CN109234219A - 一种自主发光堪萨斯分枝杆菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种自主发光堪萨斯分枝杆菌，该自主发光堪萨斯分枝杆菌基于堪萨斯分枝杆菌，采用电转化法，插入重组质粒pOPTIg，经传代培养筛选而成。本发明提供的自主发光堪萨斯分枝杆菌在传代培养中更加稳定；本发明设计的一种自主发光堪萨斯分枝杆菌的构建方法，在该构建过程中，提供重组质粒pOPTIg，该重组质粒pOPTIg转入堪萨斯分枝杆菌中经过筛选，从而获得抗性基因、整合酶基因和整合位点均丢失的无抗性筛选标记的自主发光堪萨斯分枝杆菌。

Description

一种自主发光堪萨斯分枝杆菌及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种自主发光堪萨斯分枝杆菌及其构建方法。

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易染色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱酸剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fastbacilli)。该菌属无鞭毛、无芽孢，一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。

堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteria Kansasii，M.Kansasii)是一种慢生长型非结核分枝杆菌(Nontuberculosis Mycobacteria,NTM)，于1953年被命名。堪萨斯分枝杆菌可引起慢性肺病，其组织病理学特征与结核病极为相似，包括急性化脓、非坏死性结节或干酪化坏死。在艾滋病患者或其他免疫能力低下的患者中，可能会缺乏很多组织学特征。堪萨斯分枝杆菌还可以引起皮肤和皮下组织疾病，甚至可能会转移，引起淋巴炎症或播散型疾病。堪萨斯分枝杆菌的感染在全世界大部分区域都有报道。由堪萨斯结核杆菌引起的感染症在非结核分枝杆菌症中，排在第二位。

堪萨斯分枝杆菌患者推荐治疗方案为利福平10mg/(kg·d)(最大量600mg/d)、异烟肼5mg/(kg·d)(最大量300mg/d)、乙胺丁醇15mg/(kg·d)，疗程用至痰培养阴转12个月。对于利福平耐药的堪萨斯分枝杆菌病患者，推荐以体外药敏为基础、由包括克拉霉素或阿奇霉素、莫西沙星、乙胺丁醇、磺胺甲公式唑或链霉素等3～4种药物组成治疗方案，疗程直至痰培养阴转12～15个月。目前对于堪萨斯分枝杆菌患者的治疗周期长，药物副作用大，急需研发新型抗生素。此菌生长缓慢，药敏实验需要7-14天才能完成，因此，构建新型的高通量筛药模型对于寻找能够有效治疗堪萨斯分枝杆菌的药物具有重要的临床意义。

目前，对分枝杆菌进行遗传操作，通常采用卡那霉素抗性基因或潮霉素抗性基因作为抗性筛选标记，本次发明涉及的抗硫链丝菌素基因是首次作为抗性筛选标记在堪萨斯分枝杆菌中应用。

此次专利首次将硫链丝菌素抗性基因作为堪萨斯分枝杆菌的抗性筛选标记，同时，此次专利首次将整合酶基因和整合酶整合位点在传代中共同丢失，自主发光的堪萨斯分枝杆菌在传代培养中更加稳定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种自主发光堪萨斯分枝杆菌，该自主发光堪萨斯分枝杆菌基于堪萨斯分枝杆菌，采用电转化法，插入重组质粒pOPTIg，经传代培养筛选而成，该自主发光堪萨斯分枝杆菌在传代培养中更加稳定；本发明设计的一种自主发光堪萨斯分枝杆菌的构建方法，在该构建过程中，提供重组质粒pOPTIg，该重组质粒pOPTIg转入堪萨斯分枝杆菌中经过筛选，从而获得抗性基因、整合酶基因和整合位点均丢失的无抗性筛选标记的自主发光堪萨斯分枝杆菌。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种自主发光堪萨斯分枝杆菌，所述自主发光堪萨斯分枝杆菌基于堪萨斯分枝杆菌，采用电转化法，插入重组质粒pOPTIg，经传代培养筛选而成；

所述重组质粒pOPTIg的核苷酸序列为：SEQ ID NO:5；

所述重组质粒pOPTIg按顺时针方向依次含有启动子、发光所需酶基因luxCDABE、抗性筛选基因Tsr、整合酶基因Int、整合酶整合位点attP的融合基因以及复制子，所述融合基因两端含有同向重复序列DifL和DifR；

所述整合酶基因Int和所述整合酶整合位点attP分别为分枝杆菌噬菌体Giles的整合酶Int和整合位点attP，其序列为：SEQ ID NO:1；

所述抗性筛选基因Tsr为硫链丝菌素抗性基因Tsr，其序列为：SEQ ID NO:4。

进一步地，所述DifL的序列为：SEQ ID NO:2；所述DifR的序列为：SEQ ID NO:3。

进一步地，所述重组质粒pOPTIg的构建包括以下步骤：

1)构建质粒pUCDTIg-A：将质粒pUC18用限制性内切酶EcoR I和Nde I消化，回收约2.5kb的功能片段A；以质粒pGH1000A为模板，用引物intattpf与引物intattpr扩增出约1.6kb的Int-attP片段(SEQ ID NO:1)，所述引物intattpf与所述引物intattpr的序列依次如SEQ ID NO:6-7所示；

所述Int-attP片段经Nde I和Hand III酶切后获得功能片段B；以质粒pDYN6902为模板，用引物Tsrf与引物Tsrr扩增出约1.2kb的Tsr片段(SEQ ID NO:4)，所述引物Tsrf与所述引物Tsrr的序列依次如SEQ ID NO:8-9所示；

所述Tsr片段经EcoR I和Hand III酶切后获得功能片段C，将所述功能片段A、所述功能片段B、所述功能片段C进行连接，得到约5.2kb的质粒pUCTI，再将质粒pUCTI中的Int基因内部的Xho I两个酶切位点进行点突变，获得质粒pUCTIg-A；

2)构建质粒pUCDTIg-B：将质粒pUCTIg-A用限制性内切酶Xba I消化，回收约2.9kb的功能片段D(Xba I-Int-attP-Tsr-Xba I)；将质粒pUCDHmke用限制性内切酶Xba I消化，回收约2.8kb的功能片段E；将所述功能片段D(Xba I-Int-attP-Tsr-Xba I)、所述功能片段E进行连接，得到约5.7kb的质粒pUCDTIg-B；

3)构建质粒pOPTIg：将质粒pOPHI用限制性内切酶Xho I消化，回收约10kb的功能片段F；将质粒pUCDTIg-B用限制性内切酶Xho I消化，回收约2.9kb的功能片段G(Xho I-DifL-Int-attP-Tsr-DifR-Xho I)；将所述功能片断F、所述功能片断G(Xho I-DifL-Int-attP-Tsr-DifR-Xho I)进行连接，得到约13kb的质粒pOPTIg。

