CN104762312A - 构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型 - Google Patents

Abstract

本发明公开了构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型。在该构建过程中，关键是重组质粒pOPAI1B的构建，pOPAI1B中含有发光所需酶基因LuxCDABE，抗性筛选基因Apr和整合酶基因Int的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子。重组质粒pOPAI1B转入脓肿分枝杆菌中经过筛选获得抗性基因和整合酶基因均丢失的无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。本发明构建的自主发光脓肿分枝杆菌可以高通量筛选药物，通过检测细菌发光情况判定药物的杀菌或抑菌效果，可用于体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，灵敏度高，重复性强。

Description

构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药模型

技术领域

本发明涉及一种通过生物技术改造获得的脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abcessus），具体地说是一种无选择标记的可自主发光的脓肿分枝杆菌。此外，本发明还首次将安普霉素抗性基因作为抗性筛选标记应用到脓肿分枝杆菌中。

背景技术

分枝杆菌属(Mycobacterium)是一类细长略弯曲的微生物，有时有分枝或出现丝状体。目前在分类学上已将分枝杆菌属归纳于放线菌中。对人致病的放线菌可分含和不含分枝菌酸两类。分枝杆菌属于含分枝菌酸类。本属细菌的主要特点是细胞壁含有大量脂质，主要是分枝菌酸。这和其染色性、生长特性、致病性、抵抗力等密切相关。一般不易着色，若经加温或延长染色时间而着色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌(acid-fast bacilli)。该菌属无鞭毛、无芽胞、一般不产生内、外毒素，其致病性和菌体成分有关。引起的疾病都呈慢性，并伴有肉芽肿。分枝杆菌种类较多，主要可分为结核分枝杆菌复合群、非结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌三类。

脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus，M. abscessus）是一种快速生长的非结核分枝杆菌（Nontuberculous mycobacteria，NTM），于1992年被命名。脓肿分枝杆菌可引起肺部、皮肤和皮下软组织感染，其他感染包括颈淋巴结炎、中耳等。它可以引起散在的和爆发性的流行，近年来已经成为医院内感染的重要病原菌，是在肺部疾病中最常被分离出来的快速生长的非结核分枝杆菌。在美国和澳大利亚、中国都分别有报道指出，在过去的十年中，由于脓肿引起的感染成上升的趋势。

脓肿分枝杆菌对抗生素的敏感性，多数资料表明仅有中度及低度的敏感药物，无高度敏感的药物。除少数脓肿分枝杆菌对一些氨基糖苷类药物如克拉霉素、阿奇霉素、丁胺卡那(MIC>2 μg/mL)及喹诺酮药物如阿米卡星MIC>2 μg/mL)等敏感外，对其他药物呈不同程度的耐药或部分菌株高度耐药。所有的脓肿分枝杆菌对抗结核药物均高度耐药：利福平MIC>512 μg/mL，异烟肼MIC>256 μg/mL。目前，脓肿分枝杆菌的致病和耐药机制尚不清楚，临床治疗只能依赖于药物敏感试验的结果选用抗生素治疗，但此菌生长缓慢，药敏试验结果需要4～5天时间才能完成；由于对多种抗生素耐药，治疗相当困难，使病程迁延，经久不愈。为寻找有效的治疗药物，本文就其耐药机制的研究进展进行综述。因此，寻找能够有效治疗脓肿分枝杆菌的药物具有重要的临床意义。

目前，对分枝杆菌噬菌体进行遗传操作，通常采用卡那霉素抗性基因或潮霉素抗性基因作为抗性筛选标记。但是，脓肿分枝杆菌对卡那霉素以及潮霉素B不敏感，所以为了方便对其进行遗传操作急需找到可用的抗性筛选标记。本次发明中涉及的抗安普霉素基因是首次作为抗性筛选标记在脓肿分枝杆菌中应用。

之前，以张天宇为主要发明人的专利“整合质粒pOPHI及无抗性筛选标记的自主发光分枝杆菌”，是采取的技术方案与此次构建构建的自主发光的脓肿分枝杆菌方案类似。但是，其专利使用的整合酶基因Int是来自于分枝杆菌噬菌体L5，而该技术使用的整合酶基因Int是来自于分枝杆菌噬菌体Tweety。同时，此次专利首次将Apr抗性基因作为脓肿分枝杆菌的抗性筛选标记，并且，在此之前没有发现任何可用于脓肿分枝杆菌的抗性筛选标记。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组质粒pOPAI1B。

本发明的另一个目的是提供一种无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。

本发明所采取的技术方案是：

一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：该重组质粒pOPAI1B按逆时针方向依次含有启动子，发光所需酶基因LuxCDABE，抗性筛选基因Apr和整合酶基因Int的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子。

进一步的，上述抗性筛选基因为安普霉素抗性基因Apr，其序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步的，上述噬菌体整合位点attP为分枝杆菌噬菌体Tweety的attP位点，其序列如SEQ ID NO:4所示。

进一步的，上述噬菌体整合酶Int为分枝杆菌噬菌体Tweety的整合酶Int，其序列如SEQ ID NO:6所示。

进一步的，上述DifR的序列如SEQ ID NO:2所示，DifL的序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步的，上述重组质粒pOPAI1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B的构建方法，包括如下步骤：

1）构建质粒pOP1B：起始质粒pOPHI用限制性内切酶Sac I和XhoI 消化后，回收约9 kb的功能片段A；以质粒pTTP1B为模板，用引物 attp1Bf与引物attp1Br扩增出约250 bp的attP片段（SEQ ID NO:4），片段attP经Sac I和Xho I酶切后与功能片段 A进行连接，得到约9 kb的质粒pOP1B；

2）构建质粒pUCDHmke：将质粒pUCDis用XbaI消化，得到约2.7 kb的功能片段；以质粒pNBV1为模板，用引物 hygr727与引物hygf0616扩增出约1.1kb的Hyg片段(SEQ ID NO:5)，片段Hyg经XbaI酶切后与约2.7 kb的功能片段进行连接，得到约3.8 kb的质粒pUCDH，再将质粒pUCDH中的Hyg基因内部的kpnI、EcoRI两个酶切位点进行点突变，获得质粒pUCDHmke；

