JP2001231566A - 細胞死抑制タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 カスパーゼ-12の活性化を抑制するタンパク
質及びその用途の提供。 【解決手段】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (a) 特定のアミノ酸配列からなるタンパク質。 (b) 上記特定のアミノ酸配列において１若しくは数個の
アミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列
からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑制するタン
パク質。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、カスパーゼ12又は
その前駆体と結合することによりカスパーゼ-12の活性
化を抑制するタンパク質、及び該タンパク質を含有する
細胞死阻害剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】カスパーゼは多細胞生物のアポトーシス
において中心的役割を果たす蛋白質分解酵素である。ヒ
ト及びマウスから現在までに計14種類のカスパーゼが見
出されている（Thornberry, N. A. & Lazebnik, Y. Cas
pases, enemies within. Science 281, 1312-1316 (199
8)）。カスパーゼの機能は、その特異的な蛋白質分解活
性によって特定の蛋白質群を切断することで果たされ
る。複数種類のカスパーゼが存在する理由の一つは、様
々なアポトーシス刺激に対応して異なるセットのカスパ
ーゼが働くためであると考えられている。

【０００３】カスパーゼは発生過程の形作り、成体にお
ける恒常性の維持、体にとって有害な細胞の排除といっ
た正常な機能を担う一方、万一、異常な活性化を起こし
た場合は神経変性疾患などの重篤な病気を引き起こすこ
とが明らかになりつつある（Yuan, J. & Yankner, B.
A., Nat. Cell Biol. 1, E44-45 (1999)）。

【０００４】カスパーゼは不活性な前駆体として生合成
され、分子内の特異的切断（プロセシング）によって活
性化する。従って、プロセシングを抑制すればカスパー
ゼによるアポトーシスを抑制できる可能性がある。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、カスパーゼ
12の活性化を抑制するタンパク質、及び該タンパク質を
含有する細胞死阻害剤を提供することを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決するため鋭意研究を行った結果、癌特異的タンパク
質であるMAGE-3又はその一部切断型がカスパーゼ-12又
はその前駆体と特異的に結合することを見出し、本発明
を完成するに至った。

【０００７】すなわち、本発明は、以下の(a)又は(b)の
組換えタンパク質、又は該タンパク質をコードする遺伝
子である。 (a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
ク質 (b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
制するタンパク質 上記遺伝子としては、以下の(c)又は(d)のDNAからなる
遺伝子が挙げられる。

【０００８】(c) 配列番号３で表される塩基配列からな
るDNA (d) 配列番号３で表される塩基配列からなるDNAとスト
リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカスパ
ーゼ-12の活性化を抑制するタンパク質をコードするDNA さらに、本発明は、前記遺伝子を含有する組換えベクタ
ーである。さらに、本発明は、前記組換えベクターを含
む形質転換体である。さらに、本発明は、前記形質転換
体を培養し、得られる培養物からカスパーゼ-12の活性
化を抑制するタンパク質を採取することを特徴とする該
タンパク質の製造方法である。

【０００９】さらに、本発明は、MAGE-3タンパク質及び
/又はその一部切断型とカスパーゼ-12又はその前駆体と
が結合してなる複合体である。さらに、本発明は、MAGE
-3タンパク質及び/又はその一部切断型を有効成分とし
て含有する細胞死阻害剤である。MAGE-3タンパク質とし
ては、以下の(e)又は(f)の組換えタンパク質が挙げら
れ、一部切断型としては、前記(a)又は(b)の組換えタン
パク質が挙げられる。

【００１０】(e) 配列番号２で表されるアミノ酸配列か
らなるタンパク質 (f) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
制するタンパク質 ここで、細胞死には、アポトーシス、ネクローシス、壊
死、予定細胞死、プログラム細胞死、及び細胞傷害から
なる群から選択される少なくとも1種が含まれる。

【００１１】さらに、本発明は、MAGE-3タンパク質及び
/又はその一部切断型を有効成分として含有する細胞死
疾患の治療剤である。ここで、細胞死関連疾患として
は、アポトーシス、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋
萎縮症、及び臓器障害からなる群から選択される少なく
とも1種が挙げられる。

【００１２】さらに、本発明は、MAGE-3タンパク質又は
その一部切断型とカスパーゼ-12又はその前駆体とを結
合させることを特徴とするカスパーゼ-12の活性化抑制
方法である。以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】

【発明の実施の形態】本発明は、癌特異的タンパク質で
あるメラノーマ関連抗原3（melanoma associated antig
en 3、MAGE-3という）及びその一部切断型並びにその用
途に関するものであり、上記タンパク質がカスパーゼ-1
2のプロセシングを抑制する機能を有することに基づい
て完成されたものである。

【００１４】カスパーゼ-12前駆体は、細胞内の小胞体
に局在し、小胞体特異的なストレスによって自己プロセ
シングが引き起こされ、活性化カスパーゼ-12に成熟す
る（Nakagawa, T. et al. Nature 403, 98-103 (200
0)）。小胞体ストレスは、ヒトの神経変性疾患アルツハ
イマー病の病因の一つであることが示唆されている。従
って、前駆体カスパーゼ-12から成熟型カスパーゼ-12へ
の活性化の抑制、あるいは成熟型カスパーゼ自体の活性
を抑制することにより、アルツハイマー病をはじめとす
る小胞体ストレス関連の疾患の予防、治療に使用するこ
とができる。また、MAGE-3タンパク質によるカスパーゼ
活性化の抑制はカスパーゼ-12に特異的であるため、こ
れを応用した阻害剤は特異性が高く、他のカスパーゼの
正常機能には悪影響を及ぼさないと期待される。

【００１５】ここで、「カスパーゼ-12の活性化を抑制
する」とは、カスパーゼ-12の前駆体に特異的に結合し
て前駆体から成熟型へのプロセシングを抑えること、あ
るいは、カスパーゼ-12の成熟体に特異的に結合して成
熟型（活性型）カスパーゼ自体の機能を抑えることを意
味する。その結果、成熟型カスパーゼ-12が引き起こす
細胞死を阻害することが可能となる。但し、本発明にお
いては、MAGE-3又はその一部切断型MAGE-3をカスパーゼ
-12の前駆体に結合させることが好ましい。

【００１６】本発明においては、MAGE-3（Gaugler, B.
et al. J. Exp. Med. 179, 921-930 (1994)）タンパク
質又はその一部切断型のタンパク質を用いてカスパーゼ
-12の活性化を抑制することができる。なお、本発明に
おいて、MAGE-3タンパク質は「MAGE-3」と表示し、MAGE
-3タンパク質をコードする遺伝子は「MAGE-3遺伝子」と
表示する。上記MAGE-3及びその切断型は、カスパーゼ-1
2に特異的であり、他のカスパーゼには結合活性を示さ
ないものである。

【００１７】本発明において、MAGE-3遺伝子は、通常の
遺伝子工学的手法を用いて単離される。そして、得られ
る遺伝子をベクターに導入して組換えベクターを作製
し、さらに組換えベクターを適当な宿主に導入して形質
転換体を得る。組換えベクターを宿主内で機能し得るよ
うに発現ベクターとして構築すると、形質転換体を培養
することによりMAGE-3を単離精製することができる。

【００１８】１．MAGE-3又はその一部切断型をコードす
る遺伝子のクローニング 本発明のMAGE-3を得るため、まず、MAGE-3をコードする
遺伝子をクローニングする。MAGE-3遺伝子の塩基配列は
既に公知であるが（Gaugler, B. et al., J. Exp. Med.
179, 921-930 (1994)）、以下の通り遺伝子工学的手法
により調製することもできる。

【００１９】(1) MAGE-3遺伝子 cDNAライブラリーの作
製及びスクリーニング MAGE-3遺伝子のmRNAの調製は、通常行われる手法により
行うことができる。例えば、精巣、腫瘍などの組織又は
細胞を、グアニジン試薬、フェノール試薬等で処理して
全RNAを得た後、オリゴdT-セルロースやセファロース2B
を担体とするポリU-セファロース等を用いたアフィニテ
ィーカラム法により、あるいはバッチ法により、ポリ(A
+)RNA(mRNA)を得る。得られたmRNAを鋳型として、オリ
ゴdTプライマー及び逆転写酵素を用いて一本鎖cDNAを合
成した後、該一本鎖cDNAから二本鎖cDNAを合成する。こ
のようにして得られた二本鎖cDNAを適当なクローニング
ベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。得ら
れる組換えベクターを用いて大腸菌等を形質転換し、テ
トラサイクリン耐性、アンピシリン耐性を指標として形
質転換体を選択することにより、cDNAのライブラリーを
得ることができる。