一种自主发光堪萨斯分枝杆菌的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

步骤1)：使用电转化法将所述重组质粒pOPTIg转入堪萨斯分枝杆菌中，得原始堪萨斯分枝杆菌；

步骤2)：所述原始堪萨斯分枝杆菌经传代培养，筛选出所述抗性筛选基因Tsr、所述整合酶基因Int和所述整合酶整合位点attP均丢失的菌种，即得无抗性筛选标记的自主发光堪萨斯分枝杆菌。

进一步地，步骤2)的具体操作为：取步骤1)中得到的原始堪萨斯分枝杆菌，挑取少量所述原始堪萨斯分枝杆菌菌落到无抗性的7H9培养基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和有所述抗性筛选基因Tsr的7H11板上，37℃培养，挑取在有所述抗性筛选基因Tsr的7H11板上未长出，而在相应的无抗生素的7H11上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于有所述抗性筛选基因Tsr的板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失所述抗性筛选基因Tsr抗性的克隆，得无抗性筛选标记的自主发光堪萨斯分枝杆菌。

本发明的有益效果是：

1、本发明是首次将硫链丝菌素抗性基因作为抗性筛选基因标记应用到堪萨斯分枝杆菌中，提供了含有硫链丝菌素抗性基因的用于构建自主发光堪萨斯分枝杆菌的质粒pOPTIg，为后续的堪萨斯分枝杆菌遗传操作提供一个新的方法。

2、本发明提供的由质粒pOPTIg构建的自主发光堪萨斯分枝杆菌，不需要添加任何底物即可发光，并且，在黑暗环境中通过肉眼便可看到发光菌落。

3、本发明制备得到的质粒pOPTIg可转入堪萨斯分枝杆菌中，从而得到可自主发光的堪萨斯分枝杆菌；并且，通过不同药物MIC测定结果分析可知，转入的质粒pOPTIg对堪萨斯分枝杆菌的生长及药物敏感性无影响，即自主发光堪萨斯分枝杆菌可替代野生堪萨斯分枝杆菌进行药物敏感性检测；同时，由实验结果分析得知堪萨斯分枝杆菌的CFU和RLU之间存在对应关系，所以可以用RLU来代替CFU作为分析细菌生长情况依据，使得堪萨斯分枝杆菌体外检测药物活性更加方便、快捷和经济。

4、本发明的自主发光分枝杆菌采用一些方法将抗性基因丢失，以使该抗性基因作为抗性筛选标记在自主发光堪萨斯分枝杆菌中二次应用成为可能。本发明构建的自主发光堪萨斯分枝杆菌的硫链丝菌素抗性基因已丢失，故对该自主发光堪萨斯分枝杆菌进行后续遗传操作时，仍可选用硫链丝菌素抗性基因作为筛选标记。

5、本发明提供的自主发光堪萨斯分枝杆菌涉及的抗硫链丝菌素基因是首次作为抗性筛选标记在堪萨斯分枝杆菌中应用。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明提供的质粒pUCDTIg-A的构建流程图；

图2是本发明提供的质粒pGH1000A酶切图谱；

图3是本发明提供的质粒pDYN6902酶切图谱；

图4是本发明提供的质粒pUCDTIg-A的构建示意图；

图5是本发明提供的质粒pUCDTIg-B的构建流程图；

图6是本发明提供的质粒pUCDTIg-B的构建示意图；

图7是本发明提供的质粒pOPTIg的构建流程图；

图8是本发明提供的质粒pOPTIg的构建示意图；

图9是本发明提供的质粒pOPTIg酶切图谱。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版)(Sambrook J，Russell DW，JanssenK，Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

实施例1：

一种自主发光堪萨斯分枝杆菌，自主发光堪萨斯分枝杆菌基于堪萨斯分枝杆菌，采用电转化法，插入了重组质粒pOPTIg，经传代培养筛选而成；

如图1所示，重组质粒pOPTIg按顺时针方向依次含有启动子(Hsp60promoter)，发光所需酶基因(luxCDABE)，抗性筛选基因Tsr(SEQ ID NO:4)、整合酶基因Int和整合酶整合位点attP(SEQ ID NO:1)的融合基因、位于融合基因两端的同向重复序列DifL(SEQ ID NO:2)和DifR(SEQ ID NO:3)，以及氨苄青霉素抗性基因(Ampr)和复制子(Rep)；各元件的功能如下：

启动子(Hsp60promoter)：一种分枝杆菌强启动子，可以启动后续基因的强表达；

发光所需酶基因(luxCDABE)：发光所需酶基因，该基因的表达使得宿主菌可以自主发光；

抗性筛选基因Tsr：抗性筛选基因Tsr即硫链丝菌素抗性基因(Tsr)，是一种选择标记，用于筛选获得目的菌株，硫链丝菌素抗性基因(Tsr)在堪萨斯分枝杆菌和大肠杆菌中表达后，可使宿主菌获得对硫链丝菌素(Tsr)的抗性，即可在含有Tsr的培养基中生长，硫链丝菌素(Thiostrepton，Tsr)是一种抗性筛选药物，用于堪萨斯分枝杆菌的Tsr浓度为10ug/ml；

整合酶基因Int：可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中，整合酶的作用是可逆的，即它既可以将含有attP的序列的质粒整合进基因组attB位点，也可以再将其解离下来，因此，在最终的目标菌中，如不含有该基因不会起到解离作用，则构建的菌株可更稳定；

整合酶整合位点attP：整合酶获得表达后，可通过结合此位点将整个质粒整合进分枝杆菌的基因组中的attB位点，即此位点的主要作用是被整合酶结合，起整合到基因组的作用，因此，在最终的目标菌中，如不含有该整合位点，则构建的菌株可更稳定；

