CN102250842A - 一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 - Google Patents
一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102250842A CN102250842A CN201110133422.2A CN201110133422A CN102250842A CN 102250842 A CN102250842 A CN 102250842A CN 201110133422 A CN201110133422 A CN 201110133422A CN 102250842 A CN102250842 A CN 102250842A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- electroporation
- transfection
- insect cell
- cell
- recombinant baculovirus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000001890 transfection Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims abstract description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 38
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims description 13
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 3
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 claims description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 9
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 244000201986 Cassia tora Species 0.000 description 3
- 235000014552 Cassia tora Nutrition 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 2
- 101150099105 alien gene Proteins 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 101100008047 Caenorhabditis elegans cut-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241001435085 Phytometra Species 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种电穿孔转染昆虫细胞的方法，本方法将构建的含报告基因的重组杆状病毒基因组和昆虫细胞在电穿孔缓冲液中混和，在电穿孔仪器中按照电穿孔条件进行电穿孔转染，从而将外源基因转染到昆虫细胞中。此方法操作简单、周期短、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种电穿孔转染昆虫细胞的方法。
背景技术
随着生物技术的发展，越来越多的外源重组质粒需要转染或转化到宿主细胞（细菌、酵母或动物细胞）中用于表达外源基因或研究某些基因的功能。大肠杆菌的转化常用化学转化法和电穿孔转化法，酵母细胞的转化采用电穿孔转化法和原生质体转化法，而动物细胞可用脂质体转染法和电穿孔转染法。现有的动物细胞尤其是哺乳动物细胞普遍采用脂质体转染法，电穿孔转染法使用比较少，而昆虫细胞一般采用脂质体转染法，没有关于电穿孔转染法的报道。
昆虫细胞在基因工程表达外源基因方面日益受到人们的重视，昆虫细胞与杆状病毒组合形成了一个强大而通用的表达系统，具有大多数高等真核生物相似的翻译后修饰、加工外源蛋白的能力。杆状病毒表达系统安全性高，对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有多角体启动子控制下，能够稳定而高效表达，容易从无血清培养上清中纯化，无内毒素污染等特点。昆虫细胞－杆状病毒表达系统作为表达系统之一，已广泛应用于基础研究、医药卫生和农业技术创新等各个领域。但是，Invitrogen公司的Bac-to-Bac、Clonetech公司的pBacPak、BD公司的BaculoGold以及其他公司的杆状病毒表达系统，将外源基因重组到穿梭质粒上后，与线性化野生型病毒基因组共同转染昆虫细胞或者直接将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞时，都采用脂质体如Cellfectin来完成，这种试剂虽然每次用量较少，但一个包装都比较昂贵，未使用完放置时间较长也会过期或失效。而一般基因工程实验室都有电穿孔仪器用于细菌或酵母的转化，而用于动物细胞尤其是昆虫细胞的电穿孔转染外源基因极为少见，理论上是可以转染质粒，但是没有详细的操作方法和说明。采用电穿孔方法转染昆虫细胞不仅可以充分利用现有的实验室仪器，而且避免了重复购置转染试剂以及试剂过期失效造成的浪费。在转染质粒的操作上，脂质体转染动物细胞的周期较长，一般超过5小时以上；而电穿孔转染仅需5分钟，周期短。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用电穿孔技术将质粒或基因组转化到昆虫细胞的方法。本发明中昆虫细胞表达系统来包括来自于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的 Sf-9、Sf-21昆虫细胞系以及商品化的High FiveTM昆虫细胞系；杆状病毒来自于苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica NPV，AcNPV)，并由此构建的杆状病毒基因组（Bacmid）转化形成E. coli DH10BAC，以及穿梭质粒pFastBac，用于将外源基因通过同源重组整合到Bacmid中，从而形成重组的杆状病毒基因组。将病毒基因组转染昆虫细胞后形成具有感染性的重组杆状病毒。