【００２０】なお、本発明では市販のcDNAライブラリー
（例えばヒト精巣cDNAライブラリー（Clonetech社））
を用いることもできる。上記のようにして得られる形質
転換体から目的のDNAを有する株を選択するスクリーニ
ング方法としては、例えば、抗体を用いたイムノスクリ
ーニングによる方法、あるいは既知の配列からプライマ
ーを合成し、これを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
を行う方法が挙げられる。

【００２１】(2) 一部切断型MAGE-3遺伝子の調製 本発明においては、MAGE-3の一部切断型をコードする遺
伝子（「切断型MAGE-3遺伝子」という）の設計及び合成
を行うことができる。一部切断型とは、MAGE-3の全長ア
ミノ酸配列（配列番号２）のN-末端若しくはC-末端のい
ずれかまたは両側から最大で合計312個のアミノ酸が欠
失した末端切断型のもの、すなわち、配列番号２に示す
アミノ酸配列のうち、欠失後のアミノ酸が少なくとも５
個、好ましくは10個以上残存しているものを意味する。
例えば、配列番号2に示すアミノ酸配列において、第1番
目〜81番目（Ser）の欠失体、第1番目〜88番目（Ser）
の欠失体、第1番目〜90番目（Gln）の欠失体、第1番目
〜93番目（Glu）の欠失体などが、本発明の一部切断型
として挙げられる。

【００２２】本発明の一部切断型のMAGE-3タンパク質
（切断型MAGE-3という）のうち１〜93番目のアミノ酸を
欠失させたものは、配列番号４で表される。該アミノ酸
配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列の第94番目
から第314番目のアミノ酸に対応するものである。

【００２３】これらの断片は、該断片をコードする領域
の外側の領域であって配列番号１で表される塩基配列の
任意の領域の配列に基づいてプライマーを設計し、MAGE
-3遺伝子（配列番号１；Gaugler, B. et al., J. Exp.
Med. 179, 921-930 (1994)）を鋳型としてPCRを行うこ
とにより得ることができる。ただし、切断型MAGE-3を合
成するためにはコード領域の５'末端に翻訳開始コドン
を含む塩基配列を付加することが望ましい。

【００２４】(3) MAGE-3遺伝子の変異体又は切断型MAGE
-3遺伝子の変異体の作製 本発明においては、MAGE-3又は切断型MAGE-3のアミノ酸
配列の一部に変異を導入することもできる。従って、こ
れらのタンパク質の変異型も本発明のMAGE-3又は切断型
MAGE-3に含まれる。アミノ酸に変異を導入するには、該
アミノ酸をコードする遺伝子の塩基配列に変異を導入す
る手法が採用される。

【００２５】遺伝子に変異を導入するには、Kunkel法若
しくはGapped duplex法等の公知手法又はこれに準ずる
方法により行うことができる。例えば、変異オリゴヌク
レオチドをプライマーとして用いた部位特異的突然変異
誘発法(Yoshikawa, F. et al., J. Biol. Chem. 271: 1
8277-18284, 1996)に基づいて変異を導入するが、変異
導入用キット（例えばMutant-K(TAKARA社製）、Mutant-
G(TAKARA社製）、TAKARA社のLA PCR in vitro Mutagene
sis シリーズキットなど）を用いて変異を導入すること
もできる。

【００２６】例えば、MAGE-3遺伝子又は切断型MAGE-3遺
伝子の塩基配列のうち、変異させた塩基及びその変異部
位の前後10塩基程度の領域を含むプライマーを合成す
る。そして、MAGE-3遺伝子を鋳型とし、上記プライマー
を用いてPCR反応を行う。この産物を精製後、適当な制
限酵素で処理することにより、目的の変異型MAGE-3遺伝
子又はその切断型遺伝子を得ることができる。

【００２７】(4) 塩基配列の決定 上記の通り得られた遺伝子について塩基配列の決定を行
う。塩基配列の決定はマキサム-ギルバートの化学修飾
法、又はM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド
鎖終結法等の公知手法により行うことができるが、通常
は自動塩基配列決定機（例えばPERKIN-ELMER社製373A D
NAシークエンサー等）を用いて配列決定が行われる。

【００２８】配列番号１にMAGE-3遺伝子の塩基配列を、
配列番号2にMAGE-3のアミノ酸配列を示し、配列番号３
に切断型MAGE-3遺伝子の塩基配列を、配列番号4に切断
型MAGE-3のアミノ酸配列を例示するが、これらのアミノ
酸配列からなるポリペプチドがカスパーゼ-12又はその
前駆体に対し特異的結合活性を有する限り、すなわちカ
スパーゼ-12の活性化を抑制することができる限り、当
該アミノ酸配列において1又は複数個、例えば1又は数
個、好ましくは１〜10個程度、さらに好ましくは１〜５
個のアミノ酸に欠失、置換、付加等の変異が生じてもよ
い。

【００２９】また、本発明の切断型MAGE-3（配列番号
４）に含まれるアミノ酸をコードする遺伝子（配列番号
３）のほか、縮重コドンにおいてのみ異なる同一のポリ
ペプチドをコードする縮重異性体も本発明の遺伝子に含
まれる。さらに、上記切断型MAGE-3遺伝子（配列番号
３）の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリ
ダイズし、かつカスパーゼ-12の活性化を抑制するタン
パク質をコードするDNAも本発明の遺伝子に含まれる。
ストリンジェントな条件とは、いわゆる特異的なハイブ
リッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成され
ない条件をいう。例えば、相同性が高い核酸同士、すな
わち60％以上、好ましくは80％以上の相同性を有するDN
A同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い場合
はハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的
には、ナトリウム濃度が15〜900mM、好ましくは15〜150
mMであり、温度が37〜70℃、好ましくは68℃での条件を
いう。

【００３０】一旦本発明の切断型MAGE-3遺伝子の塩基配
列が決定されると、その後は、化学合成によって、又は
決定された当該塩基配列から合成したプライマーを用い
たPCRによって、本発明の遺伝子を得ることができる。

【００３１】３．本発明の遺伝子を含む組換えベクター
及び形質転換体の作製 (1) 組換えベクターの作製 本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明の
切断型MAGE-3遺伝子を連結(挿入)することにより得るこ
とができる。本発明の遺伝子を挿入するためのベクター
は、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、
例えば、プラスミド DNA、ファージ DNA等が挙げられ
る。

【００３２】プラスミド DNAとしては、市販のもの、例
えばpBluescript SK+(Stratagene社)を用いることがで
きるが、これに限定されるものではなく、その他大腸菌
由来のプラスミドとして例えばpBR322、 pBR325、 pUC1
18、 pUC119等、枯草菌由来のプラスミドとして例えばp
UB110、 pTP5等、酵母由来のプラスミドとして例えばYE
p13、 YEp24、 YCp50等を使用することもできる。ま
た、ファージDNAとしてλファージ（Charon4A、Charon2
1A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）など
を、動物ウイルスとしてレトロウイルス、アデノウイル
ス又はワクシニアウイルスなどを、あるいは昆虫ウイル
スベクターとしてバキュロウイルスなどを用いることも
できる。さらに、遺伝子発現活性化タンパク質であるB4
2などが連結された融合プラスミド（例えばpNB321な
ど）を用いることもできる。但し、本発明では、上記融
合プラスミドに限定されるものではなく、GST、GFP、Hi
s-tag、Myc-tagなどが連結された融合プラスミドを用い
てもよい。

【００３３】ベクターに本発明の遺伝子を挿入するに
は、まず、精製されたDNAを適当な制限酵素で切断し、
適当なベクター DNAの制限酵素部位又はマルチクローニ
ングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採
用される。本発明の遺伝子は、その遺伝子の機能が発揮
されるようにベクターに組み込まれることが必要であ
る。そこで、本発明のベクターには、プロモーター、本
発明の遺伝子のほか、所望によりエンハンサーなどのシ
スエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シ
グナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）
などを含有するものを連結することができる。なお、選
択マーカーとしては、例えばクロラムフェニコール耐性
遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵
素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。

【００３４】(2) 形質転換体の作製 本発明の形質転換体は、本発明の組換えベクターを、目
的遺伝子が発現し得るように宿主中に導入することによ
り得ることができる。ここで、宿主としては、本発明の
遺伝子を発現できるものであれば特に限定されるもので
はない。例えば、エッシェリヒア・コリ(Escherichia c
oli）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス(Ba
cillus subtilis)等のバチルス属、シュードモナス・プ
チダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属す
る細菌が挙げられ、サッカロミセス・セレビシエ(Sacch
aromyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(S
chizosaccharomyces pombe)等の酵母が挙げられ、その
他動物細胞又は昆虫細胞が挙げられる。

