DE60120187T2

DE60120187T2 - Verkürztes bard1 protein und dessen diagnostische und therapeutische anwendungen

Info

Publication number: DE60120187T2
Application number: DE60120187T
Authority: DE
Inventors: Fabien Gautier; Jean Harb; Khaled Meflah; Irmgard Irminger-Finger
Original assignee: IRMINGER FINGER IRMIGARD; IRMINGER-FINGER IRMIGARD
Current assignee: Irminger-Finger Irmigard Genf/geneva Ch
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-09-03
Publication date: 2007-03-29
Anticipated expiration: 2021-09-04
Also published as: WO2002018536A3; JP2004518410A; CA2421258A1; US7566764B2; WO2002018536A2; JP4995399B2; ATE328082T1; DE60120187D1; FR2813606A1; US20100016228A1; EP1313855A2; US20040234959A1; FR2813606B1; EP1313855B1; CA2421258C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein aus der Spaltung des BARD1-Proteins hervorgegangenes neues Polypeptid und dessen diagnostische und therapeutische Anwendungen.
Das BARD1-Protein ist ein Protein von 67 kD, das über auf BRCA1 und BARD1 (für „BRCA1-associated ring domain", d.h. „mit BRCA1 assoziierte Ringdomäne") vorhandene Ringmotive mit dem Produkt des Tumorsuppressor-Gens BRCA1 in Wechselwirkung tritt (Wu und Mitautoren, 1996). Das für dieses Protein kodierende Gen ist kürzlich geklont worden (WO 98/12327).
Boisteau und Mitautoren beschreiben, dass die von den PROb-Zellen von Rattenkarzinom abgeleiteten apoptotischen Körper durch die Erzeugung von Antikörpern eine antitumorale Wirkung besitzen. Diese Wirkung wird nicht an aus ganzen PROb-Zellen extrahierten Proteinen beobachtet. In diesem Dokument wird auch eine Western-Blot-Analyse offenbart, in der diese Antikörper eine Bande bei etwa 70 kD in den apoptotischen Körpern und eine Bande bei etwa 100 kD in den ganzen PROb-Zellen erkennen.
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben jetzt ein neues Polypeptid identifiziert, das einem proteolytischen Fragment des im Verlauf des Apoptoseprozesses gespalteten BARD1 entspricht.
Dieses verkürzte Protein ist sehr immunogen und kann unter anderem in der Krebsbehandlung oder bei der Nachkontrolle der Wirksamkeit einer Behandlung von Krebspatienten mit proapoptotischen Wirkstoffen eingesetzt werden.
Gegenstand der Erfindung ist also dieses isolierte Polypeptid, das ein zum Beispiel mittels Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) gemessenes Molekulargewicht von etwa 67 kD besitzt und dessen Sequenz aus der Aminosäuresequenz des Proteins BARD1 besteht, dessen die Ringdomäne umfassender N-terminaler Abschnitt deletiert worden ist.
Genauer kann das Polypeptid der Erfindung als ein Polypeptid definiert werden, das aus etwa 505 bis 525 Aminosäuren besteht, die vom C-terminalen Ende des humanen BARD1-Proteins ausgehen (dessen bekannte Sequenz im Anhang als SEQ ID Nr. 1 vorgestellt wird). Noch genauer besteht das Polypeptid der Erfindung aus 525 bis 522 C-terminalen Aminosäuren des humanen BARD1.
Das Polypeptid der Erfindung kann zum Beispiel von apoptotischen Körpern ausgehend gereinigt werden, die aus Zelllinien von Mamma- oder Kolonkarzinomen hervorgehen.
Genauer kann das Polypeptid der Erfindung durch das Verfahren gewonnen werden, das daraus besteht,

– Zellen, die zum Beispiel einer Zelllinie wie PROb, SW48 oder MCF7 angehören, bis zur Konfluenz zu kultivieren;
– die Apoptose dieser Zellen zu induzieren, indem sie während 24 Stunden bei 37°C mit einem Kulturmedium behandelt werden, das 5 mM Natriumbutyrat (NaB) enthält;
– isoliertes rekombinantes BARD1-Protein hinzuzufügen;
– während einer genügend langen Zeit, zum Beispiel 60 Minuten bei 37°C, zu inkubieren, um die Spaltung des BARD1-Proteins zu einer Form von 67 kDa zu beobachten.

Das Polypeptid der Erfindung wird durch einen Antikörper erkannt, der gegen ein Polypeptid gerichtet ist, das den Aminosäuren 255 bis 265 von BARD1 entspricht.
Die Autoren der Erfindung haben im Übrigen gezeigt, dass die Hydrolyse von BARD1 in einem frühen Stadium der Apoptose und in einer vom Zellzyklus abhängigen Weise erfolgt. Diese Hydrolyse wird durch EGTA und durch den Calpain-Inhibitor I, das N-Acetyl-Leu-Leu-norleucinal (ALLnL), gehemmt, jedoch nicht durch mehrere Caspase-Inhibitoren, was eine Hydrolyse durch calciumabhängige Cysteinproteasen, die Calpaine, nahelegt.
Alle Proteine, die aus einer Sequenz bestehen, die der benannten Sequenz von 505 bis 525 Aminosäuren homolog ist, sind ebenfalls in der Definition dieses Polypeptids von 67 kD einbegriffen.
Die Erfindung hat weiter eine Nucleinsäure zum Gegenstand, die für dieses verkürzte Protein oder seine Homologen kodiert.
Unter einer homologen Aminosäuresequenz wird eine Sequenz verstanden, die der benannten Sequenz von 505 bis 525 Aminosäuren zu wenigstens 70%, bevorzugt zu 80% und weiter bevorzugt zu 90% ähnlich ist.