同向重复序列Dif：该序列可以被分枝杆菌自身的一种解离酶识别，并高效切除，因而可以在后续操作中去掉硫链丝菌素抗性基因、整合酶基因和整合位点；

氨苄青霉素抗性基因(Ampr)：是一种筛选标记，但只在大肠杆菌等细菌中起作用，在分枝杆菌中无作用，因为分枝杆菌对氨苄青霉素天然耐药；

复制子(Rep)：负责质粒在大肠杆菌中复制的元件。

质粒pOPTIg的具体构建方法如下：

1)质粒pUCTIg-A的构建

如图2至图4所示，起始质粒pUC18用限制性内切酶EcoR I和Nde I消化后，回收约2.5kb的功能片段A；以质粒pGH1000A为模板，用引物intattpf：5’-CCCAAGCTTTCCTTTTGGAATGATGATCGCC-3’(SEQ ID NO:6)与引物intattpr：5’-GGAATTCCATATGTCTAGACGGTCACCCCCGCCGGTTTGAC-3’(SEQ ID NO:7)扩增出约1.6kb的Int-attP片段(SEQID NO:1)(含来自分枝杆菌噬菌体Giles的Int-attP)，片段Int-attP经Nde I和Hand III酶切后获得功能片段B；以质粒pDYN6902为模板，用引物Tsrf：5’-GGAATTCTCTAGAGGGATTGTCTTTCTTCAGCTC-3’(SEQ ID NO:8)与引物Tsrr：5’-CCCAAGCTTTTATCGGTTGGCCGCGAGATTC-3’(SEQ ID NO:9)扩增出约1.2kb的Tsr片段(SEQ ID NO:4)，片段Tsr经EcoR I和Hand III酶切后获得功能片段C，将功能片段A、功能片段B、功能片段C混合后，加入连接酶进行连接获得重组质粒pUCTI，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒pUCTI；用Xba I单切鉴定，正确的质粒经酶切后跑胶结果应该是2.9kb和2.4kb处各有一条带；再将酶切正确的质粒送去测序，选取出Int-attP-Tsr片段不存在突变的质粒进行后续实验，测序采用引物是pUC18通用引物；将质粒pUCTI送上海捷瑞生物工程有限公司进行突变，突变Int基因内部Xho I酶切位点(CTCGAG)突变为CTAGAG，从而去掉了内部的Xho I位点，形成质粒pUCTIg-A；

2)质粒pUCDTIg-B的构建

如图5至图6所示，将质粒pUCTIg-A用限制性内切酶Xba I消化，回收约2.9kb的功能片段D(Xba I-Int-attP-Tsr-Xba I)；将质粒pUCDHmke用限制性内切酶Xba I消化，回收约2.8kb的功能片段E；将功能片段D、功能片段E混合后，加入连接酶进行连接获得重组质粒pUCDTIg-B，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒pUCDTIg-B；用Xho I单切鉴定，正确的质粒经酶切后跑胶结果应该是2.9kb和2.6kb处各有一条带；此质粒可用于后续实验；

3)质粒pOPTIg的构建

如图7至图9所示，将质粒pOPHI用限制性内切酶Xho I消化，回收约10kb的功能片段F；将质粒pUCDTIg-B用限制性内切酶Xho I消化，回收约2.9kb的功能片断G(Xho I-DifL-Int-attP-Tsr-DifR-Xho I)；将功能片断F、功能片段G混合后，加入连接酶进行连接获得重组质粒pOPTIg，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒pOPTIg，用Spe I和Bgl II双酶切鉴定，正确的质粒精美且酶切后跑胶结果应该是8.9kb和4.1kb处各有一条带；此质粒可用于后续实验。

实施例2：

本发明提供了一种自主发光堪萨斯分枝杆菌的制备方法

本实施例涉及的7H9培养基、7H11培养基、吐温80均购自广州华奇盛生物公司。

Biorad电转仪(Biorad GenePulserXceII)以及电转杯购自Biorad公司。

1、需要准备的材料：

1)堪萨斯分枝杆菌(Mycobacteria Kansasii)

2)10％甘油+0.05％Tween 80+20mL甘油+180mL水+100uLTween 80，并用0.2um滤器过滤，要求新鲜配置，不得超过1周；

3)灭菌的玻璃珠，50mL离心管，Biorad的0.2cm电转杯，25mL移液管；

4)50mL长好的对数期的菌液[菌液的OD值，达到0.6-0.8]。带滤芯的1mL枪尖。

2、电转化

1)将待转菌(堪萨斯分枝杆菌，Mycobacteria Kansasii)接种至含有50mL 7H9(含0.1％Tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37℃摇菌培养扩增；

冻存甘油菌需要先加到含有5mL培养基的50mL离心管复壮，待长起之后，需取>2mL，接种到含有50mL 7H9(含0.1％Tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；

菌落需刮取上百个菌落加入含有50mL 7H9(含0.1％Tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；

普通生长的或在4℃保存的菌，接种时可以取1至5mL加入含有50mL 7H9(含0.1％Tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；

2)检测菌液的OD值，若达到0.6-0.8，则可进行电转化；

3)将40mL菌液转至50mL离心管中，加入10-13颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后，将菌落团打散，于4℃离心机中6000rpm离心8分钟；

4)加入40mL 10％甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于37℃离心机中8000rpm离心8分钟；

5)重复步骤4)2次后，留约1mL上清，用带滤芯的枪尖，吹吸充分混匀后于冰上放置；

6)于标记好的0.2cm的电转杯中，分别加入10uL浓缩后的质粒pOPTIg和200uL分枝杆菌(即堪萨斯分枝杆菌)感受态细胞，轻柔吹吸充分混匀后于37℃放置10分钟，加入电转仪前擦尽电转杯上的水分；

7)用Biorad电转化仪进行电转化，电转化条件为：电压2.5KV、电阻1000Ω、电容25uF脉冲波，未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于19-21微秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态，若感受态细胞洗得不干净或智力含盐较多，会发生爆炸；

8)迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2mL 7H9(含吐温80)培养基(先用1mL转移电转液，再用1mL洗涤电转杯)，转移至50mL离心管中；

9)于37℃孵箱中孵育4-12小时，充分复活细菌并使其抗性表达；

10)用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1mL/1.5mL tube分装，10000rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6mL 7H9培养基重悬后，以500uL/板铺于含抗生素(10ug/mL硫链丝菌素Tsr)的7H11培养板中，同时稀释一百倍后，以500uL/板的量铺Tsr板；

11)避光于37℃孵箱培养。

该电转化过程中，待转菌为堪萨斯分枝杆菌时，所用到的试剂及耗材均需于37℃预热，电转化全程需在室温中进行。

3、检测平板上生长出的单克隆菌落发光值的大小

1)将Tsr板上生长的单个菌，挑取到含有100ug 7H9培养基的1.5mL离心管中，混匀后，将离心管放入发光检测仪器(普洛麦格公司的GLOMAX2020)，检测发光值大小，根据经验，一般发光值在100以下的可认定为不发光，发光值在105或更高的可认定为发光很强；

2)选取发光值在105或更高的单克隆进行传代，筛选出抗性基因、整合酶基因和整合位点均丢失的发光菌即为目标菌株，即自主发光堪萨斯分枝杆菌。

2)中的具体筛选方法如下：

步骤a.连续传代摇菌培养：从平板上，挑取发光值在105或更高的单克隆接种到5mL 7H9培养基中，摇床震荡培养约7天。将培养所得的菌液适当稀释后，进行铺板，以每个平板长出5-50个菌落为宜；

