CN107674876B

CN107674876B - MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用

Info

Publication number: CN107674876B
Application number: CN201610620668.5A
Authority: CN
Inventors: 张猛; 李卓蔚; 贾庆利; 刘香伶
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2016-08-01
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2036-08-01
Also published as: CN107674876A

Abstract

本发明涉及MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用。所涉及的MoKCS基因包含选自以下一种的序列：SEQ ID NO.1所示序列；与SEQ ID NO.1具有90％以上同源性的基因。所涉及的酶为MoKCS基因编码的酶。本发明的MoKCS基因和其编码的酶可用于提高植物中超长链脂肪酸含量的应用。本发明在培育富含神经酸等超长链脂肪酸植物和农作物中具有重要应用价值，尤其可用于培育生产高附加值油料作物。

Description

MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用

技术领域

本发明属于生物技术和作物基因工程领域，包括编码改善农艺品质性状的多肽的核酸。本发明涉及编码β-酮酯酰CoA合酶(KCS)的KCS核酸序列以及该序列编码蛋白在转基因植物中的应用。本发明尤其涉及在植物和种子中提高超长链单不饱和脂肪酸水平和改变脂肪酸组成的方法。

背景技术

神经酸(顺-15-二十四碳烯酸；15-Tetracosenoic acid,(15Z)-，简称24:1)是一个超长链脂肪酸(碳链长度大于或等于22个碳原子)，因其富集于神经组织，尤其是大脑的白质和髓鞘以及末梢神经而得名。除了极少数植物，神经酸在植物中的含量不高于总脂肪酸含量的0.01％。在植物中，神经酸以三酰甘油的形式存在；在动物中，神经酸作为组成神经鞘磷脂的主要脂肪酸成分。神经酸广泛应用于医药以及工业方面(Coupland andLangley,1991；Coupland,1996；Coupland and Yann,2001)。

神经酸在神经细胞髓鞘的合成过程中起到了很重要的作用,而且在人类大脑白质的鞘脂类中均有发现。伴随脱髓鞘疾病如肾上腺脑白质营养不良(ALD)和多发性硬化症(MS)此类疾病的发生，在鞘脂类中，神经酸含量显著减少(Sargent and Coupland et al.,1994)。神经酸对脱髓鞘疾病有积极治疗效果。在制药工业生产中，神经酸已经作为生产用于治疗多发性硬化症(MS)药物的原料(Nicholls,1996)。神经酸适合成年人脑部的营养保健，尤其适合给婴儿配方食品中以及怀孕或哺乳期的妇女用作补充(Coupland,1996)。

德国圭尔夫大学公开了在牛饲料中加入用含有神经酸成分的油脂，以为人类改善牛奶使之品质更加健康的方法(Bettger and DiMichelle-Ranalli et al.,2003，专利号WO2005036981)，此项措施旨在促进人类的神经发育和预防神经变性疾病的发生。显然,一种富含神经酸的转基因植物油可以在此类项目获得可观收益。

在对植物的基因遗传研究的过程中，科学家已经实现了对植物中特定性状的修饰，从提高马铃薯块茎的淀粉含量到提高或改变油料作物(如油菜和向日葵)的脂肪酸含量。随着人类对植物油脂需求和消费的增长，科学家使用生物技术手段改变植物种子脂肪酸含量也日益广泛(Topfer等，1995，Science 268:681-686)。植物学家通过对转基因植物中生物合成途径的调控，培育出特殊的品种，从而生产出具有高附加值的产品。目前美国已经在许多传统油料(如大豆(美国专利号5,955,650)、油菜(美国专利号5,955,650)、向日葵(美国专利号6,084,164)和非常规油脂植物(如烟草(Cahoon等，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:11184-11188))中改变了植物种子中脂肪酸的合成或组分。

发明内容

蒜头果(Malania oleifera)属铁青树科蒜头果属,为中国特有单种属树种。仅自然分布于中国云南东南部至广西西部的狭长地带。蒜头果种仁中油脂含量达64.5％(丁俊峰，2008)，其中神经酸占总的脂肪酸组分中的43.2％(马柏林等，2004)。蒜头果因其自身的生物学特性，导致蒜头果繁殖困难，进而引起蒜头果种群扩大和更新不良。由于多种不利因素，加上分布区域狭窄，使蒜头果处于濒危状态,也被列为国家二级保护植物(赖家业，2006)。蒜头果尽管已有商业公司在广西、云南等地发展蒜头果的栽培与种植，但其发展受到很大的地域限制及栽培规模限制。