Der Begriff „ähnlich" bezieht sich auf die vollkommene Ähnlichkeit bzw. die Identität der verglichenen Aminosäuren, aber auch auf die unvollkommene Ähnlichkeit, die Gleichartigkeit genannt wird. Diese Suche nach Gleichartigkeiten in einer Polypeptidsequenz berücksichtigt die konservativen Substitutionen, d.h. die Substitutionen von Aminosäuren der gleichen Klasse wie zum Beispiel die Substitutionen von Aminosäuren mit ungeladenen Seitenketten (wie dem Asparagin, dem Glutamin, dem Serin, dem Threonin und dem Tyrosin), von Aminosäuren mit basischen Seitenketten (wie dem Lysin, dem Arginin und dem Histidin), von Aminosäuren mit sauren Seitenketten (wie der Asparaginsäure und der Glutaminsäure) und von Aminosäuren mit apolaren Seitenketten (wie dem Glycin, dem Alanin, dem Valin, dem Leucin, dem Isoleucin, dem Prolin, dem Phenylalanin, dem Methionin, dem Tryptophan und dem Cystein).
Allgemeiner versteht man also unter „homologer Aminosäuresequenz" jede Aminosäuresequenz, die sich von der benannten Sequenz durch die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer Aminosäure oder einer beschränkten Anzahl von Aminosäuren und namentlich durch die Substitution von natürlichen Aminosäuren durch nicht-natürliche oder Pseudoaminosäuren an Positionen unterscheidet, an denen diese Modifikationen die oben genannten biologischen Eigenschaften nicht signifikant beeinträchtigen.
Die Homologie wird allgemein durch Einsatz von Sequenzanalyse-Software bestimmt (zum Beispiel dem Sequence Analysis Software Package der Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison WI 53705). Sequenzen ähnlicher Aminosäuren werden so alignt, dass der maximale Grad von Homologie (d.h. Identität oder Gleichartigkeit, wie oben definiert) erreicht wird. Es kann zu diesem Zweck erforderlich sein, Zwischenräume („gaps") künstlich in die Sequenz einzuführen. Nach optimalem Alignment wird der Grad der Homologie ermittelt, indem bezogen auf die Gesamtzahl von Positionen alle diejenigen Positionen registriert werden, für die die Aminosäuren der beiden verglichenen Sequenzen identisch sind.
Das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann mit allen dem Fachmann wohlbekannten Verfahren synthetisiert werden. Das Polypeptid der Erfindung kann zum Beispiel durch Verfahren der synthetischen Chemie wie denen vom Typ der Merrifield-Synthese synthetisiert werden, die aus Gründen der Reinheit, antigenen Spezifität, Abwesenheit von unerwünschten Nebenprodukten und ihrer Bequemlichkeit von Vorteil ist.
Das erzeugte Protein kann dann ausgebracht und gereinigt werden.
Die eingesetzten Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Das gewonnene rekombinante Polypeptid kann von Zelllysaten und -extrakten vom Überstand des Kulturmediums ausgehend mit Verfahren wie die der Fraktionierung, der Chromatographie, der Immunaffinität mit Hilfe spezifischer mono- oder polyklonaler Antikörper usw., die individuell oder kombiniert eingesetzt werden, gereinigt werden.
Das Polypeptid der Erfindung kann insbesondere von apoptotischen Körpern ausgehend gereinigt werden, die von Tumorzellen stammen, und zwar durch Affinitätschromatographie mit einer Säule von Antikörpern, die für das C-terminale Ende des Proteins BARD1 spezifisch sind.
Die Nucleinsäuresequenz, die für das verkürzte BARD1-Protein kodiert, kann in einen Expressionsvektor eingefügt werden, in dem sie operativ an Elemente wie insbesondere Promotoren, Aktivatoren und/oder Terminatoren der Transkription gebunden ist, die ihre Expression zu regulieren erlauben.
Ein rekombinantes Protein kann also ebenfalls mit einem Verfahren erzeugt werden, bei dem ein Vektor, der eine wie oben definierte Aminosäure enthält, in eine Wirtszelle überführt wird, die unter Bedingungen kultiviert wird, die die Expression des entsprechenden Polypeptids ermöglichen.
Die Signale, die die Expression der Nucleotidsequenzen steuern (Promotoren, Aktivatoren, Terminationssequenzen usw.), werden in Abhängigkeit von der eingesetzten Wirtszelle gewählt. Zu diesem Zweck können die erfindungsgemässen Nucleotidsequenzen in Vektoren der autonomen Replikation im gewählten Wirt oder in integrierende Vektoren des gewählten Wirts eingefügt werden. Solche Vektoren können nach Verfahren hergestellt werden, die durch den Fachmann geläufigerweise eingesetzt werden, und die sich ergebenden Klone können mit Standardverfahren wie zum Beispiel der Elektroporation oder der Calciumphosphatfällung in einen geeigneten Wirt eingeführt werden.
Die Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, wie sie oben beschrieben worden sind und eine erfindungsgemäss definierte Nucleotidsequenz umfassen, stellen ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfindung dar.
Die Erfindung zielt ausserdem auf Wirtszellen ab, die vorübergehend oder dauerhaft durch diese Expressionsvektoren transfiziert worden sind. Diese Zellen können gewonnen werden, indem eine in einen wie oben definierten Vektor eingefügte Nucleotidsequenz in prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen eingeführt wird und diese Zellen dann unter Bedingungen kultiviert werden, die die Replikation und/oder die Expression der transfizierten Nucleotidsequenz ermöglichen.
Die Tumorrepressor-Eigenschaften des erfindungsgemässen verkürzten BARD1-Proteins oder der für dieses Protein kodierenden Nucleinsäure können in der Behandlung von Tumoren genutzt werden. Dabei kann es sich um alle Arten von Tumoren handeln, insbesondere aber Brustkrebs, Ovarialkrebs, Lungenkrebs oder Krebs im Verdauungskanal wie die Kolonkarzinome.
