CN109706167A

CN109706167A - 一种自主发光的鲍曼不动杆菌及其构建方法和应用

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Publication number: CN109706167A
Application number: CN201910051035.0A
Authority: CN
Inventors: 张天宇; 高亚敏; 王帅; 郭玲敏; 卢智黎; 蔡晓吟; 方翠婷
Original assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Biomedicine and Health of CAS
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2019-05-03
Anticipated expiration: 2039-01-24
Also published as: CN109706167B

Abstract

本发明公开了一种用于转化鲍曼不动杆菌的转移质粒，其按照顺时针依次含有复制子ori、氨苄抗性基因AmpR、转座子序列、接合转移起始位点oriT，其中，转座子序列含有能使鲍曼不动杆菌自主发光的碱基序列以及抗性基因，抗性基因的两端带有DifR和DifL序列；还公开了一种无抗性标记的自主发光的鲍曼不动杆菌，所述鲍曼不动杆菌的基因组中含有能表达自主发光蛋白的基因，且鲍曼不动杆菌的基因组中没有抗性筛选基因。本发明中由转移质粒pUC18T‑mini‑Tn7T‑lux‑Ab‑dif‑Apr和辅助质粒pTNS3参与构建的自主发光鲍曼不动杆菌，不需要添加任何底物即可发光；并且在黑暗环境中通过肉眼便能看到发光菌落。

Description

一种自主发光的鲍曼不动杆菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种自主发光的鲍曼不动杆菌及其构建方法和应用。

背景技术

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。该菌是医院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。通常情况下，对鲍曼不动杆菌有较强作用的药物主要有抗绿脓杆菌的青霉素类、第三和第四代头孢菌素(主要是头孢他啶、头孢吡肟等)、碳青霉烯类、β-内酰胺类抗生素复合制剂(头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦等)、氟喹诺酮类、氨基糖苷类、替加环素、多粘菌素、舒巴坦等。但是因为近年来抗菌药物的滥用，鲍曼不动杆菌对以上药物的耐药率也在不断上升，氟喹诺酮类、氨基糖苷类等耐药率甚高，碳青霉烯类的耐药率也有上升，因此开发治疗耐药的鲍曼不动杆菌的抗生素十分有必要。

转座子(Transposon，Tn)又称转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。Tn7转座子是一种定点插入型转座子，固定地插在细菌的glmS基因之后。glmS基因与细胞壁的合成有关，是一种必需基因。Tn7转座子因其具有插入染色体后对细菌基因的表达没有任何影响、不影响细菌的生长状态、插入位点明确、携带大基因片段等特点，已经作为一种基因操作工具应用于多种细菌。

传统遗传操作要求携带抗性标记基因，用于筛选阳性转化结果。在利用转座子系统将目的碱基序列整合到细菌基因组上亦需要抗性筛选标记，但是由于该菌株含有抗性基因，可能会给后续的遗传操作及应用带来不便，如在药物筛选/评价中可能存在交叉抗性。目前常见的用于切除抗性标记的序列重组系统包括来源于细菌噬菌P1的Cre/loxP系统，转座子γδ的TnpR/res系统，酿酒酵母的Flp/FRT系统。但是这些系统都需要将含有解离酶基因的质粒转入宿主菌，在诱导表达并消除抗性基因后，还需去除该质粒，在实际应用上非常的不便。Xer-cise特异性重组系统主要在细菌染色体复制过程中起作用，Xer解离酶的作用是在细胞分裂期间的染色体分离阶段识别复制末端的dif序列，催化染色体二聚体解离，从而形成染色体单体。大肠杆菌、霍乱弧菌等细菌都存在Xer-cise系统。然而Xer-cise系统用于切除抗性基因最近几年才被报道，目前已被用于分枝杆菌属的遗传操作，尚未见于鲍曼不动杆菌。与上述所述系统相比，Xer-cise序列特异性重组系统的优势在于，利用菌株本身编码的Xer重组酶，不需要人工表达外源蛋白来实现抗性基因的去除，省去了很多不必要的麻烦。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种用于转化鲍曼不动杆菌的转移质粒，所述转移质粒按照顺时针依次含有复制子ori、氨苄抗性基因AmpR、转座子序列、接合转移起始位点oriT，其中，所述转座子序列含有能使鲍曼不动杆菌自主发光的碱基序列以及抗性基因，所述的抗性基因的两端带有DifR和DifL序列。应当说明的是，DifR和DifL序列选自Xer-cise特异性重组系统，该系统利用宿主菌内源表达的解离酶即可实现抗性基因的切除。

优选地，所述能使鲍曼不动杆菌自主发光的碱基序列为LuxCDABE基因序列。由于LuxCDABE的碱基序列是本发明所属技术领域的公知常识，为节省篇幅，本文中未列出LuxCDABE的具体碱基序列。

优选地，所述抗性基因为安普霉素抗性基因和/或甲氧苄啶抗性基因。

优选地，所述转座子序列按顺时针依次含有反向重复序列Tn7R、抗性基因、启动子promoter、LuxCDABE基因和反向重复序列Tn7L。其中，Tn7R的碱基序列优选如SEQ ID NO.1所示，Tn7L的碱基序列优选如SEQ ID NO.2所示。