发明人在蒜头果中发现了一种基因，同时发明人发现该基因在培育富含神经酸植物和农作物中有较高应用价值。

本发明的MoKCS基因包含选自以下一种的序列：SEQ ID NO.1所示序列；与SEQ IDNO.1具有90％以上同源性的基因。

另一方面，本发明MoKCS基因包含编码选自以下一种蛋白的编码序列：SEQ IDNO.2所示序列；与SEQ ID NO.2具有90％以上同源性的蛋白。

本发明的MoKCS基因可用于提高植物中超长链脂肪酸含量的应用。所述超长链脂肪酸包括神经酸或芥酸中的一种或两种。

本发明还提供一种酶，该所提供的酶包含选自以下一种的序列：SEQ ID NO.2所示序列；与SEQ ID NO.2具有90％以上同源性的蛋白。

本发明的酶可用于提高植物中超长链脂肪酸含量的应用。所述超长链脂肪酸包括神经酸和芥酸中的一种或两种。

与现有的已经验证具有控制合成神经酸功能的基因相比，本发明具有以下效果：

(1)蒜头果是中国珍稀植物资源，发明人从该植物基因组中发现并克隆得到一种新型的KCS基因，与目前十字花科植物中已经验证了具有脂肪酸延长功能的β-酮酯酰CoA合酶(KCS)的氨基酸序列比较，这蒜头果MoKCS基因编码的氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸(Cys)，但只有3个保守的组氨酸(His)，实现脂肪酸延长酶功能的一个重要关键性位点429位上为酪氨酸(Tyr)。

(2)克隆得到的MoKCS位于KCS家族分类中的ζ亚家族。

(3)该基因在拟南芥种子特异表达，转基因植株的种子中芥酸和神经酸含量等超长链脂肪酸均有明显提升。芥酸比例较未转化的拟南芥野生型Col-0提高了4倍，达到了8.1％。野生型中不含神经酸，转基因株系中神经酸明显积累，含量最高可达5.3％。

(4)本发明所述蒜头果的β-酮酯酰CoA合酶基因MoKCS在培育富含神经酸等超长链脂肪酸植物和农作物中具有重要应用价值，尤其可用于培育生产高附加值油料作物。

附图说明

图1发育中不同时期蒜头果种子的脂肪酸组分；图例中脂肪酸种类，冒号前的数字代表碳链长度，冒号后数字代表双键数量(例如C24:1表示碳链长度为24碳、双键数目为1的脂肪酸，C24:1也就是本发明中的神经酸)；样品采集时期Ⅰ为2012年8月14日(开花后121天)；Ⅱ为2012年9月13日(开花后151天)；Ⅲ为2012年10月18日(开花后186天)；

图2蒜头果MoKCS基因与拟南芥KCS基因家族的系统进化树；

图3植物表达载体pH2GW7+MoKCS；

图4蒜头果MoKCS转基因拟南芥植株T3代种子中的超长链脂肪酸组分：左起3条柱状分别表示：二十碳烯酸(20:1)、芥酸(22:1)、神经酸(24:1)；图例中脂肪酸种类，冒号前的数字代表碳链长度，冒号后数字代表双键数量(例如C24:1表示碳链长度为24碳、双键数目为1的脂肪酸，C24:1也就是本发明中的神经酸)；

图5A.拟南芥野生型(Col-0)种子的脂肪酸甲酯气相色谱图；B.蒜头果MoKCS转基因拟南芥植株T3代种子的脂肪酸甲酯气相色谱图；峰编号说明：1.十六酸甲酯(C16:0)；2.硬酯酸甲酯(C18:0)；3.油酸甲酯(C18:1)；4.亚油酸甲酯(C18:2)；5.亚麻酸甲酯(C18:3)；6.花生酸甲酯(C20:0)；7.顺-11-二十碳烯酸(C20:1)；8.顺-11,14-二十碳二烯酸甲酯(C20:2)；9.二十二酸甲酯(C22:0)；10.芥酸甲酯(C22:1)；11.二十四酸甲酯(C24:0)；12.二十四酸甲酯；神经酸甲酯(C24:1),纵坐标为气相色谱检测器信号响应强度，单位为微伏(uV)；