【００３５】大腸菌等の細菌を宿主とする場合は、本発
明の組換えベクターが該細菌中で自律複製可能であると
同時に、プロモーター、リボゾーム結合配列、本発明の
遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ま
しい。また、プロモーターを制御する遺伝子が含まれて
いてもよい。大腸菌としては、例えばエッシェリヒア・
コリ(Escherichia coli)BL21（DE3）、JM109、HB101な
どが挙げられ、枯草菌としては、例えばバチルス・ズブ
チリス(Bacillus subtilis)WB700、LKS87などが挙げら
れる。

【００３６】プロモーターは、大腸菌等の宿主中で発現
できるものであればいずれを用いてもよい。例えばtrp
プロモーター、lacプロモーター、P_Lプロモーター、P_R
プロモーターなどの、大腸菌感染性ファージに由来する
T7プロモーターなどが用いられる。tacプロモーターな
どのように、人為的に設計改変されたプロモーターを用
いてもよい。

【００３７】細菌への組換えベクターの導入方法は、細
菌にDNAを導入する方法であれば特に限定されるもので
はない。例えばカルシウムイオンを用いる方法(Cohen,
S.N.et al.：Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69：2110-
2114 (1972))、エレクトロポレーション法等が挙げられ
る。

【００３８】酵母を宿主とする場合は、例えばサッカロ
ミセス・セレビシエ(Saccharomycescerevisiae)、シゾ
サッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e)、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などが用
いられる。この場合、プロモーターとしては酵母中で発
現できるものであれば特に限定されず、例えばgal1プロ
モーター、gal10プロモーター、ヒートショックタンパ
ク質プロモーター、MFα1プロモーター、PHO5プロモー
ター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモ
ーター、AOX1プロモーター等が挙げられる。酵母への組
換えベクターの導入方法としては、酵母にDNAを導入す
る方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレ
ーション法(Becker, D.M. et al., Methods. Enzymol.
194,182-187(1990))、スフェロプラスト法(Hinnen, A.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75,1929-1933
(1978))、酢酸リチウム法(Itoh, H. J. Bacteriol., 15
3,163-168 (1983))等が挙げられる。

【００３９】動物細胞を宿主とする場合は、サル細胞CO
S-7、Vero、チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細
胞）、マウスL細胞、ラットGH3、PC12若しくはNG108-15
細胞、又はヒトFL、HEK293、HeLa若しくはJurkat細胞な
どが用いられる。プロモーターとしてSRαプロモータ
ー、SV40プロモーター、LTRプロモーター、β-アクチン
プロモーター等が用いられ、また、ヒトサイトメガロウ
イルスの初期遺伝子プロモーター等を用いてもよい。動
物細胞への組換えベクターの導入方法としては、例えば
エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポ
フェクション法等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とする
場合は、Sf9細胞、Sf21細胞などが用いられる。昆虫細
胞への組換えベクターの導入方法としては、例えばリン
酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレ
ーション法などが用いられる。

【００４０】４．切断型MAGE-3の生産 本発明の切断型MAGE-3は、前記形質転換体を培養し、そ
の培養物から採取することにより得ることができる。
「培養物」とは、培養上清、培養細胞若しくは培養菌体
又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するも
のである。本発明の形質転換体を培養する方法は、宿主
の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。

【００４１】大腸菌や酵母菌等の微生物を宿主として得
られた形質転換体を培養する培地は、微生物が資化し得
る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の
培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培
地、合成培地のいずれを用いてもよい。

【００４２】炭素源としては、グルコース、フラクトー
ス、スクロース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピ
オン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアル
コール類が挙げられる。窒素源としては、アンモニア、
塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のア
ンモニウム塩又はその他の含窒素化合物のほか、ペプト
ン、肉エキス、コーンスティープリカー等が挙げられ
る。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二
カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩
化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭
酸カルシウム等が挙げられる。

【００４３】培養は、通常、振盪培養又は通気攪拌培養
などの好気的条件下、37℃で６〜24時間行う。培養期間
中、pHは6.5〜7.5に保持する。pHの調整は、無機又は有
機酸、アルカリ溶液等を用いて行う。培養中は必要に応
じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培
地に添加してもよい。

【００４４】プロモーターとして誘導性のプロモーター
を用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する
場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加して
もよい。例えば、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド
(IPTG)で誘導可能なプロモーターを有する発現ベクター
で形質転換した微生物を培養するときには IPTG等を培
地に添加することができる。また、インドール酢酸(IA
A)で誘導可能なtrpプロモーターを用いた発現ベクター
で形質転換した微生物を培養するときにはIAA等を培地
に添加することができる。

【００４５】動物細胞を宿主として得られた形質転換体
を培養する培地としては、一般に使用されているRPMI16
40培地、DMEM培地又はこれらの培地に牛胎児血清等を添
加した培地等が挙げられる。培養は、通常、５％CO₂存
在下、37℃で１〜30日行う。培養中は必要に応じてカナ
マイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加しても
よい。

【００４６】培養後、本発明の切断型MAGE-3が菌体内又
は細胞内に生産される場合には、超音波処理、凍結融解
の繰り返し、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は
細胞を破砕することにより上記タンパク質を採取する。
また、本発明の切断型MAGE-3が菌体外又は細胞外に生産
される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分
離等により菌体又は細胞を除去する。その後、タンパク
質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方法、例え
ば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いること
により、前記培養物中から本発明のタンパク質を単離精
製することができる。

【００４７】５．細胞死阻害剤 MAGE-3及び切断型MAGE-3は、カスパーゼ-12又はその前
駆体と特異的に反応して前駆体から成熟体へのプロセシ
ングを阻害する。従って、MAGE-3又はその切断型は、細
胞死の阻害剤として、また細胞死に伴う疾患（細胞死関
連疾患）の治療又は予防のために使用することができ
る。さらに、MAGE-3遺伝子及び切断型MAGE-3遺伝子は、
細胞死関連疾患の遺伝子治療剤として有用である。また
MAGE-3の細胞内含量を定量することにより、細胞、組織
の抗アポトーシス能を検査することができる。

【００４８】上記細胞死関連疾患としては、アルツハイ
マー病、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、及
び臓器障害等が挙げられ、これらの疾患が単独で発症し
たものでも、複数種類が合併したものでも本発明の治療
剤の適用対象となり得る。なお、合併症には上記疾患と
他の疾患とが合併したものも含まれる。本発明の治療剤
又は遺伝子治療剤は、経口又は非経口的に全身又は局所
投与することができる。

【００４９】本発明のタンパク質又は遺伝子を細胞死関
連疾患の予防剤又は治療剤（遺伝子治療剤を含む）とし
て使用する場合は、使用する対象を特に限定するもので
はない。例えば、神経系（脳、脊髄等）、血管系（動
脈、静脈、心臓等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器
系（唾液腺、胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リン
パ節、脾臓、胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系
（精巣、卵巣、子宮等）などの組織に生じる疾患につい
て治療又は予防を特異目的として用いることができる。
これらの疾患は、単独であっても、併発したものであっ
ても、上記以外の他の疾病を併発したものであってもよ
く、いずれも本発明のタンパク質又は遺伝子の使用の対
象とすることができる。

【００５０】本発明の治療剤を経口投与する場合は、錠
剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、トローチ剤、内
用水剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤等のいずれのもので
あってもよく、使用する際に再溶解させる乾燥生成物に
してもよい。また、本発明の治療剤を非経口投与する場
合は、静脈内注射（点滴を含む）、筋肉内注射、腹腔内
注射、皮下注射、坐剤などの製剤形態を選択することが
でき、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投
与量容器の状態で提供される。

【００５１】これらの各種製剤は、製剤上通常用いられ
る賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、
界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防
腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤、等張化剤等な
どを適宜選択し、常法により製造することができる。

【００５２】上記各種製剤は、医薬的に許容される担体
又は添加物を共に含むものであってもよい。このような
担体及び添加物の例として、水、医薬的に許容される有
機溶剤、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニ
ルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸
ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルス
ターチナトリウム、ペクチン、キサンタンガム、アラビ
アゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、グリセリン、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリ
ン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン
酸、ヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトー
ル、ラクトースなどが挙げられる。使用される添加物
は、本発明の剤型に応じて上記の中から適宜又は組み合
わせて選択される。

【００５３】本発明の治療剤の投与量は、投与対象の年
齢、投与経路、投与回数により異なり、広範囲に変える
ことができる。この場合、本発明のタンパク質の有効量
と適切な希釈剤及び薬理学的に使用し得る担体との組合
せとして投与される有効量は、一回につき体重1kgあた
り0.0001〜1000mg/bodyの範囲の投与量を選ぶことがで
き、１日１回から数回に分けて１日以上投与される。

