를 위한 생산법은, in vitro 및 in vivo의 생산계가 있다. in vitro의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수가 있다.

진핵세포를 사용하는 경우, 예를 들면, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 숙주로 사용할 수 있다. 동물세포로서는, 포유류세포, 예를 들면 CHO(J. Exp. Med. (1995) 108,945), COS, 3T3, 미엘로마, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero, 양생류세포, 예를 들면 아프리카쓰메가에루난모세포(Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), 또는 곤충세포, 예를 들면 sf9, sf21, Tn5가 알려져 있다.

CHO세포로서는, 특히 DHFR유전자를 결손한 CHO세포인 dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) 이나 CHO K1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)를 적합하게 사용할 수 있다. 동물 세포에 있어서, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO세포가 바람직하다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면, 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 카티오닉리포좀 DOTAP (베링거 만하 임사 제)를 사용한 방법, 일렉트로포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 행하는 것이 가능하다.

식물세포로서는, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 단백질 생산계로서 알려져 있고, 이 것을 유리배양하면 좋다. 진균세포로서는, 효모, 예를 들면 사카로미세스속, 예를 들면 사카로미세스 세레비시에 (Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스퍼길루스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)가 알려져 있다.

원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는, 대장균(E. coli), 예를 들면 JM109, DH5α, HB101 등을 들 수가 있고, 기타 고초균이 알려져 있다.

이들의 세포를 목적으로 하는 DNA에 의해 형질전환하여, 형질전환된 세포를 in vitro에서 배양함으로써 단백질이 얻어진다.

배양은, 공지의 방법에 따라 행할 수가 있다. 예를 들면, 동물세포의 배양액으로서, 예를 들면 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있다. 그 때, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있고, 무혈청 배양해도 좋다. 배양시의 pH는, 약 6~8인 것이 바람직하다. 배양은, 통상 약 30~40℃에서 약 15~200시간 행하고, 필요에 따라서 배지의 교환, 통기, 교반을 더한다.

한편, in vivo에서 단백질을 생산시키는 계로서는, 예를 들면, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수가 있다. 이들의 동물 또는 식물에 목적으로 하는 DNA를 도입하여, 동물 또는 식물의 체 내에서 단백질을 생산시키고 회수한다. 본 발명에 있어서, 「숙주」라 함은, 이들의 동물, 식물을 포함한다.

동물을 사용하는 경우, 포유류동물, 곤충을 사용하는 생산계가 있다. 포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 포유류 동물을 사용하는 경우, 트란스제닉 동물을 사용할 수 있다.

예를 들면, 목적으로 하는 DNA를, 염소β카제인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자와의 융합유전자로서 조제한다. 이어서, 이 융합유전자를 함유하는 DNA 단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에 이식한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트란스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 목적하는 단백질을 얻을 수 있다. 트란스제닉 염소로부터 생산되는 단백질을 함유하는 유즙량을 증가시키기 위하여, 적당한 호르몬을 트란스제닉 염소에 사용해도 좋다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

또, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적하는 단백질을 코드하는 DNA를 삽입한 바큘로바이러스를 누에에 감염시킴으로써, 이 누에의 체액에서 목적하는 단백질을 얻을 수 있다(Susumu, M. et al., Nature (1985) 315, 592-594).

또한, 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다. 담배를 사용하는 경우, 목적으로 하는 단백질을 코드하는 DNA를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시켜, 이 담배의 잎에서 소망의 폴리펩티드를 얻을 수가 있다(Julian K.-C. Ma et al., Eur. j. Immunol. (1994) 24, 131-138).

이 것에 의해 얻어진 본 발명의 단백질은, 숙주세포내 또는 숙주세포외(배지 등)에서 단리하여, 실질적으로 순수하고 균일한 단백질로서 정제할 수 있다. 단백질의 분리·정제는 통상의 단백질의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 좋고, 하등 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 크로마토그라피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적당히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다.

크로마토그라피로서는, 예를 들면 어피니티 크로마토그라피, 이온교환 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피, 겔여과, 역상 크로마토그라피, 흡착 크로마토그라피 등을 들 수가 있다(Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들의 크로마토그라피는 액상 크로마토그라피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그라피를 사용해서 행할 수 있다. 본 발명은 이들의 정제방법을 사용하여 고도로 정제된 단백질도 포함한다.

또한, 단백질을 정제 전 또는 정제 후에 적당한 단백질수식효소를 작용시킴 으로써, 임의로 수식을 가하기도 하고 부분적으로 펩티드를 제거할 수도 있다. 단백질수식효소로서는, 예를 들면 트립신, 키모트립신, 리실엔도펩티다제, 프로테인키나제, 글루코시다제 등이 사용된다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질과 결합하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체의 형태에는, 특히 제한은 없고, 폴리클로날항체 외에 모노클로날 항체도 포함된다. 또한, 토끼 등의 면역동물에 본 발명의 단백질을 면역해서 얻는 항혈청, 모든 종류의 폴리클로날항체 및 모노클로날항체, 또한 인간항체나 유전자 재조합에 의한 인간형화 항체도 포함된다.

항체취득의 감작항원으로서 사용되는 본 발명의 단백질은, 그의 유래로 되는 동물종에 제한되지 않지만 포유동물, 예를 들면 인간, 마우스 또는 랫트 유래의 단백질이 바람직하고, 특히 인간 유래의 단백질이 바람직하다. 인간 유래의 단백질은, 본 명세서에 개시되는 유전자서열 또는 아미노산서열을 사용해서 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 감작항원으로서 사용되는 단백질은, 완전한 단백질이어도 좋고, 또한, 단백질의 부분 펩티드이어도 좋다. 단백질의 부분 펩티드로서는, 예를 들면, 단백질의 아미노기(N) 말단 단편이나 카르복시(C) 말단단편을 들 수가 있다. 본 명세서에서 기술하는 「항체」라 함은 단백질의 전장(全長) 또는 단편에 반응하는 항체를 의미한다.

본 발명의 단백질 또는 그의 단편을 코드하는 유전자를 공지의 발현벡터계에 삽입하고, 이 벡터로 본 명세서에서 기술한 숙주세포를 형질전환시켜, 이 숙주세포 내외로부터 목적하는 단백질 또는 그의 단편을 공지의 방법으로 얻고, 이들을 감갖항원으로서 사용하면 좋다. 또한, 단백질을 발현하는 세포 또는 그의 용해물 또는 화학적으로 합성한 본 발명의 단백질을 감작항원으로서 사용해도 좋다.

감작항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로, 설치목, 토끼목, 영장목의 동물이 사용된다.

설치목의 동물로서는, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스타 등이 사용된다. 토끼목의 동물로서는, 예를 들면 토끼가 사용된다. 영장목의 동물로서는, 예를 들면 원숭이가 사용된다. 원숭이로서는 협비하목(挾鼻下目)의 원숭이(구세계 원숭이), 예를 들면 카니쿠이원숭이, 아카게원숭이, 만토히히, 침판지 등이 사용된다.

감작항원을 동물에 면역하는데는, 공지의 방법에 따라서 행해진다. 일반적인 방법으로서는, 감작항원을 포유동물의 복강내 도는 피하에 주사한다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS (Phosphate Buffered Saline)이나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것에 대해서, 소망에 따라 통상의 보조약, 예를 들면 프로인드 완전 보조약(Freund's complete adjuvant)를 적당량 혼합하여 유화시킨 후, 포유동물에 투여한다. 또한, 그 후, 프로인드 불완전 보조약(Freund's incomplete adjuvant)으로 적당량 혼합한 감작항원을, 4 ~ 21일마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수 있다. 이와 같이 면역하여, 혈청 중에 소망의 항체 레벨이 상승하는 것을 통상의 방법에 의해 확인한다.

여기서, 본 발명의 단백질에 대한 폴리클로날항체를 얻는데는, 혈청 중의 소망의 항체 레벨이 상승한 것을 확인한 후, 항원을 감작한 포유동물의 혈액을 취한다. 이 혈액에서 공지의 방법에 의해 혈청을 분리한다. 폴리클로날항체로서는, 폴리클로날항체를 함유하는 혈청을 사용해도 좋고, 필요에 따라 이 혈청에서 폴리클로날항체를 함유하는 획분을 또한 단리해서, 이 것을 사용해도 좋다. 예를 들면, 본 발명의 단백질을 커플링시킨 어피니티칼럼을 사용해서, 본 발명의 단백질만을 인식하는 획분을 얻고, 또한 이 획분을 프로테인A 또는 프로테인G칼럼을 이용해서 정제함으로써, 면역 글로불린G 또는 M을 조제할 수 있다.

모노클로날항체를 얻는데는, 상기 항원을 감작한 포유동물의 혈청 중에 소망의 항체레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물에서 면역세포를 취출하여 세포융합에 제공하면 좋다. 이 때, 세포융합에 사용되는 바람직한 면역세포로서, 특히 비장세포를 들 수가 있다.

상기 면역세포와 융합되는 다른 쪽의 친세포로서는, 바람직하기는 포유동물의 미엘로마세포, 더욱 바람직하기는 약제에 의한 융합세포 선별을 위한 특성을 획득한 미엘로마 세포를 들 수가 있다.

상기 면역세포와 미엘로마세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인 등의 방법(Galfre, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.

세포 융합에 의해 얻어진 하이브리도마는, 통상의 선택배양액, 예를 들면, HAT 배양액(히포키산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양액)으로 배양함으 로써 선택된다. 당해 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 통상 수일~수주간 계속해서 행한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하여, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝을 행한다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 임파구, 예를 들면 EB 바이러스에 감염한 인간 임파구를 in vitro에서 단백질, 단백질 발현세포 또는 그의 용해물로 감작하여, 감작임파구를 인간 유래의 영구분열능을 갖는 미엘로마세포, 예를 들면 U266과 융합시켜, 단백질으로의 결합활성을 갖는 소망의 인간항체를 생산하는 하이브리도마를 얻을 수도 있다(특개소 63-17688호 공보).