所述方法按如下步骤进行：
1）构建含报告基因的重组杆状病毒基因组
报告基因经过酶切重组到穿梭质粒中形成含报告基因的重组穿梭质粒后，将含报告基因的重组穿梭质粒在大肠杆菌中通过同源重组构建含报告基因的重组杆状病毒基因组。
2）电穿孔转染昆虫细胞
将重组杆状病毒基因组和昆虫细胞在电穿孔缓冲液中混和，在电穿孔仪器中按照电穿孔条件进行电穿孔转染，从而将外源基因转染到昆虫细胞中，所述的电穿孔缓冲液为200-400mM蔗糖，7-13mM Na3PO4，1-3mM MgCl2，pH6.2-6.6；电穿孔条件为电压 100-140V，电击时间25-35ms，温度0-25℃。
本发明所述的方法中穿梭质粒为pFastBac1、pFastBacTM Dual、pBacPak、pAcSG及其衍生质粒。
本发明所述的方法中昆虫细胞为Sf-9细胞、Sf-21细胞、High Five细胞 。
与常规转染昆虫细胞普遍采用的脂质体转染方法相比，本发明采用电穿孔方法将外源质粒转染昆虫细胞比较简便、周期短、成本低，不必购买昂贵的转染试剂，而且转染效果和效率与脂质体转染法相近。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明实施方案。
图1是GFP基因扩增电泳图。泳道1为 DNA Marker；泳道2为 GFP基因片段。
图2是重组穿梭质粒GFP/pFastBac的双酶切鉴定电泳图。泳道1为DNA Marker；泳道2和3为重组穿梭质粒基因片段的BamHⅠ与xhoⅠ双酶切产物。
图3是重组杆状病毒基因组的PCR电泳图。泳道1为 DNA Marker；泳道2为1#重组杆状病毒基因组的PCR产物；泳道3为2#重组杆状病毒基因组的PCR产物；泳道4为3#重组杆状病毒基因组的PCR产物；泳道5为4#重组杆状病毒基因组的PCR产物。
图4是重组杆状病毒基因组电穿孔转染昆虫细胞后显微镜观察图。A是紫外激发光下的细胞，B是可见光下的细胞。
图5是重组杆状病毒基因组脂质体转染昆虫细胞后显微镜观察图。A是紫外激发光下的细胞，B是可见光下的细胞。
图6是重组杆状病毒基因组电穿孔转染昆虫细胞子代细胞显微镜观察图。A是紫外激发光下的细胞，B是可见光下的细胞。
图7是重组杆状病毒基因组脂质体转染昆虫细胞子代细胞显微镜观察图。A是紫外激发光下的细胞，B是可见光下的细胞。
具体实施方式
实施例1：
（1）重组穿梭质粒GFP/pFastBac的构建和重组杆状病毒基因组的获得
以pEGFP-N2质粒（来源于BD bioscience Clontech公司）为模板，使用TaqPlus DNA聚合酶（来源于TIANGEN公司，J8422）扩增GFP基因，并引入BamHⅠ与xhoⅠ酶切位点，引物序列为 GFPP1: 5’-CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG -3’；GFPP2: 5’-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’。PCR扩增条件:95℃，5min预变性；95℃变性30sec，50℃退火45sec，72℃延伸2min；30个循环；最后72℃延伸10min。采用BIO-RAD PCR扩增仪，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，获得了预期750bp大小的GFP基因（见附图1），胶回收纯化GFP基因。
重组穿梭质粒GFP/pFastBac的构建：取GFP基因和穿梭质粒pFastBac1（来源于Invitrogen 公司，为昆虫细胞的表达质粒）各1μg 分别用10U BamHⅠ（来源于TAKALA公司，CKB701A）与10U xhoⅠ（来源于TAKALA公司，CK1701A）于37℃酶切3小时后，分别进行胶回收；取胶回收纯化的GFP片段双酶切产物100ng和纯化的穿梭质粒pFastBac1双酶切产物150ng用T4 DNA连接酶1U（来源于TAKALA公司，CK5021B）16℃连接过夜；连接产物通过热休克法转化CaCl2制备的E. coli DH5α，转化产物涂布于Amp+/Gem+-LB双抗性平板，37℃培养16小时，挑取2个单菌落接种Amp+/Gem+-LB双抗性培养液中增菌后，使用质粒抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）提取和纯化质粒，用BamHⅠ与xhoⅠ双酶切鉴定重组穿梭质粒，琼脂糖凝胶电泳观察，获得了预期大小的片段（见附图2），表明GFP基因重组到pFastBac质粒上。