步骤b.平板37℃培养7天后观察，挑取100-200个单菌落同时划线到无抗生素7H11板和含10ug/mL抗性筛选基因Tsr的7H11板，并对应编号；

步骤c.放置37℃培养箱培养7天左右，可观察在Tsr板上是否有未长出的克隆，而在相应的无抗板上长出，挑取相应的克隆到5mL 7H9培养基中培养约7天，取500uL培养物铺于Tsr板(10ug/mL)，培养7天，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失抗性筛选基因Tsr抗性的克隆，即丢失抗性筛选基因Tsr、整合酶基因Int和整合酶整合位点attP的克隆。

4、野生堪萨斯分枝杆菌与自主发光堪萨斯分枝杆菌对不同药物敏感性的测定

从常用来治疗堪萨斯分枝杆菌的药物中选取了利福平(RIF)、异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)及阿米卡星(AMK)，先以96孔板检测这些药物对自主发光堪萨斯分枝杆菌的液体MIC，之后，根据特性药物的液体MIC，制定出用平板法检测药物MIC时平板药物浓度设定方案，具体操作如下：

1)液体检测药物MIC时，根据相关文献报道，设定了带检测药物的浓度梯度，液体检测药物对堪萨斯分枝杆菌MIC的具体操作步骤如下：

步骤a.将自主发光堪萨斯分枝杆菌在7H9(含10％OADC及0.05％Tween 80)培养基培养至OD600在0.6左右时，对菌液进行稀释。当菌液被稀释至200uL菌液发光值在3000-5000之间时，将菌液加入96孔板中，每孔加入稀释后的菌液195uL；

步骤b.按照设定的浓度，将相应的药物(5uL)加入到96孔板中(96孔板的最边缘孔不加药物)，每种药物按同一种方案平行做3组；同时，在对照组中加入溶解药物的溶剂(5uL)，也做3组；

步骤c.以第一次加药记为d0，记录d0、d1、d2以及d3每孔菌发光值；

步骤d.根据液体数据分析得到液体MIClux(表2)，MIClux指加药组比不加药组的发光值低10倍时的药物浓度；

2)根据液体检测堪萨斯脓肿分枝杆菌对药物的敏感性，设定平板法检测药物MIC时选用的药物浓度，具体操作步骤如下：

步骤a.将野生堪萨斯分枝杆菌以及自主发光堪萨斯分枝杆菌在7H9(含10％OADC及0.05％Tween 80)培养基中培养至OD600在1.0左右；

步骤b.先以50倍稀释菌液，在稀释10-3、10-5后，各取10-3、10-5稀释度的菌液500uL铺含有不同药物浓度的7H11平板；

步骤c.待37℃培养7天后读板计数；

步骤d.最后确定的药物MIC见表1和表2；

表1

注：该表为平板法检测野生堪萨斯分枝杆菌与自主发光堪萨斯分枝杆菌对不同药物的MIC；

表2

注：该表为液体发检测野生堪萨斯分枝杆菌与自主发光堪萨斯分枝杆菌对不同药物的MIC_lux；

步骤e.由药物MIC测定结果可知，自主发光堪萨斯分枝杆菌对药物的敏感性与野生堪萨斯分枝杆菌相比无差异，并且，平板检测的堪萨斯分枝杆菌MIC结果与自主发光堪萨斯分枝杆菌液体检测的MIC结果一致，说明可以通过液体法检测发光堪萨斯分枝杆菌的发光情况来判定药物的杀菌和抑菌效果。

本发明主要是利用整合质粒pOPTIg，该质粒含有荧光素酶操纵子基因luxCDABE、抗性筛选基因Tsr、整合酶基因Int；其中，发光所需酶基因luxCDABE：荧光素酶操纵子基因luxCDABE，该系列基因的表达使得宿主菌可以自主发光；抗性筛选基因Tsr：抗性筛选基因Tsr是一种选择标记，用于筛选获得目的菌株；整合酶基因Int：来自分枝杆菌噬菌体Giles的整合酶基因，可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中；将此质粒电转入堪萨斯分枝杆菌中，使用硫链丝菌素筛选出阳性克隆，并检测到发光，即获得目标菌株。

本发明是首次将硫链丝菌素抗性基因作为抗性筛选标记应用到堪萨斯分枝杆菌中，提供了含有硫链丝菌素抗性基因的用于构建自主发光堪萨斯分枝杆菌的质粒pOPTIg，为后续的堪萨斯分枝杆菌遗传操作提供一个新的方法。

本发明由质粒pOPTIg构建的自主发光堪萨斯分枝杆菌，不需要添加任何底物即可发光，并且，在黑暗环境中通过肉眼便可看到发光菌落。

本发明制备得到的质粒pOPTIg可转入堪萨斯分枝杆菌中，从而得到可自主发光的堪萨斯分枝杆菌；并且，通过不同药物MIC测定结果分析可知，转入的质粒pOPTIg对堪萨斯分枝杆菌的生长及药物敏感性无影响，即自主发光堪萨斯分枝杆菌可替代野生堪萨斯分枝杆菌进行药物敏感性检测；同时，由实验结果分析得知堪萨斯分枝杆菌的CFU和RLU之间存在对应关系，所以可以用RLU来代替CFU作为分析细菌生长情况依据，使得堪萨斯分枝杆菌体外检测药物活性更加方便、快捷和经济。

本发明的自主发光分枝杆菌采用一些方法将抗性基因丢失，以使该抗性基因作为抗性筛选标记在自主发光堪萨斯分枝杆菌中二次应用成为可能；本发明构建的自主发光堪萨斯分枝杆菌的硫链丝菌素抗性基因已丢失，故对该自主发光堪萨斯分枝杆菌进行后续遗传操作时，仍可选用硫链丝菌素抗性基因作为筛选标记。