Die Erfindung hat daher ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die ein wie vorstehend definiertes Polypeptid oder eine für dieses Polypeptid kodierende Nucleinsäure in Verbindung mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Die Verabreichungsweisen, die Posologien und die galenischen Formen der erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen, die zumindest ein Polypeptid enthalten, können in der üblichen Art und Weise vom Fachmann festgelegt werden, und zwar namentlich in Übereinstimmung mit den Kriterien, die allgemein berücksichtigt werden, um eine dem Patienten angepasste therapeutische Behandlung zu etablieren, zum Beispiel dem Alter oder Körpergewicht des Patienten, der Gefährlichkeit seines Allgemeinzustandes, der Toleranz gegenüber der Behandlung, festgestellten Nebenwirkungen usw.
Allgemein kann erwachsenen Menschen eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge verabreicht werden, die zwischen etwa 0,1 μg und etwa 1 mg variiert.
Die Erfindung hat auch eine pharmazeutische Zusammensetzung zum Gegenstand, die eine wie vorstehend definierte Nucleinsäure, die für das verkürzte BARD1-Protein kodiert, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wobei die Zusammensetzung zum Einsatz in der Gentherapie bestimmt ist. Die bevorzugt in einen allgemein viralen Vektor (wie die Adeno- oder Retroviren) eingefügte Nucleinsäure kann in nackter Gestalt verabreicht werden, also frei von jeglichen Trägern, die die Übertragung in die Targetzelle begünstigen, wie anionischen Liposomen, kationischen Lipiden, Mikropartikeln wie zum Beispiel Goldmikropartikeln, Fällungsmitteln wie Calciumphosphat oder jeglichen anderen, die Transfektion erleichternden Mitteln. In diesem Falle kann das Polynucleotid einfach in der Gegenwart oder in Abwesenheit eines Trägers mit einer physiologisch annehmbaren Lösung wie einer sterilen Lösung oder einer sterilen Pufferlösung verdünnt werden.
Alternativ kann eine Nucleinsäure der Erfindung mit Mitteln kombiniert werden, die die Transfektion erleichtern. Sie kann unter anderem 1) mit einem chemischen Stoff wie dem Bupivacain kombiniert werden, der die Zellpermeabilität modifiziert; 2) in Liposome verkapselt werden, möglicherweise in der Gegenwart von zusätzlichen Substanzen, die die Transfektion erleichtern; oder 3) mit kationischen Lipiden oder Siliciumdioxid-, Gold- oder Wolfram-Mikropartikeln kombiniert werden.
Wenn die Nucleinsäurekonstrukte der Erfindung auf Mikropartikel aufgebracht sind, können diese intradermal oder intraepidermal mit dem Verfahren der Genkanone („gene gun") (WO 94/24263) injiziert werden.
Die als Medikament einzusetzende Menge hängt namentlich vom Nucleinsäurekonstrukt selbst, von der Person, dem diese Nucleinsäure verabreicht wird, von der Art der Verabreichung und dem Typ der Formulierung sowie von der Pathologie ab. Allgemein kann erwachsenen Menschen eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Menge, die zwischen etwa 0,1 μg und etwa 1 mg, bevorzugt zwischen etwa 1 μg und etwa 800 μg und vorzugsweise zwischen etwa 25 μg und etwa 250 μg variiert, verabreicht werden.
Die Nucleinsäurekonstrukte der Erfindung können auf jedem herkömmlichen Verabreichungsweg wie insbesondere auf parenteralem Wege verabreicht werden. Die Wahl des Verabreichungsweges hängt insbesondere von der gewählten Formulierung ab. Eine gezielte Verabreichung am Ort der betrachteten Tumoren kann besonders vorteilhaft sein.
Die Erfindung hat also schliesslich den Einsatz der genannten pharmazeutischen Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zum Gegenstand, das für die Behandlung von Tumoren bestimmt ist.
Der in Betracht gezogene Patient ist allgemein ein Mensch, aber die Anwendung kann gegebenenfalls auch auf alle Säuger ausgedehnt werden.
Das Auftreten der verkürzten Form von BARD1 im Verlauf von Apoptoseprozessen ermöglicht übrigens eine In-vitro-Nachkontrolle der Wirksamkeit einer Krebsbehandlung bei mit proapoptotischen Wirkstoffen behandelten Patienten. Zu diesem Zweck kann ein In-vitro-Nachweisverfahren für das Polypeptid der Erfindung von 67 kD in einem biologischen Muster wie zum Beispiel einem Muster von Tumorgeweben verwendet werden.
Einer Variante zufolge kann ein In-vitro-Nachweisverfahren für gegen das immunogene Polypeptid von 67 kD erzeugte Antikörper in einem biologischen Muster wie Blut oder Urin der Patienten verwendet werden.
Diese Verfahren können auf die üblichen Verfahren des Immunnachweises wie z.B. Western Blot oder die Immunhistochemie zurückgreifen, und zwar mittels eines Antikörpers Anti-BARD1 oder Anti-Verkürztes BARD1, wenn es sich darum handelt, das Polypeptid von 67 kD nachzuweisen, oder mittels des genannten Polypeptids oder eines epitopischen Fragments davon, wenn es sich darum handelt, die Antikörper nachzuweisen.
Die folgenden Beispiele und Figuren veranschaulichen die Erfindung, ohne ihre Tragweite einzuschränken.
BILDUNTERSCHRIFTEN
1 zeigt ein Alignment der Aminosäuresequenzen in BARD1-Proteinen von Mensch, Ratte und Maus. Die dem Ring-Motiv, den drei Ankyrin-Wiederholungen und den beiden BRCT-Tandemdomänen entsprechenden Sequenzen sind hervorgehoben. Die konservierte Mutation Q564H des humanen BARD1-Proteins ist ebenfalls angedeutet. Die Sequenzen sind unter Einführung von Zwischenräumen („gaps") alignt, um die maximale Identität der Aminosäuresequenzen zu erreichen. Die Zahlenwerte für die Aminosäureidentität werden dann berechnet, indem jeder Zwischenraum als eine einzige Ungleichheit angesehen wird (Tabelle 1) Die cDNA-Sequenz des Ratten-BARD1 ist beim EMBL unter der Accessionsnummber AF182946 verfügbar, die der Maus unter der Nummer AF057157 und diejenige des Menschen unter der Genbank-Nummer U76638.