重组杆状病毒基因组GFP/BAC的获得：将重组穿梭质粒GFP/pFastBac，通过热休克法转化CaCl2制备的E.coli DH10BAC(来源于INVITROGEN 公司)，转化产物涂布于含100μg/ml x-gal与40μg/ml IPTG的Kan+/Gem+/Tet+-LB三抗性平板上，37℃培养过夜，进行蓝白斑筛选。挑取4个白斑菌落，在上述三抗性平板上划线，37℃培养，重复三轮划线筛选后，挑取4个白斑菌落使用Taq酶（TIANGEN公司，J8428）和通用引物进行菌落PCR鉴定。通用引物序列：M13 Forward:5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，M13 Reverse:5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。PCR扩增条件为：94℃ 5min；94 ℃ 45s，55℃45s，72℃ 5min (30个循环)；72℃ 10min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，获得了预期3106bp大小的片段，包含有转座子基因、启动子序列和GFP基因（见附图3），对应的菌落则含有重组杆状病毒基因组GFP/BAC。将含有重组杆状病毒基因组GFP/BAC的菌落接种于5ml液体Kan+/Gem+/Tet+-LB中，37℃振荡培养18小时，取1.5ml菌液转于1.5ml Eppendorf管中，14000g，离心1分钟，弃上清，菌体沉淀用碱裂解法提取重组病毒基因组GFP/BAC（参见分子克隆实验指南，第二版）。获得的GFP/BAC基因组于-20℃冻存备用。
（2）重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞
重组杆状病毒基因组电穿孔转染昆虫细胞：酚氯仿抽提的GFP/BAC基因组，乙醇沉淀浓缩至100ng/μl，共30μl，加入等体积电穿孔缓冲液平衡，电穿孔缓冲液为300mM蔗糖，10mM Na3PO4，1mM MgCl2，pH6.4。用生长液（Grace粉 4.572％、NaHCO3 0.035％、水解乳蛋白0.33％、酵母浸提物0.33％、胎牛血清10%、青霉素 4U、链霉素 10U，NaOH调pH至6.4）吹下细胞培养瓶中培养的昆虫细胞Sf-9细胞，吸出并转入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清生长液，使用电穿孔缓冲液清洗离心沉淀的细胞两次，1000rpm离心5分钟，弃去电穿孔缓冲液后，用100μl电穿孔缓冲液重悬沉淀的Sf-9细胞，细胞密度为104个/μl，加入平衡后的GFP/BAC基因组混匀，转移至2mm电转杯中，冰水浴5分钟；电穿孔仪器为BIO-RAD Xcell，电穿孔条件为：电压 140V、电击时间25ms、温度4℃；电转结束后，电转杯置于冰水浴中5min后，吸出细胞铺于六孔板中，用生长液0.5ml冲洗电转杯中的细胞，加入到六孔板同一孔中，继续加入生长液至3ml，27℃恒温培养，3天后荧光显微镜观察转染情况（见附图4），荧光细胞数为0.87×106/ml，占所在孔细胞数量的的比例为86.14%。
重组杆状病毒基因组脂质体转染昆虫细胞：重组杆状病毒基因组脂质体转染前24小时，将Sf-9细胞置六孔板于27℃进行培养，每孔细胞数为106个。酚氯仿抽提GFP/BAC基因组，乙醇沉淀浓缩至10μl，浓度为100ng/μl，然后加入90μl无血清生长液平衡。取6μl脂质体Cellfectin（来源于Invitrogen公司，383437），加入100μl无血清生长液，混匀，再与GFP/BAC混合，常温下静置30分钟。同时，弃去六孔板Sf-9细胞的生长液，用无血清生长液清洗Sf-9细胞表面两次，加入0.8ml无血清生长液至Cellfectin与GFP/BAC混合液中，混匀后移至Sf-9细胞表面，27℃静置培养5h后，吸出细胞表面生长液，加入新鲜生长液，27℃恒温培养，3天后荧光显微镜观察转染情况（见附图5），荧光细胞数为1.24×106/ml，占所在孔细胞数量的的比例为86.53%。
比较两种不同的转染Sf-9细胞方法发现，重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞均能成功，并有相近结果，但是电穿孔法比脂质体法简便、快速。
（3）重组杆状病毒的制备和传代
将含有绿色荧光的细胞，连同上清的生长液（含有重组杆状病毒）一起从六孔板中，吸出并转入离心管中，1000rpm离心5分钟。收集上清液，上清液含有重组杆状病毒液，标记为第一代重组病毒为P1，于4℃保存。Sf-9细胞以106个/孔铺入六孔板中，27℃静置培养24小时后，每孔接入500μl重组杆状病毒液。27℃恒温培养，3天后荧光显微镜观察传代情况（见附图6、7）。结果表明：电穿孔法和脂质体法获得的P1重组杆状病毒能够继续感染Sf-9细胞，而且传代后子代病毒可以继续表达外源基因GFP。
实施例2：
（1）重组穿梭质粒的构建和重组杆状病毒基因组的获得，方法同实施例1，采用的穿梭质粒为pBacPak。
（2）重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞，方法同实施例1，昆虫细胞为sf-21，采用的电穿孔缓冲液为400mM蔗糖，7mM Na3PO4，3mM MgCl2，pH值为6.4；电穿孔条件为：电压 140V，电击时间25ms，温度4℃。结果荧光细胞数为0.77×106/ml，占所在孔细胞数量的的比例为82.68%。
（3）重组杆状病毒的制备和传代，方法同实施例1。
实施例3：
（1）重组穿梭质粒的构建和重组杆状病毒基因组的获得，方法同实施例1，采用的穿梭质粒为pBacPak。
（2）重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞，方法同实施例1，昆虫细胞为sf-21，采用的电穿孔缓冲液为200mM蔗糖，13mM Na3PO4，1mM MgCl2，pH值为6.4；电穿孔条件为：电压 140V，电击时间25ms，温度4℃。结果荧光细胞数为0.73×106/ml，占所在孔细胞数量的的比例为82.16%。
（3）重组杆状病毒的制备和传代，方法同实施例1。
实施例4：
（1）重组穿梭质粒的构建和重组杆状病毒基因组的获得，方法同实施例1，采用的穿梭质粒为pFastBac1。