3）构建质粒pUCDI1B：质粒pUCDHmke用限制性内切酶Sma I和Xba I 消化后，回收约2.7kb的功能片段B；以质粒pTTP1B为模板，用引物 int1Bf与引物int1Br扩增出约1.4 kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int经Sma I和Xba I酶切后与功能片段 B进行连接，得到约4.1kb的质粒pUCDI1B；

4）构建质粒pUCDIAm：用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDI，回收约4.0 kb功能片段；以质粒pIJ6902为模板，用引物 AprXf与引物AprXr扩增出约860 bp的Apr片段(SEQ ID NO:1)；将上述约4.0 kb功能片段和Apr片段连接得约4.9 kb的质粒pUCDAI，再将pUCDAI中Apr基因内部的XhoI酶切位点进行点突变，去掉XhoI位点，得质粒pUCDIAm；

5）构建质粒pUCDAI1B：用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDI1B，得到约4.1 kb功能片段；用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDIAm，回收约860bp 的功能片段Xba I-Apr-XbaI；将该2种功能片段进行连接，得到约5.0 kb的质粒pUCDAI1B；

6）构建质粒pOPAI1B: 用限制性内切酶XhoI消化质粒pOP1B，得到约9.3 kb功能片段；用限制性内切酶XhoI消化质粒pUCDAI1B，回收约2.3 kb 的功能片段Xho I-dif-Int-Apr-dif –Xho I；将该2种功能片段进行连接，得到红11.7 kb的质粒pOPAI1B；

上述引物attp1Bf、attp1Br、hygr727、hygf0616、int1Bf、int1Br、AprXf和AprXr的序列依次分别如SEQ ID NO:8～15所示。

一种无抗性筛选标记的自主发光的脓肿分枝杆菌，其制备方法包括以下步骤：

1）电转化法将上述的重组质粒pOPAI1B转入脓肿分枝杆菌中，获得自主发光脓肿分枝杆菌；

2）将获得的自主发光脓肿分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。

进一步的，上述步骤2）的具体操作为：将步骤1）得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含安普霉素（Apr）的7H11板上，37℃培养，挑取在Apr板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Apr板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Apr抗性的克隆。

本发明的有益效果是：

1）本发明是首次将安普霉素抗性基因作为抗性筛选标记应用到脓肿分枝杆菌中，在此之前未发现任何可以用于脓肿分枝杆菌的抗性筛选标记。本提供了含有安普霉素抗性基因的用于构建自主发光脓肿分枝杆菌的质粒pOPAI1B，为后续的脓肿分枝杆菌遗传操作提供一个新的方法。

2）由质粒pOPAI1B构建的自主发光脓肿分枝杆菌，不需要添加任何底物即可发光。并且，在黑暗环境中通过肉眼便能看到发光菌落。

3）本发明制备得到的质粒pOPAI1B可转入脓肿分枝杆菌中，从而得到可自主发光的脓肿分枝杆菌。并且，通过不同药物MIC测定结果分析可知，转入的质粒pOPAI1B对脓肿分枝杆菌的生长及药物敏感性无影响。即自主发光脓肿分枝杆菌可替代野生脓肿分枝杆菌进行药物敏感性检测。同时，由实验结果分析得知脓肿分枝杆菌的CFU和RLU之间存在对应关系，所以可以用RLU来代替CFU作为分析细菌生长情况依据，使得脓肿分枝杆菌体外检测药物活性更加方便、快捷及经济；

4）本发明构建的自主发光脓肿分枝杆菌可以高通量筛选药物，通过检测细菌发光情况判定药物的杀菌或抑菌效果。并且，药敏实验结果可在9小时内得到。由此方法进行体外筛选药物有减轻工作量、节省筛药时间以及节约成本等优点。本发明的无抗性筛选标记自主发光分枝杆菌可用于体外药物活性检测，不需要任何底物，可连续检测同一样品，灵敏度高，重复性强。

5）相对于现有的具有抗性标记的自主发光分枝杆菌，本发明的自主发光分枝杆菌因为没有抗性基因，所以更加适用于大规模操作（抗性基因的表达可能对菌的生长，对药物的敏感性等有一定的影响）； 

6）本发明的自主发光分枝杆菌采用一些方法将抗性基因丢失，以使该抗性基因作为抗性筛选标记在自主发光脓肿分枝杆菌中二次应用成为可能。本发明构建的自主发光脓肿分枝杆菌的安普霉素抗性基因已丢失，故对该自主发光脓肿分枝杆菌进行后续遗传操作时，仍可选用安普霉素抗性基因作为筛选标记。

7）迄今为止，对分枝杆菌噬菌体进行遗传操作，通常采用抗卡那霉素基因或抗潮霉素基因作为抗性筛选标记。但是，脓肿分枝杆菌对卡那霉素以及潮霉素B不敏感，所以为了方便对其进行遗传操作急需找到可用的抗性筛选标记。本次发明中涉及的抗安普霉素基因是首次作为抗性筛选标记在脓肿分枝杆菌中应用。另外，安普霉素抗性筛选标记在脓肿中成功应用为后续通过遗传操作方法研究脓肿分枝杆菌致病机制等提供便利。

8）目前，抗脓肿分枝杆菌的药物体外筛选，要么需要加入底物，成本高，无法连续监测同一样品，要么很难区分杀菌和抑菌效果，而且对实验条件要求高，重复性较差，通常药敏结果需要4～5天时间才能完成。而本发明技术构建的自主发光脓肿分枝杆菌可以高通量筛选药物，通过检测细菌发光情况判定药物的杀菌或抑菌效果。并且，药敏实验结果可在9小时内得到。由此方法进行体外筛选药物有减轻工作量、节省筛药时间以及节约成本等优点。

附图说明

图1质粒pOP1B的构建流程图；

图2 质粒pUCDAIm的构建流程图；

图3 质粒pOPAI1B构建流程图；

图4 质粒pOPAI1B酶切图谱；

图5质粒pNBV1酶切图谱；

图6 质粒pTTP1B酶切图谱；

图7 本发明自主发光脓肿分枝杆菌的发光形态图；

图8液体法检测本发明自主发光脓肿分枝杆菌对药物的敏感性，图中药物浓度单位为μg/mL。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括PCR扩增、质粒提取、质粒转化、DNA片段连接、酶切、凝胶电泳等都采用常规的方法，具体可参见《分子克隆实验指南》(第三版) (Sambrook J, Russell DW，Janssen K, Argentine J.黄培堂等译，2002，北京：科学出版社)。