在第二个方面，本发明提供了上述所述用于转化鲍曼不动杆菌的转移质粒的构建方法，包括以下步骤：

(1a)将起始质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Tp用限制性内切酶XbaΙ和BamHΙ消化后，回收起始质粒酶切后的大片段产物；

(2a)XbaΙ和BamHΙ酶切PCR扩增后的Apr基因，回收酶切后的片段，所述酶切后的片段为两端带有dif序列的Apr基因片段；

(3a)将步骤(1a)中回收的起始质粒酶切后的大片段产物和步骤(2a)中酶切后的片段进行连接，得到用于转化鲍曼不动杆菌的转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr。

优选地，所述步骤(2a)中PCR扩增用的引物对如SEQ ID NO:4和如SEQ ID NO:5所示。

在第三个方面，本发明提供了一种自主发光的鲍曼不动杆菌，所述鲍曼不动杆菌的基因组中含有能表达自主发光蛋白的基因，且鲍曼不动杆菌的基因组中没有抗性筛选基因。

优选地，所述能表达自主发光蛋白的基因为LuxCDABE基因。

在第四个方面，本发明提供了一种自主发光的鲍曼不动杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1b)提供第一个方面所述的转移质粒；

(2b)将步骤(1b)的转移质粒和含有转座酶基因的辅助质粒同时转入鲍曼不动杆菌感受态细胞，涂于Apr抗性的LB平板，得到自主发光的鲍曼不动杆菌。其中转入方式优选电转或接合转移。应当说明的是，该构建方法不仅适用于鲍曼不动杆菌的构建，还适用于构建带有Xer-cise序列特异性重组系统的细菌，如大肠杆菌、霍乱弧菌等；该构建方法不仅适用于发光菌的构建，也适用于表达其它外源蛋白；辅助质粒优选pTNS3或pTNS2；所述编码转座酶的基因为TnsABCD，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

优选地，所述构建方法还包括步骤(3b)：将步骤(2b)获得的自主发光鲍曼不动杆菌传代培养，筛选出抗性基因丢失的发光菌，获得无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌。

在第五个方面，本发明提供了一种用于构建自主发光的鲍曼不动杆菌的试剂盒，包括上述所述的转移质粒，以及表达转座酶基因的辅助质粒。

在第六个方面，本发明提供了一种采用上述所述方法构建得到的鲍曼不动杆菌。

在第七个方面，本发明提供了上述所述的的鲍曼不动杆菌在制备或筛选抗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。

综上所述，本发明的有益效果为：

1)本发明首次将Tn7转座系统与dif序列结合，作为特异性重组位点应用到鲍曼不动杆菌中，该方法为一步法构建自主发光菌，仅需将dif序列连接在抗性基因两端，利用宿主菌内源表达的解离酶即可实现抗性切除；相较于其他特异性重组系统如TnpR/res、Flp/FRT系统，该方法无需人工表达外源解离酶，操作简便快捷；

2)本发明中由转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr和辅助质粒pTNS3参与构建的自主发光鲍曼不动杆菌，不需要添加任何底物即可发光；并且，在黑暗环境中通过肉眼便能看到发光菌落；

3)相对于现有的具有抗性标记的自主发光分枝杆菌，本发明的自主发光鲍曼不动杆菌没有抗性基因，其生理状态、药物敏感性更贴近于野生型，所以更加适用于大规模操作；

4)本发明制备得到的自主发光鲍曼不动杆菌发光强度高、稳定性强，CFU和RLU之间存在对应关系，所以可以用RLU(相对光单位)来代替CFU(菌落形成单位)作为分析细菌生长情况的依据；只需通过对光线的检测就可对该微生物在环境中的生长、活性、分布等进行实时在线监测，这是所有其它生物报告基因所不可比拟的；

5)本发明构建无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌的方法也适用于其它带有Xer-cise重组系统的细菌，极大地简便了遗传操作，为发光细菌的应用提供便利。

附图说明

图1为pUC18T-mini-Tn7T-lux-Tp质粒图谱；

图2为pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr质粒图谱；

图3为质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr的构建流程示意图；

图4为辅助质粒pTNS3图谱；

图5为发光菌的形态图；

图6为将传代后获得的发光菌分别涂于含有Apr抗性平板和无抗生素平板的结果图；其中6号克隆在无抗性平板(左边的平板)上生长，在Apr平板(右边的平板)上未生长。

图7为PCR筛选无抗性AlAb的电泳结果图；其中泳道M：2kb plus；泳道1-2：无抗AlAb；泳道3-4：有抗性的AlAb；

图8为本发明中AlAb的生长曲线，时间为横坐标，log₁₀RLU/mL为纵坐标；

图9为本发明中AlAb和Ab的生长曲线，其中，时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标，Ab为鲍曼不动杆菌，AlAb为实施例2制备的无抗性选择标记的自主发光鲍曼不动杆菌；