（2）重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞，方法同实施例1，昆虫细胞为sf-9，采用的电穿孔缓冲液为300mM蔗糖，10mM Na3PO4，1mM MgCl2，pH 6.4；电穿孔条件为：电压 100V，电击时间35ms，温度8℃。结果荧光细胞数为0.28×106/ml，占所在孔细胞数量的比例为23.53%。
（3）重组杆状病毒的制备和传代，方法同实施例1。
实施例5：
（1）重组穿梭质粒的构建和重组杆状病毒基因组的获得，方法同实施例1，采用的穿梭质粒为pAcSG。
（2）重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞，方法同实施例1，昆虫细胞为High Five，采用的电穿孔缓冲液为300mM蔗糖，10mM Na3PO4，1mM MgCl2，pH 6.6；电穿孔条件为：140V，电击时间25ms，温度0℃。结果荧光细胞数为0.81×106/ml，
占所在孔细胞数量的的比例为81.11%。
（3）重组杆状病毒的制备和传代，方法同实施例1。
实施例6：
（1）重组穿梭质粒的构建和重组杆状病毒基因组的获得，方法同实施例1，采用的穿梭质粒为pAcSG。
（2）重组杆状病毒基因组的电穿孔转染和脂质体转染昆虫细胞，方法同实施例1，昆虫细胞为High Five，采用的电穿孔缓冲液为300mM蔗糖，10mM Na3PO4，2mM MgCl2，pH 6.2；电穿孔条件为：电压130V，电击时间30ms，温度25℃。结果荧光细胞数为0.62×106/ml，占所在孔细胞数量的的比例为71.75%。
（3）重组杆状病毒的制备和传代，方法同实施例1。
Claims (3)
1.一种电穿孔转染昆虫细胞的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：
1）构建含报告基因的重组杆状病毒基因组
报告基因经过酶切重组到穿梭质粒中形成含报告基因的重组穿梭质粒后，在大肠杆菌中通过同源重组构建含报告基因的重组杆状病毒基因组；
2）电穿孔转染昆虫细胞
将重组杆状病毒基因组和昆虫细胞在电穿孔缓冲液中混和，在电穿孔仪器中按照电穿孔条件进行电穿孔转染，从而将外源基因转染到昆虫细胞中，所述的电穿孔缓冲液为200-400mM蔗糖，7-13mM Na3PO4，1-3mM MgCl2，pH6.2-6.6；电穿孔条件为电压 100-140V，电击时间25-35ms，温度0-25℃。
2.根据权利要求1所述的电穿孔转染昆虫细胞的方法，其特征是穿梭质粒为pFastBac1、pFastBacTM Dual、pBacPak、pAcSG及其衍生质粒。
3.根据权利要求1或2所述的电穿孔转染昆虫细胞的方法，其特征是昆虫细胞为Sf-9细胞、Sf-21细胞、High Five细胞 。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110133422.2A CN102250842A (zh) | 2011-05-23 | 2011-05-23 | 一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110133422.2A CN102250842A (zh) | 2011-05-23 | 2011-05-23 | 一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102250842A true CN102250842A (zh) | 2011-11-23 |
Family
ID=44978413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110133422.2A Pending CN102250842A (zh) | 2011-05-23 | 2011-05-23 | 一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102250842A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113897285A (zh) * | 2014-11-14 | 2022-01-07 | 麻省理工学院 | 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1316432A (zh) * | 2000-02-18 | 2001-10-10 | 理化学研究所 | 细胞死亡抑制蛋白 |
| CN1786177A (zh) * | 2004-12-06 | 2006-06-14 | 北京大学 | 一种表达虎纹捕鸟蛛毒素－i的方法及其专用载体 |
| WO2010009252A1 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Maxcyte, Inc. | Methods for optimizing electroporation |
-
2011
- 2011-05-23 CN CN201110133422.2A patent/CN102250842A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1316432A (zh) * | 2000-02-18 | 2001-10-10 | 理化学研究所 | 细胞死亡抑制蛋白 |
| CN1786177A (zh) * | 2004-12-06 | 2006-06-14 | 北京大学 | 一种表达虎纹捕鸟蛛毒素－i的方法及其专用载体 |
| WO2010009252A1 (en) * | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Maxcyte, Inc. | Methods for optimizing electroporation |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 《Journal of General Virology》 19891231 Susan G. Mann et al. Efficient Transfection of Insect Cells with Baculovirus DNA Using Electroporation 3501-3505 1-3 第70卷, 第12期 * |