图6载体pGW-MCS的图谱。

以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

以下实施例中，仅对相对特殊的研究方法给以详细介绍。常规的试验方法以及所涉及的常规生化试剂未进行详细描述，研究方法参考《分子克隆实验指南》(J.莎姆布鲁克等著)等。

实施例一蒜头果种子脂肪酸成分分析

1.植物材料准备

蒜头果(Malania oleifera)采集自广西乐业国营雅长林场，第一批样品采集日期为2012年8月14日(DAF121，开花后121天)，为发育中期成熟的种子；第二批采集日期为2012年9月13日(DAF151，开花后151天)，为发育中后期成熟的种子；第三批样品采集日期为2012年10月18日(DAF186，开花后186天)，采集后保存于4℃低温冰箱，为成熟的种子，用于测定脂肪酸组分。

2.脂肪酸的Folch法提取与成分分析

(1)取1g左右的蒜头果胚组织，用研钵将其研碎后，置于螺口玻璃刻度试管中。

(2)加入5ml氯仿：甲醇＝1:2溶液，在涡旋仪上充分震荡混匀后，再加入1ml的水，然后再一次充分震荡混匀，随后以1500r/min，离心10min，取下层液相(氯仿-酯)用氮气吹干。

(3)加入2ml甲酯化反应液(含有2.5％浓H₂SO₄的CH₃OH溶液)，80℃水浴不少于2h。

(4)在水浴锅中取出上述试管，待试管冷却至室温之后，试管中加入1ml色谱级正己烷，同时加入2ml的生理盐水(0.9％NaCl溶液)，在涡旋仪上充分混匀后，在台式离心机上以1500r/min，离心10min，取上清，置于用正己烷润洗过的HPLC进样瓶中，用于测定脂肪酸组分。

(5)脂肪酸气相色谱分析：气相色谱仪型号为Clarus680GC(美国PerkinElmer公司),色谱分析釆用程序升温方式:起始温度为50℃保持1min，然后以35℃/min的速率上升至175℃，保持1min；然后以4℃/min的速率上升至230℃,保持12min。待色谱分析结束后,依据峰的保留时间确定脂肪酸组分，对样品中的每种脂肪酸组分进行均一化处理。脂肪酸分析结果见附图1，随着种子的发育，神经酸不断积累，最后达到约40％。

实施例二 MoKCS基因的克隆

1.植物材料准备

蒜头果(Malania oleifera)采集自广西乐业国营雅长林场。采集日期为2012年9月13日(DAF151，开花后151天)，为发育中后期成熟的种子。保存于-80℃超低温冰箱，用于总RNA提取。

本试验所用拟南芥为野生型Col-0。拟南芥种子在4℃的环境下放置2-4天进行同步化处理后，在人工控制培养室的培养，生长条件为：温度条件为22℃，光周期是16小时光照/8小时黑暗，光强是100-130μE m^-2 S^-1。

2.蒜头果总RNA的提取

采用LiCl-PVP去除多糖多酚法提取蒜头果种胚总RNA。

3.逆转录合成第一链cDNA

采用MMLV逆转录酶反转录获得第一链cDNA用于后面的反应。

4.简并引物的设计

使用NCBI网址中的BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索并收集拟南芥β-酮酯酰CoA合酶的同源基因。然后使用DNAMAN，将GenBank中登录的多种植物的β-酮酯酰CoA合酶基因(KCS)的基因序列进行多重比对分析。根据分析结果，设计了以下PCR引物(简并引物)，以扩增对应于所获得的高保守区域的cDNA片段。

FAE 3-F：5＇－GVATGGGBTGYAGTGCNG－3＇

FAE 3-R：5＇－CCAHACBGCACTRTTACACTTRA－3＇

5.cDNA末端的快速扩增(RACE)

基于通过简并引物克隆获得的基因保守区域序列，设计能够特异扩增目标基因的引物，并用RACE法得到目的基因的3’端和5’端的序列(包括非翻译区)。

3'-RACE获得基因3'末端序列：按Clonetech公司的SMARTTM RACE cDNAAmplification Kit说明书操作，以cDNA为模板，以GSP、NGSP与UPM(引物名称，引物序列参照产品说明书)为引物，进行3’-RACE扩增。

用于3'-RACE的引物

F10 3'RACE 251：5’-ATG TCC GAC CGA TGG CAT TCT AAG-3’

F10 3'RACE 438 N：5’-GCC CCC TTA TGC TAC CAA TGT CT-3’