以下实施例中PCR反应所用的TransTaq-T DNA Polymerase、dNTP以及相关试剂均购买自北京全式金生物技术；抗生素安普霉素购自美仑生物技术有限公司；大肠杆菌感受态DH5a购买于广州东盛生物科技有限公司；DNA连接反应均采用Takara 宝生物公司的 T4 DNA连接试剂盒；质粒DNA提取试剂盒、DNA回收试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Magen(美基)生物公司。

实施例1

构建整合质粒pOPAI1B，构建流程见图1～3，质粒pOPAI1B的图谱见图4。如图4所示，质粒pOPAI1B按逆时针方向依次含有分枝杆菌强启动子（Hsp60），发光所需酶基因（LuxCDABE），安普霉素抗性基因（Apr）(SEQ ID NO:1)和整合酶基因（Int）(SEQ ID NO:6)的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR（SEQ ID NO:2）和DifL（SEQ ID NO:3），噬菌体整合位点(attP)（SEQ ID NO:4），以及氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和复制子（Rep）。各元件的功能如下：

Hsp60：一种分枝杆菌强启动子，可以启动后续基因的强表达。

LuxCDABE：发光所需酶基因，该基因的表达使得宿主菌可以自主发光 ^[5] 。

整合酶基因（Int）：可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。整合酶的作用是可逆的，即它既可以将含有attP 的序列的质粒整合到基因组attB位点，也可以再将其解离下来。因此，在最终的目标菌中如不含有该基因，不会起到解离作用，则构建的菌株可能更稳定。

安普霉素抗性基因（Apr）：安普霉素抗性基因（Apr）是一种选择标记，用于筛选获得目的菌株。安普霉素抗性基因（Apr）在脓肿分枝杆菌和大肠杆菌中表达后，可使宿主菌获得对安普霉素（Apr）的抗性，即可在含有Apr的培养基中生长。安普霉素（Apramycin, 缩写为Apr）是一种常用的抗性筛选药物，用于脓肿分枝杆菌的Apr浓度为240 μg/mL，用于大肠杆菌的Apr浓度为100 μg/mL。

同向重复序列dif：该序列可以被分枝杆菌自身的一种解离酶识别，并高效切除，因而可以在后续操作中去掉安普霉素抗性基因和整合酶基因。

噬菌体整合位点(attP)：整合酶获得表达后，可通过结合此位点将整个质粒整合进分枝杆菌的基因组中的attB 位点。即此位点的主要作用是被整合酶结合，起整合到基因组的作用。

氨苄青霉素抗性基因（Ampr）：是一种筛选标记，但只在大肠杆菌等细菌中起作用,在分枝杆菌中无作用，因为分枝杆菌对氨苄青霉素天然耐药。

复制子（Rep）：负责质粒在大肠杆菌中复制的元件。

质粒pOPAI1B的具体构建方法如下：

1、质粒pOP1B的构建：

如图1所示起始质粒pOPHI（具体构建方法见专利:CN201210183007.2）用限制性内切酶Sac I和XhoI 消化后，去掉抗性基因Hyg、功能片段Int(来自分枝杆菌噬菌体L5的整合酶)以及之前残存的无能功能的Int’ (来自分枝杆菌噬菌体L5的整合酶)，回收约9kb功能片段A；以质粒pTTP1B（由美国匹兹堡大学Hatfull实验室惠赠，质粒图谱见图6，具体构建方法见参考文献[5]）为模板，用引物 attp1Bf ：5’-aagagctcttctgcgtttcttagttgccat-3’ （SEQ ID NO:8)与引物attp1Br：5’-aaactcgaggacatgtaggaccagtgaaa-3’ （SEQ ID NO:9)扩增出250 bp的attp片段(SEQ ID NO:4) (含来自分枝杆菌噬菌体Tweety的attp位点)，片段attp经Sac I和Xho I消化后与功能片段 A混合后，加入连接酶进行连接获得重组质粒pOP1B，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒pOP1B。用Pst I和Sac I消化鉴定质粒pOP1B，正确的质粒经酶切后跑胶结果应该是200 bp和9 kb处各有一条带。再将酶切正确的质粒送去测序，以选取出attp片段不存在突变的质粒进行后续实验，测序采用引物是pUC19通用引物。

2、构建质粒pUCDHmke：

1）将质粒pUCDis（具体构建方法见专利: CN201210183007.2）用XbaI消化，得到2.7kb的功能片段；

2）以质粒pNBV1（由美国约翰霍普金斯大学William Bishai实验室惠赠，质粒图谱见图5，具体构建方法见参考文献[4]）为模板，用引物 hygr727（SEQ ID NO:10）与引物hygf0616（SEQ ID NO:11）扩增出1.1 kb的Hyg片段(SEQ ID NO:5)，片段Hyg经Xba I酶切后与功能片段进行连接，得到约3.8 kb的质粒pUCDH，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含潮霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用限制性内切酶SmaI和XbaI酶切鉴定质粒pUCDH，正确的质粒 pUCDH可切下2.7 kb 和1.1 kb 两个条带；

3）将质粒pUCDH送上海捷瑞生物工程有限公司进行突变, 突变Hyg基因内部的KpnI酶切位点 (GGTACC)突变为GGTACA 以及EcoR I酶切位点 (GAATTC)突变为GAATTA，从而去掉了内部的KpnI和EcoRI位点，形成质粒pUCDHmke。

3、构建质粒pUCDI1B：

如图3所示：

1）起始质粒pUCDHmke用限制性内切酶Sma I和Xba I 消化后，回收约2.7 kb功能片段B；

2）以质粒pTTP1B为模板，用引物 int1Bf（SEQ ID NO:12）与引物int1Br（SEQ ID NO:13）扩增出约1.4 kb的Int片段(SEQ ID NO:6)（此整合酶基因是来自Tweety分枝杆菌噬菌体）；

3）片段Int经Sma I和Xba I双酶切后与约2.7 kb功能片段 B混合后加入连接酶进行酶连，得到约4.1 kb的质粒pUCDI1B。转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含氨苄青霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，之后挑取阳性克隆到液体LB中培养后提取质粒；