이어서, 얻어진 하이브리도마를 마우스복강내에 이식하여, 이 마우스에서 복수를 회수하여, 얻어진 모노클로날항체를, 예를 들면 황산암모늄침전, 프로테인A, 프로테인G칼럼, DEAE이온교환 크로마토그라피, 본 발명의 단백질을 커플링한 어피니티 칼럼 등에 의해 정제하는 것으로 조제하는 것이 가능하다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 단백질의 정제, 검출에 사용되는 것 외에, 본 발명의 단백질의 아고니스트(agonist)나 안타고니스트(antagonist)의 후보로 된다. 또한, 이 항체를 본 발명의 단백질이 관여하는 질환의 항체치료에 응용하는 것도 고려된다. 얻어진 항체를 인체에 투여하는 목적(항체치료)으로 사용하는 경우에는, 면역원성을 저하시키기 때문에, 인간항체나 인간형 항체가 바람직하다.

예를 들면, 인간 항체유전자의 레파토리를 갖는 트란스제닉 동물에 항원으로 되는 단백질, 단백질 발현세포 또는 그의 용해물을 면역해서 항체생산세포를 취득하고, 이 것을 미엘로마세포와 융합시킨 하이브리도마를 사용해서 단백질에 대한 인간 항체를 얻을 수가 있다(국제공개번호 WO92-03918, WO93-2227, WO94-02602, WO94-25585, WO96-33735 및 WO96-34096참조).

하이브리도마를 사용해서 항체를 생산하는 것 이외에, 항체를 생산하는 감작 임파구 등의 면역세포를 암유전자(oncogene)에 의해 불사화시킨 세포를 사용해도 좋다.

이와 같이 얻어진 모노클로날항체는, 또한 유전자 재조합 기술을 사용해서 생산시킨 재조합형 항체로서 얻을 수 있다(예를 들면, Borrebaeck, C.A.K. and Larrick, J.W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990참조). 재조합형 항체는, 그 것을 코드하는 DNA를 하이브리도마 또는 항체를 생산하는 감작 임파구 등의 면역세포에서 클로닝하여, 적당한 벡터에 병합하고, 이 것을 숙주에 도입하여 생산시킨다. 본 발명은, 이 재조합형 항체를 포함한다.

또한, 본 발명의 항체는, 본 발명의 단백질에 결합하는 한, 그의 항체 단편이나 항체수식물이어도 좋다. 예를 들면, 항체단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv(scFv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)를 들 수가 있다. 구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들면, 파파인, 펩신으로 처리하여 항체단편을 생성시키든가, 또는 이들 항체단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이 것을 발현 벡 터에 도입한 후, 적당한 숙주세포로 발현시킨다. (예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. and Horwitz, A.H. Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496; Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515; Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. et al., Methods Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. and Walker, B.W., Trends Biotechnol. (1991) 9, 132-137참조).

항체수식물로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명의 「항체」에는 이들의 항체수식물도 포함된다. 이와 같은 항체수식물을 얻는데는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들의 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

또한, 본 발명의 항체는, 공지의 기술을 사용해서 비인간항체 유래의 가변영역과 인간항체유래의 정상영역으로부터 되는 키메라항체 또는 비인간항체 유래의 CDR(상보성 결정영역)과 인간항체유래의 FR(프레임워크영역) 및 정상영역으로부터 되는 인간형화항체로서 얻을 수 있다.

상기와 같이 해서 얻어진 항체는, 균일하게 될 때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 좋다. 예를 들면, 어피니티 크로마토그라피 등의 크로마토그라피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아미드겔 전기영동, 등전점전기영동 등을 적당히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만(Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기에서 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도의 측정 또는 효소결합면역흡착검정법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 등에 의해 행할 수 있다.

어피니티 크로마토그라피에 사용하는 칼럼으로서는, 프로테인A 칼럼, 프로테인G 칼럼을 들 수가 있다. 예를 들면, 프로테인A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia) 등을 들 수가 있다.

어피니티 크로마토그라피 이외의 크로마토그라피로서는, 예를 들면, 이온교환 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피, 겔여과, 역상 크로마토그라피, 흡착크로마토그라피 등을 들 수가 있다. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들의 크로마토그라피는 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그라피를 사용해서 행할 수 있다.

또한, 본 발명의 항체의 항원결합활성을 측정하는 방법으로서, 예를 들면, 흡광도의 측정, 효소결합면역흡착검정법(ELISA), EIA(효소면역측정법), RIA(방사면역측정법) 또는 형광항체법을 사용할 수 있다. ELISA를 사용하는 경우, 본 발명의 항체를 고상화한 플레이트에 본 발명의 단백질을 첨가하고, 이어서 목적하는 항체를 함유하는 시료, 예를 들면, 항체생산세포의 배양 상징액이나 정제항체를 첨가한다.

효소, 예를 들면, 알카리 포스파타제 등으로 표지한 항체를 인식하는 이차항체를 첨가하여, 플레이트를 배양하고, 이어서 세정한 후, p-니트로페닐인산 등의 효소기질을 첨가해서 흡광도를 측정함으로써 항원결합활성을 평가할 수 있다. 단백질로서 단백질의 단편, 예를 들면, 그의 C말단으로 되는 단편 또는 N말단으로 되는 단편을 사용해도 좋다. 본 발명의 항체의 활성평가에는, BIAcore (Pharmacia제)를 사용할 수 있다.

이들의 방법을 사용함으로써, 본 발명의 항체와 시료 중에 함유되는 본 발명의 단백질이 함유되는 것으로 예상되는 시료를 접촉시키고, 이 항체와 이 단백질과의 면역복합체를 검출 또는 측정하거나, 또는 이 항체를 사용해서 이 단백질을 발현하는 세포를 면역 염색하는 것으로 되는, 본 발명의 단백질의 검출 또는 측정방법을 실시할 수 있다.

본 발명의 단백질의 검출 또는 측정방법은, 단백질을 특이적으로 검출 또는 측정할 수 있기 때문에, 단백질을 사용한 여러가지의 실험 등에 유용하다.

본 발명은, 또한, 인간 WT1 상호작용 단백질을 코드하는 DNA(서열번호:1) 또는 이 DNA와 상보적인 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈하여, 적어도 15염기의 사슬 길이를 갖는 DNA에 관한 것이다. 「특이적으로 하이브리다이즈한다」라 함은, 통상의 하이브리다이제이션 조건하에, 바람직하기는 스트린전트한 하이브리다이제이션 조건하에서, 다른 단백질을 코드하는 DNA와의 크로스 하이브리다이제이션이 의미있게 생기지 않는 것을 의미한다. 이와 같은 DNA에는, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA 또는 이 DNA와 상보적인 DNA와 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 프로브나 프라이머, 누클레오티드 또는 누클레오티드 유도체(예를 들면, 안티센스 올리고누클레오티드나 리보자임 등)가 포함된다. 또한, 이와 같은 DNA를 DNA칩의 제작에 이용할 수도 있다.

본 발명은, 예를 들면, 서열번호:1의 염기서열 중 어느 개소에 하이브리다이즈하는 안티센스 올리고누클레오티드를 포함한다. 이 안티센스 올리고누클레오티드는, 바람직하기는 서열번호:1의 염기서열 중의 연속하는 적어도 15개 이상의 누클레오티드에 대한 안티센스 올리고누클레오티드이다. 더욱 바람직하기는, 상기 연속하는 적어도 15개 이상의 누클레오티드가 번역개시 코돈을 함유하는 상기 안티센스 올리고누클레오티드이다.

안티센스 올리고누클레오티드로서는, 그들의 유도체나 수식체를 사용할 수 있다. 이와 같은 수식체로서, 예를 들면 메틸포스포네이트형 또는 에틸포스포네이트형과 같은 저급알킬포스포네이트수식체, 포스포로티오에이트수식체 또는 포스포로아미데이트수식체 등을 들 수가 있다.

여기서 말하는 「안티센스 올리고누클레오티드」라 함은, DNA 또는 mRNA의 소정의 영역을 구성하는 누클레오티드에 대응하는 누클레오티드가 전부 상보적인 것만 아니고, DNA 또는 mRNA와 올리고누클레오티드가 서열번호:1에 나타낸 염기서열에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 한, 1 또는 복수개의 누클레오티드의 미스매치가 존재해 있어도 좋다.

이와 같은 DNA는, 적어도 15개의 연속한 누클레오티드서열 영역에서, 적어도 70%, 바람직하기는 적어도 80%, 더욱 바람직하기는 90% 이상, 더더욱 바람직하기는 95% 이상의 염기서열상의 상동성을 갖는다. 또한, 상동성을 결정하기 위한 알고리즘은 본 명세서에 기재한 것을 사용하면 좋다. 이와 같은 DNA는, 후술하는 실시예 에 기재한 바와 같이, 본 발명의 단백질을 코드하는 DNA를 검출 또는 단리하기 위한 프로브로서, 또는 증폭하기 위한 프라이머로서 유용하다.

본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드유도체는, 본 발명의 단백질의 생산세포에 작용해서, 이 단백질을 코드하는 DNA 또는 mRNA에 결합하는 것에 의해, 그의 전사 또는 번역을 저해하기도 하고, mRNA의 분해를 촉진하기도 해서, 본 발명의 단백질의 발현을 억제함으로써, 결과적으로 본 발명의 단백질의 작용을 억제하는 효과를 갖는다.

본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드 유도체는, 그들에 대해서 불활성인 적당한 기제와 혼화해서 도포제, 팝제 등의 외용제로 할 수가 있다.

또한, 필요에 따라서, 부형제, 등장화제, 용해보조제, 안정화제, 방부제, 무통화제 등을 첨가해서 정제, 분말제, 과립제, 캡슐제, 리포좀캡슐제, 주사제, 액제, 점비제 등, 또한 동결건조제로 할 수가 있다. 이들은 통상의 방법에 따라서 조제할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드 유도체는 환자의 환부에 직접 적용하든가, 또는 혈관내에 투여하는 것 등으로 해서 결과적으로 환부에 도달할 수 있도록 환자에 적용한다. 또한, 지속성, 막투과성을 높이는 안티센스 봉입 소재를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 리포즘, 폴리-L-리진, 리피드, 콜레스테롤, 리포펙틴 또는 이들의 유도체를 들 수가 있다.