获得基因的5'末端序列：以cDNA为模板，以GSP、NGSP与UPM(引物名称，引物序列参照产品说明书)为引物，进行5'-RACE扩增，按照上述方法将目的条带回收、克隆后进行测序，根据所得5'端片段与中间片断的重叠区域，以及阅读框是否包含起始密码子ATG，确定所得片段是否为目的基因的5'片段。

用于5’-RACE的引物

F10 5'RACE 736 GSP：5’-ATC TCC TTT CTT CAC CCT TCCCTT-3’

F10 5'RACE 676 NGSP：5’-GCTCAATGTGTTGCCAAAACGATAA-3’

通过RACE对cDNA末端快速克隆，扩增获得了蒜头果β-酮酯酰CoA合酶基因的基因片段。

6.MoKCS基因全长cDNA和基因CDS克隆

根据RACE方法以及ORF区确定的基因序列信息，设计了用于特异扩增了蒜头果β-酮酯酰CoA合酶基因片段的如下引物，用于扩增和克隆全长cDNA和基因CDS编码区。

以蒜头果的cDNA为模板，采用FastPfu DNA Polymerase(Transgene)高保真酶PCR扩增MoKCS，PCR产物经测序确定。

PCR条件：94℃20s，52℃30s和72℃1min30s共34个循环。

克隆KCS基因的引物序列：

KCS-F10-F：5＇－CTGTTGTTTGCTTCAAGGGATT－3＇

KCS-F10-R：5＇－CGGCGAAACAAAGACAAGATA－3＇

7.序列分析

将克隆得到的蒜头果MoKCS与从GenBank获取得到的拟南芥KCS基因家族的21个成员的氨基酸序列在软件ClustalX 2.1(Larkin et al.2007)中进行多重对比，结果见附图2。编码蛋白的保守区域分析发现，MoKCS基因编码的氨基酸序列中有6个保守的半胱氨酸(Cys)，但只有3个保守的组氨酸(His)，位点429位上(相对拟南芥KCS18)为酪氨酸(Tyr),见SEQ ID NO.2。

实施例三：植物表达载体的构建

1.MoKCS基因连接到Gateway入门载体

设计了一对用于特异扩增了蒜头果β-酮酯酰CoA合酶基因的PCR扩增引物，用于扩增多肽编码区的引物，还分别添加用于引入Gateway入门载体的限制性酶位点(BamH I和Kpn I)。

引物序列如下：

上游引物(F)：5＇－CGGGATCCCTGTTGTTTGCTTCAAGGGATT－3＇

下游引物(R)：5＇－GGGGTACCCGGCGAAACAAAGACAAGATA－3＇

将PCR产物和Gateway前入门载体pGW-MCS分别进行BamH I和Kpn I双酶切，连接后筛选单克隆菌落，提取质粒后经测序鉴定确认。

载体pGW-MCS具有序列表中SEQ ID No.4的双链DNA序列(图6)。

SEQ ID No.3为MCS序列，该序列中，自5’端第1位-22位碱基为T7启动子序列，第23位-30位碱基为NotI酶切位点序列，第27位-32位碱基为SacII酶切位点序列，第33位-38位碱基为EcoRI酶切位点序列，第39位-44位碱基为SmaI酶切位点序列，第44位-49位碱基为BamHI酶切位点序列，第49位-54位碱基为HindIII酶切位点序列，第55位-60位碱基为SphI酶切位点序列，第61位-66位碱基为PstI酶切位点序列，第67位-72位碱基为SalI酶切位点序列，第73位-78位碱基为XbaI酶切位点序列，第79位-99位碱基为SP6启动子序列。

SEQ ID No.4中，自5’端第3位-458位碱基为f1噬菌体复制起点(f1ori)，第241位-1019位碱基为LacZ基因片段，第600位-616位碱基为M13正向引物，第659位-758位碱基为attL1重组序列，第759位-780位碱基为T7启动子序列，第781位-839位碱基为MCS序列，第839位-857位碱基为sp6启动子序列，第858位-957位碱基为attL2重组序列，第1015位-1031位碱基为M13反向引物序列，第1035位-1055位碱基为lacZ操纵子序列，第1063位-1093位碱基为lacZ启动子序列，第1417位-2005位碱基为ori序列，第2176位-3036位碱基为AmpR基因序列，第3037位-3141位碱基为AmpR启动子序列。

