CN105779500A - 一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法 - Google Patents

一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，属于基因工程和蛋白工程领域。所述的方法包含如下基因片段：AcMNPV的gp64基因上游同源重组基因片段、下游同源重组基因片段、博莱霉素抗性基因片段、ires基因片段、野生型gp64基因片段；所述方法包含如下步骤：同源重组基因的构建、突变型rSw106‑inv菌株Ac‑Zeo‑Δgp64的构建、突变型rSw106‑inv菌株Ac‑Zeo‑Δgp64的鉴定、ires补偿性低量表达野生型GP64蛋白的转移载体的构建及转座、重组杆状病毒的构建和外源蛋白展示效率的检测。本发明将杆状病毒表面展示效率提高了约4倍，有效解决了杆状病毒表面展示效率低的缺点。

Description

一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法
技术领域
本发明属于基因工程和蛋白工程领域，具体涉及一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法。
背景技术
杆状病毒表面展示系统(Baculovirus Display System，BDS)因其安全性高、成本低廉、外源基因容纳量大、翻译后加工机制完善、展示蛋白活性强等优点，已成功展示出病毒、细菌、真菌、动植物等各种蛋白，成为使用最为广泛的真核生物展示系统之一。目前，杆状病毒表面展示系统在基因呈递、基因治疗、病虫害防治、单克隆抗体制备和新型多价疫苗研发等领域已经取得重要成果。
杆状病毒表面展示系统构建原理是：使用极晚期多角体蛋白启动子ph驱动“外源基因+gp64基因”(gp64融合基因)的表达，并运输至被侵染细胞的宿主细胞膜上。子代重组杆状病毒出芽时，获取宿主细胞膜结构组成自身囊膜，并将GP64融合蛋白展示在病毒囊膜表面。
由于杆状病毒自身大量表达的野生型GP64蛋白与GP64融合蛋白之间产生强烈的竞争性抑制，导致传统的BDS虽然能成功的将外源蛋白展示在重组杆状病毒囊膜表面，但展示效率低，无法有效的应用于大规模生产应用。
发明内容
为有效解决杆状病毒表面展示效率低的缺点，本发明的首要目的在于提供一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，所述的方法为对Invasin介导的DAP缺陷型Sw106受体菌E.coliAcMultiBac/Δasd Sw106/PGB2ΩInv(野生型rSw106-inv菌株Ac)进行基因改造，替换掉gp64基因，并利用转移载体引入补偿性低量表达野生型GP64蛋白。
所述的替换掉gp64基因，具体为：在gp64基因上下游设计同源重组基因片段gp64F和gp64R，将博莱霉素抗性基因片段插入到gp64F和gp64R之间，利用细菌内同源重组技术，实现博莱霉素抗性基因替换掉gp64基因。
所述的引入补偿性低量表达野生型GP64蛋白，具体为：利用ires介导低量补偿表达野生型GP64蛋白。
上述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，具体包括以下步骤：
(1)同源重组基因的构建：利用PCR技术获得gp64基因上下游同源重组基因片段和博莱霉素抗性基因片段；利用over-lap PCR技术，将三段基因片段按照“上游同源重组基因片段-博莱霉素抗性基因片段-下游同源重组基因片段”的顺序构建出同源重组基因；
(2)突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的构建：利用电转化技术，将同源重组基因导入野生型rSw106-inv菌株Ac，42℃高温诱导细菌内同源重组，利用博莱霉素抗性基因替换掉gp64基因，获得突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64；
(3)突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的鉴定：将步骤(2)中诱导后的rSw106-inv菌株均匀涂于含有博莱霉素和二氨基庚二酸的LB固体培养基平板，挑取部分单克隆菌株进行PCR鉴定，筛选出突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64；
(4)ires补偿性低量表达野生型GP64蛋白的载体构建：利用基因扩增技术获得ires基因片段和野生型gp64基因片段，按照ires-gp64的顺序插入转移载体的多克隆位点，利用Tn7转座技术导入突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64中。步骤(1)中所述的gp64基因为AcMNPV的gp64基因。