본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드 유도체의 투여량은, 환자의 상태에 따라서 적당히 조정하여 바람직한 양을 사용할 수 있다. 예를 들면, 0.1 ~ 100 ㎎/㎏, 바람직하기는 0.1 ~ 50㎎/㎏의 범위에서 투여할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드는 본 발명의 단백질의 발현을 저해하고, 따라서 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 억제하는 것에 있어서 유용하다. 또한, 본 발명의 안티센스 올리고누클레오티드를 함유하는 발현 저해제는, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 가능한 점에서 유용하다.

본 발명의 단백질은, 그 것에 결합하는 화합물의 스크리닝에 유용하다. 즉, 본 발명의 단백질과, 이 단백질에 결합하는 화합물을 함유하는 것으로 예상되는 피검시료를 접촉시키고, 그리고 본 발명의 단백질에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 선택하는 것으로부터 되는 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 있어서 사용된다.

스크리닝에 사용되는 본 발명의 단백질은 재조합 단백질이어도, 천연 유래의 단백질이어도 좋다. 또한, 부분 펩티드이어도 좋다. 피검시료로서는 특히 제한은 없고, 예를 들면, 세포추출물, 세포배양상징액, 발효미생물생산물, 해양생물추출물, 식물추출물, 정제 또는 조정제(粗精製)단백질, 펩티드, 비펩티드성 화합물, 합성 저분자화합물, 천연화합물을 들 수가 있다. 피검시료를 접촉시키는 본 발명의 단백질은, 예를 들면 정제한 단백질로서, 담체에 결합시킨 형태로서, 다른 단백질과의 융합 단백질로서 피검시료에 접촉시킬 수 있다.

본 발명의 단백질을 사용해서, 예를 들면 이 단백질에 결합하는 단백질(리간드 등)을 스크리닝하는 방법으로서는, 당업자에게 공지된 많은 방법을 사용하는 것이 가능하다. 이와 같은 스크리닝은, 예를 들면, 면역침강법에 의해 행할 수 있 다. 구체적으로는, 이하와 같이 행할 수 있다. 본 발명의 단백질을 코드하는 유전자를, pSV2neo, pcDNAI, pCD8 등의 외래유전자 발현용의 벡터에 삽입하는 것으로 동물세포 등으로 이 유전자를 발현시킨다.

발현에 사용되는 프로모터로서는 SV40 early promoter(Rigby In Williamson(ed.), Genetic Engineering, Vol. 3. Academic Press, London, p.83-141 (1982)), EF-1 αpromoter (Kim 등 Gene 91, p.217-223 (1990)), CAG promoter (Niwa et al. Gene 108, p.193-200 (1991)), RSV LTR promoter (Cullen Methods in Enzymology 152, p.684-704 (1987), SR αpromoter (Takebe et al. Mol.Cell.Biol. 8, p.466(1988)), CMV immediate early promoter (Seed and Aruffo Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84, p.3365-3369 (1987)), SV40 late promoter (Gheysen and Fiers J.Mol.Appl.Genet. 1, p.385-394 (1982)), Adenovirus late promoter (Kaufman et al. Mol.Cell.Biol. 9, p.946 (1989)), HSV TK promoter 등의 일반적으로 사용할 수 있는 프로모터이라면 어떤 것을 사용해도 좋다.

동물세포에 유전자를 도입하는 것으로 외래유전자를 발현시키기 위해서는, 일렉트로포레이션법(Chu, G. et al. Nucl.Acid Res. 15, 1311-1326 (1987)), 인산칼슘법 (Chen, C and Okayama, H. Mol.Cell.Biol. 7, 2745-2752 (1987)), DEAE덱스트란법 (Lopata, M.A. et al. Nucl.Acids Res. 12, 5707-5717 (1984); Sussman, D.J. and Milman, G. Mol.Cell.Biol. 4, 1642-1643 (1985)), 리포펙틴법 (Derijard, B. Cell 7, 1025-1037 (1994); Lamb, B.T. et al. Nature Genetics 5, 22-30 (1993); Rabindran, S.K. et al. Science 259, 230-234 (1993)) 등의 방법이 있지만, 어느 방법에 의해서도 좋다.

특이성이 밝혀져 있는 모노클로날항체의 인식부위(에피토프)를 본 발명의 단백질의 N말단 또는 C말단에 도입함으로써, 모노클로날항체의 인식부위를 갖는 융합 단백질로서 본 발명의 단백질을 발현시킬 수 있다. 사용하는 에피토프항체계로서는 시판되고 있는 것을 이용할 수 있다(실험의학 13, 85-90 (1995)). 멀티클로닝 사이트를 통해서, β-갈락토시다제, 말토스 결합 단백질, 글루타치온 S-트란스페라제, 녹색형광단백질 (GFP) 등과의 융합 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터가 시판되고 있다.

융합 단백질로 함으로써 본 발명의 단백질의 성질을 가능한한 변화시키지 않도록 하기 위하여 수개로부터 수십개의 아미노산으로 되는 작은 에피토프부분만을 도입해서, 융합 단백질을 조제하는 방법도 보고되어 있다. 예를 들면, 폴리히스티딘 (His-tag), 인플루엔자 응집소 HA, 인간 c-myc, FLAG, Vesicular stomatitis 바이러스당단백질 (VSV-GP), T7 gene10 단백질 (T7-tag), 인간단순헤르페스 바이러스 당 단백질 (HSV-tag), E-tag (모노클로날파아지상의 에피토프) 등의 에피토프와 그 것을 인식하는 모노클로날항체를, 본 발명의 단백질에 결합하는 단백질의 스크리닝을 위한 에피토프항체계로서 이용할 수 있다(실험의학 13, 85-90(1995)).

면역침강에 있어서는, 이들의 항체를, 적당한 계면활성제를 이용해서 조제한 세포용해액에 첨가함으로써 면역복합체를 형성시킨다. 이 면역복합체는 본 발명의 단백질, 그 것과 결합능을 갖는 단백질 및 항체로부터 이루어진다. 상기 에피토프에 대한 항체를 이용하는 것 이외에, 본 발명의 단백질에 대한 항체를 이용해서 면 역침강을 행하는 것도 가능하다. 본 발명의 단백질에 대한 항체는, 예를 들면, 본 발명의 단백질을 코드하는 유전자를 적당한 대장균 발현 벡터에 도입해서 대장균 내에서 발현시키고, 발현시킨 단백질을 정제하고, 이 것을 토끼나 마우스, 랫트, 염소, 닭 등에 면역하는 것으로 조제할 수 있다. 또한, 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 상기 동물에 면역함으로써 조제할 수도 있다.

면역복합체는, 예를 들면, 항체가 마우스IgG항체이라면, Protein A Sepharose나 Protein G Sepharose를 사용해서 침강시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을, 예를 들면, GST 등의 에피토프와의 융합 단백질로서 조제한 경우에는, 글루타치온-Sepharose 4B 등의 이들의 에피토프에 특이적으로 결합하는 물질을 이용해서, 본 발명의 단백질의 항체를 이용한 경우와 동일하게, 면역복합체를 형성시킬 수 있다.

면역침강의 일반적인 방법에 대해서는, 예를 들면, 문헌(Harlow, E. and Lane, D.: Antibodies, pp.511-552, Cold Spring Harbor Laboratory Publications, New York (1988)에 기재된 방법에 따라서 또는 준해서 행하면 좋다.

면역침강된 단백질의 해석에는 SDS-PAGE가 일반적이고, 적당한 농도의 겔을 사용해서 단백질의 분자량에 의해 결합해 있는 단백질을 해석할 수 있다. 또한, 이 때, 일반적으로 본 발명의 단백질에 결합한 단백질은, 쿠마시염색이나 은염색이라고 한 단백질의 통상의 염색법에서는 검출하는 것은 곤란하므로, 방사성 동위원소인 ³⁵S-메티오닌이나 ³⁵S-시스테인을 함유한 배양액에서 세포를 배양하고, 이 세포 내의 단백질을 표지해서, 이 것을 검출하는 것으로 검출감도를 향상시킬 수 있다.

단백질의 분자량이 판명되면 직접 SDS-폴리아크릴아미드겔로부터 목적하는 단백질을 정제하여, 그의 서열을 결정할 수도 있다.

또한, 본 발명의 단백질을 사용해서, 이 단백질에 결합하는 단백질을 단리하는 방법으로서는, 예를 들면 웨스트 웨스탄 블로팅법(Skolnik, E.Y. et al., Cell (1991) 65, 83-90)을 사용해서 행할 수 있다. 즉, 본 발명의 단백질과 결합하는 결합 단백질을 발현하고 있는 것이 예상되는 세포, 조직, 장기 (예를 들면, 심장, 태반, 정소, 흉선, 말초혈백혈구 등의 조직, 세포나 배양세포 등)로부터 파아지 벡터(λgt11, ZAP 등)을 사용한 cDNA 라이브라리를 제작하고, 이 것을 LB-아가로스상에서 발현시켜 필터로 발현시킨 단백질을 고정하고, 정제해서 표지한 본 발명의 단백질과 상기 필터를 반응시켜, 본 발명의 단백질과 결합한 단백질을 발현하는 플라크를 표지에 의해 검출하면 좋다.

본 발명의 단백질을 표지하는 방법으로서는, 비오틴과 아비딘의 결합성을 이용하는 방법, 본 발명의 단백질 또는 본 발명의 단백질에 융합한 펩티드 또는 폴리펩티드 (예를 들면, GST 등)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 방법, 방사성 동위원소를 이용하는 방법 또는 형광을 이용하는 방법 등을 들 수가 있다.

또한, 본 발명의 스크리닝방법의 다른 태양으로서는, 세포를 사용한 2-하이브리드 시스템(Fields, S., and Sternglanz, R., Trends. Genet. (1994) 10, 286-292)을 사용해서 행하는 방법을 들 수가 있다. 본 발명의 단백질을 SRF DNA 결합영역 또는 GAL4 DNA 결합영역과 융합시켜서 효모세포 중에서 발현시켜, 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질을 발현하고 있는 것이 예상되는 세포에서, VP16 또는 GAL4 전사활성화영역과 융합하는 형으로 발현하는 cDNA라이브라리를 제작하여, 이 것을 상기 효모세포에 도입하고, 검출된 양성 클론으로부터 라이브라리 유래 cDNA를 단리해서 대장균에 도입해서 발현시킨다(효모세포 내에서 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질이 발현하면, 양자의 결합에 의해 레포터 유전자가 활성화되어, 양성의 클론을 확인할 수 있다).