本发明的自主发光堪萨斯分枝杆菌涉及的抗硫链丝菌素基因是首次作为抗性筛选标记在堪萨斯分枝杆菌中应用。

本发明中所用到的噬菌体整合酶Int和attP片段均来自于Giles分枝杆菌噬菌体。

序列表

<110> 合肥中科干细胞再生医学有限公司

<120> 一种自主发光堪萨斯分枝杆菌及其构建方法

<130> 2018

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

atggggcgac gcggcaaccg cgaaggcaca taccggcacc ggccggacgg gcgctgggag 60

gcccggttgc tctatgacga cccggtcacc ggtgaacgcc gccgggcatc gttctacggc 120

aagacgaaga cggcggtacg ggccaaaatg cgcgaagcta tcgaccgcct cgacgccgac 180

gccccggtgc gtgacgccgc ggtgaccgtg gccgattgga tgcgccggtg gtgcaccacc 240

accctgttgg tctccggccg cgccgacagc accaaatcgt tgtacggcac actgtcgcgc 300

caatacgtcg aacccgcccc gttcggcgcg atccggttgg accgcctgcg cacatccgat 360

gtcgaggcgt tggtgctgcg ccttcaacag gccacccgcc cgggccgcga cgggacgccg 420

gtgcgcgcgg tcgccgacag cacgatccgg tcgacctaca ccgtgttgcg ccaggcgctc 480

gacggcgcgg tgcgcgacgg cctgatggcg cgcaaccctg cggcggccat gaagcggccc 540

gggttgtcgc gcccggaagt ccggcggatc aacgacgcgc agttggccga cctgttggcc 600

gccaccgccg gatcccgcta ccaccgcgcc ctgttgctga tcgcggcgac cggactgcgc 660

gccggggagg cgttggccct tcggtgggac gccgtcgacc tcgacgccgg gtcgctgcgc 720

gtggtggcca ccgtcggccg cgtcgagcgt cgcctgcgcc tcacgacgcc gaagacggaa 780

cgatcccgcc ggacggtgcc gttgacgccg gacatggtgt cgatgctgcg tcggcaccgc 840

gccgaccagt tagctgaacg cctgcgcgcg gccaacgtgt gggaggacca cgggttggtg 900

ttcccgtcgg cgttcggccg cccggtggat ccgcgcaacc tgttgcgggt ggtggagcag 960

gccgccgcgc aggttggcct agagggcgtc ggcgtgcaca ccctgcgtca cgccgcggcg 1020

gtggcgatgc tagaggcggg catccacatc cgcgcggtcg ccgacatcct cgggcattcg 1080

tcggtggcgg tcacggggga catctacggc cacacgtccg acgcgaccgc gcgggccgcc 1140

gtcgacgtgt tgtcggcgcg cctgcggatc gcggacggca gcggacagtc ttagcgagct 1200

cgacggacgc ggacggacgc cggagcaatt ggggtcaaaa ttggggtcaa acagaaaaag 1260

gggcggcttc ccgtctccgg aaaaccgccc ctgatctgcg tcgggctgac aggatttgaa 1320

cctgcgaccc cttgaccccc agtcattcaa aaggcatccg cgtggatccg cccgggtacc 1380

gaatccgcag gtcacgcccg gttgcgcaca atggcggaca tcggcgaatc gccccgaacc 1440

ccgatgcaat tggggtcaaa attggggtca aaccggcggg ggtgaccg 1488

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

taagccgata agcgacatta tgtcaagt 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

taagccgata agcgacatta tgtcaagt 28

<210> 4

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

atgactgagt tggacaccat cgcaaatccg tccgatcccg cggtgcagcg gatcatcgat 60

gtcaccaagc cgtcgcgatc caacataaag acaacgttga tcgaggacgt cgagcccctc 120

atgcacagca tcgcggccgg ggtggagttc atcgaggtct acggcagcga cagcagtcct 180

tttccatctg agttgctgga tctgtgcggg cggcagaaca taccggtccg cctcatcgac 240

tcctcgatcg tcaaccagtt gttcaagggg gagcggaagg ccaagacatt cggcatcgcc 300

cgcgtccctc gcccggccag gttcggcgat atcgcgagcc ggcgtgggga cgtcgtcgtt 360

ctcgacgggg tgaagatcgt cgggaacatc ggcgcgatag tacgcacgtc gctcgcgctc 420

ggagcgtcgg ggatcatcct ggtcgacagt gacatcacca gcatcgcgga ccggcgtctc 480

caaagggcca gccgaggtta cgtcttctcc cttcccgtcg ttctctccgg tcgcgaggag 540

gccatcgcct tcattcggga cagcggtatg cagctgatga cgctcaaggc ggatggcgac 600

atttccgtga aggaactcgg ggacaatccg gatcggctgg ccttgctgtt cggcagcgaa 660

aagggtgggc cttccgacct gttcgaggag gcgtcttccg cctcggtttc catccccatg 720

atgagccaga ccgagtctct caacgtttcc gtttccctcg gaatcgcgct gcacgagagg 780

atcgacagga atctcgcggc caaccgataa 810

<210> 5

<211> 13066

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc 60

aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag 120

gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg cggcattttg 180

ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg aagatcagtt 240

gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc ttgagagttt 300

tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat gtggcgcggt 360

attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact attctcagaa 420

tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca tgacagtaag 480

agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact tacttctgac 540

aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 600

cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 660

acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 720

ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 780

ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 840

gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 900

atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 960

ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 1020

attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 1080

ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 1140

aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 1200

aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 1260

ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 1320

tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 1380

ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 1440

cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 1500

agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 1560

gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 1620

ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 1680

tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 1740

tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 1800

cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 1860

tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 1920

gcggaagagc gcccaatacg caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat tcattaatgc 1980

agctggcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc aattaatgtg 2040

agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc tcgtatgttg 2100

tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaggaaaca gctatgacca tgattacgcc 2160

aagcgcgcaa ttaaccctca ctaaagggaa caaaagctgg gtaccgcagc gagtcagtga 2220

gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 2280

attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa 2340

ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc 2400

gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg 2460

attacgccaa gcgcgcaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctccaccgcg 2520