2A zeigt eine Western-Blot-Analyse von Karzinomzellproteinen von Ratten und Menschen sowie ihrer apoptotischen Körper, die mit einem monoklonalen Anti-BARD1-Antikörper 6D10 der Ratte nachgewiesen wurden.
2B zeigt den gleichen Analysentyp mit einem Nachweis durch einen polyklonalen antihumanen Antikörper 669D. Man bemerke, dass a.b. hier apoptotischer Körper bedeutet.
2C zeigt eine Western-Blot-Analyse von Proteinen apoptotischer Körper, die zuerst unter Einsatz eines polyklonalen Anti-BARD1-Antikörpers WFS von Mäusen realisiert worden ist. Die Immunkomplexe werden unter Einsatz des Chemicon-Kits auf gelöst, danach wird das Filter erneut einem humanen Anti-BARD1-Antikörper 669D ausgesetzt.
2D zeigt eine Immunfällung von Lysaten apoptotischer Körper, die von mehreren Karzinomzellen abgeleitet worden waren, mit einem Nachweis durch einen humanen Anti-BARD1-Antikörper 669D. Der Niederschlag wurde einer Elektrophorese unterworfen, dann wurde mit 1:250 verdünnten Seren von Ratten, die mit apoptotischen Körpern PROb immunisiert worden waren, ein Immunblot realisiert.
3A zeigt eine Analyse von Produkten der In-vitro-Hydrolyse des humanen BARD1-Proteins mit SW48-Zelllysaten, die während 24 Stunden bis zur Konfluenz mit 5 mM Natriumbutyrat behandelt worden waren. Die aus dem Überstand ausgebrachten apoptotischen Körper (1) bzw. die adhärenten Zellen (2) wurden in einem DIV-Puffer solubilisiert und einem mit Methionin-³⁵S markierten humanen BARD1-Protein zugegeben. Nach vierstündiger Inkubation bei 37°C wurden die Hydrolyseprodukte durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit PhosphorImager radiographiert.
3B zeigt den gleichen Analysentyp, wobei die adhärenten Zellen im DIV-Puffer solubilisiert und während null bis drei Stunden (T0 bis T3) mit einem mit Methionin-³⁵S markierten humanen BARD1-Protein inkubiert wurden.
4 ist eine graphische Darstellung, die das Wachstum von PROb-Tumoren in BDIX-Ratten nach Impfung mit dem F1-Fragment von BARD1 bzw. einem Kontrollprotein (Fucosyltransferase) darstellen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Identifizierung eines Proteins von 67 kD als Spaltprodukt des BARD1-Proteins
Materialien und Verfahren
Zellkulturen
Die verwendeten REGb-Rattenkolon-Karzinomzellen und PROb-Rattenkolon-Adenokarzinomzellen wurden von einer durch Dimethylhydrazin induzierten Zelllinie abgeleitet (Caignard und Mitautoren, 1985). Das Rattenmammakarzinom 13762, das humane Kolonkarzinom SW48 und das Mammakarzinom MCF7 wurden von der ECACC erhalten. Die Zellen wurden bei 37°C in Einschichtkulturen in einem Medium RPMI 1640 (Gibco) mit 10% fötalem Kalbsserum und 2 mM Glutamin kultiviert. Die Zellen wurden mit 0,025% Trypsin und 0,02% EDTA passagiert.
Immunscreening und Klonierung der cDNA von Ratten-BARD1
Eine cDNA-Bibliothek der PROb-Rattenkarzinom-Zelllinie wurde im Expressionsvektor λTrip1Ex (Clontech) hergestellt. Eine Million Banden wurden mit Seren von Ratten gescreent, die mit apoptotischen Körpern und mit IL-2 geimpft worden waren (Boisteau und Mitautoren, 1997). Die gegen E. coli gerichteten Antikörper wurden durch vierstündiges Inkubieren der ultraschallbehandelten E. coli-Bakterien bei Umgebungstemperatur mit 1:10 in PBS verdünntem Serum, das 5% Magermilchpulver enthielt, aus dem Antiserum von Ratten eliminiert, dann während zehn Minuten bei 13 000 g zentrifugiert. Der Insert von 456 Basenpaaren (Fragment F1) wurde sequenziert, und die Sequenz wurde einer Analyse mit der Genbank des NCBI unterworfen. Er wies eine starke Homologie mit dem humanen BARD1-Protein auf. Die Klonierung der vollständigen cDNA des Ratten-BARD1 wurde ausgeführt, indem die PROB-cDNA-Bibliothek benutzt wurde, die mit dem SMART-PCR-Kit von Clontech hergestellt worden war. Die internen Primer für RACE PCR wurden nach Herstellerempfehlungen vom klonierten Insert ausgewählt.
Klonierung der humanen BARD1-cDNA
Drei Fragmente der humanen BARD1-cDNA wurden ausgehend von der Gesamt-RNA amplifiziert, die aus Zelllinien der humanen Kolonkarzinoma SW48 extrahiert worden war. Die als A, B und C bezeichneten Fragmente wurden unter Verwendung der folgenden Primer gewonnen: Fragment A, Vorwärtsprimer R135S/Rückwärtsprimer B202N (Thai und Mitautoren, 1998); Fragment B, Vorwärtsprimer B202N (Thai und Mitautoren, 1998)/Rückwärtsprimer 5'-CACCAATGCCTTATGCTGGAGC-3'; Fragment C, Vor wärtsprimer 5'-GAAGTAGTGACTCCTGAGAAGG-3'/Rückwärtsprimer 5'-TCAGCTGTCAAGAGGAAGCAACTC-3'. Jedes Fragment wurde in ein Plasmid von pGEM (Promega) kloniert, dann unter Verwendung von Not1-Pst1/Pst1-Hind III/Hind III-Bst XI herausgeschnitten bzw. gereinigt, dann in Not1/Bst XI-Schnittstellen von pGEM ligiert.