4）用BamH I和Kpn I双切鉴定所得质粒，正确质粒会出现0.5 kb和3.6 kb两条带；再利用pUC19通用引物对质粒pUCDI1B的Int基因部分进行测序，最后选定Int基因部分未突变的质粒命名为pUCDI1B，并以此质粒进行后续实验。

4、质粒pUCDIAm的构建：

如图2所示：

1）用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDI（具体构建方法见专利: CN201210183007.2），回收约4.0 kb功能片段；

2）以质粒pIJ6902为模板，用引物 AprXf（SEQ ID NO:14）与引物AprXr（SEQ ID NO:15）扩增出约860 bp的Apr片段(SEQ ID NO:1)；

3）将上述2种功能片段混合后加入连接酶进行连接，得到约4.9 kb的质粒pUCDAI，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含安普霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用Xba I酶切，正确质粒在4.0 kb和860 bp处各有一条带；

4）将质粒pUCDAI送上海捷瑞生物工程有限公司进行突变, 突变Apr基因内部的XhoI酶切位点 (CTCGAG)突变为CTCGAG，从而去掉了基因内部的XhoI位点，形成质粒pUCDIAm。

5、构建质粒pUCDAI1B：

如图3所示：

1） 用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDIAm，回收约860 bp 的功能片段Xba I-Apr-Xba I；

2）用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDI1B，得到约4.1 kb功能片段；

3） 将上述2种功能片段混合后加入连接酶进行连接，得到约5.0 kb的质粒pUCDAI1B，转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含安普霉素抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，用Xba I酶切，正确质粒在4.1 kb和860 bp处各有一条带。

6、构建质粒pOPAI1B:

如图3所示：

1）用限制性内切酶XhoI消化质粒pUCDAI1B；回收约2.3 kb 的功能片段Xho I-dif-Int-Apr-dif –Xho I；

2）用限制性内切酶XhoI消化质粒pOP1B，得到约9.3 kb功能片段；

3）将上述2种功能片段进行连接，得到约11.7 kb的质粒pOPAI1B（见图3和图4），转化大肠杆菌感受态DH5α，利用含Apr抗性的LB固体平板筛选出阳性克隆，挑取单克隆到LB液体培养基中培养后，提取质粒，酶切鉴定出正确的克隆即为质粒pOPAI1B。用限制性内切酶XhoI酶切鉴定质粒pOPAI1B，正确的质粒pOPAI1B可切下约9.3 kb 和约2.3 kb 两个条带。

实施例2一种无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌的制备方法

本实施例涉及的7H9培养基、7H11培养基、吐温80均购自广州华奇盛生物公司。

Biorad 电转化仪（Biorad GenePulser Xcell）以及电转杯购自Biorad公司。

1.需要准备的材料：

1）脓肿分枝杆菌（Mycobacterium. abscessus）

2)   10% 甘油+0.05% Tween 80 +20mL 甘油+180 mL水+100μL Tween 80，并用0.2μm滤器过滤。要求新鲜配制，不得超过1周。

3）灭菌的玻璃珠，50ml离心管，Biorad 的0.2cm的电转杯，25 ml移液管。

4）50ml长好的对数期的菌液[菌液的OD值，达到0.6-1.3]。带滤芯的1ml枪尖。

2.   电转化：

1)   将待转菌（脓肿分枝杆菌，Mycobacterium. abcessus）接种至含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，37℃摇菌扩增。

冻存甘油菌需要先加到含有5ml培养基的50ml 离心管复壮，待长起之后，需取>2ml，接种到含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中；

菌落需刮取上百个菌落加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中，同时锥形瓶中需加入10颗左右的玻璃珠；

普通生长的或在4℃保存的菌，接种时可以取1至5ml加入含有50 mL 7H9(含0.1% tween 80)的液体培养基的锥形瓶中。

2)   检测菌液的OD值，若达到0.6～1.3，则可进行电转化。

3)   将40ml菌液转至50 mL离心管中，加入10~13颗玻璃珠后，于涡旋器中充分涡旋5分钟后[目的是将菌团块打散]，于4℃离心机中6000 rpm离心8分钟。

4)   加入40mL 10%甘油，于涡旋器中充分洗涤细菌后，于4℃离心机中6000 rpm离心8分钟。

5)   重复步骤4）2次后，留约1 mL上清，用带滤芯的枪尖，吹吸充分混匀后于冰上放置。

6)   于标记好的0.2cm的电转杯中，分别加入10 μL 浓缩后的质粒pOPAI1B和200 μL分枝杆菌（即脓肿分枝杆菌）感受态细胞。轻柔吹吸充分混匀后于冰上放置10分钟，加入电转仪前擦尽电转杯上的水分。

7)   用Biorad 电转化仪进行电转化，以电压2.5KV、电阻1000 ?、电容25μF脉冲波进行电转化。未加DNA的细菌阴性对照的脉冲时间应于19~21秒间，该时间范围显示待转细菌处于良好状态。若感受态细胞洗得不干净或质粒含盐较多，会发生爆炸。

8）迅速用带滤芯的枪尖于电转液中加入2 mL 7H9(含吐温80)培养基(先用1 mL转移电转液，再用1 mL洗涤电转杯)，转移至50mL离心管中。

9）于37℃孵箱中孵育4～12小时，充分复活细菌并使其抗性表达。

10）用带滤芯的枪尖吹吸混匀后，1ml/1.5ml tube 分装，10000 rpm离心1分钟沉淀转化菌，弃上清，用0.6 mL 7H9培养基重悬后，以500 μL/板铺于含抗生素（240 μg/mL安普霉素Apr）的7H11培养板中。同时稀释一百倍后，以500 μL/板的量铺Apr板。

11）避光于37℃孵箱培养。

备注：待转菌为脓肿分枝杆菌时，所用到的试剂及耗材均需于4℃预冷，电转全过程需冰浴中完成。

3、检测平板上生长出的单克隆菌落发光值的大小

1）将Apr板上生长的单个菌，挑取到含有100μg 7H9培养基的1.5mL 离心管中，混匀后，将离心管放入发光检测仪器（普洛麦格公司的GLOMAX2020），检测发光值大小。根据经验，一般发光值在100以下的可认定为不发光，发光值在10⁵或更高的可认定为发光很强。

2）对于发光很强的单个菌落，在暗室中，凭肉眼可以看到明显的蓝色荧光（见图7）。

4、选取发光值在10 ⁵ 或更高的单克隆进行传代，筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为目标菌株。