【００５４】本発明の遺伝子を遺伝子治療剤として使用
する場合は、本発明の遺伝子を注射により直接投与する
方法のほか、該遺伝子が組込まれたベクターを投与する
方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイ
ルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペス
ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レト
ロウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベ
クターを用いることにより効率よく投与することができ
る。また、本発明の遺伝子をリポソームなどのリン脂質
小胞に導入し、そのリポソームを投与する方法を採用し
てもよい。すなわち、リポソームは、生物的に分解可能
な素材を含む閉鎖小胞であるため、リポソームと本発明
の遺伝子とを混合することにより、リポソーム内部の水
層や脂質二分子層に本発明の遺伝子を保持させる（リポ
ソーム-遺伝子複合体）。次に、該複合体を細胞ととも
に培養すると複合体中の遺伝子が細胞内に取り込まれる
（リポフェクション法）。そして、得られる細胞を以下
の投与方法で投与すればよい。

【００５５】本発明の遺伝子治療剤の投与形態として
は、通常の静脈内、動脈内等の全身投与のほか、中枢神
経系組織（脳、脊髄等）、血管系（動脈、静脈、心臓
等）、呼吸器系（気管、肺等）、消化器系（唾液腺、
胃、腸、肝臓、膵臓等）、リンパ系（リンパ節、脾臓、
胸腺等）、泌尿器系（腎臓等）、生殖系（精巣、卵巣、
子宮等）などに局所投与を行うことができる。さらに、
カテーテル技術、外科的手術等と組み合わせた投与形態
をを採用することもできる。本発明の遺伝子治療剤の投
与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型
によって異なるが、通常は、本発明の遺伝子の重量にす
ると成人1日あたり0.01〜100mg/bodyの範囲が適当であ
る。

【００５６】６．抗アポトーシス活性の検出 本発明は細胞、組織の抗アポトーシス活性を検出するこ
とにも応用できる。すなわち、MAGE-3の定量によりMAGE
-3を高発現していることが示された細胞又は組織は、抗
アポトーシス活性を獲得していると判断される。例えば
MAGE-3を特異的に認識する抗体（ポリクローナル、モノ
クローナル）を作用させることによりMAGE-3の検出、定
量が可能である。細胞、組織から調製した抽出液をニト
ロセルロース膜などにスポットしてドットブロットを作
製するか、あるいは抽出液を電気泳動した後にニトロセ
ルロース膜などに転写してウエスタンブロットを作った
後、抗MAGE-3抗体及び2次抗体を順次作用させてMAGE-3
を検出できる。あるいは抽出液を用いてELISA（Enzyme-
linked immunosorbent assay）法などにより溶液のまま
MAGE-3を定量することもできる。また、細胞、組織を直
接、 抗MAGE-3抗体で免疫染色することにより、抗アポ
トーシス活性を獲得した細胞、組織の検出に用いること
が可能である。

【００５７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範
囲が限定されるものではない。なお、本実施例において
は、核酸関連試薬及び酵素は、Takara Biomedicals社
（日本）またはNew EnglandBiolabs 社（アメリカ）よ
り購入した。大腸菌用の培地基材はDifco社（アメリ
カ）より購入した。哺乳類細胞用の培地基材はGibco-BR
L社（アメリカ）より購入した。その他、一般試薬は、
断りが無い限りSigma-Aldrich社（アメリカ）製を使用
した。

【００５８】〔実施例1〕 MAGE-3遺伝子のクローニング ヒト精巣のcDNAライブラリー（Clonetech社、アメリ
カ）を鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行
い、大量発現実験に用いるためのMAGE-3蛋白質コード領
域を得た。概要は以下の通りである。なお、一般的なDN
A、RNAの取り扱いについてはSambrook らの方法（Sambr
ook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T.Molecular c
loning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring H
arbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yo
rk, USA (1989)）に記述された方法に従った（以下、同
様）。

【００５９】MAGE-3はメラノーマ（黒色腫細胞）をはじ
めとする多くの癌細胞で高発現が観察されているが正常
な組織については精巣以外でのみ発現が検出される（Va
n Pel, A. et al. Immunol Rev 145, 229-250 (199
5)）。PCRに用いたプライマーNTOP77、 NBOT68、NTOP7
9、NBOT65の配列は下記の通りである。後のクローニン
グを容易にするため、5'側のプライマー(NTOP79)には制
限酵素EcoRV, 3'側のプライマー(NBOT65)には制限酵素X
hoIで切断可能な配列（それぞれGATATCとCTCGAG）を含
ませてある。

【００６０】 NTOP77: GCCCAGCTCCTGCCCACACT（配列番号５） NBOT68: GGATGCGGCCCCGGAAGGT（配列番号６） NTOP79: CTCGATATCGCACCATGCCTCTTGAGCAGAGG（配列番号
７） NBOT65: CTCCTCGAGTCACTCTTCCCCCTCTCT（配列番号８）

【００６１】PCRのためのDNAポリメラーゼ及び反応用緩
衝液一式（Expanded High FidelityPCR systemはBoehri
nger Mannheim社（ドイツ）より購入した。PCRの反応条
件は以下のように設定した。精巣cDNA１ngを鋳型とし、
NTOP77及び NBOT68を用いて第一段目のPCRを行った。第
一段目の反応は、変性（94℃,１分）、プライマーのア
ニーリング（59℃, １分）及びDNA伸長(72℃,１分)の工
程を１サイクルとしてこれを40サイクル行った。これに
よって得られたPCR産物の1000分の１量を２回目のPCRに
供した。第二段目の反応は、NTOP79及び NBOT65をプラ
イマーとして用い、変性（94℃,１分）、プライマーの
アニーリング（50℃, １分）及びDNA伸長(72℃,１分)の
工程を35回繰り返した。

【００６２】これらのPCRによって特異的に増幅された
約900塩基対のDNA断片は制限酵素EcoRV及びXhoI（共にT
akara Biochemcals社製）で末端を切断した後、アガロ
ースゲル電気泳動とそれに続くDNA抽出（アメリカ・Bio
101社製、Genecleanキットを使用した）によって精製し
た。精製したDNA断片は汎用ベクターpBluescript SK(-)
のEcoRV, XhoI部位に挿入・連結し、プラスミドpNB178
を得た。

【００６３】〔実施例2〕 MAGE-3の大量生産 大腸菌を用いてMAGE-3の大量生産を行った。まず、pNB1
78にクローン化されているMAGE-3遺伝子をPCRによって
増幅した。なお、5'側プライマーにはNheIで切断可能な
配列を、 3'側プライマーにはXhoIで切断可能な配列を
付加した。反応サイクルは変性（94℃,１分）、プライ
マーのアニーリング（51℃, １分）及びDNA伸長(72℃,2
分)の工程を１サイクルとしてこれを25サイクル行っ
た。

【００６４】PCRで増幅されたDNAを実施例１に記載の方
法と同様にして精製した後、大腸菌用発現プラスミドベ
クターpRSET-A（Invitrogen社、アメリカ）のNheI, Xho
I部位に挿入、連結し、プラスミドpNB202を得た。な
お、pRSET-Aベクターを用いるとクローン化された遺伝
子の5'端にHis-His-His-His-His-His配列を含むタグ配
列（Met-Arg-Gly-Ser-His-His-His-His-His-His-Gly-Me
t-Ala-Ser：配列番号9）が付加されるため、ニッケルイ
オンを有するアフィニティ樹脂（例えばProbond、Invit
rogen社）を用いた蛋白質のアフィニティ精製が可能と
なる。

【００６５】pNB202を用いて大腸菌BL21(DE3) pLysS株
を形質転換した。形質転換体はアンピシリン（100 mg/m
l）及びクロラムフェニコール(34 mg/ml) を含むLB培地
（Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. Mol
ecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbo
r, New York, USA (1989)）で培養した。対数増殖期に
ある形質転換体を含む培地に0.2 mM isopropyl-beta-D-
thiogalactoside (IPTG)を入れてMAGE-3遺伝子の発現を
誘導した。強制発現により生産されたMAGE-3タンパク質
はNovagen社（アメリカ）の方法に基づき、Probondアフ
ィニティ樹脂（Invitrogen）を用いて精製した。その結
果、１リットルの培養液から約100 マイクログラムの精
製MAGE-3を得た。精製されたMAGE-3の純度が高いことは
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した
（図１）。

【００６６】〔実施例3〕 MAGE-3とカスパーゼ-12前駆
体との結合実験 COS-1細胞中でカスパーゼ-12前駆体とMAGE-3蛋白質を強
制的に発現させた後、その細胞抽出液中での両者の結合
を免疫沈降法により検討した。免疫沈降物の検出に使用
するための抗MAGE-3抗体は、ウサギを免疫して作製し
た。MAGE-3のC-末端配列に相当するペプチド（CHISYPPL
HEWVLREGEE（配列番号10）、Tana Laboratories、アメ
リカ）をキャリアー蛋白質（活性化ヘモシアニン、Pier
ce社、アメリカ）に結合させた後、アジュバントととも
にウサギに注射した。なお、ペプチド・アミノ末端側の
「C」はキャリアー蛋白質及びアフィニティ樹脂との結
合のため人為的に付加してある。一方、同じ配列のペプ
チドを活性化FMPセルロファィン樹脂（生化学工業、日
本）にカップリングさせてペプチドカラムを作製し、後
のアフィニティ精製に用いた。免疫したウサギから得ら
れた抗血清をペプチドカラムにアプライし、特異的抗体
をペプチドに結合させた。特異的抗体はpH2.6のグリシ
ン溶液によってカラムから溶出させた。溶出液のpHは1M
Trisの添加によって中性まで上げ、中に含まれる特異
的抗体を後の実験に用いた。

