CN108998464B - pSP107质粒及其应用、构建方法 - Google Patents

Abstract

pSP107质粒及其应用、构建方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种新的质粒pSP107质粒、以及该pSP107质粒的应用和构建方法。本发明的质粒可以转化到UET2和UEMT2原生质体中，获得UeTSP菌株和UeMTSP菌株，这两种菌株可以侵染茭白使茭白孕茭，为人工孕茭提供了一种新的思路。

Description

pSP107质粒及其应用、构建方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及pSP107质粒及其应用、构建方法。

背景技术

菰黑粉菌（Ustilago esculenta）是一种独特的病原真菌，其侵染茭白植株（Zizania latifolia）后可抑制植株抽穗开花并刺激茎基部膨大形成可食用的茭白。在东亚及东南亚地区尤其是中国，茭白是一种营养很高的水生蔬菜，也是一种重要的药材。但是田间常出现充满冬孢子的灰茭和少量冬孢子形成的芝麻茭，误食后易形成肺炎，不利于茭白产业的发展。鉴于人工育种技术的成功开发，如何控制茭白中菰黑粉菌冬孢子的形成将是茭白人工育种的一大关键。

前期研究发现，菰黑粉菌与其他二型态真菌类似，存在酵母型和菌丝型两种型态，而由酵母型向菌丝型转换是此类真菌致病性的关键。在菰黑粉菌中，其二型态转换受到a，b基因的调控，需要两个性亲和单倍体融合形成双核菌丝，在侵染过程中受环境因子影响菌丝内两个细胞核核融形成一个二倍体的核从而产生二倍体的冬孢子。

申请人在长期研究过程中发现自龙茭2号灰茭中分离得到单倍体菌株UET1（交配基因型为a1b1，该菌株在CN 105838616 A的发明专利中已经公开，保藏号为CGMCCNo.11843）、UET2（交配基因型为：a2b2，该菌株在CN105838615A的发明专利中已经公开，保藏号为：CGMCC No.11844）、UEMT3（交配基因型为a3b3，该菌株在CN105838617A的发明专利中已经公开，保藏号为：CGMCC No.11842）和UEMT2（交配基因型为a2b2，该菌株在CN105838618A的发明专利中已经公开，保藏号为：CGMCC No.11841）。当UET1与UET2或当UEMT3与UEMT2两个性亲和菰黑粉菌共培养时，两个性亲和菰黑粉菌共培养时，体外培养的菌落从酵母型向菌丝型转变，菌落生长气生菌丝，菌丝可以侵染茭白，使茭白孕茭，但是容易产生灰茭。

基于上述问题，申请人成功构建pSP107质粒，经试验发现该质粒经原生质体转化，可获得单倍体的可产生菌丝的UeTSP菌株和UeMTSP菌株，该菌株可成功侵染茭白。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种pSP107质粒及其应用、构建方法的技术方案。

所述的一种带有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的pSP107质粒。

所述的pSP107质粒作为菰黑粉菌UET2或UEMT2的原核表达载体的应用。

所述的pSP107质粒作为菰黑粉菌UET2或UEMT2的原核表达载体获得UeTSP和UeMTSP菌株的应用，所述的UeTSP和UeMTSP菌株能够侵染茭白使茭白孕茭。

所述的pSP107质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）获得菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA；

2）以菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA为模板，以mfa1.2F和mfa1.2R，bE1F和bE1R为引物进行PCR,获得mfa1.2和bE1基因序列，所述的mfa1.2F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，bE1F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，bE1R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

3）用mfa1.2F和bE1R引物，以mfa1.2和bE1基因序列为模板，进行融合PCR，将mfa1.2和bE1基因连接成一个长片段；

4）将融合PCR产物和pUMa932质粒经限制性内切酶ECORⅤ和HindⅢ双酶切2h后的产物，连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后提取重组质粒，即为原核表达质粒pSP107。

本发明的质粒经酶切后，可以转化到UET2和UEMT2原生质体中，获得UeTSP菌株和UeMTSP菌株，这两种菌株可以侵染茭白使茭白孕茭，为人工孕茭提供了一种新的思路。

附图说明

图1为mfa1.2和bE1基因电泳扩增图；

图2为pUMa932质粒图谱；

图3为pUMa932质粒经双酶切图；

图4为mfa1.2和bE1基因融合PCR结果图；

图5为pSP107质粒图谱；

图6为构建的UeTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（下）及菌落（上）形态显微观察图；

图7为构建的UeMTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌（上）及菌落（下）形态显微观察图；