2.将基因重组至植物表达载体

根据试验目的，通过LR反应，将蒜头果KCS基因导入带有种子特异性启动子Phaseolin，并带有DsRed筛选标记的表达载体pH2GW7::Phaseolin。在0.2ml的离心管中，按顺序加入下列溶液反应体系：1μL pGW-MCS::KCS质粒；0.5μL 5×LR Clonase enzyme mix0.5μL；pH2GW7::Phaseolin::DsRed质粒；0.5μL ddH₂O，25℃温浴反应1hr。反应终止后转化DH5α感受态，37℃过夜培养后，在平板上挑取单克隆，以Phaseolin启动子序列设计正向引物，KCS基因KCS-R为反向引物，进行PCR菌落鉴定，得到pH2GW7::Phaseolin::DsRed::KCS改造质粒菌株。使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒提取质粒。植物表达载体图见附图3。

引物序列如下：

Phaseolin启动子序列设计正向引物：

KCS-R：5＇－CGGCGAAACAAAGACAAGATA－3＇

实施例四：农杆菌介导的蒜头果MoKCS的拟南芥的转化

1.采用冻融法将植物表达载体转化到农杆菌(GV3101菌株)

2.拟南芥的遗传转化

通过花序浸沾法对拟南芥进行遗传转化(Clough and Bent,1998)。

3.拟南芥转基因植物的获得及纯合

收集KCS基因转化得到的拟南芥T0代种子于1.5ml离心管，可在绿色光(激发波长为543nm)的条件下，激发出红色荧光。透过红色的滤光片，相对于未转化的野生型植株Col-0来说，可以通过肉眼观察到阳性转化种子发出的红色荧光，依据此可以筛选出T1代转基因植株并移至以蛭石、珍珠岩、泥炭为基质的盆钵中，让其在培养室中继续生长直至种子被收获。T1代转基因植株种子进行单株收获标号为MoKCS#1-MoKCS#39，共39个株系，然后通过DsRed荧光标记对以上每个单株继续进行筛选并进行脂肪酸组分分析，挑选出神经酸含量高的16个株系，每个株系随机挑出8粒带荧光标记的种子，让其继续在培养室中生长直至种子成熟并单株收获，T2代标号为MoKCS#1-1，MoKCS#1-2至MoKCS#1-8，MoKCS#2-1、MoKCS#2-2至MoKCS#2-8，其它MoKCS株系的表示方法与MoKCS#1和MoKCS#2的类似。对以上T2代KCS转基因植株的每个单株收获的种子通过DsRed荧光标记对以上每个单株继续进行筛选，当筛选到某一T2代单株上收获的种子全部具有红色荧光时，则认为该转基因株系为纯合子，可以用于后续试验。

4.拟南芥种子脂肪酸组分分析

拟南芥成熟种子(包括野生型Col-0、步骤3中获得的T2代种子以及T2代单株上收获的纯合子)在自然光下通风干燥直至重量不发生变化。依据(Poirier et al.,PlantPhysiol,1999，121(4):1359-1366.)方法对拟南芥种子脂肪酸进行提取与分析。

称取10mg种子并加入4ml 1M浓硫酸甲醇溶液提取液，随后放于的水浴进行脂肪酸提取并进行酯化反应，待其冷却至室温后，加入2ml 0.9％NaCl(w/v)终止反应，接着加入2ml正己烷，振荡混匀之后2300rpm离心3min提取脂肪酸甲酯，用移液器吸取上层的有机相，