【００６７】カスパーゼ-12 cDNA及びMAGE-3 cDNAのそ
れぞれを哺乳類細胞用発現プラスミド、pcDNA3.1(-) (I
nvitorogen社、アメリカ)にクローン化し、COS-1細胞へ
一過性のトランスフェクションにより導入した。カスパ
ーゼ-12についてはそのアミノ末端にFLAG配列（Hopp,
T. P. et al. Bio/Technol 6, 1204-1210 (1988)）を付
加するような改変遺伝子を用いた。細胞への導入にはSu
perfect Transfectionkit（Quiagen社、ドイツ）を用い
た。

【００６８】トランスフェクションから２日後、COS-1
細胞を回収し、細胞抽出液を調製した。抗FLAGアフィニ
ティゲル(Sigma-Aldrich社、アメリカ)を用いて細胞抽
出液中よりFLAG付加カスパーゼ-12を選択的に免疫沈降
させた。なお、タンパク質の検出は、ウエスタンブロッ
ト法（Harlow, E. & Lane, D. Antibodies: a laborato
ry manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, New York, USA (1988)）により行
った（ECL-plusキット（Amersham-Pharmacia社）。

【００６９】結果を図２に示す。図２において、レーン
１はその免疫沈降物にMAGE-3が共存していることを示し
ている。これは抗FLAGアフィニティゲルにより沈降する
カスパーゼ-12前駆体にMAGE-3が結合していたためであ
る。対照実験として、COS-1細胞にMAGE-3のみを強制発
現させた場合には抗FLAGアフィニティゲルによってMAGE
-3を免疫沈降させることはできない（レーン２）。従っ
て、哺乳類の培養細胞の中でMAGE-3蛋白質とカスパーゼ
-12前駆体とは、安定な複合体を形成することが示され
た。

【００７０】〔実施例4〕 カスパーゼ-12内のMAGE-3結
合領域、及び特異性の検討 アメリカのR. Brentらが開発した酵母２ハイブリッド法
（Gyuris, J. et al.Cell 75, 791-803 (1993)）に従っ
てカスパーゼ-12内のMAGE-3結合領域を検討した。この
方法によれば２種類の蛋白質の結合はこれらを含む酵母
株がベータ・ガラクトシダーゼ活性を示すことで検出で
きる。MAGE-3 cDNAはベクターpJG4-5にクローン化する
ことにより遺伝子発現活性化蛋白質(B42)との融合遺伝
子(プラスミド名、pNB321)を作製した。

【００７１】カスパーゼ-12の成熟型に含まれるp10サブ
ユニット（Thornberry, N. A. & Lazebnik, Y. Science
281, 1312-1316 (1998)）に対応するcDNA断片をベクタ
ーpEG202にクローン化することによりLexAのDNA結合領
域との融合遺伝子（プラスミド名、pNB316）を作製し
た。

【００７２】検定用出芽酵母EGY48に３種類のプラスミ
ド、pNB321、pNB316及びベータ・ガラクトシダーゼ・レ
ポーター遺伝子を含むpSH18-34を導入した株 NMY307を
作製した。NMY307を合成培地（0.67 %イースト窒素源(D
ifco社、アメリカ)、ヒスチジン-、トリプトファン-、
ウラシル-不含・アミノ酸・核酸混合物（Bio-101社、ア
メリカ）, 2 % ガラクトース）で培養した。Gyuris ら
の方法（Gyuris, J. etal. Cell 75, 791-803 (1993)）
に従ってNMY307の持つベータ・ガラクトシダーゼ活性を
調べた。一方、他のカスパーゼ（カスパーゼ-1, -2, -
3, -8）のp10領域（それぞれ、pEG202にクローン化し
た）とMAGE-3（pJG4-5にクローン化した）とを含む酵母
株について、上記と同様にしてベータ・ガラクトシダー
ゼ活性を調べた。

【００７３】結果を図３に示す。図３において、１、
２、３、８及び12は、それぞれカスパーゼ-1、-2、-3、
-8及び-12のp10領域とMAGE-3を含む酵母細胞である。
「P」は正の対照株であり、EGY48に活性型の転写因子
（プラスミド名、pSH17-4）とベータ・ガラクトシダー
ゼ・レポーター遺伝子（プラスミド名、pSH18-34）を導
入したものである。また、「N」は負の対照株であり、E
GY48にカスパーゼ-12のp10とベータ・ガラクトシダーゼ
・レポーター遺伝子を導入したものである。

【００７４】ベータ・ガラクトシダーゼ活性が生じた酵
母は、基質であるX-Gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-
beta-D-thiogalactoside）から有色の物質を生成させて
いることが示された（下パネルの「12」）。これは、成
熟型カスパーゼ-12の p10領域がMAGE-3蛋白質と結合し
たことを意味する。なお、このベータ・ガラクトシダー
ゼ活性は、比較として用いた正の対照株（下パネルの
「P」）と同程度である。一方、負の対照株ではほとん
ど発色は見られなかった（下パネルの「N」）。さら
に、試験したカスパーゼ-1、-2、-3及び-8は、いずれも
負の対照株(N)と同様の発色しか見られなかった（図
３、下パネル）。すなわち、これらのカスパーゼとMAGE
-3との結合は検出されなかった。従って、カスパーゼ-1
2内のC-末端側にあるp10領域（成熟型において約10kDa
のサブユニットになる）がMAGE-3との結合に必要である
ことが示され、さらに、MAGE-3とカスパーゼ-12との結
合が特異的であることが示された。

【００７５】〔実施例5〕 カスパーゼ-12とMAGE-3部分
切断型との結合試験◎ カスパーゼ-12（前駆体型）の p10領域と結合可能な因
子をHeLa細胞のcDNAライブラリーを用いて探索した。カ
スパーゼ-12（前駆体型） p10領域をpEG202にクローン
化して相互作用トラップ法（R. Brentらによる、Gyuri
s, J. et al. Cell 75, 791-803 (1993)）を行った。得
られた結合タンパク質は、全てMAGE-3の部分切断型であ
った。部分切断型は以下の通りである。最も短い切断型
は、MAGE-3蛋白質（配列番号２）の94番目のGly残基か
らC-末端のGlu残基までのアミノ酸配列を有するもので
ある（切断型１）。

【００７６】 切断型１：MAGE-3の１〜93番目のアミノ酸が欠失したも
の。 切断型２：MAGE-3の１〜90番目のアミノ酸が欠失したも
の。 切断型３：MAGE-3の１〜88番目のアミノ酸が欠失したも
の。 切断型４：MAGE-3の１〜81番目のアミノ酸が欠失したも
の。

【００７７】上記の通り得られた切断型のそれぞれにつ
いて、Gyurisらの方法（上記）に基づいて切断型MAGE-3
との結合を調べた。すなわち、カスパーゼ-12内のp10領
域、切断型MAGE-3、lacZレポーター遺伝子の３者を形質
転換により導入された出芽酵母EGY48をガラクトース合
成培地プレート上で生育させた。プレート上のコロニー
をナイロン膜（Hybond-N⁺, Amersham-Pharmacia社）に
移した後、酵母細胞を液体窒素につけて破砕した。破砕
された酵母をつけたナイロン膜をX-Galを含むリン酸緩
衝液（Gyuris, J. ewt al. Cell 75, 791-803 (1993)）
に浸し、30？Cで４〜６時間保温した。カスパーゼ-12 p
10と切断型MAGE-3との結合によって酵母細胞内のlacZ遺
伝子が発現されることによりβ-ガラクトシダーゼが産
生され、その酵素活性によってナイロン膜上に青色の呈
色反応が起こることを確認した。

【００７８】調べた切断型全てが強い呈色反応を示した
ことから、MAGE-3の少なくともGly94からGlu314(C-末
端)までの部分長ポリペプチド（図4のくさび型矢印（94
番目）からC末端(314番目)までの領域）もカスパーゼ-1
2との結合能を有することが示された。