具体筛选方法如下：

1）连续传代摇菌培养

从平板上，挑取发光值在10⁵或更高的单克隆接种到5mL 7H9培养基中，摇床振荡培养约2天。将培养所得的菌液适当稀释后，进行铺板，以每个平板上长出5～50个菌落为宜。

平板37℃培养3天后观察，挑取100-200个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含240 μg/mL Apr的7H11板，并对应编号；

放置37℃培养箱培养3天左右，可观察在Apr板上是否有未长出的克隆，而在相应的无抗板上长出，挑取相应的克隆到5mL 7H9培养基中培养约2天，取500微升培养物铺于Apr板（240 μg/mL），培养2 ~3 天，若平板上无单克长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Apr抗性的克隆，即丢失安普霉素抗性基因（Apr）和整合酶基因的克隆。

5、野生脓肿分枝杆菌与自主发光脓肿分枝杆菌对不同药物的敏感性测定

从常用来治疗脓肿分枝杆菌的药物中选取了克拉霉素（CLR）、阿米卡星（AMK）、头孢西丁（FOX）以及氯法齐明（CLF），先以96孔板检测这些药物对自主发光脓肿分枝杆菌的液体MIC。之后，根据特定药物的液体MIC，制定出用平板法检测药物MIC时平板药物浓度设定方案。具体操作如下：

1 液体检测药物MIC时，根据相关文献报道，设定了待检测药物的浓度梯度。液体检测药物对脓肿分枝杆菌MIC具体方法如下：

1.1 将自主发光脓肿分枝杆菌在7H9 (含10%OADC及0.05%Tween80)培养基培养至OD₆₀₀在0.5左右时，对菌液进行稀释。当菌液被稀释至100 μl菌液的发光值在2000-5000之间时，将菌液加入96孔板中，每孔加入稀释后的菌液100 μl；

1.2 按照设定的浓度，将相应的药物加入到96孔板中（96孔板的最边缘的孔不加药物），每种药物按同一种方案平行做3组；同时，在对照组中加入溶解药物的溶剂，也做3组。

1.3 以第一次加药记为0h，记录0h、3h以及9h每孔菌发光值；

1.4 以每一时间点的细菌发光值作图（如图7所示，图中药物浓度单位为μg/mL），分析细菌对药物的敏感情况；

1.5 根据液体数据分析得到液体MIC_lux（表2），MIC_lux指加药组比不加药组的发光值低10倍时的药物浓度。

2 根据液体检测脓肿分枝杆菌对药物的敏感性，设定平板法检测药物MIC时选用的药物浓度。

具体操作方法如下：

1.1 将野生脓肿分枝杆菌以及自主发光脓肿分枝杆菌在7H9 (含10%OADC及0.05%Tween80)培养基中培养至OD₆₀₀达到1.0左右；

1.2 先以50倍稀释菌液，再稀释10^-3、10^-5后，各取10^-3、10^-5稀释度的菌液500ul铺含有不同药物浓度的7H11平板；

1.3 待37℃培养3天后读板计数；

1.4 最后确定的药物MIC见表1；

表1平板法检测野生脓肿分枝杆菌与自主发光脓肿分枝杆菌对不同药物的MIC

表2液体法检测野生脓肿分枝杆菌与自主发光脓肿分枝杆菌对不同药物的MIC_lux

1.5由药物MIC测定结果可知，自主发光脓肿分枝杆菌对药物的敏感性与野生脓肿分枝杆菌相比无差异。并且，平板检测的脓肿分枝杆菌MIC结果与自主发光脓肿分枝杆菌液体检测的MIC结果一致，说明可以通过液体法检测发光脓肿分枝杆菌的发光情况来判定药物的杀菌或抑菌效果。

本发明主要是利用整合质粒pOPAI1B，该质粒含有荧光素酶操纵子基因luxCDABE、安普霉素抗性基因、整合酶基因Int。LuxCDABE : 荧光素酶操纵子，该系列基因的表达使得宿主菌可以自主发光。Int : 来自分枝杆菌噬菌体Tweety的整合酶基因，可以表达出整合酶，将质粒整合进分枝杆菌的基因组中。将此质粒电转化入脓肿分枝杆菌中，使用安普霉素抗性筛选出阳性克隆，并检测到发光，即获得目标菌株。

本次发明中所用到的噬菌体整合酶int和attp片段均来自于Tweety分枝杆菌噬菌体。Tweety噬菌体是从耻垢分枝杆菌（ Mycobacterium smegmatis）分离出的分枝杆菌噬菌体，基因组全长58692bp，包含编码109个蛋白的基因。其中，编码酪氨酸重组酶家族的基因int位于Tweety分枝杆菌噬菌体基因组的中心位置，假定attp位点位于紧接int基因上游的短的间隔区域内，包含Tweety分枝杆菌噬菌体attP–int cassette的质粒可以精确、高效被整合到分枝杆菌基因组的tRNA ^Lys 基因中。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

上文中涉及到的参考文献的具体信息如下：

[1] Tan, S., and Zhang, T., Yang, F., et al. (2014). Efficient construction of unmarked recombinant mycobacteria using an improved system. Journal of microbiological methods103, 29-36.

[2] Zhang T, Li SY, Nuermberger EL. (2012).Autoluminescent Mycobacterium tuberculosis for Rapid, Real-Time, Non-Invasive Assessment of Drug and Vaccine Efficacy. PLoS ONE 7(1): e29774.

[3]Zhang TY, Bishai WR, Grosset JH, Nuermberger EL. (2010).Rapid assessment of antibacterial activity against Mycobacterium ulcerans by using recombinant luminescent strains. Antimicrob Agents Chemother 54,2806-2813.

[4] Howard NS, Gomez JE, Ko C, Bishai WR. (1995). Color selection with a hygromycin-resistance-based escherichia coli-mycobacterial shuttle vector. Gene 166:181-182.

[5] Thuy T. Pham, Deborah Jacobs-Sera, Marisa L. Pedulla, et al. (2007). Comparative genomic analysis of mycobacteriophage Tweety: evolutionary insights and construction of compatible site-specific integration vectors for mycobacteria. Microbiology 53:82711-2723.