「2-하이브리드 시스템」(「MATCHMAKER Two-Hybrid System」, 「Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit」, 「MATCHMAKER One-Hybrid System」(모두 Clontech사제), 「HybriZAP Two-Hybrid Vector System」(Stratagene사제), 문헌「Dalton S, and Treisman R (1992) Characterization of SAP-1, a protein recruited by serum response factor to the c-fos serum response element. Cell 68, 597-612」)를 이용해서, 본 발명의 단백질에 결합하는 단백질 또는 그의 유전자를 조제하는 것도 가능하다. 레포터 유전자로서는, HIS3 유전자 외에, Ade2 유전자, LacZ 유전자, CAT 유전자, 루시페라제 유전자, PAI-1 (Plasminogen activator inhibitor typel) 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 단백질과 결합하는 화합물의 스크리닝은, 어피니티 크로마토그라피를 이용해서 행할 수도 있다. 예를 들면, 본 발명의 단백질을 어피니티 칼럼의 담체에 고정하고, 여기에 본 발명의 단백질과 결합하는 단백질을 발현하고 있는 것이 예상되는 피검시료를 적용한다. 이 경우의 피검시료로서는, 예를 들면 세포추출물, 세포용해물 등을 들 수가 있다. 피검시료를 적용한 후, 칼럼을 세정하여, 본 발명의 단백질에 결합한 단백질을 조제할 수가 있다.

얻어진 단백질은, 그의 아미노산서열을 분석하고, 그 것을 기초로 올리고 DNA를 합성하고, 이 DNA를 프로브로서 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써, 이 단백질을 코드하는 DNA를 얻을 수 있다.

본 발명에 있어서, 결합한 화합물을 검출 또는 측정하는 수단으로서 표면플라즈몬공명현상을 이용한 바이오센서를 사용할 수도 있다. 표면플라즈몬공명현상을 이용한 바이오센서는 본 발명의 단백질과 피검화합물과의 사이의 상호작용을 미량의 단백질을 사용해서 또한 표지하는 것 없이, 표면플라즈몬공명 시그날로서 리얼타임으로 관찰하는 것이 가능하다(예를 들면, BIAcore, Pharmacia 제). 따라서, BIAcore 등의 바이오센서를 사용함으로써 본 발명의 단백질과 피검화합물과의 결합을 평가하는 것이 가능하다.

또한, 단백질에 한하지 않고, 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물(아고니스트, 및 안타고니스를 포함한다)을 단리하는 방법으로서는, 예를 들면, 고정한 본 발명의 단백질에, 합성화합물, 천연물뱅크, 또는 랜담파아지 펩티드 디스플레이 라이브라리를 작용시켜, 본 발명의 단백질에 결합하는 분자를 스크리닝하는 방법이나, 콤비나토리알 케미스트리(combinatonial chemistry) 기술에 의한 하이스루푸트(high throughput)를 사용한 스크리닝방법 (Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS; Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-464, Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature, Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13, Hogan JC Jr., Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p17-19)가 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 본 발명은, 본 발명의 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 WT1 상호작용 단백질은 WT1 단백질과 결합하여, WT1 단백질의 기능을 제어하는 활성을 가지므로, 이 활성을 지표로, 본 발명의 WT1 상호작용 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물을 스크리닝하는 것이 가능하다.

이 스크리닝방법은, (a) 피검시료 존재하에서, WT1 상호작용 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 공정, (b) 이 세포의 증식을 증식을 검출하는 공정, (c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우와 비교해서, 이 증식을 촉진 또는 억제하는 화합물을 선택하는 공정을 포함한다.

스크리닝에 사용되는 단백질로서는, WT1 단백질의 기능을 제어하는 활성을 갖는 한 특히 제한은 없다. 예를 들면, 인간 WT1 상호작용 단백질을 들 수 있지만, 이들 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 사용하는 것이 가능하다. 또한, WT1 상호작용 단백질은, 세포가 내인적으로 발현하는 것이어도, 외래적으로 발현하는 것이어도 좋다.

피검시료로서는 특히 제한은 없으며, 예를 들면, 세포추출물, 세포배양상징액, 발효미생물생산물, 해양생물추출물, 식물추출물, 정제 또는 조정제 단백질, 펩티드, 비펩티드성 화합물, 합성 저분자화합물, 천연화합물을 들 수가 있다. 또한, 상기 본 발명의 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝에서 얻어진 화합물을 피검화합물로서 사용하는 것도 가능하다.

이 스크리닝에 의해 단리되는 화합물은, 본 발명의 단백질의 아고니스트나 안타고니스트의 후보로 된다. 「아고니스트」라 함은, 본 발명의 단백질에 결합하는 것에 의해, 그의 기능을 활성화하는 분자를 가리킨다. 또한, 「안티고니스트」라 함은, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 것에 의해서 그의 기능을 제어하는 분자를 가리킨다. 또한, 생체내에 있어서, 본 발명의 단백질과 상호작용하는 분자(DNA나 단백질을 포함한다)와의 상호작용을 저해하는 화합물의 후보로 된다.

세포증식의 검출은, 예를 들면 콜로니 형성율을 측정하므로서 검출하는 외에, 세포의 증식속도의 결정, 세포주기의 측정 등에 의해 행할 수 있다.

이들 스크리닝에 의해 단리된 화합물은, 본 발명의 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하기 위한 약제의 후보로 되고, 본 발명의 단백질이 관여하는 질환(예를 들면, 암 등)의 치료의 응용이 고려된다.

또한, 본 발명의 스크리닝방법을 사용해서 얻어지는, WT1 상호작용 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물의 구조의 일부를, 부가, 결실 및/또는 치환에 의해 변환되는 물질도, 본 발명의 스크리닝방법을 사용해서 얻어지는 화합물에 포함된다.

본 발명은, 또한 본 발명의 WT1 상호작용 단백질과 WT1 단백질과의 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물의 스크리닝방법에 관한 것이다. 이 방법은, (a) 피검시료의 존재하에서, WT1 상호작용 단백질 및 WT1 단백질을 반응시키는 공정, (b) 양단백질의 결합활성을 측정하는 공정, 및 (c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우와 비교해서, 이 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물을 선택하는 공정을 포함한다.

본 발명의 단백질과 WT1 단백질과의 결합을 피검시료에 함유하는 화합물이 촉진하는지 또는 제어하는지를 검정하는 방법으로서는, 웨스트 웨스탄 블로팅법이나 용액 중(in vitro), 세포내(in vivo)에서의 양단백질의 결합체를 정량함으로써 검정할 수 있다.

본 발명의 스크리닝방법을 사용해서 얻어지는 화합물을 인간이나 포유동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 모르모트, 토끼, 닭, 고양이, 개, 양, 돼지, 소, 원숭이, 망토비비, 침판지의 의약으로서 사용하는 경우에는, 단리된 화합물 자체를 직접 환자에 투여하는 이외에, 공지의 제제학적 방법에 의해 제제화해서 투여를 행하는 것도 가능하다.

예를 들면, 필요에 따라서 당의(糖衣)를 실시한 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제로서 경구적으로, 또는 물 또는 그 외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형으로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클 (vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합해서, 일반적으로 인정된 제약실시에 요구되는 단위용량형태로 혼화함으로써 제제화하는 것이 고려된다. 이들 제제에 있어서 유효성분의 양은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.

정제, 캡슐제에 혼화될 수 있는 첨가제로서는, 예를 들면 젤라틴, 콘스타치, 트라간트검, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 콘스타치, 젤라틴, 알긴산과 같은 팽화제, 스테아린산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 유당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 아카모노유 또는 체리와 같은 향미제가 사용된다. 조제단위형태가 캡슐인 경우에는, 상기 재료에 또한 유지와 같은 액상담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용해서 통상의 제제실시에 따라서 처방할 수 있다.

주사용의 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조약을 함유하는 등장액, 예를 들면 D-솔비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수가 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알콜, 구체적으로는 에탄올, 폴리알콜, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리솔베트80(TM), HCO-50도 병용해도 좋다.

유성액으로서는 참깨기름, 대두유를 들 수가 있고, 용해보조제로서 안식향산벤질, 벤질알콜과 병용해도 좋다. 또한, 완충제, 예를 들면 인산염완충액, 아세트산나트륨완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알콜, 페놀, 산화방지제와 배합해도 좋다. 조제된 주사액은, 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.

환자의 투여는, 예를 들면 동맥내 주사, 정맥내 주사, 피하주사 등 외에, 비강내적, 경기관지적, 근육적, 또는 경구적으로 당업자에게 공지된 방법에 의해 행할 수 있다. 투여량은, 환자의 체중이나 연령, 투여방법 등에 의해 변동하지만, 당업자라면 적당한 투여량을 적당히 선택하는 것이 가능하다. 또한, 이 화합물이 DNA에 의해 코드될 수 있는 것이라면, 이 DNA를 유전자 치료용 벡터에 병합해서 유전자치료를 행하는 것도 고려된다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 의해 변동하지만, 당업자라면 적당히 선택하는 것이 가능하다.

예를 들면, 본 발명의 단백질과 결합하는 화합물이나 본 발명의 단백질의 활성을 저해하는 화합물의 투여량은 증상에 따라 차이는 있지만, 경구 투여의 경우, 일반적으로 성인(체중 60㎏)에 있어서는, 1일당 약 0.1 ~ 100㎎, 바람직하기는 약 1.0 ~ 50㎎, 더욱 바람직하기는 약 1.0 ~ 20㎎이다.

비경구적으로 투여하는 경우는, 그의 1회 투여량은 투여대상, 대상 장기, 증상, 투여방법에 의해서도 다르지만, 예를 들면 주사제의 형에서는 통상 성인(체중 60㎏)에 있어서는, 1일당 약 0.01 ~ 30㎎, 바람직하기는 약 0.1 ~ 20㎎, 더욱 바람직하기는 약 0.1 ~ 10㎎ 정도를 정맥주사에 의해 투여하는 것이 좋다. 다른 동물의 경우도, 체중 60㎏에 대해서 환산한 양을 투여할 수 있다.