Apoptotische Induktion und Reinigung der apoptotischen Körper
Die Apoptose wurde durch eine Behandlung mit Natriumbutyrat (NaB) induziert. Zellen in unterschiedlichen Stadien von Konfluenz wurden während unterschiedlicher Zeitdauern bei 37°C im Komplettmedium mit 5 mM NaB (Sigma) behandelt. Die apoptotischen Körper wurden wie früher beschrieben (Gautier und Mitautoren, 1999) gereinigt.
Herstellung und Reinigung der F1-Fragmente von Ratten-BARD1
Das Fragment F1 von Ratten-BARD1 wurde aus dem Plasmid λTrip1Ex der cDNA-Bibliothek herausgeschnitten und in-frame in die Schnittstelle Pst1 des Plasmids pQE32 (Qiagen) eingefügt. Das sich ergebende Fusionsprotein, das am N-terminalen Ende des Fragments F1 von BARD1 ein 6 × His-Tag aufweist, wurde in E. coli exprimiert, dann durch Affinitätschromatographie auf einem Ni-NTA-Harz gereinigt, wobei die Empfehlungen der Hersteller für den QIAexpressionist-Kit (Qiagen) beachtet wurden.
Immunisierung von Mäusen und Herstellung eines monoklonalen Antikörpers
BALB/c-Mäuse (Iffa-Credo) erhielten in Abständen von drei Wochen subkutane Injektionen von 100 μg des Fragments F1 von Ratten-BARD1 in 0,1 ml unvollständigen Freundschen Adjuvans (Life Technologies), emulgiert in 0,1 ml sterilen PBS-Puffers mit 0,5% Triton X-100. Die Splenozyten einer Maus wurden in Gegenwart von Polyethylenglykol 1500 (Boehringer Mannheim) mit dem Mäusemyelom SP20 (ECACC) fusioniert. Die Hybridomen wurden in Komplettmedium, das mit 20% fötalem Kalbsserum, Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Sigma) und 1,5 ng/ml rekombinantem IL-6 (RD-Systems) ergänzt war, auf Platten mit 96 Löchern gegeben. Die Überstände der Hybridomen wurden mit ELISA geprüft, indem ein gereinigtes F1-Fragment von BARD1 als Antigen verwendet wurde.
Immunfällung
Die apoptotischen Körper wurden während 30 Minuten auf Eis mit 2% Triton X-100 in PBS extrahiert, die mit einem EDTA-freien Proteaseninhibitorcocktail (Boehringer Mannheim) ergänzt worden war. Der Auszug wurde während 15 Minuten bei 15 000 g zentrifugiert, und der Überstand wurde mit gegen das humane BARD1-Protein gerichteten, 1:1000 verdünnten polyklonalen Kaninchen-Antikörpern (669D) inkubiert (Wu und Mitautoren, 1996, und Jin und Mitautoren, 1997). Nach vierstündiger Inkubation bei konstantem Rühren wurden die Immunkomplexe durch Zusatz von 50 μl Kaninchen-Anti-IgG-Agarose immungefällt. Die an die Agarose gebundenen Immunkomplexe wurden mit PBS mit 1% Triton X-100 gewaschen, das Proteaseinhibitoren enthielt, und von den Agarosekügelchen durch Erhitzen in einem reduzierenden Puffer für eine Elektrophorese und einen Immunblot, wie hierunter beschrieben, extrahiert.
Western Blot
Die Elektrophorese erfolgte unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) (Laemmli und Mitautoren, 1970). Die Proteine wurden auf ein 0,45-μm-PVDF-Filter (Millipore) übertragen und mit primären Antikörpern in Berührung gebracht. An Meerrettich-Peroxidase gekoppelte, 1:15000 verdünnte sekundäre Antikörper (Sigma) wurden verwendet. Die Immunkomplexe wurden durch Chemilumineszenz mit einem Super Signal-Kit (Pierce) visualisiert.
Gekoppelte In-vitro-Transkription und -Translation und Bestimmung der In-vitro-Spaltung des Proteins
Das mit Methionin-³⁵S markierte humane BARD1-Protein wurde unter Verwendung des Kits von Systemen von an TNT gekoppeltem Retikulozytenlysat (Promega) in vitro transkribiert und transduziert. In einem Reaktionsmedium für die Transkription und Translation, das 4 μl von Methionin-³⁵S enthielt (NEN), wurde 1 μg des Plasmids eingesetzt. Für die In-vitro-Spaltung wurden 2 μl der Transkriptions- und Translationsprodukte während der angedeuteten Zeitdauer bei 37°C mit den apoptotischen oder nicht-apoptotischen Zellextrakten inkubiert, die in einem DIV-Puffer (20 mM HEPES pH 7,5, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,1% SB14, 0,5 mM PMSF) hergestellt worden waren. Die Hydrolyseprodukte wurden dann durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch Autoradiographie unter Verwendung des PhosphorImagers 445SI (Molecular Dynamics) nachgewiesen. Die Hemmung der Spaltung wurde durch Zugabe von Caspase-Inhibitoren oder eines Proteasom-Inhibitors (Lactacystin) (Calbiochem) oder des Calpain-Inhibitors I (ALLnL) (Chemicon) ausgewertet.