图10为本发明中UAlAb在不同抗生素不同浓度条件下的生长曲线，其中时间为横坐标，log₁₀RLU/mL为纵坐标。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明公开了一种无抗性选择标记的自主发光鲍曼不动杆菌的构建方法，其利用Tn7转座子系统将荧光素酶基因LuxCDABE整合到鲍曼不动杆菌的基因组中，实现荧光素酶在鲍曼不动杆菌中高效稳定的表达；所构建的鲍曼不动杆菌不存在基因工程改造过程中的抗性筛选标记，无需添加底物即可实现自主发光。

在一些实施例中，该方法共采用了两种质粒：辅助质粒pTNS3和转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr；转移质粒含有以反向重复系列Tn7L和Tn7R为侧翼的转座子序列，转座子序列含有安普霉素抗性基因Apr，荧光素酶基因LuxCDABE和位于Apr两端的同向重复序列DifR和DifL，DifR和DifL序列为Xer-cise特异性重组系统的识别位点，无需导入表达外源解离酶的碱基序列即可实现抗性基因的切除；辅助质粒包含有编码转座酶的基因TnsABCD；在一些实施例中，本发明的构建方法共同转化辅助质粒(pTNS3或pTNS2)和转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-dif-Apr；在一些实施例中，反向重复序列和编码转座酶的基因选自Tn7转座子系统。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。下述实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等，都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版，Sambrook J，Russe11 DW，Janssen K，Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

以下实施例中PCR反应所用的Trans Taq-T DNA Polymerase、dNTP以及相关试剂均购买自北京全式金生物技术；抗生素氨苄青霉素、安普霉素购自美仑生物技术有限公司；大肠杆菌感受态DH5a购买于广州东盛生物科技有限公司；DNA连接反应均采用Takara宝生物公司的T4DNA连接试剂盒；质粒DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒购自Magen(美基)生物公司；Biorad电转化仪(BioradGenePulser Xcel1)以及电转杯购自Biorad公司。

实施例1转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr的构建

(1)按照流程图3构建转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr。如图2所示，质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr按顺时针方向依次含有复制起始位点(ori)，氨苄抗性基因(AmpR)，安普霉素抗性基因(Apr)，荧光素酶基因(LuxCDABE)，位于AprR基因两端的同向重复序列DifR和DifL。各元件的功能如下：

LuxCDABE：即荧光素酶基因，是发光所需酶基因，该基因的表达使得宿主菌可以自主发光。

安普霉素抗性基因(AprR)：安普霉素抗性基因(Apr)是一种选择标记，用于筛选获得目的菌株；安普霉素抗性基因(Apr)在鲍曼不动杆菌和大肠杆菌中表达后，可使宿主菌获得对安普霉素(Apr)的抗性，即可在含有Apr的培养基中生长；安普霉素(Apramycin，缩写为Apr)是一种常用的抗性筛选药物，用于鲍曼不动杆菌的Apr浓度为100μg/mL，用于大肠杆菌的Apr浓度为50μg/mL。

同向重复序列dif：该序列可以被宿主菌自身的一种解离酶识别，并高效切除dif序列间的抗性基因，因而，可以在后续操作中去掉安普霉素抗性基因。

氨苄青霉素抗性基因(AmpR)：是一种筛选标记，用于筛选获得目的菌株；在大肠杆菌中表达后，可使宿主菌获得对氨苄青霉素(Amp)的抗性，即可在含有Amp的培养基中生长。

ori:负责质粒在大肠杆菌中复制的元件。

(2)转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-apr的具体构建方法如下：

S1、如图1所示，起始质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Tp(由弗吉尼亚医护大学JoannaB.Goldberg实验室惠赠，质粒图谱见图1)用限制性内切酶XbaΙ和BamHΙ消化后，回收约11kb的功能片段A；

S2、以质粒pMABH1(本实验室保存)为模板，用引物Ab-Dif-apr-F：

5’-CGGGATCCATGGTGTTCGTATAATGTATATTATGTTAAATCACCACCGACTATTTG-3’(SEQ IDNO.4)和引物Ab-Dif-apr-R：

5’-TGCTCTAGAAGCTTATTTAACATAATATACATTATACGAACAAGCTCAGCCAATCGAC-3’(SEQID NO.5)(其中下划线部分为dif序列)扩增出dif-Apr；

S3、用XbaΙ和BamHΙ酶切，获得954bp的功能片段B，该片段为两端带有来自鲍曼不动杆菌dif序列的安普霉素Apr基因片段；

S4、将功能片段A和功能片段B混合后，加入连接酶进行连接，获得重组质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含Apr的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养，提取质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr；用HindΙΙΙ和NcoΙ消化鉴定质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr，正确的质粒经酶切后跑胶结果是10931bp和934bp处各有一条带；再将酶切正确的质粒送去测序，以选取出dif片段不存在突变的质粒，以进行后续实验。

实施例2一种无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌的构建方法

1.电转化

(1)制备鲍曼不动杆菌感受态细胞，将待转菌单菌落(鲍曼不动杆菌，Acinetobacter baumannii)接种于15mL LB培养基中，37℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀在0.4-0.8，室温，12000g，离心5min，收集菌体。用10mL的10％甘油重新悬浮、洗涤菌体，室温，12000g，离心5min，倒净残液，重复2次。用500μL的10％的甘油重悬菌液并混匀合并。将感受态细胞分装成100uL/管，放-80℃冰箱，保存备用(最好每次都制备新的感受态)。