다음에, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

실시예 1. WTIP의 정제

(1) GST 융합단백질의 제작과 정제

pBluescriptII/WT1(+/+)(Kudoh T. et al., Oncogene, Vol.13, p.1431-1439, 1996)을 템플레이트로 하고, 5'말단에 EcoRI, 3'말단에 NotI 인식서열을 부가한 하기의 프라이머:

1) GST-WT2

5'-TTGAATTCAATGGGCTCCGACGTGCGG-3' (서열번호 : 3)

5'-TTGTCGACCATGGGATCCTCATGCTT-3' (서열번호 : 4)

2) GST-WT3

5'-TTGAATTCAATGGGCTCCGACGTGCGG-3' (서열번호 : 5)

5'-TTGTCGACGAAGACACCGTGCGTGTG-3' (서열번호 : 6)

3) GST-WT4

5'-TTGAATTCAGATCCAATGGGCCAGCAC-3' (서열번호 : 7)

5'-TTGTCGACGAAGACACCGTGCGTGTG-3' (서열번호 : 8)

를 사용해서 PCR를 행하여 삽입단편을 제작했다. 증폭곤란한 영역은 적당한 플라스미드에 의해 제한효소단편을 삽입했다. 증폭단편의 염기서열은, GST-WT3에서는 1-882, GST-WT2에서는 1-546, GST-WT4에서는 541-882이다(도 1b). 삽입단편을 pGEX-5X-3(Amersham Pharmacia Biotech)에 병합하고, 시퀀스(sequence)를 확인한 후, 대장균주 BL21(DE3)을 형질전환했다. 이 때, 융합단백질의 가용성을 높이기 위하여 티오레독신(thioredoxin)발현벡터인 pT-Trx를 공발현시켰다(Yasukawa T. et al., J. Biol. Chem. Vol.270, p.25328-25331, 1995).

발현 확인 후, 하룻밤 동안 배양한 액을 10배 희석해서 37℃에서 1.5시간 동안 배양한 후, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 최종농도 0.1mM로 첨가하고, 또한 5시간 동안 배양한 후, 균체를 회수하고, 세포용해완충액(50mM Tris HCl pH7.5, 50mM Nacl, 1mM EDTA, 1mM Pefabloc SC(Boehringer Mannheim), 10㎍/㎖로이펩틴, 1mM DTT)를 첨가하고, 초음파 파쇄로 가용화했다. 상징액 중의 융합단백질을 글루타치온 세파로스 4B(Amersham Pharmacia Biotech)에 결합시키고, 용출완충액(50mM Tris Hcl pH7.5, 150mM Nacl, 20mM 환원 글루타치온, 1mM DTT)으로 용출했다. 단백질 농도 측정은 Bradford법(Protein Assay, Bio-Rad)을 사용해서 행하고, 소혈청알부민을 표준으로 했다.

(2) west western blot에 의한 WTIP의 검출

K562 세포 내에 GST융합단백질로 검출할 수 있는 WT1 상호작용 단백질이 있는지 여부를 조사하기 위하여, K562 5x10⁶개를 500㎕의 SDS-PAGE용 샘플 완충액에 용해하고, west western blot를 행했다.

시료 단백질을 SDS-PAGE로 분리한 후, 세미드라이법으로 PVDF막(Immobilon-P, Millipore)에 전사하고, 2% 탈지유를 넣고 TBST(0.05% Tween 20)로 블로킹하고, 10 ~ 20㎍/㎖ TBS의 융합단백질과 1시간 내지 하룻밤 동안 반응시켰다.

PVDF막은, TBST로 세정한 후, 항GST항체(Santa Cruz)의 TBST 1000배 희석액과 1시간 동안 반응시키고, 다시 TBST로 세정하고, 항마우스IgG항체(알카리포스파타제(ALP)결합, 또는 호스라딧슈·퍼옥시다제(HRP)결합)의 TBST 8000배 희석액과 1시간 동안 반응시켰다. TBST 및 TBS로 세정 후, ALP결합항체에서는 NBT/BCIP 용액으로 발색시키고, HRP결합항체에서는 ECL로 발광시켰다.

도 2에 west western blot의 결과를 나타냈다. GST-WT2 및 GST-WT3에서 115kDa 부근에서 인지되는 밴드가, GST에서는 인지되지 않고, 이 것이 특이적 밴드이고 약 115kDa의 WT1 상호작용 단백질의 존재가 나타났다. 또한, 같은 밴드는 GST-WT4에서 인지되지 않기 때문에, WT1의 N말단측 182아미노산잔기내에 결합부위 를 갖는 것이 시사되었다. 이 사이즈(p115)의 WT1 상호작용 단백질의 보고는 없기 때문에, 분리정제를 시도해보았다.

(3) WTIP의 정제

샘플조제

K562세포 6x10⁸개 (단백질 약 140㎎)를 PBS로 세정한 후, 세포용해완충액 (50mM Tris Hcl pH7.5, 50mM Nacl, 1mM EDTA, 1mM Pefabloc, 10㎍/㎖)27㎖에 용해하고, 60W에서 30초 초음파 파쇄 후, 10% SB-12를 함유하는 세포용해완충액 3㎖를 첨가하고, 또한 60W 30초로 2회 초음파 파쇄 하고, 5M Nacl로 최종농도를 150mM로 했다.

원심분리로 상징액을 분리하고, 또한 0.45㎛의 필터로 여과하여, FPLC (Amersham Pharmacia Biotech)용 샘플로 했다.

크로마토그라피

음이온교환 크로마토그라피는 HiLoad 16/10Q Sepharose High Performance (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하고, 유속 2㎖/분, 0 ~ 0.5M Nacl의 염농도구배로 용출했다. 개시완충액은 20mM Tris Hcl pH7.5, 0M Nacl, 1mM EDTA, 0.1% CHAPS, 용출완충액은 개시 완충액 + 0.5M Nacl이다. 용출한 각 분획으로부터 20㎕를 분취하고, GST-WT3를 사용한 west western blot를 행하고, WT1 상호작용 단백질을 검출한 분획(도 3)을 다음의 정제에 사용했다.

동일한 완충액을 사용해서 MONO Q HR 5/5(Amersham Pharmacia Biotech)로 음이온교환 크로마토그라피를 행했다. 유속은 1㎖/min이였다. 각 분획에 대해서 동일한 어세이를 행했다(도 4). 소수성 상호작용 크로마토그라피는 Phenyl Superose HR 5/5(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하고, 유속 0.5㎖/min, 1.0 ~ 0M의 염농도구배로 용출했다. 개시 완충액은 20mM Tris HCl pH7.5, 1.0M (NH₄)₂SO₄, 1mM EDTA, 용출 완충액은 20mM Tris HCl pH7.5, 0M(NH₄)₂SO₄, 1mM EDTA이다. 상기와 동일하게 west western blot로 분획의 어세이를 행하고, WT1 상호작용 단백질을 검출한 분획(도 5)에서 단백질을 트리클로로아세트산으로 회수하고, SDS-PAGE(5.0%겔)로 분리 후, PVDF막 (ProBlott, Applied Biosystem)에 전사하고, 펩티드 매핑(peptide mapping)에 사용했다.

즉, 소수성 상호작용 크로마토그라피 후, SDS-PAGE상, 115kDa부근의 특이적 밴드가 분리되었기 때문에, 이 것을 PVDF막에 전사하고, CBB염색 및 west western blot를 행하여, CBB 밴드를 동정했다(도 6). 이 PVDF막에서 밴드를 끊어내어, 직접 펩티드·매핑에 사용했다.

펩티드·매핑

PVDF막에 전사한 단백질을, 막상에서 리실엔도펩티다제로 분해하여, 생성한 펩티드를 HPLC로 분리 후, 각 펩티드의 분자량을 질량분석기(MALDI-TOF MS)로 측정했다. 펩티드의 분자량 패턴을 아미노산서열 데이타 베이스와 비교하여, 본래의 단백질을 예측했다.

WTIP의 동정

펩티드·매핑(peptide mapping)의 결과, 이 밴드 내에 다음의 3종류의 단백질의 존재가 예측되었다. HYPA/FBP11(Acess No. AFO49528), RNA 헤리카제관련 단백질(AFO83255), 및 siah결합 단백질 1(U51586)이다. HYPA/FBP11에서는 3'측, siah결합 단백질1에서는 5'측 염기서열이 미결정이고, RNA헤리카제관련 단백질 전서열이 결정되어 있지만 분자량은 77.9kDa로 밴드 위치로부터 예상되는 분자량과 크게 달랐다. 이 중에서 WT1 상호작용 단백질을 동정하기 위하여, 각 유전자의 기지영역의 His tag 부가 단백질을 제작하여, GST-WT3와의 결합을 조사했다. 그 결과, HYPA/FBP11이 GST-WT3와 결합했기 때문에, 전장의 클로닝, 결합부위의 동정을 행했다.

또한, 상기 His tag 부가 단백질의 제작은 다음과 같이해서 행했다.

인간 백혈병 세포주 K562 또는 KG-1의 cDNA를 템플레이트로 하고, 5'말단에 BamHI, 3'말단에 XhoI 인식서열을 부가한 프라이머(HYPA/FBP11(AFO49523)의 개시코돈을 1로 하고, 1-1218(아미노산1-406), 1-534(아미노산(1-178), 1-294(아미노산1-98)염기를 증폭)로 PCR를 행하여 삽입단편을 제작하고(도 7b), C말단에 His tag를 부가하는 pET-21b(+)(Novagen)에 삽입했다. GST융합단백질과 거의 동일한 방법으로 대장균을 배양하고, 균체를 회수했다. 단, pT-Trx는 사용하지 않았다. 배양액 1㎖ 유래의 균체를 100㎕의 SDS-PAGE용 샘플 완충액에 용해하고, 직접 west western blot 및 western blot에 사용했다. western blot에서 사용한 항체는 항His tag 항체(c-term, Invitrogen)이다.