Synchronisation der Zellzyklen
Die SW48-Zellen wurden in G₀ durch Kontakthemmung in 175-cm²-Flaschen arretiert. Nach dreitägiger Konfluenz wurden die Zellen 1:10 auf 75-cm²-Flaschen mit einer Konzentration von 3 × 10⁶ Zellen pro Flasche aufgeteilt. Die Zellen wurden 12, 20, 28, 36 und 44 Stunden nach der Aussaat während 24 Stunden mit 5 mM NaB behandelt und geerntet. Um die Zellzyklenverteilung zu jedem Zeitpunkt zu bestimmen, wurde der Inhalt jeder Flasche einer Trypsinierung unterworfen, dreimal mit 10 ml eisgekühlter PBS-Lösung gewaschen und während 16 Stunden bei –20°C mit 1 ml tropfenweise zugegebenem, eisgekühltem 70-%igem Ethanol fixiert. Die fixierten Zellen wurden pellettiert, in 500 μl PC-Puffer (96% 0,2 M Na₂HPO₄, 4% 0,1 M Citronensäure, pH 7,8) erneut suspendiert und während 30 Minuten bei Umgebungstemperatur belassen. Danach wurden sie gewaschen und in 500 μl Propidiumiodid in einer Färbelösung (PBS, 0,12% Triton X-100, 0,12 mM EDTA, 100 μg/ml RNase A) erneut suspendiert, während 30 Minuten bei 37°C inkubiert und mit einem Durchfluss-Cytometer FACScan (Beckton Dickinson) analysiert. Für die Bestimmung der In-vitro-Spaltung des Proteins wurden die Zellen abgekratzt und die Zellextrakte wie vorstehend beschrieben hergestellt.
Ergebnisse
Klonierung der für das 67-kD-Protein kodierenden cDNA
Das Immunscreening der λTrip1Ex-cDNA-Bibliothek mit den Seren von Ratten, die mit apoptotischen Körpern und IL-2 auf ein Karzinom behandelt worden waren, führte zur Identifizierung eines positiven Inserts von 456 Basenpaaren des Rattengens BARD1 (Fragment F1). Dieses Fragment erstreckt sich zwischen den Aminosäuren 460 und 611 (1). Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die prozentuale Homologie zwischen den BARD1-Proteinen der Ratte, des Menschen und der Maus.
Prozentuale Homologie zwischen den BARD1-Proteinen der Ratte, des Menschen und der Maus
Das 67-kD-Protein ist ein Fragment von BARD1
Um die Identität des 67-kD-Proteins als eines BARD1-Fragments beweisen zu können, haben die Autoren der Erfindung seine Expression in den Tumorzellen und in den apoptotischen Körpern bestimmt. Dazu haben sie monoklonale Antikörper (Klon 6D10) gegen das Fragment F1 erzeugt. Als er an PROb- und REGb-Rattenkarzinomzellen geprüft wurde, hat dieser monoklonale Antikörper 6D10 ein Protein von 97 kD erkannt, aber ebenfalls eine Bande bei etwa 67 kD in den von diesen Zellen nach einer Behandlung mit Natriumbutyrat abgeleiteten apoptotischen Körpern (2A). Dieses Ergebnis wurde durch den Einsatz eines polyklonalen Antikörpers 669D (Wu und Mitautoren, 1996, und Jin und Mitautoren, 1997) gegen das humane BARD1-Protein bestätigt. Eine Behandlung der humanen Kolonzellen SV48 oder Brustdrüsenzellen MCF7 mit Natriumbutyrat führte nach einem Immunblot mit einem polyklonalen Antikörper 669D zu einem ähnlichen Ergebnis (2B). Schliesslich konnte durch Immunfällung von BARD1 aus von Karzi nomen des Menschen oder der Ratte abgeleiteten apoptotischen Körpern mit dem polyklonalen Antikörper 669D, gefolgt von einem Immunblot mit dem Serum einer geheilten Ratte ein Protein von 67 kD nachgewiesen werden (2D). Die Gesamtheit dieser Ergebnisse beweist die Identität des 67-kD-Proteins als eines Fragments von BARD1.
BARD1 wird während der Apoptose gespalten
Wenn die von humanen MCF7-Karzinomen oder PROb-Rattenkarzinomen stammenden apoptotischen Körper auf einer gleichen Membran hintereinander mit dem polyklonalen humanen Anti-BARD1-Antikörper 669D bzw. dem gegen den N-terminalen Abschnitt des Proteins BARD1 der Maus (Aminosäuren 101 bis 114) gerichteten Antikörper WFS (Irminger-Finger, 1988) inkubiert wurden, beobachteten die Autoren der Erfindung, dass der Antikörper WFS das 67-kD-Molekül nicht erkannte, während der Antikörper 669D das 67-kD-Molekül in jedem der beiden Typen von apoptotischen Körpern erkannte (2C). Dies legt nachdrücklich nahe, dass die Spaltstelle des BARD1 im N-terminalen Abschnitt, aber abwärts von der Ringdomäne (Aminosäuren 40 bis 84, 1) liegt, der für die Wechselwirkung der Proteine BARD1 und BRCA1 wesentlich ist (Wu und Mitautoren, 1996).