gtggcggccg ctctagaggt gaccacaacg acgcgcccgc tttgatcggg gacgtctgcg 2580

gccgaccatt tacgggtctt gttgtcgttg gcggtcatgg gccgaacata ctcacccgga 2640

tcggagggcc gaggacaagg tcgaacgagg ggcatgaccc ggtgcggggc ttcttgcact 2700

cggcataggc gagtgctaag aataacgttg gcactcgcga ccggtgagtc gtaggtcggg 2760

acggtgaggc caggcccgtc gtcgcagcga gtggcagcga ggacaacttg agccgtccgt 2820

cgcgggcact gcgcccggcc agcgtaagta gcggggttgc cgtcacccgg tgacccccgg 2880

tttcatcccc gatccaatca cttcgcaatg gccaagacaa ttgcggatcc cttggaggat 2940

acgtatgact aaaaaaattt cattcattat taacggccag gttgaaatct ttcccgaaag 3000

tgatgattta gtgcaatcca ttaattttgg tgataatagt gtttacctgc caatattgaa 3060

tgactctcat gtaaaaaaca ttattgattg taatggaaat aacgaattac ggttgcataa 3120

cattgtcaat tttctctata cggtagggca aagatggaaa aatgaagaat actcaagacg 3180

caggacatac attcgtgact taaaaaaata tatgggatat tcagaagaaa tggctaagct 3240

agaggccaat tggatatcta tgattttatg ttctaaaggc ggcctttatg atgttgtaga 3300

aaatgaactt ggttctcgcc atatcatgga tgaatggcta cctcaggatg aaagttatgt 3360

tcgggctttt ccgaaaggta aatctgtaca tctgttggca ggtaatgttc cattatctgg 3420

gatcatgtct atattacgcg caattttaac taagaatcag tgtattataa aaacatcgtc 3480

aaccgatcct tttaccgcta atgcattagc gttaagtttt attgatgtag accctaatca 3540

tccgataacg cgctctttat ctgttatata ttggccccac caaggtgata catcactcgc 3600

aaaagaaatt atgcgacatg cggatgttat tgtcgcttgg ggagggccag atgcgattaa 3660

ttgggcggta gagcatgcgc atcttatgct gatgtgatta aatttggttc ttaaaaagag 3720

ctttgcatta tcgataatcc tgttgatttg acgtccgcag cgacaggtgc ggctcatgat 3780

gtttgttttt tacgatcagc gagcttgttt ttctgcccaa aacatatatt acatgggaaa 3840

tcattatgag gaatttaagt tagcgttgat agaaaaactt aatctatatg cgcatatatt 3900

accgaatgcc aaaaaagatt ttgatgaaaa ggcggcccta ttctttagtt caaaaagaaa 3960

gcttgtttgc tggattaaaa gtagaggtgg atattcatca acgttggatg attattgagt 4020

caaatgcagg tgtggaattt aatcaaccac ttggcagatg tgtgtacctt catcacgtcg 4080

ataatattga gcaaatattg ccttatgttc aaaaaaataa gacgcaaacc atatctattt 4140

tccttgggag tcatcattta aatatcgaga tgcgttagca ttaaaaggtg cggaaaggat 4200

tgtagaagca ggaatgaata acatatttcg agttggtgga tctcatgacg gaatgagacc 4260

gttgcaacga ttagtgacat atatttctca tgaaaggcca tctaactata tggctaagga 4320

gttgcggttg aatagaacag actcgattcc ggaagaagat aagttccttg atttgtccca 4380

aataggtaaa agtatggaaa atgaatcaaa atataaaacc atcgaccacg ttatttgtgt 4440

gaaggaaata aaaaaattca tgtttgggaa acgctgccag aagaaaacag cccaaagaga 4500

aagaatgcca ttattattgc ttctttagtc tggttttgcc cgcaggatgg atcattttgc 4560

tggtctggcg gaatatttat cgcggaatgg atttcatgtg atccgctatg attcgcttca 4620

ccacgttgga ttgagttcag ggacaattga tgaatttaca atgtctatag gaaagcagag 4680

cttgttagca gtggttgatt ggttaactac acgaaaaata aataacttcg gtatgttggc 4740

ttcaagctta tctgcgcgga tagcttatgc aagcctatct gaaatcaatg cttcgttttt 4800

aatcaccgca gtcggtgttg ttaacttaag atattctctt gaaagagctt tagggtttga 4860

ttatctcagt ctacccatta atgaattgcc ggataatcta gattttgaag gccataaatt 4920

gggtgctgaa gtctttgcga gagattgtct tgattttggt tgggaagatt tagcttctac 4980

aattaataac atgatgtatc ttgatatacc gtttattgct tttactgcaa ataacgataa 5040

ttgggtcaag caagatgaag ttatcacatt gttatcaaat attcgtagta atcgatgcaa 5100

gatatattct ttgttaggaa gttcgcatga cttgagtgaa aatttagtgg tcctgcgcaa 5160

tttttatcaa tcggttacga aagccgctat cgcgatggat aatgatcatc tggatattga 5220

tgttgatatt actgaaccgt catttgaaca tttaactatt gcgacagtca atgaacgccg 5280

aatgagaatt gagattgaaa atcaagcaat ttctctgtct taaaatctat tgagatattc 5340

tatcactcaa atagcaatat aaggactctc tatgaaattt ggaaactttt tgcttacata 5400

ccaacctccc caattttctc aaacagaggt aatgaaacgt ttggttaaat taggtcgcat 5460

ctctgaggag tgtggttttg ataccgtatg gttactggag catcatttca cggagtttgg 5520

tttgcttggt aacccttatg tcgctgctgc atatttactt ggcgcgacta aaaaattgaa 5580

tgtaggaact gccgctattg ttcttcccac agcccatcca tacgccaact gtgaagatgt 5640

gaatttattg gatcaaatgt caaaaggacg atttcggttt ggtatttgcc gagggcttta 5700

caacaaggac tttcgcgtat tcggcacaga tatgaataac agtcgcgcct tagcggaatg 5760