(2)将100μL的鲍曼不动杆菌感受态细胞转移至2mm的电转杯中，加入50ng的转移质粒pUC18T-mini-Tn7T-lux-Ab-dif-Apr(由实施例1制得)和50ng的辅助质粒pTNS3(pTNS3图谱参见图4)。轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置30min，加入电转仪前擦尽电转杯上的水分。

(3)用Biorad电转化仪进行电转化，以25μF，200Ω，2.5kV脉冲波进行电转化。此过程若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸。

(4)迅速加入1mL LB培养基，混匀后于37℃，振荡(200rpm)1h，充分复活细菌使其抗性表达。

(5)取100μL菌液涂布于含100μg/mL安普霉素抗性的LB固体培养基上，剩余菌液在13000g下离心2min，弃去上清液后用200μL LB培养基重悬，将菌液再次涂布于含100g/mLApr抗性的LB培养基上，于37℃培养直到产生明显菌落。

2.检测是否发生转座

1)挑取Apr板上生长的单菌落到含有20μL无菌水的1.5mL离心管中，混匀，将离心管放入发光检测仪器(普洛麦格公司的GLOMAX2020)，检测发光值大小。根据经验，一般发光值在100以下的可认定为不发光，发光值在10⁵或更高的可认定为发光很强，发光菌的形态如图5所示。

2)以上述得到的发光菌为模板，用

引物P_glmSF1：5’-TTTGCTGATGAAAATAGCGG-3’(SEQ ID NO.6)

和引物P_Tn7R：5’-CACAGCATAACTGGACTGATTTC-3’(SEQ ID NO.7)

进行PCR扩增，如果在240bp左右处有条带，则证明该单菌落发生转座，标记为AlAb。

3.传代培养AlAb

1)取AlAb以1:10000接种5mL到不含Apr的LB液体培养基中，并置于37℃，200rpm恒温摇床培养；含Apr抗性的菌落要进行第一代传代时，保存菌种，750μL菌液+250μL 80％甘油。一般保存在甘油20-30％，保存在-80℃。

2)当菌液OD₆₀₀达到0.7时，再将该菌液以1:10000接种5mL到不含Apr的LB液体培养基中，并置于37℃，200rpm恒温摇床培养。

3)在重复步骤2)达到4次左右后，将该菌液稀释后铺于无抗性的LB平板，并置于37℃恒温培养箱培养，24h后观察。

4.初步筛选抗性丢失AlAb

如果同一菌落的菌在无抗性LB平板上可生长而在含100μg/mL Apr的LB平板上未长起来，则初步断定该菌中已没有Apr基因。

具体筛选步骤如下：挑取上一步传代培养得到的单菌落，同步接种到无抗性的LB平板以及含100μg/mL Apr的LB平板。然后，将平板置于37℃恒温培养箱培养24h后观察，结果如图6所示。

5.PCR验证筛选的无抗性AlAb

使用下列引物Ab-Dif-apr-F：

5’-TGCTCTAGAAGCTTATTTAACATAATATACATTATACGAACAAGCTCAGCCAATCGAC-3’(SEQID NO.5)去扩增菌落的Apr抗性基因。

用该引物进行菌落PCR扩增和电泳验证dif-Apr-dif片段是否丢失，结果如图7所示。同时，从鉴定抗性已丢失的AlAb中取700μL菌液(即无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌UAlAb)加300μL 80％甘油，混匀后，保存于-80℃。

实施例3验证无抗性AlAb的发光稳定性

1)传代培养实施例2制得的无抗性AlAb

a.取AlAb以1:10000接种5mL到LB液体培养基中，并置于37℃，200rpm恒温摇床培养；

b.当菌液OD₆₀₀达到0.7时，再将该菌液以1:10000接种5mL到LB液体培养基中，并置于37℃，200rpm恒温摇床培养；

c.在重复步骤b数次后，将该菌液稀释后铺于无抗性的LB平板，并置于37℃恒温培养箱培养，24h后观察。

2)统计AlAb所占比例

当平板上菌落长出后，随机挑取200个单菌落并用发光检测仪检测RLUs。如果被检测单菌落的RLUs是Ab单菌落RLUs的5倍以上即大于200RLUs，则判定该单菌落为发光菌落。AlAb所占的比例为发光菌落数/200。

3)准备待测菌种

1)获取AlAb和Ab单菌落：将AlAb和Ab以划线接种的方式接种于无抗性LB平板培养，待37℃培养15h即可得到单菌落；

2)接种单菌落培养：从平板上挑取单菌落，接种到5mL的LB液体培养基，37℃，200rpm恒温摇床培养；

3)待液体培养AlAb和Ab的OD₆₀₀在0.5-0.7时，以1:10000的比例接种到5mL LB培养基，37℃，200rpm恒温摇床培养。

4)测定不同时间段的OD₆₀₀及RLUs并作记录

以接种时刻记做0h，开始测定时，每间隔1h便从培养基中取200μL菌液，检测RLUs及OD₆₀₀并作记录；RLUs(相对光单位)的测定一直持续到菌液RLUs开始降低为止。