图8为茭白经UeTSP菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）；

图9为茭白经UeMTSP菌株侵染后共聚焦观察图（左图叶鞘，右图茎部）。

具体实施方式

以下结合实施例来进一步说明本发明。

实例1：菰黑粉菌 UET1菌株中基因组DNA的提取

1、提前半小时在65℃水浴锅内水浴加热CTAB提取液；

2、用枪头取UET14菌体（厚度约5mm）于2.0mL离心管中，加入10颗左右不锈钢钢珠（直径1mm），标记；通风橱内，加入800ul预热的CTAB提取液；震荡仪70Hz，震荡150s，破碎菌体；

3、65℃水浴1h；

4、加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），混匀；

5、通风橱内，室温静置15min；室温，10000rpm离心10min；此时离心管内出现分层现象，上清中含有核酸，中间是蛋白层，底部为钢珠和杂质；小心吸取上清液至新的1.5mL离心管中（可一直重复4、5步，直至肉眼不可见中间蛋白层）；

8、向上清中加入等体积的异丙醇，温和地颠倒混匀，可直接离心或静置5-10min后离心；

9、预冷离心机至4℃，然后4℃，10000rpm离心10min；

10、倒上清，加1mL的75%乙醇，轻轻颠倒洗涤DNA；4℃，10000rpm离心5min，弃上清；

11、弃去上清后，可置于37℃烘箱中或倒扣在纸巾上5-10min进行干燥，亦可采用其他干燥方式；若底部有残留乙醇也无碍；

12、加入30ul无菌水溶解DNA，50℃水浴20min，去除挥发物；-20℃保存。

实例2：mfa1.2基因的克隆

以实例1中获得的UET1菌株中基因组DNA为模板，根据设计的mfa1.2F和mfa1.2R引物，克隆mfa1.2基因。mfa1.2F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

PCR扩增体系：（50 ul）

10×PCR buffer （takara） 5ul

dNTP mix （takara） 4ul

mfa1.2F 1ul

mfa1.2R 1ul

LATaq （takara） 0.5ul

dd H2O 37.5ul

UET1UET1 DNA 1ul

PCR反应条件如下：

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。

实例3：bE1基因的克隆

以实例1中获得的UET1菌株中基因组DNA为模板，根据设计的bE1F和bE1R引物进行PCR，克隆bE1基因。bE1F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，bE1R的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示。

PCR扩增体系：（50 ul）

10×PCR buffer （takara） 5ul

dNTP mix （takara） 4ul

bE1F 1ul

bE1R 1ul

LATaq （takara） 0.5ul

dd H₂O 37.5ul

UET1UET1 DNA 1 ul

PCR反应条件如下：

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。

mfa1.2和bE1基因电泳扩增图如图1所示。

实例4：pUMa932质粒线性化

酶切体系（30 ul）

pUMa932质粒DNA 4 ul

HindⅢ HF(neb) 1 ul

ECORⅤHF(neb) 1 ul

1x Qcut Buffer 3 ul

dd H₂O 21 ul

在37℃下，酶切2h。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收。置于﹣20℃冰箱备用。pUMa932质粒图谱如图2所示。pUMa932质粒经双酶切如图3所示，使用ECORⅤ和HindⅢ将pUMa932质粒进行双酶切，得到两个片段，片段长度在4000左右的为我们需要的片段，进行割胶回收，得到目的片段。

实例5：融合PCR

一轮 25 ul体系

10×PCR buffer （takara） 2.5ul

dNTP mix （takara） 2ul

LATaq （takara） 0.25ul

Mfa片段 2ul

bE1片段 2ul

dd H2O 16.25 ul

PCR反应条件如下：

二轮 50 ul体系

10×PCR buffer （takara） 5ul

dNTP mix （takara） 4ul

LATaq （takara） 0.5ul

mfa1.2F 2ul

bE1R 2ul

一轮产物 3ul

dd H₂O 33.5 ul

PCR反应条件如下：

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶后用试剂盒回收。

mfa1.2和bE1基因融合PCR结果如图4所示。mfa1.2的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，bE1的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

实例6：融合PCR产物与双酶切开的pUMa932载体连接

为完成此步骤，使用南京诺维赞生物科技有限公司生产的ClonExpress II OneStep Cloning Kit重组克隆试剂盒。具体步骤如下所示：

1）于冰上配制以下反应体系：

组分（20 ul）

pUMa932线性化载体 1.5ul

mfa1.2- bE1融合片段 1.5ul

5×CEⅡ buffer 4ul

ExnaseⅡ 2ul

dd H₂O 11ul

(注：ClonExpress® II 重组反应体系最适克隆载体使用量为0.03 pmol， 最适插入片段使用量为0.06 pmol(载体与插入片段摩尔比为1 : 2)。这些摩尔数对应的DNA质量可由以下公式粗略计算获得：最适克隆载体使用量 = [0.02 × 克隆载体碱基对数]ng(0.03 pmol)最适插入片段使用量 = [0.04 × 插入片段碱基对数]ng (0.06 pmol))。