<110>  中国科学院广州生物医药与健康研究院

       安徽大学

       广州市胸科医院

<120>  构建无选择标记的自主发光脓肿分枝杆菌的方法及建立相应体外高通量筛药

       模型

<160>  15   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  856

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  1

caccaccgac tatttgcaac agtgccgttg atcgtgctat gatcgactga tgtcatcagc       60

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aaagcgcagc gcccatccat ttgcctttgc ggcagcgggg ccacaggcag agcagatcat      420

ctctgatcca ttgcccctgc cacctcactc gcctgcaagc ccggtcgccc gtgtccatga      480

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tggcaagttg gtacgcgtcg attatctcga gaatgaccac tgctgtgagc gctttgcctt      660

ggcggacagg tggctcaagg agaagagcct tcagaaggaa ggtccagtcg gtcatgcctt      720

tgctcggttg atccgctccc gcgacattgt ggcgacagcc ctgggtcaac tgggccgaga      780

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<210>  2

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

tgtctagacc ggccgtgcgg aattaa                                            26

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

attctagatt caggcgccgg gggcggtgtc                                        30

<210>  4

<211>  250

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

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tcgaaaccct cacggcgcac aggtcagagg ccataagcct cagaggggat caccctaaag      240

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<210>  5

<211>  1062

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

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agtcggaggc gtacgcggtc ctggcggacg ccccggttcc ggtgccccgc ctcctcggcc      360

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<210>  6

<211>  1406

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  6

ataccaggag aaacgttgtc aaacccgcag gtagaccccc gatactgcgc aattctgcgt       60

aatgctgcgc agcaccgtag ggtgaaccgt agggtgaccc cctgggaggg aaaacgatgg      120

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<210>  7

<211>  11714

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  7

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tgccctcgtg gtcaggtctg gacgacgagc cgttcgatcc tgccacgtcg cccgttacac     2700

cggaccttgg agttgtctct gacacattct ggcgcctgcc aaatgtaaag cgcagcgccc     2760

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ccctgccacc tcactcgcct gcaagcccgg tcgcccgtgt ccatgaactc gatgggcagg     2880

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gctcccgcga cattgtggcg acagccctgg gtcaactggg ccgagatccg ttgatcttcc     3180

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caactatcaa acgcttcggt taagcttaaa gcacaccctt tctgcgtcct cgtattgacg     3360

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agatgattga aatcatcacg tttcagagat tctttttcgt aacttttcca gccgcctccg     3720

gttatgatat aaaggctttt atctccagaa aatgagattt ttttatcttt catataatgg     3780

cagagtaaat aaataaagta tggcgaacca ataagacaaa gatctttccc ttgatttttt     3840

attcgttcaa gactattcaa tgttttaaca aaatctattc gttcttctgt tacggtaaat     3900

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ttaaatctat ctggtcccaa attgactaat tctatttgat gatcaaacca actaccaaca     4020

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tgagaagtta ataagcgagt aaacttaaaa accgatgttg ggaatacagg tatgtcatca     4200