步骤(1)中所述的gp64基因上下游同源重组基因片段，通过下述的引物对扩增获得：其中，gp64基因上游同源重组基因片段的扩增引物如下：
gp64F-F:5’-tcatgagattgccaatcaaacgctcg-3’；
gp64F-R:5’-acacgtgctgcaaacaaaagtctacgttca-3’。
gp64基因下游同源重组基因片段的扩增引物如下：
gp64R-F:5’-aggagcaggactgaacatcgaacacgcgcaac-3’；
gp64R-R:5’-aaatagcctcgttgagactctcctga-3’。
步骤(1)中所述的博莱霉素抗性基因片段的扩增引物如下：
Zeocin-F:5’-gtagacttttgtttgcagcacgtgttgacaa-3’；
Zeocin-R:5’-gcgtgttcgatgttcagtcctgctcctcg-3’。
步骤(2)中所述的野生型rSw106-inv菌株Ac为E.coli AcMultiBac/ΔasdSw106/PGB2ΩInv。
步骤(2)中所述突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64为E.coliAcMultiBac-Δgp64/Δasd Sw106/PGB2ΩInv。
步骤(4)中所述的ires基因片段通过下述的引物扩增获得：
ires-F:5’-aagagctcaataaaagaacctataatcccttcgc-3’(Sac I)；
ires-R:5’-aagcggccgcgttactagatataaatagataaagct-3’(Not I)。
步骤(4)中所述的野生型gp64基因片段通过下述的引物扩增获得：
gp64-F:5’-aagcggccgcatggtaagcgctattgttttatatgt-3’(Not I)；
gp64-R:5’-aaggatccatggtgagcaagggcgaggagctgtt-3’(BamH I)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法包含如下特定的基因片段：AcMNPV的gp64基因上游同源重组基因片段(gp64F)、下游同源重组基因片段(gp64R)、博莱霉素抗性基因片段(ZeocinR)、gp64基因信号肽(SP)、缺失起始密码子的gp64基因(gp64ΔATG)、缺失起始密码子的海肾荧光素酶报告基因(RlucΔTAA)、萤火虫荧光素酶报告基因(Fluc)；其中，海肾荧光素酶报告基因和萤火虫荧光素酶报告基因主要用于对本发明和传统BDS展示效率的检测。
所述方法包含如下操作步骤：同源重组基因的构建、突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的构建、突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的鉴定、ires补偿性低量表达野生型GP64蛋白的转移载体的构建及转座、重组杆状病毒的构建和目的蛋白展示效率的检测。本发明将杆状病毒表面展示效率提高了约4倍，解决了杆状病毒表面展示系统低展示效率的缺点。
附图说明
图1A：同源重组基因的PCR扩增琼脂糖电泳结果图，其中：上游同源重组基因片段gp64F(1)；博莱霉素抗性基因片段ZeocinR(2)；下游同源重组基因片段gp64R(3)；M为DNA Marker；
图1B：over-lap PCR扩增出同源重组基因gp64F-ZeocinR-gp64R(1)；M为DNA Marker；
图2：同源重组基因gp64F-ZeocinR-gp64R导入野生型rSw106-inv菌株Ac并完成菌内同源重组的示意图；其中：AcMultiBac：E.coli AcMultiBac/ΔasdSw106/PGB2ΩInv；AcMultiBac-Δgp64：E.coli AcMultiBac-Δgp64/ΔasdSw106/PGB2ΩInv。
图3：使用引物gp64F-F和gp64R-R对突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64进行PCR筛选和鉴定的琼脂糖电泳图，其中：使用引物gp64F-F和gp64R-R对不同单克隆的突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64进行PCR筛选和鉴定(1、2、3、4)；对照组选用野生型rSw106-inv菌株Ac(5)；
图4：转移载体pF-p64sp-R64-ph-F-I64-ph-G示意图；