2）使用移液器轻轻吹打混匀，（请勿震荡混匀），短暂离心反应液收集至管底。

3）37℃反应30min；降至4℃或立即置于冰上冷却。

实例7：重组产物转化

1）于- 80℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞（100μL），冰上放置溶解，做好标记；

2）加入10 μL连接产物，小心吹打混匀，冰上放置20 ~30 min；（备注：该过程用于使连接产物充分吸附到感受态细胞表面）

3）42℃水浴热激90 s ，快速放置到冰上冷却，并保持3-5 min；

4）加入800 μL LB培养基，37 ℃，200 rpm培养1 h；

5）8000 rpm，2 min离心；

6）移除约700 μL培养基，剩余100 μL培养基吹打混匀，涂相应抗性的平板，37 ℃倒置培养10-14 h；

7）挑取单菌落，挑单菌落于2 mL离心管，离心管中加入1 mL加入抗生素的LB液体培养基，37 ℃，180 rpm培养4-8 h即可进行菌液PCR验证。

将菌液PCR条带相符的菌液送到上海桑尼测序公司进行测序。测序正确的菌液扩摇并提质粒，将其命名为pSP107质粒。该pSP107质粒图谱如图5所示，pSP107质粒的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

实例8：pSP107质粒的酶切

pSP107质粒 4ul

PVUⅠHF（neb） 1ul

1x Qcut Buffer 3ul

dd H2O 22ul

在37℃下，酶切2h。

1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用Magen凝胶DNA微量回收试剂盒回收产物。置于﹣20℃冰箱备用。

实例9：UET2原生质体的制备

1、菌株培养：

从平板上挑UET2单菌落接种到15-20mL YEPS液体培养基中，28℃，180 rpm摇床振荡预培养至OD600为0.8-1.5之间（约24 h）。

将小摇的菌液5 mL接种到新的50 mL YEPS液体培养基中继续培养至OD600为0.6～0.8，（6～8 h），最长时间不超过12 h。

2、原生质体制备

（1）取少许培养好的菰黑粉菌置于载玻片上在显微镜下观察，确认无污染；

（2）将50 mL菌液收集到50 mL的无菌管中，常温3000rpm，离心5 min，弃上清；

（3）将菌体重悬于25 mL SCS中，常温3000 rpm，离心5min，弃上清；

（4）加入配制好的2mL SCS/lywallzyme重悬菌体（轻柔吹打，避免产生过多气泡）；

（5）室温（25℃左右）水平慢速摇床（50 rpm以下）上酶解（MT型约40～50 min），每隔约10分钟取样观察，最终时间以酶解效果为准，原生质体产生量约为50%，几乎所有细胞开始产生原生质体时进行下一步；

（6）在菌液中加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（7）再次加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（8）再次加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（9）将细胞重悬于10 mL预冷的STC中，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（10）将细胞重悬于500 μL预冷的STC（蔗糖）中，冰上放置，分装到提前在-80℃冰箱中预冷的1.5 mL离心管中，每管50 μL，置于-80℃冰箱中保存。

实例10：UET2原生质体转化

1、取两瓶Regenerations-Agar（蔗糖）微波加热至融化，冷却至60℃后取其中一瓶培养基加入萎锈灵（10 mg/mL）使萎锈灵终浓度为50μg/mL后倒平板，每个平皿上倒约10 mL培养基（可略厚），另一瓶暂时放置在60℃烘箱中保温；

2、取原生质体冰上放置10 min；

3、各原生质体中分别加入1 μL Heparin；

4、每管加入总量为1～5 μg的实例8准备好的DNA（体积不允许超过10 μL）

轻轻吹打两三下混匀，冰浴10 min。在此期间，自烘箱中取出未加抗生素的100ml的Regenerations-Agar培养基，在已凝固的含萎锈灵的Regenerations-Agar平板上再倒一层培养基，每个平板倒约10 mL培养基（可略薄），制成再生平板；

5、每管原生质体中加入500 μL STC-PEG（蔗糖），轻轻颠倒两下混匀后冰上放置15min；

6、将冰上放置15 min后的原生质体全部加入到相应抗性的再生平板上，颠倒涂板；

7、将涂好的平板正置放在28 ℃培养箱中培养3-4天等表面干燥后倒置，再培养2-5天筛选转化子。

实例11：转化子表型验证

将再生平板上长出的转化子，继代于YEPS加入萎锈灵（终浓度为50μg/mL）抗性的平板上扩大培养。将菌株保存，并继代于YEPS平板上，每12h观察一次表型。经观察可知，24hUeTSP菌落上开始有菌丝大量生长。将得到的新菌株UeTSP进行保藏。该菌株于2018年06月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.15929，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）。