置于已用正己烷润洗过的HPLC进样瓶中，用于脂肪酸组分的气相色谱分析，

方法同前。测定分析结果见附图4。结果表明，MoKCS转基因拟南芥株系种子中芥酸和神经酸明显积累。

核苷酸序列表电子文件

<110>西北农林科技大学

<120>MoKCS基因、该基因编码的酶及其应用

<141>

<160>

<210>1

<211>1539

<212>DNA

<213>MoKCS基因

<220>

<223>

<400>1

1 ATGGCTCAAC CAAAGCTTGT CAAACCCTTG ATCGCTCCAT CTGCTTCCCC AAGACTTCCT

61 GATTTCAAAC AGGGTGTGAA ACTGAAATAT GTGAAACTGG GCTACCATTA CCTCGTTACT

121 CATGCAATGT ACCTCTTCCT ACCACCTCTT GCAGTCATCG CTGCAGTCCA GCTCTCCACA

181 TTCTCACTCC AAGATGTTCA TGACCTTTTG GGGCAGCTCC GGTACAATCT CATTTCAGTG

241 ATCCTTTGCT CCAGCACCCT TGTCTTTCTA TCCACTCTTT ATTTCCTCAC TCGCCCCCGC

301 CCTGTTTATC TTGTTGATTT CTCGTGCTTT AAGCCTGATG ATGATGATAA AAAATGCTCG

361 TGGCAACGTT TCATGAAGTG TTCTGAATCA AGAGGTACAT TCACTGAGGA AAATATTGAG

421 TTCCAAAGGA AAATTATGGC AAGATCTGGT ATTGGTGAAT CAACTTACCT GCCACCAGCT

481 GTTATGAAAA TTCCTCCAAA TTCGTCAATG GCGGAAGCGA GAGAAGAAGC CAAGATGATA

541 ATCTTTGGTG TTCTTGATCG CCTCTTTGAG AAAACCTCAG TGAAACCAAA AGATATCAGT

601 ATCCTAATTG TCAATTGTAG CTTATTCAAT CCCGTACCTT CTCTATCTGC AATGGTTGTT

661 AACCATTACA AGCTAAGAGG GAACACACGT ACTTATAATT TGGGTGGGAT GGGTTGTAGT

721 GCTGGTTTGA TCTCAATTGA TCTTGCAAAA GACCTACTTC GAGTTCATCC CAATTCTTAT

781 GCATTGGTTG TAAGCATGGA AAGCATCACT ATGAATTGGT ATTTTGGGAA TGAGAGATCA

841 ATGATCGTCC CGAATTGCTT GTTCCGAATG GGAGGGGCAG CAGTTTTGCT TTCCAACAAG

901 ATGTCCGACC GATGGCATTC TAAGTACAAA TTGGTCCACA CTGTCCGGAC TCACAAAGGT

961 TCTGATGATA AGTGCTATAC TTGTGTTACC CAGCGAGAGG ATTCCATTGG GAAGATTGGG

1021 ATTTCTTTGT CAAAGGATCT GATGGCAGTT GCTGGCGATG CCCTGAAGGC AAACATCACT

1081 ACATTGGGCC CCCTTGTGCT ACCAATGTCT GAACAGCTAC TCTTCTTTGC AACATTGGTC

1141 GGGAGGAAAT TTTTTAAGGT GAAGGTGAAG CCTTACATCC CAGATTTCAA GCTAGCTTTT

1201 GAGCATTTCT GTATTCATGC TGGGGGAAGA GCTGTGCTAG ATGAATTGCA AAAGAACTTG

1261 CAGCTTACTG ATTGGCATAT CGAACCTTCA AGGATGACAC TATACCGTTT TGGCAACACA

1321 TCAAGTAGCT CTCTCTGGTA TGAATTGGCT TATACCGAAG CCAAGGGAAG GGTGAAGAAA

1381 GGAGATAGAA CATGGCAAAT AGCATTTGGT TCTGGGTTCA AGTGTAACAG TGCAGTTTGG

1441 GAGGCTCTAA GAACTATCAA CCCCGCAAAG GAGAAGAATC CATGGATGAC GGAGATCCAC

1501 CAGTTCCCTA TAAATGTTCC GCAAGTCTCG GCCATCTAA

<210>2

<211>512

<212>氨基酸序列

<213>MoKCS基因编码的酶

<220>

<223>

<400>2

1 MAQPKLVKPL IAPSASPRLP DFKQGVKLKY VKLGYHYLVT HAMYLFLPPL AVIAAVQLST

61 FSLQDVHDLL GQLRYNLISV ILCSSTLVFL STLYFLTRPR PVYLVDFSCF KPDDDDKKCS