ctggtacggg ctgataaaga atggcatgac agagggatat atggaagctg ataatgaaca 5820

tatcaagttc cataaggtaa aagtaaaccc cgcggcgtat agcagaggtg gcgcaccggt 5880

ttatgtggtg gctgaatcag cttcgacgac tgagtgggct gctcaatttg gcctaccgat 5940

gatattaagt tggattataa atactaacga aaagaaagca caacttgagc tttataatga 6000

agtggctcaa gaatatgggc acgatattca taatatcgac cattgcttat catatataac 6060

atctgtagat catgactcaa ttaaagcgaa agagatttgc cggaaatttc tggggcattg 6120

gtatgattct tatgtgaatg ctacgactat ttttgatgat tcagaccaaa caagaggtta 6180

tgatttcaat aaagggcagt ggcgtgactt tgtattaaaa ggacataaag atactaatcg 6240

ccgtattgat tacagttacg aaatcaatcc cgtgggaacg ccgcaggaat gtattgacat 6300

aattcaaaaa gacattgatg ctacaggaat atcaaatatt tgttgtggat ttgaagctaa 6360

tggaacagta gacgaaatta ttgcttccat gaagctcttc cagtctgatg tcatgccatt 6420

tcttaaagaa aaacaacgtt cgctattata ttagctaagg agaaagaaat gaaatttgga 6480

ttgttcttcc ttaacttcat aattcaacaa ctgttcaaga acaaagtata gttcgcatgc 6540

aggaaataac ggagtatgtt gataagttga ttttgaacag acattttagt gtatgaaaat 6600

catttttcag ataatggtgt tgtcggcgct cctctgactg tttctggttt tctgctcggt 6660

ttaacagaga aaattaaaat tggttcatta aatcacatca ttacaactca tcatcctgtc 6720

gccatagcgg aggaagcttg cttattggat cagttaagtg aagggagatt tattttaggg 6780

tttagtgatt gcgaaaaaaa agatgaaatg cattttttta atcgcccggt tgaatatcaa 6840

cagcaactat ttgaagagtg ttatgaaatc attaacgatg ctttaacaac aggctattgt 6900

aatccagata acgattttta tagcttccct aaaatatctg taaatcccca tgcttatacg 6960

ccaggcggac ctcggaaata tgtaacagca accagtcatc atattgttga gtgggcggcc 7020

aaaaaaggta ttcctctcat ctttaagtgg gatgattcta atgatgttag atatgaatat 7080

gctgaaagat ataaagccgt tgcggataaa tatgacgttg acctatcaga gatagaccat 7140

cagttaatga tattagttaa ctataacgaa gatagtaata aagctaaaca agagacgcgt 7200

gcatttatta gtgattatgt tcttgaaatg caccctaatg aaaatttcga aaataaactt 7260

gaagaaataa ttgcagaaaa cgctgtcgga aattatacgg agtgtataac tgcggctaag 7320

ttggcaattg aaaagtgtgg tgcgaaaagt gtattgctgt cctttgaacc atgaatgatt 7380

tgatgagcca aaaaaatgta atcaatattg ttgatgataa tattaagaag taccacatgg 7440

aatataccta atagatttcg agttgcagcg aggcggcaag tgaacgaatc cccaggagca 7500

tagataacta tgtgactggg gtgagtgaaa gcagccaaca aagcagcagc ttgaaagatg 7560

aagggtataa aagagtatga cagcagtgct gccatacttt ctaatattat cttgaggagt 7620

aaaacaggta tgacttcata tgttgataaa caagaaatta cagcaagctc agaaattgat 7680

gatttgattt tttcgagcga tccattagtg tggtcttacg acgagcagga aaaaatcaga 7740

aagaaacttg tgcttgatgc atttcgtaat cattataaac attgtcgaga atatcgtcac 7800

tactgtcagg cacacaaagt agatgacaat attacggaaa ttgatgacat acctgtattc 7860

ccaacatcgg tttttaagtt tactcgctta ttaacttctc aggaaaacga gattgaaagt 7920

tggtttacca gtagcggcac gaatggttta aaaagtcagg tggcgcgtga cagattaagt 7980

attgagagac tcttaggctc tgtgagttat ggcatgaaat atgttggtag ttggtttgat 8040

catcaaatag aattagtcaa tttgggacca gatagattta atgctcataa tatttggttt 8100

aaatatgtta tgagtttggt ggaattgtta tatcctacga catttaccgt aacagaagaa 8160

cgaatagatt ttgttaaaac attgaatagt cttgaacgaa taaaaaatca agggaaagat 8220

ctttgtctta ttggttcgcc atactttatt tatttactct gccattatat gaaagataaa 8280

aaaatctcat tttctggaga taaaagcctt tatatcataa ccggaggcgg ctggaaaagt 8340

tacgaaaaag aatctctgaa acgtgatgat ttcaatcatc ttttatttga tactttcaat 8400

ctcagtgata ttagtcagat ccgagatata tttaatcaag ttgaactcaa cacttgtttc 8460

tttgaggatg aaatgcagcg taaacatgtt ccgccgtggg tatatgcgcg agcgcttgat 8520

cctgaaacgt tgaaacctgt acctgatgga acgccggggt tgatgagtta tatggatgcg 8580

tcagcaacca gttatccagc atttattgtt accgatgatg tcgggataat tagcagagaa 8640

tatggtaagt atcccggcgt gctcgttgaa attttacgtc gcgtcaatac gaggacgcag 8700

aaagggtgtg ctttaagctt aaccgaagcg tttgatagtt gactgcagct cgagtaagcc 8760

gataagcgac attatgtcaa gtcccgggtc tagagggatt gtctttcttc agctcgctga 8820

tgatatgctg acgctcaatg ccgtttggcc tccgactaac gaaaatcccg catttggacg 8880

gctgatccga ttggcacggc ggacggcgaa tggcggagca gacgctcgtc cgggggcaat 8940

gagatatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga cgtatcgggc cctggccagc tagcaggcga 9000