实例12：所构建菌株侵染能力及孕茭表型验证

将所构建的UeTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌落状态，从图6可以看出，该菌株在36h菌丝大量生长。且在接种后如图8所示，菌株可直接侵染茭白，使茭白孕茭，但是不产生冬孢子，即不形成灰茭这种不利表型。

实例13：UEMT2原生质体的制备

1、菌株培养：

从平板上挑UEMT2单菌落接种到15-20mL YEPS液体培养基中，28℃，180 rpm摇床振荡预培养至OD600为0.8-1.5之间（约24 h）。

将小摇的菌液5 mL接种到新的50 mL YEPS液体培养基中继续培养至OD600为0.6～0.8，（6～8 h），最长时间不超过12 h。

2、原生质体制备

（1）取少许培养好的菰黑粉菌置于载玻片上在显微镜下观察，确认无污染；

（2）将50 mL菌液收集到50 mL的无菌管中，常温3000rpm，离心5 min，弃上清；

（3）将菌体重悬于25 mL SCS中，常温3000 rpm，离心5min，弃上清；

（4）加入配制好的2mL SCS/lywallzyme重悬菌体（轻柔吹打，避免产生过多气泡）；

（5）室温（25℃左右）水平慢速摇床（50 rpm以下）上酶解（MT型约40～50 min），每隔约10分钟取样观察，最终时间以酶解效果为准，原生质体产生量约为50%，几乎所有细胞开始产生原生质体时进行下一步；

（6）在菌液中加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（7）再次加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（8）再次加10 mL预冷的SCS，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（9）将细胞重悬于10 mL预冷的STC中，4℃，2400 rpm，离心10 min，弃上清；

（10）将细胞重悬于500 μL预冷的STC（蔗糖）中，冰上放置，分装到提前在-80℃冰箱中预冷的1.5 mL离心管中，每管50 μL，置于-80℃冰箱中保存。

实例14：UEMT2原生质体转化

1、取两瓶Regenerations-Agar（蔗糖）微波加热至融化，冷却至60℃后取其中一瓶培养基加入萎锈灵（10 mg/mL）使萎锈灵终浓度为50μg/mL后倒平板，每个平皿上倒约10 mL培养基（可略厚），另一瓶暂时放置在60℃烘箱中保温；

2、取原生质体冰上放置10 min；

3、各原生质体中分别加入1 μL Heparin；

4、每管加入总量为1～5 μg的实例8准备好的DNA（体积不允许超过10 μL）

轻轻吹打两三下混匀，冰浴10 min。在此期间，自烘箱中取出未加抗生素的100ml的Regenerations-Agar培养基，在已凝固的含萎锈灵的Regenerations-Agar平板上再倒一层培养基，每个平板倒约10 mL培养基（可略薄），制成再生平板；

5、每管原生质体中加入500 μL STC-PEG（蔗糖），轻轻颠倒两下混匀后冰上放置15min；

6、将冰上放置15 min后的原生质体全部加入到相应抗性的再生平板上，颠倒涂板；

7、将涂好的平板正置放在28 ℃培养箱中培养3-4天等表面干燥后倒置，再培养2-5天筛选转化子。

实例15：转化子表型验证

将再生平板上长出的转化子，继代于YEPS加入萎锈灵（终浓度为50μg/mL）抗性的平板上扩大培养。将菌株保存，并继代于YEPS平板上，每12h观察一次表型。经观察可知，36h后UeMTSP菌落上开始有菌丝大量生长。将得到的新菌株UeMTSP进行保藏。该菌株于2018年07月02日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCCNo.16040，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，分类命名为：茭白黑粉菌（Ustilago esculenta）。

实例16：所构建菌株侵染能力及孕茭表型验证

将所构建的UeMTSP菌株在YEPS平板上活化，观察12、24、36、48小时的菌落状态，从图7可以看出，该菌株在36h菌丝大量生长。且在接种后如图9所示，菌株可直接侵染茭白，使茭白孕茭，但是不产生冬孢子，即不形成灰茭这种不利表型。

序列表

<110> 中国计量大学

<120> pSP107质粒及其应用、构建方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8394

<212> DNA

<213> 质粒(plasmid)