【００７９】〔実施例6〕 MAGE-3蛋白質とカスパーゼ
との結合実験（成熟型カスパーゼ-12の結合） 本実施例では、カスパーゼ-12の前駆体及び活性型がそ
れぞれどの程度、MAGE-3蛋白質に結合するかをGST-融合
蛋白質結合実験により検討した。成熟型カスパーゼ-12
(p30という)は、成熟型（活性型）カスパーゼ-12には含
まれないN-末端のプロ配列を前駆体型カスパーゼからあ
らかじめ除き、代わりにHis-His-His-His-His- His配列
をN-末端に持つタンパク質として作製した。このp30のc
DNAを大腸菌用発現プラスミドベクターpRSET-A（Invitr
ogen社）にクローン化した。p30を大腸菌で大量発現さ
せると自己プロセシングによって成熟型に変換される。

【００８０】一方、前駆体型のカスパーゼを自己プロセ
シングをしないように安定化するため、カスパーゼ-12
の活性部位にあるCys残基をSer残基に置換した変異型p3
0 (p30C/Sと表す)を別に大腸菌で大量発現させた。大腸
菌の培養及びp30蛋白質の誘導合成はInvitrogen社のプ
ロトコールに従った。p30及びp30C/Sは、ともにN-末端
の6×(His)配列を利用してニッケルカラムアフィニティ
・クロマトグラフィー（Probond Affinity resin, Invi
trogen社）により精製した。

【００８１】後にカスパーゼ-12との結合産物を容易に
回収する目的でMAGE-3のN-末端側に人為的にグルタチオ
ン-S-トランスフェラーゼ(GSTと表す)を融合させた蛋白
質をコードするcDNA（pNB341）を作製した。MAGE-3の c
DNAを大腸菌用発現プラスミドベクター、pGEX-4T-3（Am
ersham-Pharmacia社、スウェーデン）に読み枠を合わせ
てクローン化することにより融合遺伝子を構築した。大
腸菌XL-2 Blue MRF'にpNB341を導入後、Amersham-Pharm
acia社のプロトコールに従って大腸菌の培養及びGST-MA
GE-3蛋白質の誘導合成を行った。GST-MAGE-3を含む大腸
菌の抽出液からGST-MAGE-3蛋白質をグルタチオン樹脂
（Glutathione Sepharose 4B, Amersham-Pharmacia社）
により精製した。精製は同社のプロトコールに従った。

【００８２】精製したGST-MAGE-3蛋白質をp30（成熟
型）またはp30C/S（前駆体型）と混合した後、グルタチ
オン樹脂を用いて溶液より回収した。GST-MAGE-3蛋白質
とともに共沈殿してくる蛋白質をウエスタンブロット法
により解析した。結果を図5に示す。図5において、各レ
ーンは以下の通りである。

【００８３】 レーン１：成熟型カスパーゼ-12とGSTとを混合したとき
の対照（MAGE-3を含まない） レーン２： GST-MAGE-3とともに沈殿として回収された
カスパーゼ-12（成熟型） レーン３：前駆体型カスパーゼ-12とGSTとを混合したと
きの対照（MAGE-3を含まない） レーン４：GST-MAGE-3とともに沈殿として回収されたカ
スパーゼ-12（前駆体型）

【００８４】図5より、p30（成熟型）及びp30C/S（前駆
体型）は、ともに共沈殿産物内に認められるが、成熟型
に比べて前駆体型（p30C/S）の方が明らかに多く認めら
れた（図５）。従って、カスパーゼ-12は前駆体及び成
熟型のいずれもGST-MAGE-3蛋白質と結合するが、成熟型
よりも前駆体の方が効率的にGST-MAGE-3蛋白質と結合す
ることが判明した。

【００８５】〔実施例7〕 MAGE-3によるカスパーゼ活性
化の抑制 本実施例では、試験管内で合成したカスパーゼ-12前駆
体（48 kDa）を成熟型カスパーゼ-12によって切断さ
せ、生体内での活性化を試験管内で再現した。前駆体に
対する成熟型カスパーゼ-12の切断部位は特異的であ
り、その切断部位は、成熟型に含まれる約20 kDaと約10
kDaのサブユニット（それぞれp20、p10と呼ぶ）の境界
にある特定のAsp残基の部位である（図６、図７Aレーン
２）。この切断反応液にMAGE-3蛋白質を共存させること
により特異的切断を抑制することができる。実験は以下
の通り行った。

【００８６】カスパーゼ-12前駆体をコードするcDNAと
試験管内蛋白質合成キット（TNT invitro transcriptio
n/translation kit, Promega社、アメリカ）を用いてカ
スパーゼ-12前駆体を合成した。合成反応液には[³⁵S]で
標識されたメチオニン(Amersham-Pharmacia社)を入れ
て、前駆体が放射性標識されるようにした。

【００８７】切断反応は、20 mM Tris-HCl (pH7.0)、10
mM ジチオスレイトール中に放射性標識前駆体、成熟型
カスパーゼ-12、MAGE-3を混合し、37℃で45分間、行っ
た。切断反応の停止のため、２倍濃度の電気泳動サンプ
ル緩衝液(100 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 % ラウリル硫
酸ナトリウム、10 %メルカプトエタノール、0.2 % ブロ
モフェノールブルー、20％グリセロール)を等量添加し
た後、100？Cで４分間加熱した。

【００８８】切断反応液はSDS-ポリアクリルアミドゲル
（14％）電気泳動により展開した。電気泳動ゲルは増感
剤Ampify（Amersham-Pharmacia 社）で処理した後、乾
燥させ、オートラジオグラフィーに供した。乾燥ゲル内
の放射性の蛋白質はBAS2500検出システム（フジフィル
ム社、日本）により検出した。結果を図7に示す。図７
において各レーンは以下の通りである。

【００８９】(1) パネルA レーン１：放射性メチオニンの存在下で試験管内合成し
たカスパーゼ-12前駆体。 レーン２〜７：カスパーゼ-12前駆体を成熟型（0.28μ
g）で切断したもの。切断反応の際、下記の量のMAGE-3
を共存させた。

【００９０】レーン２（０μg）、レーン３(0.3μg）、
レーン４(1.5μg)、レーン５(3μg)、レーン６(6μg)、
レーン７(12μg) レーン８：カスパーゼ-12前駆体を成熟型（1.1μg）で
切断したもの。12 μgのMAGE-3を共存させた。 レーン９：カスパーゼ-12前駆体を成熟型（1.1μg）で
切断したもの。MAGE-3の代わりに12μgの牛血清アルブ
ミンを共存させた対照試料。

【００９１】(2) パネルB レーン１：試料はパネルAのレーン７と同様（切断反応
の際、12μgのMAGE-3を共存させた）。 レーン２：試料はパネルAのレーン７と同様（切断反応
の際、24μgのMAGE-3を共存させた）。 レーン３：パネルAのレーン９と同じ試料

【００９２】図７Aレーン２から７には、0から12マイク
ログラムまで順次増量したMAGE-3を共存させた例を示し
ている。12マイクログラムの添加でカスパーゼ-12の切
断反応はほぼ完全に抑制された。対照としてMAGE-3の代
わりに12マイクログラムの牛血清アルブミンを加えた場
合には、抑制効果は全く見られなかった（レーン９）。
この抑制効果は、主にMAGE-3がカスパーゼ-12前駆体に
結合することによるものである。

【００９３】さらに、12マイクログラムのMAGE-3でほぼ
完全に切断が抑制された条件下で、過剰（４倍量）の成
熟型カスパーゼ-12を加えても、切断は回復しなかった
（レーン８）。一方、同様の条件下で過剰（２倍量）の
基質（カスパーゼ-12前駆体）を加えると、再び特異的
切断を検出することができた（図７B，レーン２）。

【００９４】以上より、カスパーゼは特異的な分子内切
断によって活性化することが示された。また、MAGE-3は
カスパーゼ-12前駆体に強く結合し、カスパーゼ-12の活
性化を阻害することが示された。

【００９５】〔実施例8〕 培養細胞におけるMAGE-3の抗
アポトーシス作用 本実施例は、培養細胞でMAGE-3を高発現させると小胞体
ストレス依存性のアポトーシスに対する抵抗性が高まる
ことを確認するものである。MAGE-3のカスパーゼ-12活
性化抑制を細胞レベルで検討するため、MAGE-3を高発現
させた細胞株を樹立してアポトーシス刺激に対する反応
を調べた。なお、精巣以外の正常組織ではMAGE-3の発現
は検出されていない（Van Pel, A. et al. Immunol Rev
145, 229-250 (1995)）。