5)绘制生长曲线

通过分析步骤4)所得数据，以时间为横坐标，log₁₀RLU/mL为纵坐标，绘制生长曲线：T-log₁₀RLU/mL，如图8所示；

以时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标，绘制生长曲线：T-OD₆₀₀，如图9所示。根据图8和图9所示的结果可知，本发明的无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌(AlAb)的生长曲线与野生型的鲍曼不动杆菌(Ab)一致，同时相对发光值的曲线与生长曲线基本相同，故本发明的无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌(AlAb)的生长不受插入基因的影响，其生长情况可以用发光值替代观察。

实施例4无抗性标记的自主发光鲍曼不动杆菌(UAlAb)的药物敏感性的测定

1.获得UAlAb和Ab单菌落

自-80℃取出冻存的无抗性标记的鲍曼不动杆菌(UAlAb)和野生型的鲍曼不动杆菌(Ab)，放在碎冰上融化，采用划线法接种到无抗的LB固体平板上，37℃培养箱中培养12h即可获得单菌落。

2.配置药液：

分别称取25.6mg的替加环素、左氧氟沙星、安普霉素与多粘菌素B溶于10mLDMSO中，配成2560μg/mL的抗生素母液，将母液与培养基按照1:9比例进行稀释，获得待测药液①。

3.制备待测菌液：

从1中挑取1个野生型的鲍曼不动杆菌单菌落Ab，接到5mLMH肉汤培养基中，37℃，200rpm培养4～5h，利用比浊仪调整菌液比浊度至0.5麦氏。此时细菌浓度相当于(1～2)×10⁸CFU/mL，制成Ab待测菌液，将待测菌液用MH肉汤再稀释1000倍，此时菌液浓度为(1～2)×10⁵CFU/mL，为待测菌悬液，剩余液体可在平板上检测纯度。

从1中挑取1个自主发光的鲍曼不动杆菌(UAlAb)单菌落，接到5mLMH肉汤培养基中，37℃，200rpm培养4～5h，将菌液用MH肉汤培养基稀释到相对发光值(RLU)在3000-5000，为待测菌液。

4.MIC测定

1>使用96孔板，在第一列孔中加入200μl待测菌液①，逐次2倍稀释至11孔，每孔液体为100μl。往96孔板中加入100μlAb待测菌悬液。每个浓度做三个重复。其中需要设置空白对照和不含抗生素加细菌的对照。37℃培养16～20h。

2>根据野生型鲍曼不动杆菌的MIC，制备检测浓度为4MIC，2MIC，MIC，1/2MIC，1/4MIC的待测溶液，将待测溶液加入1.5mL的Ep管中，往Ep管中加入100μlUAlAb待测菌悬液，每个浓度做三个平行。其中需要设置空白对照和不含抗生素加细菌的对照。37℃培养，每隔两个小时检测一次相对发光值(RLU)。

5.MIC的判定

1>野生型的鲍曼不动杆菌MIC的判定：通过肉眼判定MIC，若相邻两孔中，一孔出现菌落或浑浊，一孔澄清，澄清孔对应的抗生素浓度即为MIC，同时可以辅助酶标仪测定OD₆₂₀，辅助判断MIC(待测孔OD₆₂₀值与空白对照相近，并且肉眼观测澄清即为MIC)。

2>自主发光的鲍曼不动杆菌MIC的判定：通过检测发光值，以相比于对照组发光值90％不发光的最小浓度为MIC。

UAlAb在不同抗生素不同浓度条件下的生长曲线如图10所示，UAlAb和Ab对抗生素的敏感性检测结果如表1所示。

表1:抗生素敏感性检测结果

Ab:野生型的鲍曼不动杆菌；UAlAb:无抗性标记的自主发光的鲍曼不动杆菌。

根据表1的检测结果，说明我们在野生型的Ab中转座插入luxCDABE基因后制备的UAlAb对抗生素敏感性与野生型Ab相同，UAlAb可以代替野生型Ab用于筛选和评价新的化合物和抗生素。

实施例5检测抗性基因的去除效率

传代培养实施例2制得的无抗性AlAb

1.取在Apr抗性平板上转化出的AlAb以1:10000接种5mL到LB液体培养基中，并置于37℃，200rpm恒温摇床培养；

2.当培养到12h时即达到指数生长末期后，再将该菌液以1:10000接种5mL到LB液体培养基中，并置于37℃，200rpm恒温摇床培养；

3.2中每次进行传代时，将菌液适当稀释后涂布到无抗性的LB固体平板上，37℃培养箱中培养得到单菌落，共进行5次传代培养。

4.从每次传代培养时涂布的平板上随机挑取50个单菌落同时转接到无抗的LB平板和含Apr 100μg/mL的LB固体平板上，37℃培养箱中培养24h后，统计可以在无抗性的平板上生长而不能在Apr抗性平板上生长的菌落数，计算切除效率，切除效率＝不能在Apr抗性平板上生长的菌落数/50，结果如表2所示。