<400> 1

gaactcgagc agctgaagct taactcgctt atttgacttg cttatccttc gcctagtctg 60

atctctgacg agatcatgct gcggaaccac agacccaaat ttcgaatgag cgcgctttca 120

ttcggggtgg ccaatataga gagtaacaaa atcgagacaa aaaggacgag gactttgcag 180

caccgcaacc aagttcagta acttgactag gcgagcaaga gccaatcaat gagattagaa 240

ttcgaaaaga ggtaggggtt ccaaccatcg gcagtggaaa gccggcgatc cgagcatcct 300

tgcctgtttt tcgaccagaa tagactcggg gtcgtggcca acgagagaga tcggcgattg 360

cctcaacaag cgatgcaatc acgtccaatg gggttgctgc ctgtttagcg aaagaattgg 420

ccgatcaaaa tcaaagcccc tgagcaacgt cagtatcgag gtctcttcac aatcagcgaa 480

gagaggcaag aagagacctg aacttactta ccaaagcaag cttaggcgac aatacatgtg 540

gagtagccga gaggggctcc accgccacgg ccctcatcgg cgggcgaggg ctgggtctcg 600

gagacggagg actgggcggg ctgagtgaag atggagaaca ttttcagaaa gaagtgtggg 660

gtgtttaaat cggtgttcga acgagtgtgt gaatgagagt agttgtgctt tggatatcga 720

ctagcttcgg atcccgctgc ttatatcctt ttcgacgccg tttacatgtt gtggtcaggc 780

taactaggga cacagtatct ctgtgttcat aggtgcgcac tcctaccgtc caggagctgg 840

agagtgacag ttgctactga ccagcactac agaccagtca ttgagatgaa caaaggaaca 900

cgaggctagc aaggctctcc tttccatcct tcagtggcga gcctccctta ttttggctcg 960

ttccctttcc aattcgggac ttcgagtgcg aaggtggcgg tctgacgtct ctgagtcttt 1020

gttgtttagt tcagtgactg aaaacgtggg caccaaccat acaaactggc agccagtgcc 1080

ttgcgctaag attatcaatc agacaatctc tttcatcctt ccatgcagta ctgaccatca 1140

gataaagggc attgtgagat ttggacaaag ggcattcagc gccattattc caaagtggca 1200

gggtcccttt gacacaatac ggttagtcgc acagccgatt gatgcattgt ttagatctcc 1260

ccatgcaatc ttggccgctt tcccaggctg tctctcgaac aattatcccc tttcaacgtc 1320

ctcaaccccc ggttcaggtt ggagattggc atacactttt cctttatttt tccctttgtg 1380

agcgcaaaat tcgatgcaac gcgtaggctc tttgctttat attaaaaggg acctggggtc 1440

cctttgtcaa gttctgcaga agccaatccg caatcagttt cataccaagc acggaaagaa 1500

gtacaatgta ctgtacagta cggaccgaat cagcataccc tatgtcttat attgattcga 1560

tgatatagca gaagataaga aacgcatgtc tcagacacgc agtgttcaag gtgctatttg 1620

agctttgtgt caccgcacac aaaagtgaca cgccctggaa gcaaaccaca aacgagtcca 1680

aagggctgtc gcagacgctg ttctcacaat tagcaagtac agtgaagatg tttacgctca 1740

ccactgttca ttactccaaa gattctgcaa actgtgtttg ataggaaaga attgaaacaa 1800

gcgagaacgt agctttttcg ctcgaacgct gcgaatcaaa ctcgtgatcg gggctatatc 1860

aaaatcgccg gcttgtgaca agccaaagta acgagattaa ctcgtcagat tggaaagaaa 1920

gggctaaact acaggctgat cgacctagga aacactcgga gactcaaacg ctggactttg 1980

aaccctcttg tacagaactc aagcctcgtg taagtcaacc tgcggaccta gctatgcggc 2040

tcggaaaggt taaatagagg gcggtacagg tcgtcctgat ctgctttccg acatcacaca 2100

tcacacctca cactttacaa caccacctca aaagacctct tcccctctag ctccttctgt 2160

cactaaattc ttcaaagaag ctgcaagtgt agcatgtgaa atgttttctt ctacccactt 2220

cggtcactta aacccctgtg tcattttatc aaagctttga gccgtaaagt gtaagccgcg 2280

gtagtatctt ggctgtgccg atacgcacag attctcttgc ctgacctcaa gctactcctt 2340

cctccaccat ctcaacagct gacacttttc atgcatatcg actaggacaa cggatatcga 2400

gtgatacaac gggaatttcc aaaacacaaa gggtagccag aatacaaagc gaaaacgaat 2460

caaccaaacg cggcggagag actgtttgaa gagaaagttt ctctcctgat tagcaccggc 2520

acctgtccaa gtgcatcgta aggaggcaaa tcgtgctgct tgacggcagg ctcgagatag 2580

gttgccgtct gagcgttgtc aagcgtgtgc gcttcaggca ctgagatgca cgtgccaggc 2640

gcagagcctc ttgtattgtc tgtgagacag taaaaatcac agagggctgt ggtcagtgag 2700

gggaacaagt aacgttctct gaaagggaag gcacttaccc gtggaaaggg aatccgtcga 2760

cagcttctga acgcgtttcg gcagcgcttt gacttttcgc ccgcctttca agttgagact 2820