Die Spaltung von BARD1 während der Apoptose hängt vom Zellzyklus ab
Die Autoren der Erfindung haben die Wirkung einer NaB-Behandlung auf die Spaltung von BARD1 in adhärenten SW48-Zellen bzw. den aus dem Überstand ausgebrachten apoptotischen Körpern untersucht. 3A zeigt, dass die Lysate der adhärenten Zellen nach vierstündiger Inkubation das radiomarkierte humane BARD1-Protein völlig gespaltet haben, da das humane BARD1 ganzer Länge völlig verschwunden und ein 67-kD-Protein erschienen war. Jedoch hat die Inkubation mit Lysaten der apoptotischen Körper keine Wirkung auf die Hydrolyse von hBARD1. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die in der Spaltung des BARD1 wirksame proteolytische Aktivität vor dem letzten Apoptoseschritt zur Entfaltung kommt, der zur Bildung von apoptotischen Körpern und zur Zellenablösung führt. Die Analyse der zur Hydrolyse des hBARD1 führenden Kinetik mit Lysaten adhärenter SW48-Zellen, die während 48 Stunden mit 5 mM NaB behandelt worden waren, hat gezeigt, dass die Spaltung nach einer Stunde beendet ist (3B). Eine zusätzliche Analyse der kinetischen Induktion dieser Spaltung durch NaB hat gezeigt, dass das p67-Protein nach vierstündiger Behandlung der Zellen mit NaB auftrat und die Spaltung nach 12 Stunden praktisch komplett war. Interessanterweise ist die Hydrolyse des hBARD1 in vom Zellzyklus abhängiger Weise reguliert und erfolgt vorwiegend während der G₀/G₁-Phase. Dies konnte durch den Zusatz von NaB 32 Stunden nach Aussetzen der Zellen gezeigt werden, da sich in diesem Stadium 80% der Zellen in der G₀/G₁-Phase und nur 5% in der G2/M-Phase befanden, was zu einer vollständigen Umwandlung des hBARD1 zu p67 führte.
Beispiel 2
Spaltung durch Calpaine
Material und Verfahren
Bestimmung der Caspaseaktivität
Zur Messung der Caspaseaktivität wurden jeweils 10 μg Zellextrakt in 5 μl DIV-Puffer verdünnt. Das Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-methylcumarin (Ac-DEVD-AMC), das Acetyl-Val-Glu-Ile-Asp-7-amino-4-methylcumarin (Ac-VEID-AMC) und das Acetyl-Ile-Glu-Ile-Asp-7-amino-4-methylcumarin (Ac-IETD-AMC) (Bachem) als Substrate der Caspasen 3, 6 bzw. 8 wurden in einer Endkonzentration von 50 μM zugefügt. Die Spaltungsaktivität wurde mit einem Fluorolite 1000 (Dynatech Laboratories) verfolgt.
Zellfraktion
Die Zellen wurden in Flaschen von 75 cm² kultiviert, trypsiniert und in 100 μl CEB-Puffer (50 mM HEPES pH 7,4, 50 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 10 μM Cytochalasin B) erneut suspendiert. Die erneut suspendierten Zellen wurden während 30 Minuten auf Eis belassen, dann durch 50 Stösse eines eisgekühlten Dounce-Homogenisators homogenisiert. Die Zellkernfraktion wurde durch zehnminütiges Zentrifugieren mit 800 g bei 4°C her gestellt. Das Pellet wurde in einem CEB-Puffer erneut suspendiert und bei –80°C aufbewahrt. Die mitochondrialen und postmitochondrialen Fraktionen wurden durch zehnminütiges Zentrifugieren mit 13 000 g bei 4°C gewonnen. Gleichzeitig wurden das in CEB erneut suspendierte mitochondriale Pellet und die postmitochondriale Fraktion in aliquote Anteile aufgeteilt und bei –80°C aufbewahrt.
Ergebnisse
Um die für die Spaltung von hBARD1 verantwortliche proteolytische Aktivität zu definieren, wurden unterschiedliche Zellextraktpräparate aus mit NaB behandelten SW48-Zellen untersucht. Es erwies sich, dass die Zellkernpräparate ebenso wie die mitochondrialen Präparate in der Lage waren, hBARD1 zu spalten. Der bei 13 000 g gewonnene Überstand des Organellenpräparats hatte keine Wirkung.
Die Kaskade der Effektorproteasen des apoptotischen Prozesses umfasst Cysteinproteasen wie die Caspasen oder Calpaine. Die Autoren der Erfindung haben daher die Aktivitäten der Caspasen während der Behandlung der SW48-Zellen mit NaB bestimmt, indem spezifische Substrate eingesetzt wurden, und gefunden, dass die Aktivitäten der Caspasen 3, 6 und 8 progressiv zunahmen, wobei Caspase 3 nach sechs- und zwölfstündiger NaB-Behandlung am aktivsten war. Der Einsatz von peptidischen Inhibitoren für die Caspasen zeigte, dass das Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluormethylketon (Z-VAD-fmk), ein Caspaseninhibitor, bei hoher Konzentration (100 μM) die Hydrolyse von hBARD1 leicht hemmte. Hingegen hatten die spezifischen Inhibitoren der Caspase 3, das Benzyloxycarbonyl-Asp-Glu-Val-Asp-fluormethylketon (Z-DEVD-fmk) bzw. der Caspase 6, das Benzyloxycarbonyl-Val-Glu-Ile-Asp-fluormethylketon (Z-VEID-fmk) keine Wirkung. Dieses Phänomen wurde durch die Tatsache bestätigt, dass die gereinigte Caspase 3 keine Wirkung auf die Hydrolyse von hBARD1 hatte. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass hBARD1 kein direktes Substrat der Caspasen ist. Darüber hinaus wird die Proteolyse des hBARD1 durch Lactacystin, einen Proteasom-Inhibitor, selbst bei Konzentrationen von 100 μM nicht blockiert, wodurch ausgeschlossen wird, dass das Proteasom in diesen Mechanismus verwickelt sein könnte.
Eine gewisse Anzahl von Proteinen, die während der Apoptose abgebaut werden, sind Targets der Calpaine. Ein möglicher Mechanismus für die Aktivierung der Calpaine beinhaltet die In-vivo-Spaltung eines Calpain-Inhibitors, des Calpastatins (DeMartino und Mitautoren, 1984). Die Ergebnisse der Autoren der Erfindung zeigen erstens, dass das Calpastatin in den SW48-Zellen nach zwölfstündiger Behandlung mit NaB völlig gespalten war, und zweitens, dass der Calpain-Inhibitor I, ALLnL, und EGTA die Hydrolyse von hBARD1 in dosisabhängiger Weise stark hemmen. Die Gesamtheit dieser Ergebnisse legt nachdrücklich nahe, dass das Protein BARD1 durch Calpaine hydrolysiert wird.