【００９６】MAGE-3 cDNAを含むpNB179をSuperfect Tra
nsfection kitを用いてマウスの筋芽細胞株、C2C12細胞
に導入した。PNB179には薬剤耐性遺伝子Neoが含まれて
いることを利用し、染色体に組み込まれたプラスミドを
含む形質転換細胞を、抗生物質ジェネティシン（Geneti
cin：Gibco-BRL)を含む培地で選択的に増殖させた。２
週間の選択的培養の後、培養プレートに生じた耐性細胞
のコロニーを拾い、別々に培養してクローン化した。そ
れぞれのクローンにおけるMAGE-3の発現量をウエスタン
ブロット（抗MAGE-3蛋白質抗体を用いた）で検討し、MA
GE-3が高発現している２株（C2/MA13, C2/MA21）を得
た。

【００９７】細胞内ではカスパーゼ-12は小胞体依存性
のアポトーシス誘導刺激によって活性化される（Nakaga
wa, T. et al. Nature 403, 98-103 (2000)）。そこ
で、小胞体特異的カルシウムATPアーゼの阻害剤である
サプシガージン（thapsigargin：Calbiochem社、アメリ
カ, Thastrup, O. et al. Proc Natl Acad Sci USA 87,
2466-2470 (1990))を上記高発現株の培地に0.4μMの濃
度で添加した(24時間)。

【００９８】その結果、細胞内カルシウムバランスが崩
れてカスパーゼ-12の活性化を促し、細胞のアポトーシ
スが誘導された。すなわち、0.4マイクロモルのthapsig
ariginを24時間作用させると、親株のC2C12細胞の50％
以上がアポトーシスの形態を示して死に至った（図８、
右側の上パネル）。

【００９９】これに対して、C2/MA13及び C2/MA21株
は、同様のthapsigargin処理に対して抵抗性を示した。
顕微鏡観察によれば、C2/MA13及び C2/MA21株は90%以上
の細胞は正常な形態を保っていた（図８、右側の中、下
パネル）。なお、左側のパネルは、0.1％のジメチルス
ルホン酸処理した各細胞株の対照の試験結果である。

【０１００】次に、thapsigargin処理に対する抵抗性を
定量化するため、それぞれの細胞の生存率を算出した。
Cell Counting Kit-8（同仁化学研究所、日本）により
細胞の生存率を測定した結果、24時間のthapsigargin
処理後、C2C12の生存率は50%まで低下するのに対し、C2
/MA13及び C2/MA21では高いレベル（75%の生存率）に保
たれていた。従って、MAGE-3の高発現により、細胞が小
胞体特異的ストレスに対して抵抗性を有することが示さ
れ、これはアポトーシスの発生及び進行を抑制すること
を意味するものである。

【０１０１】

【発明の効果】本発明により、カスパーゼ-12と特異的
に結合してその活性化を抑制するタンパク質、及び該タ
ンパク質を含有する細胞死阻害剤が提供される。上記タ
ンパク質は、アポトーシスなどの細胞死を抑制するため
の薬剤として有用である。

【０１０２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> RIKEN <120> Apoptosis-inhibiting protein <130> RJH11-099 <140> <141> <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4204 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (2465)..(3409) <400> 1 acgcaggcag tgatgtcacc cagaccacac cccttccccc aatgccactt cagggggtac 60 tcagagtcag agacttggtc tgaggggagc agaagcaatc tgcagaggat ggcggtccag 120 gctcagccag gcatcaactt caggaccctg agggatgacc gaaggccccg cccacccacc 180 cccaactccc ccgaccccac caggatctac agcctcagga cccccgtccc aatccttacc 240 ccttgcccca tcaccatctt catgcttacc tccaccccca tccgatcccc atccaggcag 300 aatccagttc cacccctgcc cggaacccag ggtagtaccg ttgccaggat gtgacgccac 360 tgacttgcgc attggaggtc agaagaccgc gagattctcg ccctgagcaa cgagcgacgg 420 cctgacgtcg gcggagggaa gccggcccag gctcggtgag gaggcaaggt aagacgctga 480 gggaggactg aggcgggcct cacctcagac agagggcctc aaataatcca gtgctgcctc 540 tgctgccggg cctgggccac cccgcagggg aagacttcca ggctgggtcg ccactacctc 600 accccgccga cccccgccgc tttagccacg gggaactctg gggacagagc ttaatgtggc 660 cagggcaggg ctggttagaa gaggtcaggg cccacgctgt ggcaggaatc aaggtcagga 720 ccccgagagg gaactgaggg cagcctaacc accaccctca ccaccattcc cgtcccccaa 780 cacccaaccc cacccccatc ccccattccc atccccaccc ccacccctat cctggcagaa 840 tccgggcttt gcccctggta tcaagtcacg gaagctccgg gaatggcggc caggcacgtg 900 agtcctgagg ttcacatcta cggctaaggg agggaagggg ttcggtatcg cgagtatggc 960 cgttgggagg cagcgaaagg gcccaggcct cctggaagac agtggagtcc tgaggggacc 1020 cagcatgcca ggacaggggg cccactgtac ccctgtctca aaccgaggca ccttttcatt 1080 cggctacggg aatcctaggg atgcagaccc acttcagcag ggggttgggg cccagccctg 1140 cgaggagtca tggggaggaa gaagagggag gactgagggg accttggagt ccagatcagt 1200 ggcaaccttg ggctggggga tgctgggcac agtggccaaa tgtgctctgt gctcattgcg 1260 ccttcagggt gaccagagag ttgagggctg tggtctgaag agtgggactt caggtcagca 1320 gagggaggaa tcccaggatc tgcagggccc aaggtgtacc cccaaggggc ccctatgtgg 1380 tggacagatg cagtggtcct aggatctgcc aagcatccag gtgaagagac tgagggagga 1440 ttgagggtac ccctgggaca gaatgcggac tgggggcccc ataaaaatct gccctgctcc 1500 tgctgttacc tcagagagcc tgggcagggc tgtcagctga ggtccctcca ttatcctagg 1560 atcactgatg tcagggaagg ggaagccttg gtctgagggg gctgcactca gggcagtaga 1620 gggaggctct cagaccctac taggagtgga ggtgaggacc aagcagtctc ctcacccagg 1680 gtacatggac ttcaataaat ttggacatct ctcgttgtcc tttccgggag gacctgggaa 1740 tgtatggcca gatgtgggtc ccctcatgtt tttctgtacc atatcaggta tgtgagttct 1800 tgacatgaga gattctcagg ccagcagaag ggagggatta ggccctataa ggagaaaggt 1860 gagggccctg agtgagcaca gaggggatcc tccaccccag tagagtgggg acctcacaga 1920 gtctggccaa ccctcctgac agttctggga atccgtggct gcgtttgctg tctgcacatt 1980 gggggcccgt ggattcctct cccaggaatc aggagctcca ggaacaaggc agtgaggact 2040 tggtctgagg cagtgtcctc aggtcacaga gtagaggggg ctcagatagt gccaacggtg 2100 aaggtttgcc ttggattcaa accaagggcc ccacctgccc cagaacacat ggactccaga 2160 gcgcctggcc tcaccctcaa tactttcagt cctgcagcct cagcatgcgc tggccggatg 2220 taccctgagg tgccctctca cttcctcctt caggttctga ggggacaggc tgacctggag 2280 gaccagaggc ccccggagga gcactgaagg agaagatctg taagtaagcc tttgttagag 2340 cctccaaggt tccattcagt actcagctga ggtctctcac atgctccctc tctccccagg 2400 ccagtgggtc tccattgccc agctcctgcc cacactcccg cctgttgccc tgaccagagt 2460 catc atg cct ctt gag cag agg agt cag cac tgc aag cct gaa gaa ggc 2509 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly 1 5 10 15 ctt gag gcc cga gga gag gcc ctg ggc ctg gtg ggt gcg cag gct cct 2557 Leu Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro 20 25 30 gct act gag gag cag gag gct gcc tcc tcc tct tct act cta gtt gaa 2605 Ala Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu 35 40 45 gtc acc ctg ggg gag gtg cct gct gcc gag tca cca gat cct ccc cag 2653 Val Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln 50 55 60 agt cct cag gga gcc tcc agc ctc ccc act acc atg aac tac cct ctc 2701 Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu 65 70 75 tgg agc caa tcc tat gag gac tcc agc aac caa gaa gag gag ggg cca 2749 Trp Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro 80 85 90 95 agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc agt agg 2797 Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg 100 105 110 aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga gcc agg 2845 Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg 115 120 125 gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga aat tgg 2893 Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp 130 135 140 cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc ttg cag 2941 Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln 145 150 155 ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc cac ttg 2989 Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu 160 165 170 175 tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg ctg ggt 3037 Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly 180 185 190 gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc ctg gcc 3085 Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala 195 200 205 ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc tgg gag 3133 Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu 210 215 220 gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt atc ttg 3181 Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu 225 230 235 ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa aac tac 3229 Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr 240 245 250 255 ctg gag tac cgg cag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat gaa ttc 3277 Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe 260 265 270 ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa gtc ctg 3325 Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu 275 280 285 cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac cca ccc 3373 His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro 290 295 300 ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga gtctgagcac 3419 Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 315 gagttgcagc cagggccagt gggagggggt ctgggccagt gcaccttccg gggccgcatc 3479 ccttagtttc cactgcctcc tgtgacgtga ggcccattct tcactctttg aagcgagcag 3539 tcagcattct tagtagtggg tttctgttct gttggatgac tttgagatta ttctttgttt 3599 cctgttggag ttgttcaaat gttcctttta acggatggtt gaatgagcgt cagcatccag 3659 gtttatgaat gacagtagtc acacatagtg ctgtttatat agtttaggag taagagtctt 3719 gttttttact caaattggga aatccattcc attttgtgaa ttgtgacata ataatagcag 3779 tggtaaaagt atttgcttaa aattgtgagc gaattagcaa taacatacat gagataactc 3839 aagaaatcaa aagatagttg attcttgcct tgtacctcaa tctattctgt aaaattaaac 3899 aaatatgcaa accaggattt ccttgacttc tttgagaatg caagcgaaat taaatctgaa 3959 taaataattc ttcctcttca ctggctcgtt tcttttccgt tcactcagca tctgctctgt 4019 gggaggccct gggttagtag tggggatgct aaggtaagcc agactcacgc ctacccatag 4079 ggctgtagag cctaggacct gcagtcatat aattaaggtg gtgagaagtc ctgtaagatg 4139 tagaggaaat gtaagagagg ggtgagggtg tggcgctccg ggtgagagta gtggagtgtc 4199 agtgc 4204 <210> 2 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 35 40 45 Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp 65 70 75 80 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys 100 105 110 Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln 130 135 140 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 145 150 155 160 Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 165 170 175 Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 180 185 190 Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile 195 200 205 Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly 225 230 235 240 Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 290 295 300 His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 3 <211> 666 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(666) <400> 3 ggg cca agc acc ttc cct gac ctg gag tcc gag ttc caa gca gca ctc 48 Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu 1 5 10 15 agt agg aag gtg gcc gag ttg gtt cat ttt ctg ctc ctc aag tat cga 96 Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 20 25 30 gcc agg gag ccg gtc aca aag gca gaa atg ctg ggg agt gtc gtc gga 144 Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly 35 40 45 aat tgg cag tat ttc ttt cct gtg atc ttc agc aaa gct tcc agt tcc 192 Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser 50 55 60 ttg cag ctg gtc ttt ggc atc gag ctg atg gaa gtg gac ccc atc ggc 240 Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly 65 70 75 80 cac ttg tac atc ttt gcc acc tgc ctg ggc ctc tcc tac gat ggc ctg 288 His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu 85 90 95 ctg ggt gac aat cag atc atg ccc aag gca ggc ctc ctg ata atc gtc 336 Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val 100 105 110 ctg gcc ata atc gca aga gag ggc gac tgt gcc cct gag gag aaa atc 384 Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile 115 120 125 tgg gag gag ctg agt gtg tta gag gtg ttt gag ggg agg gaa gac agt 432 Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser 130 135 140 atc ttg ggg gat ccc aag aag ctg ctc acc caa cat ttc gtg cag gaa 480 Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu 145 150 155 160 aac tac ctg gag tac cgg cag gtc ccc ggc agt gat cct gca tgt tat 528 Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr 165 170 175 gaa ttc ctg tgg ggt cca agg gcc ctc gtt gaa acc agc tat gtg aaa 576 Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys 180 185 190 gtc ctg cac cat atg gta aag atc agt gga gga cct cac att tcc tac 624 Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr 195 200 205 cca ccc ctg cat gag tgg gtt ttg aga gag ggg gaa gag tga 666 Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 210 215 220 <210> 4 <211> 221 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Pro Ser Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg 20 25 30 Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly 35 40 45 Asn Trp Gln Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser 50 55 60 Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly 65 70 75 80 His Leu Tyr Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val 100 105 110 Leu Ala Ile Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile 115 120 125 Trp Glu Glu Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser 130 135 140 Ile Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu 145 150 155 160 Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr 165 170 175 Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys 180 185 190 Val Leu His His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr 195 200 205 Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 210 215 220 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 5 gcccagctcc tgcccacact 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 6 ggatgcggcc ccggaaggt 19 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 7 ctcgatatcg caccatgcct cttgagcaga gg 32 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic DNA <400> 8 ctcctcgagt cactcttccc cctctct 27 <210> 9 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic peptide <400> 9 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser 1 5 10 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic peptide <400> 10 Cys His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly 1 5 10 15 Glu Glu