cggactctgc agcacatcgt tcgggtgcga aaaaggattg tagtacatca tcgaaagatt 2880

gctgctgagt gaattgaagc tcgtgtctac cgtagagcat gtgctgagat ctggcgttga 2940

ctccatgcct gagctttctc tgttgctgtc catggaagga gtcttgctcg cccgctgcgt 3000

ggatttcctc ggctttgcct gtgctgttgt gatcatgcgt gctggagttc gcttcgctgc 3060

tgtaggaaca gctcgcccct gacttggatt gagattcttc ttgttggcgg cgacaagatc 3120

gtgaacccag ctacctattt tctctttgac gccgtactta atccagctga tcatacttgc 3180

ccagtcgtct tcgaaagctt tcttatcttc ggccgtgagc tgtcgaccaa gattttcgcg 3240

aagaacatcg tccaacttgt gagtcagaac tgatctgaga ggctcagtgc ggataggaag 3300

atcggaagag accaacttgg tttggataag aagtctcatg cgattgcgat cattgcacgc 3360

gaacttccgg aggatatgag accagccaga gcggcggcgc gcgttgatga accataaagt 3420

gagctgatgg acgttaagct gtttgttgtc ggaacgggcg gcagactcgt tggtaacttc 3480

gacaagtgct tctttatcgt cttgagaggg ataagggtca tccagggttg cgaggaaatg 3540

cttccgcatg tggtatgatg gtaagctctc tgagagtgga ttttcacctt cagtatccga 3600

ccgaagtagc tggaatactt cttttgcaga atcatctgct atgttcttgg attgtgcctc 3660

cagttgcaca agtgcttccg agaccacagt gatgctccta accgtttctt gaatctttcg 3720

acggacatca ggatcccctt tgttgctgat tgctccttgt cggaatgctt cttgagccca 3780

ctgtagacgg gaaagaatgt cagggctctg gttattcgat agcaatgatg cctggatctc 3840

ctccagatca gtgagtagtt cgaggagttg cattttggtg aaacctttct ctgggttggt 3900

ggcagtaaga aaaaaatggc cacggtcctt acactggtca gattccaaaa taatgcgcgt 3960

ccacaaagca gatgtaagag gttgggattg gccccttccc tttgttccat cctaccttat 4020

cataatttgc gctctagtct ttcgacccat tcttgaccat catcagctct tgttccgccg 4080

atatcagatc tgccggtctc cctatagtga gtcgtattaa tttcgataag ccaggttaac 4140

ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 4200

gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 4260

cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 4320

tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 4380

cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 4440

aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 4500

cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 4560

gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 4620

ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 4680

cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 4740

aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 4800

tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 4860

ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 4920

tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 4980

ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 5040

agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 5100

atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 5160

cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 5220

ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 5280

ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 5340

agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct 5400

agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc 5460

gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 5520

cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 5580

gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 5640

tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 5700

tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 5760

aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 5820

cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 5880

cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 5940

aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 6000

ttcctttttc aatatcgagc acgttgatgg gatcgatcct agaatatcaa tcgagccacc 6060

gtcaatttcg agcgctaagt ggagttgtcc gagtccccga atcacaagaa ttaggctcgt 6120

gctctgtgag atctctcgcg aaacccagat gaaggaaaaa aatcggaaga tcgcggaaga 6180

agtggggttc gcatggtcta acattgtcgc attcctcaca gtttcggctg gaaacggcag 6240

ggacaatcac gagaaatgcg cgacgagtat tcagttgtcc aaaattatgt cagcttgaaa 6300

gttggaaacg gcggaagaaa attcgtcagg agggcgttgc ggctagggtg aagaacggag 6360

acaatttcgg ctttgaaatt ggctcgactc tgattggatc atgacgcact gctggtccac 6420

aaccgtgtcg aaggtgccgt ctttactaca ggtccgctgg aagcaaaatg gaaaaagccg 6480

ctggagcccg actacagagc cgccgtgttt tggtaatcag tcggcaaata ggtcagcaca 6540

gcgcagcgtg acaggttctt gcaatttaca gcacagctcg tccgtctacg actttgcaca 6600

ccacaaagtg tgcggggagc aaaggagccg atcttggtcg cgcgcaaagc caaggagtct 6660

tgaacctgag agtgtgcgtg tcttgtgacg cttgcccttc tgtactttgc tgtgacacta 6720

ccaccacatc tgtcttggct ttttgttcat acatccacac cgaccatgtc gctattcaac 6780

gtcagcaacg gtcttcgtac cgctctccga ccttctgttg ccagctcttc gcgcgttgct 6840

gccttttcca caaccgccgc tgcccgtctc gccacaccca cctctgacaa cgttggcagt 6900

tcgggcaagc ctcagcactt gaagcagttc aagatctacc gatggaaccc tgacaagccc 6960

tcggagaagc ctcgtctgca gtcgtacaca ctggacctca accagaccgg tccaatggtt 7020

ctcgacgcgc tcatcaaaat caagaacgaa attgacccta cgctcacctt ccgtcgctcg 7080

tgccgtgagg gtatctgcgg ttcgtgcgct atgaatattg acggtgtcaa caccctcgcc 7140

tgcctctgcc ggatcgacaa gcagaatgac accaagatct accccttgcc gcacatgtac 7200

attgtcaagg acctcgtgcc agacttgacc cagttctaca agcagtaccg atccatcgag 7260

cctttcctca agtccaacaa caccccttct gagggtgaac atcttcagtc gcccgaggag 7320

cgtcgtcgac tcgacggtct gtacgagtgc attctgtgcg cgtgctgctc cacatcctgc 7380

ccctcttact ggtggaatca ggacgagtac cttggccccg ccgtgctcat gcaggcgtac 7440

cgatggatgg ccgactcgcg tgacgacttt ggtgaggagc gaagacagaa gctcgagaac 7500

accttttcgc tctaccgatg ccttaccatc atgaactgct ccaggacctg ccccaagaac 7560

ctcaaccctg gtaaggcaat tgcacagatc aagaaggaca tggccgtcgg cgcacccaag 7620

gcttccgagc gccctatcat ggcttcgtcg taatcttgat atatcatatc gttctttcct 7680

cagcacttct tttgtcaatt tcaaaagtat ctaattgcat tcaactccgc ttgtggtttg 7740

ttgttcagtg agagtggaaa cgctacgggc aagatgaggg cagtgttctg gcgacggaaa 7800

agtgtgcaag tgtctggcct gcgtcctcgc tggttccagc agccgatgca ggacgtgtac 7860

ctagcgattt cttcgacagc ctattgtggc agccgcgatt cgccacaatc gtacgaaagc 7920

gagacgagtt gagcgaagat ccccattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 7980

gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 8040

cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 8100

ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 8160

gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 8220

aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 8280

catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatggacat attgtcgtta gaacgcggct 8340

acaattaata cataacctta tgtatcatac acatacgatt taggtgacac tata 8394

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 2

gaactcgagc agctgaagct taactcgctt atttgacttg c 41

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 3

ctcgtgtaag tcaacctgcg gaagctgcaa gtgtagcatg 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 4

catgctacac ttgcagcttc cgcaggttga cttacacgag 40

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 5

gagaccggca gatctgatat cggcggaaca agagctgatg a 41

<210> 6

<211> 2155

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)