실시예 2. WTIP를 코드하는 cDNA의 클로닝

WTIP는 전장 약 3kbp이고, 5'말단의 약 1.3kbp가 HYPA/FBP11이다. 이 중에, 프롤린 리치 도메인과 결합하는 것이 알려져 있는 WW도메인이 함유되어 있다. 그 후, FBP11의 마우스·호모로그의 전장이 보고되었기 때문에, 이 3'말단의 서열을 사용해서 K562 및 KG-1 유래의 cDNA를 증폭한 결과 약 3kbp의 단편이 얻어졌다.

K562의 cDNA를 사용해서, 기지영역에서 PCR와 RACE(Rapid Amplification of cDNA ends)로 클로닝을 행했다. RACE는 Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech)를 사용했다. 우선, 5'측은 기지영역 중의 염기서열 5'-CTTTGCTGGTTGGCTCTCCTCCTCTTCT-3' (서열번호:9)를 안티센스 프라이머로 하고, 5'RACE를 행하여, 기지서열의 5'말단을 확인했다.

3'측은, 마우스FBP11 번역영역의 C말단에 상당하는 염기서열 5'-TTGATCATCATCCAGTTGCTCCAAAAGGG-3' (서열번호:10)를 안티센스 프라이머로 하고, HYPA 내의 염기서열 5'-TGGGACAAATGCCTGGAATGATGTCGTC-3' (서열번호:11)를 센스프라이머로 하고, PCR를 행하여, 염기서열을 결정한 결과, 이 영역 내에 NY-REN-6이 함유되어 있는 것을 알았다.

또한, NY-REN-6 영역내의 염기서열 5'-CAGCGATCAGAGTCTCGTTCTGCTTCAG-3' (서열번호:12)를 센스프라이머로 하고 3'RACE를 행하여 염기서열을 결정했다. 이들의 단편을 조합해서 WTIP의 전장을 클로닝했다.

상기와 같이해서 얻어진 약 3kbp의 DNA단편은, 인간 WTIP의 전장을 코드해 놓고, 그의 염기서열을 서열번호:1에 나타내고, 추정되는 아미노산서열을 서열번호:2에 나타냈다. 또한, 염기서열의 결정은, cDNA를 TA클로닝(In vitrogen)해서 결정했다. DNA 데이타 베이스의 검색에는, NCBI 사아바위의 Basic BLAST(BLAST 2.0)를 사용했다. 염기서열의 해석에는, GENETYX-Mac 10.1(SDC소프트웨어개발연구소)을 사용했다.

WTIP의 전장의 구조를 도 7a에 나타냈다.

실시예 3. WTIP의 WT1 상호작용 부위

WW도메인은 Pro-Pro-Leu-Pro (PPLP)의 모티브를 갖는 프롤린 리치 도메인과 결합하는 것이 알려져 있지만, 헌팅틴(Huntingtin)에 동일한 모티브는 없다. WT1에도 프롤린 리치 도메인이 존재하지만, 역시 PPLP 모티브는 없다. WT1이 WTIP와 WW도메인을 통해서 결합해 있는지 여부를 조사하기 위하여, WTIP의 변이체의 His tag 부가 단백질을 사용해서 west western blot를 행했다. 도 8에 나타낸 바와 같이, WW도메인을 함유하지 않는 변이체에서는 GST-WT3과의 결합능은 잃고, WW도메인이 WTIP와 WT1과의 결합에 필요한 것으로 나타났다.

실시예 4. 세포내에서의 WT1과 WTIP와의 반응성

WT1을 강제 발현시킨 세포주 U937을 사용해서 면역침강법에 의한 공침실험을 행하여, 세포 내에서 WT1과 WTIP의 결합을 확인했다.

1x10⁷개의 세포를 500uL의 ELB완충액(50mM HEPES pH7.5, 250mM Nacl, 0.5mM EDTA, 0.1%NP-40, 1mM Pefabloc^TM, Complete^TM EDTA free, 1mM DTT)에 용해하고, 초음파 파쇄한 후, 얼음 위에서 1시간 정치, 15000rpm, 4℃에서 원심분리한 상징액을 회수했다. 이 상징액에 항WT1항체(C-19, Santa-Cruz)4㎍을 첨가하고, 4℃에서 2시 간 동안 온화하게 교반한 후, Protein A Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) 20uL(bed volume)를 첨가하고, 또한 2시간 동안 교반했다. Protein A Sepharose를 ELB buffer 1mL로 3회 세정한 후, SDS-PAGE용 샘플·완충액 40uL를 첨가했다. 반응 상징액은 Flow Trough로서 회수하고, 동일한 샘플·완충액을 첨가했다. 양자를 90℃에서 5분 동안 가열하고, western blot를 행했다. 7.5%의 폴리아크릴아미드겔로 전기영동한 후, Immobilon P(Millipore)에 옮기고, 항WTIP항체를 1차 항체, 항토끼IgG항체(Alkaline phosphatase conjugated, Promega)를 2차 항체로 하고, NBT/BCIP로 발색시켰다.

도 9에 있어서, FT는 Flow through, IP는 Protein A Sepharose 결합분획이다. 도 9의 화살 머리의 위치에 WTIP의 밴드가 확인되었다. 즉, WT1을 강제 발현시킨 세포 내에서, WT1과 WTIP가 결합하는 것이 나타났다.