atttccgtaa tattgtcatc tactttgtgt gcctgacagt agtgacgata ttctcgacaa     4260

tgtttataat gattacgaaa tgcatcaagc acaagtttct ttctgatttt ttcctgctcg     4320

tcgtaagacc acactaatgg atcgctcgaa aaaatcaaat catcaatttc tgagcttgct     4380

gtaatttctt gtttatcaac atatgaagtc atacctgttt tactcctcaa gataatatta     4440

gaaagtatgg cagcactgct gtcatactct tttataccct tcatctttca agctgctgct     4500

ttgttggctg ctttcactca ccccagtcac atagttatct atgctcctgg ggattcgttc     4560

acttgccgcc tcgctgcaac tcgaaatcta ttaggtatat tccatgtggt acttcttaat     4620

attatcatca acaatattga ttacattttt ttggctcatc aaatcattca ttggttcaaa     4680

ggacagcaat acacttttcg caccacactt ttcaattgcc aacttagccg cagttataca     4740

ctccgtataa tttccgacag cgttttctgc aattatttct tcaagtttat tttcgaaatt     4800

ttcattaggg tgcatttcaa gaacataatc actaataaat gcacgcgtct cttgtttagc     4860

tttattacta tcttcgttat agttaactaa tatcattaac tgatggtcta tctctgatag     4920

gtcaacgtca tatttatccg caacggcttt atatctttca gcatattcat atctaacatc     4980

attagaatca tcccacttaa agatgagagg aatacctttt ttggccgccc actcaacaat     5040

atgatgactg gttgctgtta catatttccg aggtccgcct ggcgtataag catggggatt     5100

tacagatatt ttagggaagc tataaaaatc gttatctgga ttacaatagc ctgttgttaa     5160

agcatcgtta atgatttcat aacactcttc aaatagttgc tgttgatatt caaccgggcg     5220

attaaaaaaa tgcatttcat cttttttttc gcaatcacta aaccctaaaa taaatctccc     5280

ttcacttaac tgatccaata agcaagcttc ctccgctatg gcgacaggat gatgagttgt     5340

aatgatgtga tttaatgaac caattttaat tttctctgtt aaaccgagca gaaaaccaga     5400

aacagtcaga ggagcgccga caacaccatt atctgaaaaa tgattttcat acactaaaat     5460

ctgttcaaaa ttcaacttat caacatactc cgttatttcc tgcatgcgaa ctatactttg     5520

ttcttgaaca gttgttgaat tgatgaagtt aaggaagaac aatccaaatt tcatttcttt     5580

ctccttagct aatataatag cgaacgttgt ttttctttaa gaaatggcat gacatcagac     5640

tggaagagct tcatggaagc aataatttcg tctactgttc cattagcttc aaatccacaa     5700

caaatatttg atattcctgt agcatcaatg tctttttgaa ttatgtcaat acattcctgc     5760

ggcgttccca cgggattgat ttcgtaactg taatcaatac ggcgattagt atctttatgt     5820

ccttttaata caaagtcacg ccactgccct ttattgaaat cataacctct tgtttggtct     5880

gaatcatcaa aaatagtcgt agcattcaca taagaatcat accaatgccc cagaaatttc     5940

cggcaaatct ctttcgcttt aattgagtca tgatctacag atgttatata tgataagcaa     6000

tggtcgatat tatgaatatc gtgcccatat tcttgagcca cttcattata aagctcaagt     6060

tgtgctttct tttcgttagt atttataatc caacttaata tcatcggtag gccaaattga     6120

gcagcccact cagtcgtcga agctgattca gccaccacat aaaccggtgc gccacctctg     6180

ctatacgccg cggggtttac ttttacctta tggaacttga tatgttcatt atcagcttcc     6240

atatatccct ctgtcatgcc attctttatc agcccgtacc agcattccgc taaggcgcga     6300

ctgttattca tatctgtgcc gaatacgcga aagtccttgt tgtaaagccc tcggcaaata     6360

ccaaaccgaa atcgtccttt tgacatttga tccaataaat tcacatcttc aagttggcgt     6420

actggatggg ctgtgggaag aacaatagcg gcagttccta cattcaattt tttagtcgcg     6480

ccaagtaaat atgcagcagc gacataaggg ttaccaagca aaccaaactc cgtgaaatga     6540

tgctccagta accatacggt atcaaaacca cactcctcag agatgcgacc taatttaacc     6600

aaacgtttca ttacctctgt ttgagaaaat tggggaggtt ggtatgtaag caaaaagttt     6660

ccaaatttca tagagagtcc ttatattgct atttgagtga tagaatatct caatagattt     6720

taagacagag aaattgcttg attttcaatc tcaattctca ttcggcgttc attgactgtc     6780

gcaatagtta aatgttcaaa tgacggttca gtaatatcaa catcaatatc cagatgatca     6840

ttatccatcg cgatagcggc tttcgtaacc gattgataaa aattgcgcag gaccactaaa     6900

ttttcactca agtcatgcga acttcctaac aaagaatata tcttgcatcg attactacga     6960

atatttgata acaatgtgat aacttcatct tgcttgaccc aattatcgtt atttgcagta     7020

aaagcaataa acggtatatc aagatacatc atgttattaa ttgtagaagc taaatcttcc     7080

caaccaaaat caagacaatc tctcgcaaag acttcagcac ccaatttatg gccttcaaaa     7140

tctagattat ccggcaattc attaatgggt agactgagat aatcaaaccc taaagctctt     7200

tcaagagaat atcttaagtt aacaacaccg actgcggtga ttaaaaacga agcattgatt     7260

tcagataggc ttgcataagc tatccgcgca gataagcttg aagccaacat accgaagtta     7320

tttatttttc gtgtagttaa ccaatcaacc actgctaaca agctctgctt tcctatagac     7380

attgtaaatt catcaattgt ccctgaactc aatccaacgt ggtgaagcga atcatagcgg     7440

atcacatgaa atccattccg cgataaatat tccgccagac cagcaaaatg atccatcctg     7500

cgggcaaaac cagacgcaat aataatggca ttctttctct ttgggctgtt ttcttctggc     7560

agcgtttccc aaacatgaat ttttttattt ccttcaacac aaataacgtg gtcgatggtt     7620

ttatattttg attcattttc catactttta cctattatgg gacaaataca aggaacttat     7680

cttcttccag gaatcgagtc tgttctattt caaccgcaac atccttagcc gtatagttag     7740

atggcctttc atgagaaata tatgtcacta atcgttgcaa cggtctcatt ccgtcatgag     7800

atccaccaac tcgaaatatg ttattcattc ctgcttctac aatcctttcc gcacctttta     7860

atgctaacgc atctcgatat ttaaatgatg actcccaagg aaaaatagat atggtttgcg     7920

tcttattttt ttgaacataa ggcaatattt gctcaatatt atcgacgtga tgaaggtaca     7980

cacatctgcc aagtggttga ttaaattcca cacctgcatt tgactcaata atcatccaac     8040

gttgatgaat atccacctct acttttaatc cagcaaacaa gctttctttt tgaactaaag     8100

aataggccgc cttttcatca aaatcttttt tggcattcgg taatatatgc gcatatagat     8160

taagtttttc tatcaacgct aacttaaatt cctcataatg atttcccatg taatatatgt     8220

tttgggcaga aaaacaagct cgctgatcgt aaaaacaaac atcatgagcc gcacctgtcg     8280

ctgcggacgt caaatcaaca ggattatcga taatgcaaag actcttttta gaaccaaatt     8340

taatcacatc agcataagat ggcgcatgct ctaccgccca attaatcgca tctggccctc     8400

cccaagcgac aataacatcc gcatgtcgca taatttcttt tgcgagtgat gtatcacctt     8460

ggtggggcca atatataaca gataaagagc gcgttatcgg atgattaggg tctacatcaa     8520

taaaacttaa cgctaatgca ttagcggtaa aaggatcggt tgacgatgtt tttataatac     8580

actgattctt agttaaaatt gcgcgtaata tagacatgat cccagataat ggaacattac     8640

ctgccaacag atgtacagat ttacctttcg gaaaagcccg aacataactt tcatcctgag     8700

gtagccattc atccatgata tggcgagaac caagttcatt ttctacaaca tcataaaggc     8760

cgcctttaga acataaaatc atagatatcc aattggcctc tagcttagcc atttcttctg     8820

aatatcccat atattttttt aagtcacgaa tgtatgtcct gcgtcttgag tattcttcat     8880

ttttccatct ttgccctacc gtatagagaa aattgacaat gttatgcaac cgtaattcgt     8940

tatttccatt acaatcaata atgtttttta catgagagtc attcaatatt ggcaggtaaa     9000

cactattatc accaaaatta atggattgca ctaaatcatc actttcggga aagatttcaa     9060

cctggccgtt aataatgaat gaaatttttt tagtcatgaa ttcggatccg caattgtctt     9120

ggccattgcg aagtgattcc tccggatcgg ggatgaaacc gggggtcacc gggtgacggc     9180

aaccccgcta cttacgctgg ccgggcgcag tgcccgcgac ggacggctca agttgtcctc     9240

gctgccactc gctgcgacga cgggcctggc ctcaccgtcc cgacctacga ctcaccggtc     9300

gcgagtgcca acgttattct tagcactcgc ctatgccgag tgcaagaagc cccgcaccgg     9360

gtcatgcccc tcgttcgacc ttgtcctcgg ccctccgatc cgggtgagta tgttcggccc     9420

atgaccgcca acgacaacaa gacccgtaaa tggtcggccg cagacgtccc cgatcaaagc     9480

gggcgcgtcg ttgtggtcac ctctagaggt acccagcttt tgttcccttt agtgagggtt     9540

aattgcgcgc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt gttatccgct     9600

cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg gtgcctaatg     9660

agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct     9720

gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg     9780

gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc     9840

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg     9900

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct     9960

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca    10020

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct    10080

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc    10140

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt    10200

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc    10260

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc    10320

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg    10380

gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc    10440

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag    10500

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga    10560

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat    10620

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag    10680

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat    10740

cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc    10800

cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat    10860

accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag    10920

ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg    10980

ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc    11040

tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca    11100

acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg    11160

tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc    11220

actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta    11280

ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc    11340

aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg    11400

ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc    11460

cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc    11520

aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat    11580

actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag    11640

cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc    11700

ccgaaaagtg ccac                                                      11714

<210>  8

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  8

aagagctctt ctgcgtttct tagttgccat                                        30

<210>  9

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  9

aaactcgagg acatgtagga ccagtgaaa                                         29

<210>  10

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  10

attctagatc aggcgccggg ggcggtgtc                                         29

<210>  11

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  11

tgtctagacc ggccgtgcgg aattaa                                            26

<210>  12

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  12

aaatcccccg ggataccagg agaaacgttg tcaa                                   34

<210>  13

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  13

aaaagctcta gactacgcaa acgtcgatgg ga                                     32

<210>  14

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  14

ttatctagac accaccgact atttg                                             25

<210>  15

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工引物

<400>  15

tggtctagaa gctcagccaa tcgac                                             25

Claims (9)

1.一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：该重组质粒pOPAI1B按逆时针方向依次含有启动子，发光所需酶基因LuxCDABE，抗性筛选基因Apr和整合酶基因Int的融合基因，位于融合基因两端的同向重复序列DifR和DifL，以及噬菌体整合位点attP和复制子。

2.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：所述的抗性筛选基因为安普霉素抗性基因Apr，其序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：所述的噬菌体整合位点attP为分枝杆菌噬菌体Tweety的attP位点，其序列如SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：所述噬菌体整合酶Int为分枝杆菌噬菌体Tweety的整合酶Int，其序列如SEQ ID NO:6所示。

5.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：所述DifR的序列如SEQ ID NO:2所示，DifL的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.根据权利要求1所述的一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B，其特征在于：该重组质粒pOPAI1B的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

7.一种转化脓肿分枝杆菌的重组质粒pOPAI1B的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）构建质粒pOP1B：起始质粒pOPHI用限制性内切酶Sac I和XhoI 消化后，回收约9 kb的功能片段A；以质粒pTTP1B为模板，用引物 attp1Bf与引物attp1Br扩增出约250 bp的attP片段（SEQ ID NO:4），片段attP经Sac I和Xho I酶切后与功能片段 A进行连接，得到约9 kb的质粒pOP1B；

2）构建质粒pUCDHmke：将质粒pUCDis用XbaI消化，得到约2.7 kb的功能片段；以质粒pNBV1为模板，用引物 hygr727与引物hygf0616扩增出约1.1kb的Hyg片段(SEQ ID NO:5)，片段Hyg经XbaI酶切后与约2.7 kb的功能片段进行连接，得到约3.8 kb的质粒pUCDH，再将质粒pUCDH中的Hyg基因内部的kpnI、EcoRI两个酶切位点进行点突变，获得质粒pUCDHmke；

3）构建质粒pUCDI1B：质粒pUCDHmke用限制性内切酶Sma I和Xba I 消化后，回收约2.7kb的功能片段B；以质粒pTTP1B为模板，用引物 int1Bf与引物int1Br扩增出约1.4 kb的Int片段(SEQ ID NO:6)，片段Int经Sma I和Xba I酶切后与功能片段 B进行连接，得到约4.1kb的质粒pUCDI1B；

4）构建质粒pUCDIAm：用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDI，回收约4.0 kb功能片段；以质粒pIJ6902为模板，用引物 AprXf与引物AprXr扩增出约860 bp的Apr片段(SEQ ID NO:1)；将上述约4.0 kb功能片段和Apr片段连接得约4.9 kb的质粒pUCDAI，再将pUCDAI中Apr基因内部的XhoI酶切位点进行点突变，去掉XhoI位点，得质粒pUCDIAm；

5）构建质粒pUCDAI1B：用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDI1B，得到约4.1 kb功能片段；用限制性内切酶XbaI消化质粒pUCDIAm，回收约860bp 的功能片段Xba I-Apr-XbaI；将该2种功能片段进行连接，得到约5.0 kb的质粒pUCDAI1B；

6）构建质粒pOPAI1B: 用限制性内切酶XhoI消化质粒pOP1B，得到约9.3 kb功能片段；用限制性内切酶XhoI消化质粒pUCDAI1B，回收约2.3 kb 的功能片段Xho I-dif-Int-Apr-dif –Xho I；将该2种功能片段进行连接，得到红11.7 kb的质粒pOPAI1B；

上述引物attp1Bf、attp1Br、hygr727、hygf0616、int1Bf、int1Br、AprXf和AprXr的序列依次分别如SEQ ID NO:8～15所示。

8.一种无抗性筛选标记的自主发光的脓肿分枝杆菌，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：

1）电转化法将权利要求1～7任一项所述的重组质粒pOPAI1B转入脓肿分枝杆菌中，获得自主发光脓肿分枝杆菌；

2）将获得的自主发光脓肿分枝杆菌传代培养筛选出抗性基因和整合酶基因均丢失的发光菌即为无抗性筛选标记的自主发光脓肿分枝杆菌。

9.根据权利要求8所述的一种无抗性筛选标记的自主发光的脓肿分枝杆菌，其特征在于：步骤2）的具体操作为：将步骤1）得到的发光菌挑取少量菌落到无抗性的7H9培育基中，摇床培养，培养物稀释后铺板37℃培养，挑取多个单菌落同时划线到无抗生素的7H11板和含安普霉素（Apr）的7H11板上，37℃培养，挑取在Apr板上未长出，而在相应的无抗板上长出的克隆到7H9培养基中培养，再取培养物铺于Apr板上培养，若平板上无单克隆长出，则筛选所得相应克隆是正确的丢失Apr抗性的克隆。