atacttcata tatgcgggga tcgaccgcgc gggtcccgga cggggaagag cggggagctt 9060

tgccagagag cgacgacttc cccttgcgtt ggtgattgcc ggtcagggca gccatccgcc 9120

atcgtcgcgt agggtgtcac accccaggaa tcgcgtcact gaacacagca gccggtagga 9180

cgaccatgac tgagttggac accatcgcaa atccgtccga tcccgcggtg cagcggatca 9240

tcgatgtcac caagccgtcg cgatccaaca taaagacaac gttgatcgag gacgtcgagc 9300

ccctcatgca cagcatcgcg gccggggtgg agttcatcga ggtctacggc agcgacagca 9360

gtccttttcc atctgagttg ctggatctgt gcgggcggca gaacataccg gtccgcctca 9420

tcgactcctc gatcgtcaac cagttgttca agggggagcg gaaggccaag acattcggca 9480

tcgcccgcgt ccctcgcccg gccaggttcg gcgatatcgc gagccggcgt ggggacgtcg 9540

tcgttctcga cggggtgaag atcgtcggga acatcggcgc gatagtacgc acgtcgctcg 9600

cgctcggagc gtcggggatc atcctggtcg acagtgacat caccagcatc gcggaccggc 9660

gtctccaaag ggccagccga ggttacgtct tctcccttcc cgtcgttctc tccggtcgcg 9720

aggaggccat cgccttcatt cgggacagcg gtatgcagct gatgacgctc aaggcggatg 9780

gcgacatttc cgtgaaggaa ctcggggaca atccggatcg gctggccttg ctgttcggca 9840

gcgaaaaggg tgggccttcc gacctgttcg aggaggcgtc ttccgcctcg gtttccatcc 9900

ccatgatgag ccagaccgag tctctcaacg tttccgtttc cctcggaatc gcgctgcacg 9960

agaggatcga caggaatctc gcggccaacc gataaaagct ttccttttgg aatgatgatc 10020

gccgcggtga cacaatcggc gtacgcggac gcccggacgt gaccggaggc gaccgtacac 10080

ctatcccgac cgggcactat tcggcgtgga tccccacgca cccggcgacc cccgagagga 10140

caccgcaatg gggcgacgcg gcaaccgcga aggcacatac cggcaccggc cggacgggcg 10200

ctgggaggcc cggttgctct atgacgaccc ggtcaccggt gaacgccgcc gggcatcgtt 10260

ctacggcaag acgaagacgg cggtacgggc caaaatgcgc gaagctatcg accgcctcga 10320

cgccgacgcc ccggtgcgtg acgccgcggt gaccgtggcc gattggatgc gccggtggtg 10380

caccaccacc ctgttggtct ccggccgcgc cgacagcacc aaatcgttgt acggcacact 10440

gtcgcgccaa tacgtcgaac ccgccccgtt cggcgcgatc cggttggacc gcctgcgcac 10500

atccgatgtc gaggcgttgg tgctgcgcct tcaacaggcc acccgcccgg gccgcgacgg 10560

gacgccggtg cgcgcggtcg ccgacagcac gatccggtcg acctacaccg tgttgcgcca 10620

ggcgctcgac ggcgcggtgc gcgacggcct gatggcgcgc aaccctgcgg cggccatgaa 10680

gcggcccggg ttgtcgcgcc cggaagtccg gcggatcaac gacgcgcagt tggccgacct 10740

gttggccgcc accgccggat cccgctacca ccgcgccctg ttgctgatcg cggcgaccgg 10800

actgcgcgcc ggggaggcgt tggcccttcg gtgggacgcc gtcgacctcg acgccgggtc 10860

gctgcgcgtg gtggccaccg tcggccgcgt cgagcgtcgc ctgcgcctca cgacgccgaa 10920

gacggaacga tcccgccgga cggtgccgtt gacgccggac atggtgtcga tgctgcgtcg 10980

gcaccgcgcc gaccagttag ctgaacgcct gcgcgcggcc aacgtgtggg aggaccacgg 11040

gttggtgttc ccgtcggcgt tcggccgccc ggtggatccg cgcaacctgt tgcgggtggt 11100

ggagcaggcc gccgcgcagg ttggcctaga gggcgtcggc gtgcacaccc tgcgtcacgc 11160

cgcggcggtg gcgatgctag aggcgggcat ccacatccgc gcggtcgccg acatcctcgg 11220

gcattcgtcg gtggcggtca cgggggacat ctacggccac acgtccgacg cgaccgcgcg 11280

ggccgccgtc gacgtgttgt cggcgcgcct gcggatcgcg gacggcagcg gacagtctta 11340

gcgagctcga cggacgcgga cggacgccgg agcaattggg gtcaaaattg gggtcaaaca 11400

gaaaaagggg cggcttcccg ctccggaaaa ccgcccctga tctgcgtcgg gctgacagga 11460

tttgaacctg cgaccccttg acccccagtc attcaaaagg catccgcgtg gatccgcccg 11520

ggtaccgaat ccgcaggtca cgcccggttg cgcacaatgg cggacatcgg cgaatcgccc 11580

cgaaccccga tgcaattggg gtcaaaattg gggtcaaacc ggcgggggtg taccgtctag 11640

atcgattaag ccgataagcg acattatgtc aagtctcgag gtcggggatc ctctagagtc 11700

gaccaccaag ggcaccatct ctgcttgggc caccccgttg gccgcagcca gctcgctgag 11760

agccgtgaac gacagggcga acgccagccc gccgacggcg agggttccga ccgctgcaac 11820

tcccggtgca accttgtccc ggtctattct cttcactgca ccagctccaa tctggtgtga 11880

atgcccctcg tctgttcgcg caggcggggg gctctattcg tttgtcagca tcgaaagtag 11940

ccagatcagg gatgcgttgc aaccgcgtat gcccaggtca gaagagtcgc acaagagttg 12000

cagacccctg gaaagaaaaa tggccagagg gcgaaaacac cctctgacca gcggagcggg 12060

cgacgggaat cgaacccgcg tagctagttt ggaagaatgg gtgtctgccg accacatatg 12120

ggccggtcaa gataggtttt taccccctct cggctgcatc ctctaagtgg aaagaaattg 12180

caggtcgtag aagcgcgttg aagcctgaga gttgcacagg agttgcaacc cggtagcctt 12240

gttcacgacg agaggagacc tagttggcac gtcgcggatg gggatcgctg aagactcagc 12300

gcagcgggag gatccaagcc tcatacgtca acccgcagga cggtgtgagg tactacgcgc 12360

tgcagcccgg gggatccact agttctagag cggccgccac cgcggtggag ctccaattcg 12420

ccctatagtg agtcgtatta cgcgcgctca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg 12480

gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg 12540

cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc 12600

gaatgggacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 12660

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 12720

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 12780

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 12840

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 12900

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 12960

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 13020

aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa tttagg 13066

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial primers)

<400> 6

cccaagcttt ccttttggaa tgatgatcgc c 31

<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial primers)

<400> 7

ggaattccat atgtctagac ggtcaccccc gccggtttga c 41

<210> 8

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial primers)

<400> 8

ggaattctct agagggattg tctttcttca gctc 34

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工引物(Artificial primers)

<400> 9

cccaagcttt tatcggttgg ccgcgagatt c 31

Claims (4)

1.一种自主发光堪萨斯分枝杆菌，其特征在于：所述自主发光堪萨斯分枝杆菌基于堪萨斯分枝杆菌，采用电转化法，插入重组质粒pOPTIg，经传代培养筛选而成；

所述重组质粒pOPTIg的核苷酸序列为：SEQ ID NO:5；

所述重组质粒pOPTIg按顺时针方向依次含有启动子、发光所需酶基因luxCDABE、抗性筛选基因Tsr、整合酶基因Int、整合酶整合位点attP的融合基因以及复制子，所述融合基因两端含有同向重复序列DifL和DifR；

所述整合酶基因Int和所述整合酶整合位点attP分别为分枝杆菌噬菌体Giles的整合酶Int和整合位点attP，其序列为：SEQ ID NO:1；

所述抗性筛选基因Tsr为硫链丝菌素抗性基因Tsr，其序列为：SEQ ID NO:4。

2.根据权利要求1所述的一种自主发光堪萨斯分枝杆菌，其特征在于：所述DifL的序列为：SEQ ID NO:2；

所述DifR的序列为：SEQ ID NO:3。

3.一种自主发光堪萨斯分枝杆菌的构建方法，其特征在于：该构建方法包括以下步骤：

步骤1)：使用电转化法将所述重组质粒pOPTIg转入堪萨斯分枝杆菌中，得原始堪萨斯分枝杆菌；

步骤2)：所述原始堪萨斯分枝杆菌经传代培养，筛选出所述抗性筛选基因Tsr、所述整合酶基因Int和所述整合酶整合位点attP均丢失的菌种，即得无抗性筛选标记的自主发光堪萨斯分枝杆菌。

4.根据权利要求3所述的一种自主发光堪萨斯分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤2)的具体操作为：取步骤1)中得到的原始堪萨斯分枝杆菌，挑取少量所述原始堪萨斯分枝杆菌菌落到无抗性的7H9培养基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和有所述抗性筛选基因Tsr的7H11板上，37℃培养，挑取在有所述抗性筛选基因Tsr的7H11板上未长出，而在相应的无抗生素的7H11上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于有所述抗性筛选基因Tsr的7H11板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失所述抗性筛选基因Tsr抗性的克隆，得无抗性筛选标记的自主发光堪萨斯分枝杆菌。