图5：转移载体pF-p64sp-R64-ph-F-I64-ph-G导入突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64，Rluc(G4S)ΔATG引物F/R和Fluc引物F/R进行PCR筛选和鉴定的琼脂糖电泳图；(附图5中1、2、3为Rluc(G4S)ΔATG引物F/R的鉴定结果；5、6、7为Fluc引物F/R的鉴定结果；4为阴性对照)；
图6：重组杆状病毒侵染sf9细胞72hrs后，倒置荧光显微镜观察细胞荧光的结果图，(A为明场视野下；B为激发光下细胞发出的荧光)；
图7：重组杆状病毒侵染sf9细胞72hrs后，双荧光素酶检测sf9细胞膜表面的海肾荧光素酶表达量(R值)和sf9胞内萤火虫荧光素酶表达量(F值)，以R/F值为纵坐标的柱形图(A为使用传统BDS的外源蛋白展示效率，B为使用本发明的外源蛋白展示效率)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1构建同源重组基因gp64F-ZeocinR-gp64R
1)以野生型AcMNPV的基因组为模板，使用表1中对应的引物扩增出上游同源重组基因片段gp64F，基因序列长度421bp(见图1A中1)。
2)以野生型AcMNPV的基因组为模板，使用表1中对应的引物扩增出下游同源重组基因片段gp64R，基因序列长度397bp(见图1A中3)。
3)以申请人保存的ZeocinR基因为模板，使用表1中对应的引物扩增出博莱霉素抗性基因片段ZeocinR，基因序列长度452bp(见图1A中2)。
4)以基因片段gp64F、gp64R和ZeocinR为模板，使用引物gp64F-F和引物gp64R-R扩增出同源重组基因gp64F-ZeocinR-gp64R(见图1B)。
基因扩增过程中，参照DNA聚合酶说明书进行；PCR产物回收参照PCR产物回收试剂盒说明书进行。
表1
实施例2突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的构建
1)电转感受态细胞的制备：将野生型rSw106-inv菌株Ac活化后，接种到液体LB培养基中，加入卡那霉素(Kan，终浓度50μg/mL)、壮观霉素(Spe，终浓度5μg/mL)、四环素(Tet，终浓度5μg/mL)、二氨基庚二酸(DAP，终浓度5μg/mL)，32℃、200rpm振荡培养。待OD600在0.4-0.6之间，立即转入42℃、200rpm振荡培养15min，诱导菌内同源重组酶的表达。将诱导后的菌液分装至1.5mL无菌离心管中；冰浴30min，4℃、4000rpm离心10min，弃上清；加入1mL预冷的超纯水重悬沉淀，重复上述步骤两次，沉淀用100μL预冷的超纯水重悬，冰上放置备用。
2)电转化：提前打开电转化仪，预热30min，并将电转杯、超纯水、1.5mL无菌的离心管等置于4℃预冷。向电转感受态细胞中加入gp64F-ZeocinR-gp64R(0.5ng)，混匀后全部转移至预冷的电击杯中，排出气泡并用纸巾擦干电击杯外壁的水珠。将电击杯推入电转化仪中，调节电压为2600kV，电击时间2.5ms。按下pulse键，当听到蜂鸣声后，迅速取出电击杯，加入1mL的LB液体培养基(含终浓度为5μg/mL的DAP)，混匀后全部吸出至1.5mL无菌的Eppendorf离心管中，32℃、150rpm振荡培养1hr，活化电转化后的感受态细胞；42℃、200rpm振荡培养15min，诱导细菌内同源重组酶的产生；32℃、200rpm振荡培养2hrs，使细菌内完成同源重组过程(见图2)。取出活化后菌液适量，均匀涂于含有抗生素(Kan、Spe、Tet、Zeocin)、DAP、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板上，32℃倒置培养36-48hrs。
实施例3突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的鉴定：挑取上述实施例2的LB固体培养基平板上蓝色单克隆菌落，使用实施例1中引物gp64F-F和引物gp64R-R进行菌落PCR鉴定(见图3中1、2、3、4)，对照组使用野生型rSw106-inv菌株Ac(见图3中5)。
实施例4转移载体的构建及导入突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64
1)转移载体的构建：参照表2中对应的引物，扩增出如下基因片段：egfp、ires、野生型gp64、携带gp64信号肽的启动子p64sp、缺失终止密码子(ΔTAA)的海肾荧光素酶报告基因Rluc(G4S)ΔTAA、缺失起始密码子(ΔATG)的gp64ΔATG和萤光虫荧光素酶报告基因Fluc。其中，Rluc(G4S)ΔTAA、gp64ΔATG和Fluc主要用于对本发明和传统BDS展示效率的检测。