表2：抗性基因切除的效率

传代次数	不能在Apr抗性平板上生长的菌落数	切除效率
			第一代	1/50	2％
第二代	2/50	4％
			第三代	5/50	10％
第四代	10/50	20％
			第五代	14/50	28％

根据表2可知，随着自主发光鲍曼不动杆菌传代次数的增加，抗性基因切除的效率也越来越高，说明dif序列在鲍曼不动杆菌增殖过程中可以被Xer重组酶识别，从而高效的切除dif序列间的抗性基因。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院

<120> 一种自主发光的鲍曼不动杆菌及其构建方法和应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 200

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtgggcgga caataaagtc ttaaactgaa caaaatagat ctaaactatg acaataaagt 60

cttaaactag acagaatagt tgtaaactga aatcagtcca gttatgctgt gaaaaagcat 120

actggacttt tgttatggct aaagcaaact cttcattttc tgaagtgcaa attgcccgtc 180

gtattaaaga ggggcgtggg 200

<210> 2

<211> 166

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 人工序列

<222> (1)..(7)

<400> 2

aaccagataa gtgaaatcta gttccaaact attttgtcat ttttaatttt cgtattagct 60

tacgacgcta cacccagttc ccatctattt tgtcactctt ccctaaataa tccttaaaaa 120

ctccatttcc acccctccca gttcccaact attttgtccg cccaca 166

<210> 3

<211> 6110

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctaaag caaactcttc attttctgaa gtgcaaattg cccgtcgtat taaagagggg 60