| 《安徽农业大学学报》 20091231 郭冬生 等 电穿孔作用将外源基因导入中华蜜蜂卵的研究 222-225 1-3 第36卷, 第2期 * |
| 《实用分子生物学操作指南》 20031231 曹亚 电转染法 人民卫生出版社 189-191 1-3 , * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113897285A (zh) * | 2014-11-14 | 2022-01-07 | 麻省理工学院 | 化合物和组合物向细胞中的破坏和场实现的递送 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Motohashi et al. | Efficient large-scale protein production of larvae and pupae of silkworm by Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus bacmid system | |
| US5162222A (en) | Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses | |
| EP2858489B1 (en) | Recombinant dna elements for the expression of recombinant proteins in a host cell | |
| WO2003074714A1 (en) | Baculovirus expression system | |
| EP3693466B1 (en) | Method and system for preparing recombinant adeno-associated virus, and recombinant bacmid | |
| CN102628062B (zh) | 动物α干扰素和γ干扰素的表达方法 | |
| GB2463783A (en) | A method for preparing antigens of foot-and-mouth disease virus | |
| CN108018264B (zh) | 一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法 | |
| CN105200085A (zh) | 重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途 | |
| CN106987603A (zh) | 一种重组腺相关病毒的制备方法 | |
| Ono et al. | Construction of the BmNPV T3 bacmid system and its application to the functional analysis of BmNPV he65 | |
| EP2350292A1 (en) | Insect-derived promoters for foreign proteins expression in insect cells | |
| CN102286534B (zh) | 表达多外源基因的昆虫生物反应器及其构建方法和应用 | |
| Merrington et al. | Manipulation of baculovirus vectors | |
| CN1759177A (zh) | 腺病毒血清型34载体,核酸及其由此产生的病毒 | |
| CN102250842A (zh) | 一种电穿孔转染昆虫细胞的方法 | |
| CN1239699C (zh) | 利用细菌转座子构建家蚕病毒快速基因表达系统的方法 | |
| US20150353898A1 (en) | Baculoviral dna elements for the expression of recombinant proteins in a host cell | |
| CN101372686B (zh) | 侵染蛋白介导生产重组杆状病毒粒子方法 | |
| CN111378689B (zh) | 一种用于对虾的假型昆虫杆状病毒基因转移系统、病毒及构建方法和应用 | |
| Sun et al. | Production of recombinant Bombyx mori nucleopolyhedrovirus in silkworm by intrahaemocoelic injection with invasive diaminopimelate auxotrophic Escherichia coli containing BmNPV–Bacmid | |
| Miller | Exploring the gene organization of baculoviruses | |
| KR102272651B1 (ko) | 외래단백질의 발현량과 발현시간이 증대된 배큘로바이러스 | |
| CN105779500A (zh) | 一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法 | |
| WO2007125982A1 (ja) | 高効率でバキュウロウイルス生産及びタンパク質生産が可能な新規カイコ培養細胞 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20111123 |