BamH I和Sal I构建中间载体pFBDM-ph-egfp；SacⅠ和NotⅠ构建中间载体pFBDM-ph-egfp-ires；NotⅠ和PstⅠ构建中间载体pFBDM-ph-egfp-ires-gp64；Spe Ⅰ和Xma Ⅰ构建中间载体pFBDM-p64sp。Xma Ⅰ和Xho Ⅰ构建中间载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA；XhoⅠ和SphⅠ构建中间载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG；BamHⅠ和SalⅠ构建中间载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG-ph-Fluc；ClaⅠ和SpeⅠ双酶切中间载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG-ph-Fluc，ClaⅠ和AvrⅡ双酶切中间载体pFBDM-ph-egfp，利用同尾酶SpeⅠ和AvrⅡ，构建转移载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG-ph-Fluc-ph-egfp；SacⅠ和PstⅠ双酶切转移载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG-ph-Fluc和中间载体pFBDM-ph-egfp-ires-gp64构建转移载体pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG-ph-Fluc-ires-gp64，ClaⅠ和SpeⅠ构建重组质粒pFBDM-p64sp-Rluc(G4S)ΔTAA-gp64ΔATG-ph-Fluc-ires-gp64-ph-egfp，命名为pF-p64sp-R64-ph-F-I64-ph-G(见图4)。
表2
2)重组突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的构建和鉴定：利用Tn7常规转座技术，将转移载体pF-p64sp-R64-ph-F-I64-ph-G导入突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64中，均匀涂于含有抗生素(Kan、Spe、Tet、Zeo和Gm)、DAP、IPTG和X-gal的固体LB平板上，32℃倒置培养36-48hrs。挑取白色单克隆菌落，分别利用表2中Rluc(G4S)ΔATG引物F/R和Fluc引物F/R进行菌落PCR鉴定，筛选出阳性菌落(见图5中1、2、3为Rluc(G4S)ΔATG引物F/R鉴定结果；5、6、7为Fluc引物F/R鉴定结果；4为阴性对照)。
实施例5重组杆状病毒的构建
1)取实施例4，步骤2)中1mL菌液至1.5mL无菌离心管中。5000rpm离心3min，弃上清；加入1mL无菌水重悬，重复上述步骤三次，彻底洗去残留的DAP；沉淀用1mL Grace基础培养基重悬，并标记此时菌液浓度为100。使用Grace基础培养基依次稀释出10-1、10-2、10-3浓度的菌液，备用。
2)将sf9细胞均匀铺于24孔板，过夜，待细胞密度在80-90％时，弃上清，用Grace基础培养基清洗细胞2次，彻底洗去细胞间残留的胎牛血清和抗生素。将实施例5中步骤1)的菌液按照400μL/孔，分别与sf9细胞混合，28℃孵育3-4hrs，弃上清，用Grace基础培养基清洗细胞2次，彻底洗去细胞间残留菌液。按照500μL/孔，分别加入Grace完全培养基，28℃静置培养72hrs，倒置荧光显微镜观察sf9细胞荧光产生情况(见图6A为明场视野下sf9细胞；图6B为激发光下细胞发出的荧光)。
实施例6：外源蛋白展示效率的检测
将实施例5步骤2)中的重组杆状病毒粒子传代至F3代，再次侵染sf9细胞72hrs，弃上清，贴壁的sf9细胞使用PBS清洗2次并重悬，转移至不透明的96孔板内。按照50μL/孔，加入海肾荧光素酶底物，立即放入多功能酶标仪中检测读数，记为R值。按照20μL/孔，加入细胞裂解液，轻微晃动10min，使细胞充分裂解；按照50μL/孔，加入萤火虫荧光素酶底物，暗处反应10min后置于多功能酶标仪中检测读数，记为F值。每个样品设置三次重复试验。以F值为内参，测定被感染的sf9细胞膜表面海肾荧光素酶的展示效率。
实施例6中与传统BDS的展示效率进行对比，即选用野生型rSw106-inv菌株Ac进行试验，其余操作与上述步骤一致。
从图7可以看出，采用本发明构建的杆状病毒表面展示效率(A)将传统BDS表面展示效率(B)提高了约4倍。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：所述的方法为对Invasin介导的DAP缺陷型Sw106受体菌E.coli AcMultiBac/ΔasdSw106/PGB2ΩInv进行基因改造，替换掉gp64基因，并引入补偿性低量表达野生型GP64蛋白。