SEQUENCE LISTING <110> Haruo Sugiyama <120> WT1 interacting protein WTIP <130> 994673 <160> 12 <210> 1 <211> 2979 <212> DNA <213> Homosapiens <223> Nucleotide sequence encoding human WTIP <400> 1 tctgagcccg acg atg agg ccg ggg acg gga gct gag cgt gga ggc 46 Met Arg Pro Gly Thr Gly Ala Glu Arg Gly Gly 1 5 10 ctc atg gtg agt gaa atg gag agc cat cct ccc tcg cag ggt cct ggg 94 Leu Met Val Ser Glu Met Glu Ser His Pro Pro Ser Gln Gly Pro Gly 15 20 25 gac ggg gag cgg aga ttg tcc ggc tca agc ctc tgc tcc ggc tct tgg 142 Asp Gly Glu Arg Arg Leu Ser Gly Ser Ser Leu Cys Ser Gly Ser Trp 30 35 40 gtc tct gct gac ggc ttc ctg agg aga cgg ccc tcg atg ggg cac cct 190 Val Ser Ala Asp Gly Phe Leu Arg Arg Arg Pro Ser Met Gly His Pro 45 50 55 ggc atg cat tat gcc cca atg gga atg cac cct atg ggt cag aga gcg 238 Gly Met His Tyr Ala Pro Met Gly Met His Pro Met Gly Gln Arg Ala 60 65 70 75 aat atg cct cct gta cct cat gga atg atg ccg cag atg atg ccc cct 286 Asn Met Pro Pro Val Pro His Gly Met Met Pro Gln Met Met Pro Pro 80 85 90 atg gga ggg cca cca atg gga caa atg cct gga atg atg tcg tca gta 334 Met Gly Gly Pro Pro Met Gly Gln Met Pro Gly Met Met Ser Ser Val 95 100 105 atg cct gga atg atg atg tct cat atg tct cag gct tcc atg cag cct 382 Met Pro Gly Met Met Met Ser His Met Ser Gln Ala Ser Met Gln Pro 110 115 120 gcc tta ccg cca gga gta aat agt atg gat gta gca gca ggt aca gca 430 Ala Leu Pro Pro Gly Val Asn Ser Met Asp Val Ala Ala Gly Thr Ala 125 130 135 tct ggt gca aaa tca atg tgg act gaa cat aaa tca cct gat gga agg 478 Ser Gly Ala Lys Ser Met Trp Thr Glu His Lys Ser Pro Asp Gly Arg 140 145 150 155 act tac tac tac aac act gaa acc aaa cag tct acc tgg gag aaa cca 526 Thr Tyr Tyr Tyr Asn Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp Glu Lys Pro 160 165 170 gat gat ctt aaa aca cct gct gag caa ctc tta tct aaa tgc ccc tgg 574 Asp Asp Leu Lys Thr Pro Ala Glu Gln Leu Leu Ser Lys Cys Pro Trp 175 180 185 aag gaa tac aaa tca gat tct gga aag cct tac tat tat aat tct caa 622 Lys Glu Tyr Lys Ser Asp Ser Gly Lys Pro Tyr Tyr Tyr Asn Ser Gln 190 195 200 aca aaa gaa tct cgc tgg gcc aaa cct aaa gaa ctt gag gat ctt gaa 670 Thr Lys Glu Ser Arg Trp Ala Lys Pro Lys Glu Leu Glu Asp Leu Glu 205 210 215 gga tac cag aat acc att gtt gct gga agt ctt att aca aaa tca aac 718 Gly Tyr Gln Asn Thr Ile Val Ala Gly Ser Leu Ile Thr Lys Ser Asn 220 225 230 235 ctg cat gca atg atc aaa gct gaa gaa agc agt aag caa gaa gag tgc 766 Leu His Ala Met Ile Lys Ala Glu Glu Ser Ser Lys Gln Glu Glu Cys 240 245 250 acc aca aca tca aca gcc cca gtc cct aca aca gaa att ccg acc aca 814 Thr Thr Thr Ser Thr Ala Pro Val Pro Thr Thr Glu Ile Pro Thr Thr 255 260 265 atg agc acc atg gct gct gcc gaa gca gca gct gct gtt gtt gca gca 862 Met Ser Thr Met Ala Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Val Val Ala Ala 270 275 280 gca gca gcg gca gca gca gca gca gct gca gcc aat gct aat gct tcc 910 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asn Ala Asn Ala Ser 285 290 295 act tct gct tct aat act gtc agt gga act gtt cca gtt gtt cct gag 958 Thr Ser Ala Ser Asn Thr Val Ser Gly Thr Val Pro Val Val Pro Glu 300 305 310 315 cct gaa gtt act tcc att gtt gct act gtt gta gat aat gag aat aca 1006 Pro Glu Val Thr Ser Ile Val Ala Thr Val Val Asp Asn Glu Asn Thr 320 325 330 gta act att tca act gag gaa caa gca caa ctt act agt acc cct gct 1054 Val Thr Ile Ser Thr Glu Glu Gln Ala Gln Leu Thr Ser Thr Pro Ala 335 340 345 att cag gat caa agt gtg gaa gta tcc agt aat act gga gaa gaa aca 1102 Ile Gln Asp Gln Ser Val Glu Val Ser Ser Asn Thr Gly Glu Glu Thr 350 355 360 tct aag caa gaa act gta gct gat ttt act ccc aaa aaa gaa gag gag 1150 Ser Lys Gln Glu Thr Val Ala Asp Phe Thr Pro Lys Lys Glu Glu Glu 365 370 375 gag agc caa cca gca aag aaa aca tac act tgg aat aca aag gaa gag 1198 Glu Ser Gln Pro Ala Lys Lys Thr Tyr Thr Trp Asn Thr Lys Glu Glu 380 385 390 395 gca aag caa gct ttt aaa gaa tta ttg aaa gaa aag cgg gta cca tcg 1246 Ala Lys Gln Ala Phe Lys Glu Leu Leu Lys Glu Lys Arg Val Pro Ser 400 405 410 aat gct tca tgg gag cag gct atg aaa atg att att aat gat cca cga 1294 Asn Ala Ser Trp Glu Gln Ala Met Lys Met Ile Ile Asn Asp Pro Arg 415 420 425 tac agt gct ttg gca aag tta agt gaa aaa aag caa gcc ttt aat gcc 1342 Tyr Ser Ala Leu Ala Lys Leu Ser Glu Lys Lys Gln Ala Phe Asn Ala 430 435 440 tat aaa gtc cag aca gaa aaa gaa gaa aaa gaa gaa gca aga tca aag 1390 Tyr Lys Val Gln Thr Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Ser Lys 445 450 455 tac aaa gag gct aag gaa tcc ttt cag cgt ttt ctt gaa aat cat gag 1438 Tyr Lys Glu Ala Lys Glu Ser Phe Gln Arg Phe Leu Glu Asn His Glu 460 465 470 475 aaa atg act tct aca acc aga tac aaa aaa gca gag caa atg ttt gga 1486 Lys Met Thr Ser Thr Thr Arg Tyr Lys Lys Ala Glu Gln Met Phe Gly 480 485 490 gag atg gaa gtt tgg aat gca ata tca gaa cgt gat cgt ctt gaa atc 1534 Glu Met Glu Val Trp Asn Ala Ile Ser Glu Arg Asp Arg Leu Glu Ile 495 500 505 tat gaa gat gtt ttg ttc ttt ctt tca aaa aaa gaa aag gaa caa gca 1582 Tyr Glu Asp Val Leu Phe Phe Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Gln Ala 510 515 520 aag cag ttg cga aag aga aat tgg gaa gcc tta aaa aac ata ctt gac 1630 Lys Gln Leu Arg Lys Arg Asn Trp Glu Ala Leu Lys Asn Ile Leu Asp 525 530 535 aac atg gct aat gta aca tac tct acc act tgg tct gaa gcc cag cag 1678 Asn Met Ala Asn Val Thr Tyr Ser Thr Thr Trp Ser Glu Ala Gln Gln 540 545 550 555 tat ctg atg gat aat cca act ttt gca gaa gat gag gag tta caa aat 1726 Tyr Leu Met Asp Asn Pro Thr Phe Ala Glu Asp Glu Glu Leu Gln Asn 560 565 570 atg gac aaa gaa gat gca tta att tgc ttt gaa gaa cac att cgg gct 1774 Met Asp Lys Glu Asp Ala Leu Ile Cys Phe Glu Glu His Ile Arg Ala 575 580 585 tta gaa aag gag gaa gaa gaa gaa aaa cag aag agt ttg ctg aga gaa 1822 Leu Glu Lys Glu Glu Glu Glu Glu Lys Gln Lys Ser Leu Leu Arg Glu 590 595 600 agg aga cga cag cga aaa aat agg gaa tct ttc cag ata ttt tta gat 1870 Arg Arg Arg Gln Arg Lys Asn Arg Glu Ser Phe Gln Ile Phe Leu Asp 605 610 615 gaa tta cat gaa cat gga caa ctg cat tct atg tca tct tgg atg gaa 1918 Glu Leu His Glu His Gly Gln Leu His Ser Met Ser Ser Trp Met Glu 620 625 630 635 ttg tat cca act att agt tct gat att aga ttc act aat atg ctt ggt 1966 Leu Tyr Pro Thr Ile Ser Ser Asp Ile Arg Phe Thr Asn Met Leu Gly 640 645 650 cag cct gga tca act gca ctt gat ctt ttc aag ttt tat gtt gag gat 2014 Gln Pro Gly Ser Thr Ala Leu Asp Leu Phe Lys Phe Tyr Val Glu Asp 655 660 665 ctt aaa gca cgt tat cat gac gag aag aag ata ata aaa gac att cta 2062 Leu Lys Ala Arg Tyr His Asp Glu Lys Lys Ile Ile Lys Asp Ile Leu 670 675 680 aag gat aaa gga ttt gta gtt gaa gta aac act act ttt gaa gat ttt 2110 Lys Asp Lys Gly Phe Val Val Glu Val Asn Thr Thr Phe Glu Asp Phe 685 690 695 gtg gcg ata atc agt tca act aaa aga tca act aca tta gat gct gga 2158 Val Ala Ile Ile Ser Ser Thr Lys Arg Ser Thr Thr Leu Asp Ala Gly 700 705 710 715 aat atc aaa ttg gct ttc aat agt tta cta gaa aag gca gaa gcc cgt 2206 Asn Ile Lys Leu Ala Phe Asn Ser Leu Leu Glu Lys Ala Glu Ala Arg 720 725 730 gaa cgt gaa aga gaa aaa gaa gag gct cgg aag atg aaa cga aaa gaa 2254 Glu Arg Glu Arg Glu Lys Glu Glu Ala Arg Lys Met Lys Arg Lys Glu 735 740 745 tct gca ttt aag agt atg tta aaa caa gct gct cct ccg ata gaa ttg 2302 Ser Ala Phe Lys Ser Met Leu Lys Gln Ala Ala Pro Pro Ile Glu Leu 750 755 760 gat gct gtc tgg gaa gat atc cgt gag aga ttt gta aaa gag cca gca 2350 Asp Ala Val Trp Glu Asp Ile Arg Glu Arg Phe Val Lys Glu Pro Ala 765 770 775 ttt gag gac ata act cta gaa tct gaa aga aaa cga ata ttt aaa gat 2398 Phe Glu Asp Ile Thr Leu Glu Ser Glu Arg Lys Arg Ile Phe Lys Asp 780 785 790 795 ttt atg cat gtg ctt gag cat gaa tgt cag cat cat cat tca aag aac 2446 Phe Met His Val Leu Glu His Glu Cys Gln His His His Ser Lys Asn 800 805 810 aag aaa cat tct aag aaa tct aaa aaa cat cat agg aaa cgt tcc cgc 2494 Lys Lys His Ser Lys Lys Ser Lys Lys His His Arg Lys Arg Ser Arg 815 820 825 tct cga tcg ggg tca gat tca gat gat gat gat agc cat tca aag aaa 2542 Ser Arg Ser Gly Ser Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser His Ser Lys Lys 830 835 840 aaa aga cag cga tca gag tct cgt tct gct tca gaa cat tct tct agt 2590 Lys Arg Gln Arg Ser Glu Ser Arg Ser Ala Ser Glu His Ser Ser Ser 845 850 855 gca gag tct gag aga agt tat aaa aag tca aaa aag cat aag aag aaa 2638 Ala Glu Ser Glu Arg Ser Tyr Lys Lys Ser Lys Lys His Lys Lys Lys 860 865 870 875 agt aag aag agg aga cat aaa tct gac tct cca gaa tcc gat gct gag 2686 Ser Lys Lys Arg Arg His Lys Ser Asp Ser Pro Glu Ser Asp Ala Glu 880 885 890 cga gag aag gat aaa aaa gaa aaa gat cgg gaa agt gaa aaa gac aga 2734 Arg Glu Lys Asp Lys Lys Glu Lys Asp Arg Glu Ser Glu Lys Asp Arg 895 900 905 act aga caa aga tca gaa tca aaa cac aaa tcg cct aag aaa aag act 2782 Thr Arg Gln Arg Ser Glu Ser Lys His Lys Ser Pro Lys Lys Lys Thr 910 915 920 gga aag gat tct ggt aat tgg gat act tct ggc agc gaa ctg agt gaa 2830 Gly Lys Asp Ser Gly Asn Trp Asp Thr Ser Gly Ser Glu Leu Ser Glu 925 930 935 ggg gaa ttg gaa aag cgc aga aga acc ctt ttg gag caa ctg gat gat 2878 Gly Glu Leu Glu Lys Arg Arg Arg Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Asp 940 945 950 955 gat caa taaattatac caaatatatg tttacagtat gatttaaagt ctgattcaga 2934 Asp Gln ccagggactc tattttaaag ttcaactgaa ataacactgg gaaaa 2979 <210> 2 <211> <212> PRT <213> Homosapiens <223> Amino acid sequence human WTIP <400> 2 Met Arg Pro Gly Thr Gly Ala Glu Arg Gly Gly Leu Met Val Ser Glu 1 5 10 15 Met Glu Ser His Pro Pro Ser Gln Gly Pro Gly Asp Gly Glu Arg Arg 20 25 30 Leu Ser Gly Ser Ser Leu Cys Ser Gly Ser Trp Val Ser Ala Asp Gly 35 40 45 Phe Leu Arg Arg Arg Pro Ser Met Gly His Pro Gly Met His Tyr Ala 50 55 60 Pro Met Gly Met His Pro Met Gly Gln Arg Ala Asn Met Pro Pro Val 65 70 75 80 Pro His Gly Met Met Pro Gln Met Met Pro Pro Met Gly Gly Pro Pro 85 90 95 Met Gly Gln Met Pro Gly Met Met Ser Ser Val Met Pro Gly Met Met 100 105 110 Met Ser His Met Ser Gln Ala Ser Met Gln Pro Ala Leu Pro Pro Gly 115 120 125 Val Asn Ser Met Asp Val Ala Ala Gly Thr Ala Ser Gly Ala Lys Ser 130 135 140 Met Trp Thr Glu His Lys Ser Pro Asp Gly Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asn 145 150 155 160 Thr Glu Thr Lys Gln Ser Thr Trp Glu Lys Pro Asp Asp Leu Lys Thr 165 170 175 Pro Ala Glu Gln Leu Leu Ser Lys Cys Pro Trp Lys Glu Tyr Lys Ser 180 185 190 Asp Ser Gly Lys Pro Tyr Tyr Tyr Asn Ser Gln Thr Lys Glu Ser Arg 195 200 205 Trp Ala Lys Pro Lys Glu Leu Glu Asp Leu Glu Gly Tyr Gln Asn Thr 210 215 220 Ile Val Ala Gly Ser Leu Ile Thr Lys Ser Asn Leu His Ala Met Ile 225 230 235 240 Lys Ala Glu Glu Ser Ser Lys Gln Glu Glu Cys Thr Thr Thr Ser Thr 245 250 255 Ala Pro Val Pro Thr Thr Glu Ile Pro Thr Thr Met Ser Thr Met Ala 260 265 270 Ala Ala Glu Ala Ala Ala Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 275 280 285 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asn Ala Asn Ala Ser Thr Ser Ala Ser Asn 290 295 300 Thr Val Ser Gly Thr Val Pro Val Val Pro Glu Pro Glu Val Thr Ser 305 310 315 320 Ile Val Ala Thr Val Val Asp Asn Glu Asn Thr Val Thr Ile Ser Thr 325 330 335 Glu Glu Gln Ala Gln Leu Thr Ser Thr Pro Ala Ile Gln Asp Gln Ser 340 345 350 Val Glu Val Ser Ser Asn Thr Gly Glu Glu Thr Ser Lys Gln Glu Thr 355 360 365 Val Ala Asp Phe Thr Pro Lys Lys Glu Glu Glu Glu Ser Gln Pro Ala 370 375 380 Lys Lys Thr Tyr Thr Trp Asn Thr Lys Glu Glu Ala Lys Gln Ala Phe 385 390 395 400 Lys Glu Leu Leu Lys Glu Lys Arg Val Pro Ser Asn Ala Ser Trp Glu 405 410 415 Gln Ala Met Lys Met Ile Ile Asn Asp Pro Arg Tyr Ser Ala Leu Ala 420 425 430 Lys Leu Ser Glu Lys Lys Gln Ala Phe Asn Ala Tyr Lys Val Gln Thr 435 440 445 Glu Lys Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Ser Lys Tyr Lys Glu Ala Lys 450 455 460 Glu Ser Phe Gln Arg Phe Leu Glu Asn His Glu Lys Met Thr Ser Thr 465 470 475 480 Thr Arg Tyr Lys Lys Ala Glu Gln Met Phe Gly Glu Met Glu Val Trp 485 490 495 Asn Ala Ile Ser Glu Arg Asp Arg Leu Glu Ile Tyr Glu Asp Val Leu 500 505 510 Phe Phe Leu Ser Lys Lys Glu Lys Glu Gln Ala Lys Gln Leu Arg Lys 515 520 525 Arg Asn Trp Glu Ala Leu Lys Asn Ile Leu Asp Asn Met Ala Asn Val 530 535 540 Thr Tyr Ser Thr Thr Trp Ser Glu Ala Gln Gln Tyr Leu Met Asp Asn 545 550 555 560 Pro Thr Phe Ala Glu Asp Glu Glu Leu Gln Asn Met Asp Lys Glu Asp 565 570 575 Ala Leu Ile Cys Phe Glu Glu His Ile Arg Ala Leu Glu Lys Glu Glu 580 585 590 Glu Glu Glu Lys Gln Lys Ser Leu Leu Arg Glu Arg Arg Arg Gln Arg 595 600 605 Lys Asn Arg Glu Ser Phe Gln Ile Phe Leu Asp Glu Leu His Glu His 610 615 620 Gly Gln Leu His Ser Met Ser Ser Trp Met Glu Leu Tyr Pro Thr Ile 625 630 635 640 Ser Ser Asp Ile Arg Phe Thr Asn Met Leu Gly Gln Pro Gly Ser Thr 645 650 655 Ala Leu Asp Leu Phe Lys Phe Tyr Val Glu Asp Leu Lys Ala Arg Tyr 660 665 670 His Asp Glu Lys Lys Ile Ile Lys Asp Ile Leu Lys Asp Lys Gly Phe 675 680 685 Val Val Glu Val Asn Thr Thr Phe Glu Asp Phe Val Ala Ile Ile Ser 690 695 700 Ser Thr Lys Arg Ser Thr Thr Leu Asp Ala Gly Asn Ile Lys Leu Ala 705 710 715 720 Phe Asn Ser Leu Leu Glu Lys Ala Glu Ala Arg Glu Arg Glu Arg Glu 725 730 735 Lys Glu Glu Ala Arg Lys Met Lys Arg Lys Glu Ser Ala Phe Lys Ser 740 745 750 Met Leu Lys Gln Ala Ala Pro Pro Ile Glu Leu Asp Ala Val Trp Glu 755 760 765 Asp Ile Arg Glu Arg Phe Val Lys Glu Pro Ala Phe Glu Asp Ile Thr 770 775 780 Leu Glu Ser Glu Arg Lys Arg Ile Phe Lys Asp Phe Met His Val Leu 785 790 795 800 Glu His Glu Cys Gln His His His Ser Lys Asn Lys Lys His Ser Lys 805 810 815 Lys Ser Lys Lys His His Arg Lys Arg Ser Arg Ser Arg Ser Gly Ser 820 825 830 Asp Ser Asp Asp Asp Asp Ser His Ser Lys Lys Lys Arg Gln Arg Ser 835 840 845 Glu Ser Arg Ser Ala Ser Glu His Ser Ser Ser Ala Glu Ser Glu Arg 850 855 860 Ser Tyr Lys Lys Ser Lys Lys His Lys Lys Lys Ser Lys Lys Arg Arg 865 870 875 880 His Lys Ser Asp Ser Pro Glu Ser Asp Ala Glu Arg Glu Lys Asp Lys 885 890 895 Lys Glu Lys Asp Arg Glu Ser Glu Lys Asp Arg Thr Arg Gln Arg Ser 900 905 910 Glu Ser Lys His Lys Ser Pro Lys Lys Lys Thr Gly Lys Asp Ser Gly 915 920 925 Asn Trp Asp Thr Ser Gly Ser Glu Leu Ser Glu Gly Glu Leu Glu Lys 930 935 940 Arg Arg Arg Thr Leu Leu Glu Gln Leu Asp Asp Asp Gln 945 950 955 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 ttgaattcaa tgggctccga cgtgcgg 27 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ttgtcgacca tgggatcctc atgctt 26 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 ttgaattcaa tgggctccga cgtgcgg 27 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ttgtcgacga agacaccgtg cgtgtg 26 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ttgaattcag atccaatggg ccagcag 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 ttgtcgacga agacaccgtg cgtgtg 26 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 ctttgctggt tggctctcct cctcttct 28 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ttgatcatca tccagttgct ccaaaaggg 29 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 tgggacaaat gcctggaatg atgtcgtc 28 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 cagcgatcag agtctcgttc tgcttcag 28