Beispiel 3
Reinigung des gespaltenen Proteins BARD1
Herstellung von spezifischen Antikörpern des verkürzten Proteins
Poly- und monoklonale, gegen die an den N- und C-terminalen Enden des verkürzten Proteins befindlichen Peptidsequenzen gerichtete Antikörper werden erzeugt,

– gegen das den Aminosäuren 255 bis 265 des humanen BARD1-Proteins entsprechende Peptid 1;
– gegen das den Aminosäuren 527 bis 540 des humanen BARD1-Proteins entsprechende Peptid 2.

Die Peptide wurden an KLH gekoppelt. Jedes Kaninchen erhielt drei Injektionen von je 200 μg jedes Peptids in Abständen von 15 Tagen. Eine vierte Injektion erfolgte drei Wochen nach der letzten Injektion. Die Erzeugung von Antikörpern wurde mit ELISA am Serum der Kaninchen überprüft, wobei die freien Peptide als Antigen verwendet wurden.
Die erhaltenen Serumgehalte sind hoch (1/16 000). Ausserdem wurde keine Kreuzreaktivität zwischen den Seren der beiden Peptide beobachtet.
Reinigung des gespaltenen Proteins BARD1
Diese Antikörper ermöglichen es den Autoren der Erfindung, das verkürzte Protein durch Affinitätschromatographie zu reinigen, und zwar wie oben beschrieben aus gehend, entweder von apoptotischen Körpern der Tumorzellen oder von der ganzen, in vitro erzeugten und gespaltenen BARD1.
Die Reinigung erfolgt durch die Standardverfahren der Affinitätschromatographie. Die gereinigten Fraktionen werden durch Western Blot mit den erzeugten Antikörpern identifiziert.
Beispiel 4
Impfung von Ratten mit dem verkürzten BARD1-Protein
Material und Verfahren
Zwei Gruppen von BDIX-Ratten erhielten drei wöchentliche intraplantare Injektionen von je 100 μg des F1-Fragments (Aminosäuren 460 bis 611) von BARD1 oder von einem Kontrollprotein (der Fucosyltransferase), das unter den gleichen Bedingungen wie das F1-Fragment gereinigt worden war. Die Proteine wurden in 100 μl des vollständigen Freundschen Adjuvans emulgiert. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung werden die Kolontumorzellen der Ratte (PROb, 50 × 10³ je Ratte) subkutan injiziert, und das Volumen der PROb-Tumoren wird geschätzt.
Ergebnis
Man beobachtet eine Verlangsamung des Tumorwachstums, womit die Schutzwirkung einer Impfung mit einem Fragment des BARD1 demonstriert wird, das aus der 67-kD-Form hervorgeht (4) (jeder Punkt stellt den Mittelwert der an sechs Ratten gemessenen Tumorvolumina und die Standardabweichung dar).
LITERATURVERWEISE

– Benoit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 917–921, 1982.
– Boisteau et al., Apoptosis induced by sodium butyrate treatment increases immunogenicity of a rat colon tumor cell line. Apoptosis, 2: 404–412, 1997.
– Caignard et al., Interaction between two cellular subpopulations of a rat colonic carcinoma when inoculated to syngeneic host. Int. J. Cancer., 36: 273–279, 1985.
– DeMartino, G. N., and Croall, D. E., Purification and characterization of a protein inhibitor of calcium-dependent protease from rat liver. Arch. Biochem. Biophys., 232: 713–720, 1984.
– Gautier et al., Production and characterization of a monclonal antibody specific for apoptotic bodies derived from several tumor cell lines. J. Immunol. Meth., 228: 49 –58, 1999.
– Irminger-Finger et al., In-vitro repression of Brca1-associated RING domain gene, Bard1, induces phenotypic changes in mammary epithelial cells. J. Cell Biol., 143: 1329–1339, 1998.
– Jin et al., Cell cycle-dependent colocalization of BARD1 and BRCA proteins in discrete nuclear domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12075–12080, 1997.
– Köhler and Milstein, Nature, 256. 495–497, 1975; Laemmli et al., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 277: 680–685, 1970.
– Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 277: 680–685, 1970.
– Thai et al., Mutation in the BRCA1-associated RING domain (BARD1) gene in primary breast ovarian and uterine cancers. Human Mol. Gen., 7: 195–202, 1998.
– Wu et al., Identification of a RING protein that can interact in vivo with the BRCA1 gene product. Nature Gen., 14: 430–440 (1996).

SEQUENZENLISTE

Claims

Isoliertes Polypeptid, das ein durch Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (SDS-PAGE) meßbares Molekulargewicht von ungefähr 67 kD besitzt und dessen Sequenz aus 505 bis 525 Aminosäuren ausgehend vom C-terminalen Ende des humanen BARD1 besteht.
Isolierte Nukleinsäure, die aus einer für das Polypeptid des Anspruchs 1 kodierenden Nukleotidsequenz gebildet wird.
Klonierungs- und/oder Expressionsvektor umfassend die Nukleinsäuresequenz des Anspruchs 2.
Isolierte Wirtszelle, die mit einem Vektor gemäß dem Anspruch 3 transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 1, bei dem ein Expressionsvektor gemäß Anspruch 3 in eine Wirtszelle überführt wird, die unter die Expression des Proteins erlaubenden Bedingungen kultiviert wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 2 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger umfaßt.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7 zur Herstellung eines zur Behandlung von Tumoren bestimmten Arzneimittels.
In-vitro-Verfahren zum Überwachen der Wirksamkeit einer Antikrebsbehandlung bei einem mit proapoptotischen Wirkstoffen behandelten Patienten, bei dem in einer biologischen Probe gegen das wie Anspruch 1 definierte Polypeptid gerichtete Antikörper oder das Polypeptid selbst nachgewiesen werden.