cgtggccaag ggcatggtaa agactatatt ccatggctaa cagtacaaga agttccttct 120

tcaggtcgtt cccaccgtat ttattctcat aagacgggac gagtccatca tttgctatct 180

gacttagagc ttgctgtttt tctcagtctt gagtgggaga gcagcgtgct agatatacgc 240

gagcagttcc ccttattacc tagtgatacc aggcagattg caatagatag tggtattaag 300

catcctgtta ttcgtggtgt agatcaggtt atgtctactg attttttagt ggactgcaaa 360

gatggtcctt ttgagcagtt tgctattcaa gtcaaacctg cagcagcctt acaagacgag 420

cgtaccttag aaaaactaga actagagcgt cgctattggc agcaaaagca aattccttgg 480

ttcattttta ctgataaaga aataaatccc gtagtaaaag aaaatattga atggctttat 540

tcagtgaaaa cagaagaagt ttctgcggag cttttagcac aactatcccc attggcccat 600

atcctgcaag aaaaaggaga tgaaaacatt atcaatgtct gtaagcaggt tgatattgct 660

tatgatttgg agttaggcaa aacattgagt gagatacgag ccttaaccgc aaatggtttt 720

attaagttca atatttataa gtctttcagg gcaaataagt gtgcagatct ctgtattagc 780

caagtagtga atatggagga gttgcgctat gtggcaaatt aatgaggttg tgctatttga 840

taatgatccg tatcgcattt tggctataga ggatggccaa gttgtctgga tgcaaataag 900

cgctgataaa ggagttccac aagctagggc tgagttgttg ctaatgcagt atttagatga 960

aggccgctta gttagaactg atgaccctta tgtacatctt gatttagaag agccgtctgt 1020

agattctgtc agcttccaga agcgcgagga ggattatcga aaaattcttc ctattattaa 1080

tagtaaggat cgtttcgacc ctaaagtcag aagcgaactc gttgagcatg tggtccaaga 1140

acataaggtt actaaggcta cagtttataa gttgttacgc cgttactggc agcgtggtca 1200

aacgcctaat gcattaattc ctgactacaa aaacagcggt gcaccagggg aaagacgttc 1260

agcgacagga acagcaaaga ttggccgagc cagagaatat ggtaagggtg aaggaaccaa 1320

ggtaacgccc gagattgaac gcctttttag gttgaccata gaaaagcacc tgttaaatca 1380

aaaaggtaca aagaccaccg ttgcctatag acgatttgtg gacttgtttg ctcagtattt 1440

tcctcgcatt ccccaagagg attacccaac actacgtcag tttcgttatt tttatgatcg 1500

agaataccct aaagctcagc gcttaaagtc tagagttaaa gcaggggtat ataaaaaaga 1560

cgtacgaccc ttaagtagta cagccacttc tcaggcgtta ggccctggga gtcgttatga 1620

gattgatgcc acgattgctg atatttattt agtggatcat catgatcgcc aaaaaatcat 1680

aggaagacca acgctttaca ttgtgattga tgtgtttagt cggatgatca cgggctttta 1740

tatcggcttt gaaaatccgt cttatgtggt ggcgatgcag gcttttgtaa atgcttgctc 1800

tgacaaaacg gccatttgtg cccagcatga tattgagatt agtagctcag actggccgtg 1860

tgtaggtttg ccagatgtgt tgctagcgga ccgtggcgaa ttaatgagtc atcaggtcga 1920

agccttagtt tctagtttta atgtgcgagt ggaaagtgct ccacctagac gtggcgatgc 1980

taaaggcata gtggaaagca cttttagaac actacaagcc gagtttaagt cctttgcacc 2040

tggcattgta gagggcagtc ggatcaaaag ccatggtgaa acagactata ggttagatgc 2100

atctctgtcg gtatttgagt tcacacaaat tattttgcgt acgatcttat tcagaaataa 2160

ccatctggtg atggataaat acgatcgaga tgctgatttt cctacagatt taccgtctat 2220

tcctgtccag ctatggcaat ggggtatgca gcatcgtaca ggtagtttaa gggctgtgga 2280

gcaagagcag ttgcgagtag cgttactgcc tcgccgaaag gtctctattt cttcatttgg 2340

cgttaatttg tggggtttgt attactcggg gtcagagatt ctgcgtgagg gttggttgca 2400

gcggagcact gatatagcta gacctcaaca tttagaagcg gcttatgacc cagtgctggt 2460

tgatacgatt tatttgtttc cgcaagttgg cagccgtgta ttttggcgct gtaatctgac 2520

ggaacgtagt cggcagttta aaggtctctc attttgggag gtttgggata tacaagcaca 2580

agaaaaacac aataaagcca atgcgaagca ggatgagtta actaaacgca gggagcttga 2640

ggcgtttatt cagcaaacca ttcagaaagc gaataagtta acgcccagta ctactgagcc 2700

caaatcaaca cgcattaagc agattaaaac taataaaaaa gaagccgtga cctcggagcg 2760

taaaaaacgt gcggagcatt tgaagccaag ctcttcaggt gatgaggcta aagttattcc 2820

tttcaacgca gtggaagcgg atgatcaaga agattacagc ctacccacat acgtgcctga 2880

attatttcag gatccaccag aaaaggatga gtcatgagtg ctacccggat tcaagcagtt 2940

tatcgtgata cgggggtaga ggcttatcgt gataatcctt ttatcgaggc cttaccacca 3000

ttacaagagt cagtgaatag tgctgcatca ctgaaatcct ctttacagct tacttcctct 3060

gacttgcaaa agtcccgtgt tatcagagct cataccattt gtcgtattcc agatgactat 3120

tttcagccat taggtacgca tttgctacta agtgagcgta tttcggtcat gattcgaggt 3180

ggctacgtag gcagaaatcc taaaacagga gatttacaaa agcatttaca aaatggttat 3240

gagcgtgttc aaacgggaga gttggagaca tttcgctttg aggaggcacg atctacggca 3300

caaagcttat tgttaattgg ttgttctggt agtgggaaga cgacctctct tcatcgtatt 3360

ctagccacgt atcctcaggt gatttaccat cgtgaactca atgtagagca ggtggtgtat 3420

ttgaaaatag actgctcgca taatggttcg ctaaaagaaa tctgcttgaa ttttttcaga 3480

gcgttggatc gagccttggg ctcgaactat gagcgtcgtt atggcttaaa acgtcatggt 3540

atagaaacca tgttggcttt gatgtcgcaa atagccaatg cacatgcttt agggttgttg 3600

gttattgatg aaattcagca tttaagccgc tctcgttcgg gtggatctca agagatgctg 3660