Claims (18)

1. 하기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나의 단백질:

   (a) 서열번호:2로 나타낸 아미노산 서열을 가지는 WT1 상호작용 단백질,

   (b) 서열번호:2에 있어서 제 99 위치의 아미노산으로부터 제 178 위치까지의 아미노산 서열을 가지는 단백질,

   (c) 서열번호:2에 있어서 제 449 위치의 아미노산으로부터 제 541 위치까지의 아미노산 서열을 가지는 단백질,

   (d) 서열번호:2에 있어서 제 141 위치의 아미노산으로부터 제 217 위치까지의 아미노산 서열을 가지는 단백질.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제 1항의 단백질을 유효성분으로 하는 WT1 단백질 기능 조절제.
5. 삭제
6. 제 1항에 기재된 단백질을 코드하는 유전자.
7. 제 6항에 기재된 유전자를 함유해서 이루어지는 벡터.
8. 제 7항에 기재된 벡터를 보유하는 숙주세포.
9. 제 8항의 숙주세포를 배양하는 것으로 이루어지는, 제 1항에 기재된 단백질의 제조방법.
10. 제 1항에 기재된 단백질에 대한 항체.
11. 제 1항에 기재된 단백질의 검출 또는 측정방법에 있어서,

    (a) 제 10항에 기재된 항체와, 이 단백질이 함유되는 것으로 예상되는 시료를 접촉시키고,

    (b) 상기 항체와 이 단백질과의 면역 복합체의 생성을 검출 또는 측정하는 것 또는 상기 항체를 사용해서, 이 단백질을 발현하는 세포를 면역염색하는 것으로 이루어지는 방법.
12. 삭제
13. 제 1항에 기재된 단백질에 결합하는 화합물의 스크리닝방법에 있어서,

    (a) 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 피검시료를 접촉 시키는 공정,

    (b) 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 피검시료와의 결합활성을 검출하는 공정,

    (c) 이 단백질 또는 그의 부분 펩티드에 결합하는 활성을 갖는 화합물을 선택하는 공정으로 이루어지는 방법.
14. 삭제
15. 제 1항에 기재된 단백질의 활성을 촉진 또는 저해하는 화합물의 스크리닝방법에 있어서,

    (a) 피검시료의 존재하에서, 이 단백질을 발현하는 세포를 배양하는 공정.

    (b) 이 세포의 증식을 검출하는 공정,

    (c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우와 비교해서, 이 증식을 촉진 또는 억제하는 화합물을 선택하는 공정으로 이루어지는 방법.
16. 삭제
17. 제 1항에 기재된 WT1 상호작용 단백질과 WT1 단백질과의 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물의 스크리닝방법에 있어서,

    (a) 피검시료의 존재하에서, WT1 상호작용 단백질 및 WT1 단백질을 반응시키는 공정,

    (b) 양단백질의 결합활성을 측정하는 공정,

    (c) 피검시료 비존재하에서 검출한 경우와 비교해서, 이 결합을 촉진 또는 저해하는 화합물을 선택하는 공정으로 이루어지는 방법.
18. 삭제

Images