2.根据权利要求1所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：所述的替换掉gp64基因，具体为：在gp64基因上下游设计同源重组基因片段gp64F和gp64R，将博莱霉素抗性基因片段插入到gp64F和gp64R之间，利用细菌内同源重组技术，实现博莱霉素抗性基因替换掉gp64基因。
3.根据权利要求1所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：所述的引入补偿性低量表达野生型GP64蛋白，具体为：利用ires介导低量补偿表达野生型GP64蛋白。
4.根据权利要求1所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(1)同源重组基因的构建：利用PCR技术获得gp64基因上下游同源重组基因片段和博莱霉素抗性基因片段；利用over-lap PCR技术，将三段基因片段按照“上游同源重组基因片段-博莱霉素抗性基因片段-下游同源重组基因片段”的顺序构建出同源重组基因；
(2)突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的构建：利用电转化技术，将同源重组基因导入野生型rSw106-inv菌株Ac，42℃高温诱导细菌内同源重组，利用博莱霉素抗性基因替换掉gp64基因，获得突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64；
(3)突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64的鉴定：将步骤(2)中诱导后的rSw106-inv菌株均匀涂于含有博莱霉素和二氨基庚二酸的LB固体培养基平板，挑取部分单克隆菌株进行PCR鉴定，筛选出突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64；
(4)ires补偿性低量表达野生型GP64蛋白的载体构建：利用基因扩增技术获得ires基因片段和野生型gp64基因片段，按照ires-gp64的顺序插入转移载体的多克隆位点，利用Tn7转座技术导入突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64中。
5.根据权利要求4所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的gp64基因为AcMNPV的gp64基因。
6.根据权利要求4所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的gp64基因上下游同源重组基因片段，通过下述的引物对扩增获得：其中，gp64基因上游同源重组基因片段的扩增引物如下：
gp64F–F序列如SEQ ID NO:1所示；
gp64F-R序列如SEQ ID NO:2所示；
gp64基因下游同源重组基因片段的扩增引物：
gp64R-F序列如SEQ ID NO:3所示；
gp64R-R序列如SEQ ID NO:4所示。
7.根据权利要求4所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的博莱霉素抗性表达基因片段的扩增引物如下：
ZeocinR-F序列如SEQ ID NO:5所示；
ZeocinR-R序列如SEQ ID NO:6所示。
8.根据权利要求4所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的野生型rSw106-inv菌株Ac为E.coli AcMultiBac/ΔasdSw106/PGB2ΩInv。
9.根据权利要求4所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：步骤(2)中所述突变型rSw106-inv菌株Ac-Zeo-Δgp64为E.coli AcMultiBac-Δgp64/Δasd Sw106/PGB2ΩInv。
10.根据权利要求4所述的提高重组杆状病毒表面展示效率的方法，其特征在于：步骤(4)中所述的ires基因片段通过下述的引物扩增获得：
ires-F序列如SEQ ID NO:7所示；
ires-R序列如SEQ ID NO:8所示；
步骤(4)中所述的野生型gp64基因片段通过下述的引物扩增获得：
gp64-F序列如SEQ ID NO:9所示；
gp64-R序列如SEQ ID NO:10所示。
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