121 WQRFMKCSES RGTFTEENIE FQRKIMARSG IGESTYLPPA VMKIPPNSSM AEAREEAKMI

181 IFGVLDRLFE KTSVKPKDIS ILIVNCSLFN PVPSLSAMVV NHYKLRGNTR TYNLGGMGCS

241 AGLISIDLAK DLLRVHPNSY ALVVSMESIT MNWYFGNERS MIVPNCLFRM GGAAVLLSNK

301 MSDRWHSKYK LVHTVRTHKG SDDKCYTCVT QREDSIGKIG ISLSKDLMAV AGDALKANIT

361 TLGPLVLPMS EQLLFFATLV GRKFFKVKVK PYIPDFKLAF EHFCIHAGGR AVLDELQKNL

421 QLTDWHIEPS RMTLYRFGNT SSSSLWYELA YTEAKGRVKK GDRTWQIAFG SGFKCNSAVW

481 EALRTINPAK EKNPWMTEIH QFPINVPQVS AI*

<210>3

<211>99

<212>DNA

<213>MCS序列

<220>

<223>

<400>3

GTAATACGAC TCACTATAGG GCGCGGCCGC GGGAATTCCC CGGGGATCCA AGCTTGCATG 60

CCTGCAGGTC GACTCTAGAT TCTATAGTGT CACCTAAAT 99

<210>4

<211>3164

<212>DNA

<213>载体pGW-MCS

<223>

<400>4

CTAAATTGTA AGCGTTAATA TTTTGTTAAA ATTCGCGTTA AATTTTTGTT AAATCAGCTC 60

ATTTTTTAAC CAATAGGCCG AAATCGGCAA AATCCCTTAT AAATCAAAAG AATAGACCGA 120

GATAGGGTTG AGTGTTGTTC CAGTTTGGAA CAAGAGTCCA CTATTAAAGA ACGTGGACTC 180

CAACGTCAAA GGGCGAAAAA CCGTCTATCA GGGCGATGGC CCACTACGTG AACCATCACC 240

CTAATCAAGT TTTTTGGGGT CGAGGTGCCG TAAAGCACTA AATCGGAACC CTAAAGGGAG 300

CCCCCGATTT AGAGCTTGAC GGGGAAAGCC GGCGAACGTG GCGAGAAAGG AAGGGAAGAA 360

AGCGAAAGGA GCGGGCGCTA GGGCGCTGGC AAGTGTAGCG GTCACGCTGC GCGTAACCAC 420

CACACCCGCC GCGCTTAATG CGCCGCTACA GGGCGCGTCC CATTCGCCAT TCAGGCTGCG 480

CAACTGTTGG GAAGGGCGAT CGGTGCGGGC CTCTTCGCTA TTACGCCAGC TGGCGAAAGG 540

GGGATGTGCT GCAAGGCGAT TAAGTTGGGT AACGCCAGGG TTTTCCCAGT CACGACGTTG 600

TAAAACGACG GCCAGTGAGC GCGCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGAAT TGGGTACCCA 660

AATAATGATT TTATTTTGAC TGATAGTGAC CTGTTCGTTG CAACACATTG ATGAGCAATG 720

CTTTTTTATA ATGCCAACTT TGTACAAAAA AGCAGGCTGT AATACGACTC ACTATAGGGC 780

GCGGCCGCGG GAATTCCCCG GGGATCCAAG CTTGCATGCC TGCAGGTCGA CTCTAGATTC 840

TATAGTGTCA CCTAAATACC CAGCTTTCTT GTACAAAGTT GGCATTATAA GAAAGCATTG 900

CTTATCAATT TGTTGCAACG AACAGGTCAC TATCAGTCAA AATAAAATCA TTATTTGGAG 960

CTCCAGCTTT TGTTCCCTTT AGTGAGGGTT AATTGCGCGC TTGGCGTAAT CATGGTCATA 1020

GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA CACAACATAC GAGCCGGAAG 1080

CATAAAGTGT AAAGCCTGGG GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA TTGCGTTGCG 1140

CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG CTGCATTAAT GAATCGGCCA 1200

ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT TGCGTATTGG GCGCTCTTCC GCTTCCTCGC TCACTGACTC 1260

GCTGCGCTCG GTCGTTCGGC TGCGGCGAGC GGTATCAGCT CACTCAAAGG CGGTAATACG 1320

GTTATCCACA GAATCAGGGG ATAACGCAGG AAAGAACATG TGAGCAAAAG GCCAGCAAAA 1380

GGCCAGGAAC CGTAAAAAGG CCGCGTTGCT GGCGTTTTTC CATAGGCTCC GCCCCCCTGA 1440

CGAGCATCAC AAAAATCGAC GCTCAAGTCA GAGGTGGCGA AACCCGACAG GACTATAAAG 1500

ATACCAGGCG TTTCCCCCTG GAAGCTCCCT CGTGCGCTCT CCTGTTCCGA CCCTGCCGCT 1560

TACCGGATAC CTGTCCGCCT TTCTCCCTTC GGGAAGCGTG GCGCTTTCTC ATAGCTCACG 1620

CTGTAGGTAT CTCAGTTCGG TGTAGGTCGT TCGCTCCAAG CTGGGCTGTG TGCACGAACC 1680

CCCCGTTCAG CCCGACCGCT GCGCCTTATC CGGTAACTAT CGTCTTGAGT CCAACCCGGT 1740

AAGACACGAC TTATCGCCAC TGGCAGCAGC CACTGGTAAC AGGATTAGCA GAGCGAGGTA 1800

TGTAGGCGGT GCTACAGAGT TCTTGAAGTG GTGGCCTAAC TACGGCTACA CTAGAAGGAC 1860

AGTATTTGGT ATCTGCGCTC TGCTGAAGCC AGTTACCTTC GGAAAAAGAG TTGGTAGCTC 1920

TTGATCCGGC AAACAAACCA CCGCTGGTAG CGGTGGTTTT TTTGTTTGCA AGCAGCAGAT 1980

TACGCGCAGA AAAAAAGGAT CTCAAGAAGA TCCTTTGATC TTTTCTACGG GGTCTGACGC 2040

TCAGTGGAAC GAAAACTCAC GTTAAGGGAT TTTGGTCATG AGATTATCAA AAAGGATCTT 2100

CACCTAGATC CTTTTAAATT AAAAATGAAG TTTTAAATCA ATCTAAAGTA TATATGAGTA 2160

AACTTGGTCT GACAGTTACC AATGCTTAAT CAGTGAGGCA CCTATCTCAG CGATCTGTCT 2220

ATTTCGTTCA TCCATAGTTG CCTGACTCCC CGTCGTGTAG ATAACTACGA TACGGGAGGG 2280

CTTACCATCT GGCCCCAGTG CTGCAATGAT ACCGCGAGAC CCACGCTCAC CGGCTCCAGA 2340

TTTATCAGCA ATAAACCAGC CAGCCGGAAG GGCCGAGCGC AGAAGTGGTC CTGCAACTTT 2400

ATCCGCCTCC ATCCAGTCTA TTAATTGTTG CCGGGAAGCT AGAGTAAGTA GTTCGCCAGT 2460

TAATAGTTTG CGCAACGTTG TTGCCATTGC TACAGGCATC GTGGTGTCAC GCTCGTCGTT 2520

TGGTATGGCT TCATTCAGCT CCGGTTCCCA ACGATCAAGG CGAGTTACAT GATCCCCCAT 2580

GTTGTGCAAA AAAGCGGTTA GCTCCTTCGG TCCTCCGATC GTTGTCAGAA GTAAGTTGGC 2640

CGCAGTGTTA TCACTCATGG TTATGGCAGC ACTGCATAAT TCTCTTACTG TCATGCCATC 2700

CGTAAGATGC TTTTCTGTGA CTGGTGAGTA CTCAACCAAG TCATTCTGAG AATAGTGTAT 2760

GCGGCGACCG AGTTGCTCTT GCCCGGCGTC AATACGGGAT AATACCGCGC CACATAGCAG 2820

AACTTTAAAA GTGCTCATCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGAAAACTCT CAAGGATCTT 2880

ACCGCTGTTG AGATCCAGTT CGATGTAACC CACTCGTGCA CCCAACTGAT CTTCAGCATC 2940

TTTTACTTTC ACCAGCGTTT CTGGGTGAGC AAAAACAGGA AGGCAAAATG CCGCAAAAAA 3000

GGGAATAAGG GCGACACGGA AATGTTGAAT ACTCATACTC TTCCTTTTTC AATATTATTG 3060

AAGCATTTAT CAGGGTTATT GTCTCATGAG CGGATACATA TTTGAATGTA TTTAGAAAAA 3120

TAAACAAATA GGGGTTCCGC GCACATTTCC CCGAAAAGTG CCAC 3164

Claims

1.MoKCS基因，该MoKCS基因为SEQ ID NO.1所示序列。

2.MoKCS基因，该MoKCS基因为编码SEQ ID NO.2所示序列的蛋白。

3.权利要求1或2所述MoKCS基因用于提高植物中神经酸和芥酸含量的应用。

4.一种酶，该酶为SEQ ID NO.2所示序列的蛋白。

5.权利要求4所述酶用于提高植物中神经酸和芥酸含量的应用。