【０１０３】

【配列表フリーテキスト】配列番号５：合成DNA 配列番号６：合成DNA 配列番号７：合成DNA 配列番号８：合成DNA 配列番号９：合成ペプチド 配列番号10：合成ペプチド

【図面の簡単な説明】

【図１】大腸菌から精製したMAGE-3のSDS-ポリアクリル
アミドゲル電気泳動パターンを示す写真。

【図２】MAGE-3とカスパーゼ-12との哺乳類培養細胞中
における結合試験結果を示す写真。

【図３】MAGE-3とカスパーゼ-12のp10領域との結合試験
結果を示す写真。

【図４】MAGE-3のアミノ酸配列を示す図。

【図５】MAGE-3とカスパーゼ-12との結合親和性を比較
した結果を示す写真。

【図６】カスパーゼ-12前駆体の構造の模式図。

【図７】MAGE-3によるカスパーゼ-12前駆体の活性化阻
害試験結果を示す写真。

【図８】MAGE-3の高発現による細胞のアポトーシス抵抗
性誘導試験の結果を示す写真。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/47 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/64 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA31 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 AG21 CA02 CA19 CC24 DA01 DA05 4B065 AA26X AA93Y AB01 AC10 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA22 CA53 DC32 ZA012 ZA162 ZA312 ZA942 ZB072 ZB212 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA86 DA89 EA20 EA22 EA28 FA74 GA26

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質。 (a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
   制するタンパク質
2. 【請求項２】 以下の(a)又は(b)の組換えタンパク質
   をコードする遺伝子。 (a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
   制するタンパク質
3. 【請求項３】 以下の(c)又は(d)のDNAからなる遺伝
   子。 (c) 配列番号３で表される塩基配列からなるDNA (d) 配列番号３で表される塩基配列からなるDNAとスト
   リンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつカスパ
   ーゼ-12の活性化を抑制するタンパク質をコードするDNA
4. 【請求項４】 請求項２又は３記載の遺伝子を含有する
   組換えベクター。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体を培養し、得
   られる培養物からカスパーゼ-12の活性化を抑制するタ
   ンパク質を採取することを特徴とする該タンパク質の製
   造方法。
7. 【請求項７】 MAGE-3タンパク質及び/又はその一部切
   断型とカスパーゼ-12又はその前駆体とが結合してなる
   複合体。
8. 【請求項８】 MAGE-3タンパク質及び/又はその一部切
   断型を有効成分として含有する細胞死阻害剤。
9. 【請求項９】 MAGE-3タンパク質が以下の(e)又は(f)の
   組換えタンパク質である請求項８記載の細胞死阻害剤。 (e) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
   ク質 (f) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
   くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
   ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
   制するタンパク質
10. 【請求項１０】 一部切断型が以下の(a)又は(b)の組換
    えタンパク質である請求項８記載の細胞死阻害剤。 (a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若し
    くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
    ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
    制するタンパク質
11. 【請求項１１】 細胞死がアポトーシス、ネクローシ
    ス、壊死、予定細胞死、プログラム細胞死、及び細胞傷
    害からなる群から選択される少なくとも1種である請求
    項8〜10のいずれかに記載の細胞死阻害剤。
12. 【請求項１２】 MAGE-3タンパク質及び/又はその一部
    切断型を有効成分として含有する細胞死関連疾患の治療
    剤。
13. 【請求項１３】 MAGE-3タンパク質が以下の(e)又は(f)
    の組換えタンパク質である請求項12記載の治療剤。 (e) 配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (f) 配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若し
    くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
    ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
    制するタンパク質
14. 【請求項１４】 一部切断型が以下の(a)又は(b)の組換
    えタンパク質である請求項12記載の治療剤。 (a) 配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパ
    ク質 (b) 配列番号４で表されるアミノ酸配列において１若し
    くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
    ミノ酸配列からなり、かつカスパーゼ-12の活性化を抑
    制するタンパク質
15. 【請求項１５】 細胞死関連疾患が、アルツハイマー
    病、神経変性疾患、自己免疫性疾患、筋萎縮症、及び臓
    器障害からなる群から選択される少なくとも1種である
    請求項12〜14のいずれかに記載の治療剤。
16. 【請求項１６】 MAGE-3タンパク質又はその一部切断型
    とカスパーゼ-12又はその前駆体とを結合させることを
    特徴とするカスパーゼ-12の活性化抑制方法。