aacttttttg tgacgatggt gaatattatt ggcgtaccag tgatgttgat tggtacccct 3720

aaagcacgag agatttttga ggctgatttg cggtctgcac gtagaggggc agggtttgga 3780

gctatattct gggatcctat acaacaaacg caacgtggaa agcccaatca agagtggatc 3840

gcttttacgg ataatctttg gcaattacag cttttacaac gcaaagatgc gctgttatcg 3900

gatgaggtcc gtgatgtgtg gtatgagcta agccaaggag tgatggacat tgtagtaaaa 3960

ctttttgtac tcgctcagct ccgtgcgcta gctttaggca atgagcgtat taccgctggt 4020

ttattgcggc aagtgtatca agatgagtta aagcctgtgc accccatgct agaggcatta 4080

cgctcgggta tcccagaacg cattgctcgt tattctgatc tagtcgttcc cgagattgat 4140

aaacggttaa tccaacttca gctagatatc gcagcgatac aagaacaaac accagaagaa 4200

aaagcccttc aagagttaga taccgaagat cagcgtcatt tatatctgat gctgaaagag 4260

gattacgatt caagcctgtt aattcccact attaaaaaag cgtttagcca gaatccaacg 4320

atgacaagac aaaagttact gcctcttgtt ttgcagtggt tgatggaagg cgaaacggta 4380

gtgtcagaac tagaaaagcc ctccaagagt aaaaaggttt cggctataaa ggtagtcaag 4440

cccagcgact gggatagctt gcctgatacg gatttacgtt atatctattc acaacgccaa 4500

cctgaaaaaa ccatgcatga acggttaaaa gggaaagggg taatagtgga tatggcgagc 4560

ttatttaaac aagcaggtta gccatgagaa actttcctgt tccgtactcg aatgagctga 4620

tttatagcac tattgcacgg gcaggcgttt atcaagggat tgttagtcct aagcagctgt 4680

tggatgaggt gtatggcaac cgcaaggtgg tcgctacctt aggtctgccc tcgcatttag 4740

gtgtgatagc aagacatcta catcaaacag gacgttacgc tgttcagcag cttatttatg 4800

agcatacctt attcccttta tatgctccgt ttgtaggcaa ggagcgccga gacgaagcta 4860

ttcggttaat ggagtaccaa gcgcaaggtg cggtgcattt aatgctagga gtcgctgctt 4920

ctagagttaa gagcgataac cgctttagat actgccctga ttgcgttgct cttcagctaa 4980

ataggtatgg ggaagccttt tggcaacgag attggtattt gcccgctttg ccatattgtc 5040

caaaacacgg tgctttagtc ttctttgata gagctgtaga tgatcaccga catcaatttt 5100

gggctttggg tcatactgag ctgctttcag actaccccaa agactcccta tctcaattaa 5160

cagcactagc tgcttatata gcccctctgt tagatgctcc acgagcgcaa gagctttccc 5220

caagccttga gcagtggacg ctgttttatc agcgcttagc gcaggatcta gggctaacca 5280

aaagcaagca cattcgtcat gacttggtgg cggagagagt gaggcagact tttagtgatg 5340

aggcactaga gaaactggat ttaaagttgg cagagaacaa ggacacgtgt tggctgaaaa 5400

gtatattccg taagcataga aaagccttta gttatttaca gcatagtatt gtgtggcaag 5460

ccttattgcc aaaactaacg gttatagaag cgctacagca ggcaagtgct cttactgagc 5520

actctataac gacaagacct gttagccagt ctgtgcaacc taactctgaa gatttatctg 5580

ttaagcataa agactggcag caactagtgc ataaatacca aggaattaag gcggcaagac 5640

agtctttaga gggtggggtg ctatacgctt ggctttaccg acatgacagg gattggctag 5700

ttcactggaa tcaacagcat caacaagagc gtctggcacc cgcccctaga gttgattgga 5760

accaaagaga tcgaattgct gtacgacaac tattaagaat cataaagcgt ctagatagta 5820

gccttgatca cccaagagcg acatcgagct ggctgttaaa gcaaactcct aacggaacct 5880

ctcttgcaaa aaatctacag aaactgcctt tggtagcgct ttgcttaaag cgttactcag 5940

agagtgtgga agattatcaa attagacgga ttagccaagc ttttattaag cttaaacagg 6000

aagatgttga gcttaggcgc tggcgattat taagaagtgc aacgttatct aaagagcgga 6060

taactgagga agcacaaaga ttcttggaaa tggtttatgg ggaagagtga 6110

<210> 4

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgggatccat ggtgttcgta taatgtatat tatgttaaat caccaccgac tatttg 56

<210> 5

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tgctctagaa gcttatttaa cataatatac attatacgaa caagctcagc caatcgac 58

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttgctgatg aaaatagcgg 20

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cacagcataa ctggactgat ttc 23

Claims

1.一种用于转化鲍曼不动杆菌的转移质粒，其特征在于，所述转移质粒按照顺时针依次含有复制子ori、氨苄抗性基因AmpR、转座子序列、接合转移起始位点oriT，其中，所述转座子序列含有能使鲍曼不动杆菌自主发光的基因以及抗性基因，所述的抗性基因的两端带有DifR和DifL序列。

2.根据权利要求1所述的转移质粒，其特征在于，所述能使鲍曼不动杆菌自主发光的基因为LuxCDABE基因；所述抗性基因为安普霉素抗性基因和/或甲氧苄啶抗性基因；所述转座子序列按顺时针依次含有反向重复序列Tn7R、抗性基因、启动子、LuxCDABE基因和反向重复序列Tn7L。

3.一种如权利要求1或2所述的用于转化鲍曼不动杆菌的转移质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2a)中PCR扩增用的引物对如SEQ ID NO:4和如SEQ ID NO:5所示。

5.一种自主发光的鲍曼不动杆菌，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌的基因组中含有能表达自主发光蛋白的基因，且鲍曼不动杆菌的基因组中没有抗性筛选基因；优选地，所述能表达自主发光蛋白的基因为LuxCDABE基因。

6.一种自主发光的鲍曼不动杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1b)提供权利要求1或2所述的转移质粒；

(2b)将步骤(1b)的转移质粒和表达转座酶基因的辅助质粒同时转入鲍曼不动杆菌感受态细胞中，涂于Apr抗性的LB平板，得到自主发光的鲍曼不动杆菌。

7.根据权利要求7所述鲍曼不动杆菌的构建方法，其特征在于，还包括步骤(3b)：将步骤(2b)获得的自主发光鲍曼不动杆菌传代培养，筛选出抗性基因丢失的发光菌，获得无抗性筛选标记的自主发光鲍曼不动杆菌。

8.一种采用如权利要求6或7所述方法构建得到的鲍曼不动杆菌。

9.一种用于构建自主发光的鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的转移质粒，以及表达转座酶基因的辅助质粒。

10.如权利要求5或8所述的的鲍曼不动杆菌在制备或筛选抗鲍曼不动杆菌感染的药物中的应用。