<400> 6

aactcgctta tttgacttgc ttatccttcg cctagtctga tctctgacga gatcatgctg 60

cggaaccaca gacccaaatt tcgaatgagc gcgctttcat tcggggtggc caatatagag 120

agtaacaaaa tcgagacaaa aaggacgagg actttgcagc accgcaacca agttcagtaa 180

cttgactagg cgagcaagag ccaatcaatg agattagaat tcgaaaagag gtaggggttc 240

caaccatcgg cagtggaaag ccggcgatcc gagcatcctt gcctgttttt cgaccagaat 300

agactcgggg tcgtggccaa cgagagagat cggcgattgc ctcaacaagc gatgcaatca 360

cgtccaatgg ggttgctgcc tgtttagcga aagaattggc cgatcaaaat caaagcccct 420

gagcaacgtc agtatcgagg tctcttcaca atcagcgaag agaggcaaga agagacctga 480

acttacttac caaagcaagc ttaggcgaca atacatgtgg agtagccgag aggggctcca 540

ccgccacggc cctcatcggc gggcgagggc tgggtctcgg agacggagga ctgggcgggc 600

tgagtgaaga tggagaacat tttcagaaag aagtgtgggg tgtttaaatc ggtgttcgaa 660

cgagtgtgtg aatgagagta gttgtgcttt ggatatcgac tagcttcgga tcccgctgct 720

tatatccttt tcgacgccgt ttacatgttg tggtcaggct aactagggac acagtatctc 780

tgtgttcata ggtgcgcact cctaccgtcc aggagctgga gagtgacagt tgctactgac 840

cagcactaca gaccagtcat tgagatgaac aaaggaacac gaggctagca aggctctcct 900

ttccatcctt cagtggcgag cctcccttat tttggctcgt tccctttcca attcgggact 960

tcgagtgcga aggtggcggt ctgacgtctc tgagtctttg ttgtttagtt cagtgactga 1020

aaacgtgggc accaaccata caaactggca gccagtgcct tgcgctaaga ttatcaatca 1080

gacaatctct ttcatccttc catgcagtac tgaccatcag ataaagggca ttgtgagatt 1140

tggacaaagg gcattcagcg ccattattcc aaagtggcag ggtccctttg acacaatacg 1200

gttagtcgca cagccgattg atgcattgtt tagatctccc catgcaatct tggccgcttt 1260

cccaggctgt ctctcgaaca attatcccct ttcaacgtcc tcaacccccg gttcaggttg 1320

gagattggca tacacttttc ctttattttt ccctttgtga gcgcaaaatt cgatgcaacg 1380

cgtaggctct ttgctttata ttaaaaggga cctggggtcc ctttgtcaag ttctgcagaa 1440

gccaatccgc aatcagtttc ataccaagca cggaaagaag tacaatgtac tgtacagtac 1500

ggaccgaatc agcataccct atgtcttata ttgattcgat gatatagcag aagataagaa 1560

acgcatgtct cagacacgca gtgttcaagg tgctatttga gctttgtgtc accgcacaca 1620

aaagtgacac gccctggaag caaaccacaa acgagtccaa agggctgtcg cagacgctgt 1680

tctcacaatt agcaagtaca gtgaagatgt ttacgctcac cactgttcat tactccaaag 1740

attctgcaaa ctgtgtttga taggaaagaa ttgaaacaag cgagaacgta gctttttcgc 1800

tcgaacgctg cgaatcaaac tcgtgatcgg ggctatatca aaatcgccgg cttgtgacaa 1860

gccaaagtaa cgagattaac tcgtcagatt ggaaagaaag ggctaaacta caggctgatc 1920

gacctaggaa acactcggag actcaaacgc tggactttga accctcttgt acagaactca 1980

agcctcgtgt aagtcaacct gcggacctag ctatgcggct cggaaaggtt aaatagaggg 2040

cggtacaggt cgtcctgatc tgctttccga catcacacat cacacctcac actttacaac 2100

accacctcaa aagacctctt cccctctagc tccttctgtc actaaattct tcaaa 2155

<210> 7

<211> 1903

<212> DNA

<213> 菰黑粉菌(Ustilago esculenta)

<400> 7

gaagctgcaa gtgtagcatg tgaaatgttt tcttctaccc acttcggtca cttaaacccc 60

tgtgtcattt tatcaaagct ttgagccgta aagtgtaagc cgcggtagta tcttggctgt 120

gccgatacgc acagattctc ttgcctgacc tcaagctact ccttcctcca ccatctcaac 180

agctgacact tttcatgcat atcgactagg acaacggata tcgagtgata caacgggaat 240

ttccaaaaca caaagggtag ccagaataca aagcgaaaac gaatcaacca aacgcggcgg 300

agagactgtt tgaagagaaa gtttctctcc tgattagcac cggcacctgt ccaagtgcat 360

cgtaaggagg caaatcgtgc tgcttgacgg caggctcgag ataggttgcc gtctgagcgt 420

tgtcaagcgt gtgcgcttca ggcactgaga tgcacgtgcc aggcgcagag cctcttgtat 480

tgtctgtgag acagtaaaaa tcacagaggg ctgtggtcag tgaggggaac aagtaacgtt 540

ctctgaaagg gaaggcactt acccgtggaa agggaatccg tcgacagctt ctgaacgcgt 600

ttcggcagcg ctttgacttt tcgcccgcct ttcaagttga gactcggact ctgcagcaca 660

tcgttcgggt gcgaaaaagg attgtagtac atcatcgaaa gattgctgct gagtgaattg 720

aagctcgtgt ctaccgtaga gcatgtgctg agatctggcg ttgactccat gcctgagctt 780

tctctgttgc tgtccatgga aggagtcttg ctcgcccgct gcgtggattt cctcggcttt 840

gcctgtgctg ttgtgatcat gcgtgctgga gttcgcttcg ctgctgtagg aacagctcgc 900

ccctgacttg gattgagatt cttcttgttg gcggcgacaa gatcgtgaac ccagctacct 960

attttctctt tgacgccgta cttaatccag ctgatcatac ttgcccagtc gtcttcgaaa 1020

gctttcttat cttcggccgt gagctgtcga ccaagatttt cgcgaagaac atcgtccaac 1080

ttgtgagtca gaactgatct gagaggctca gtgcggatag gaagatcgga agagaccaac 1140

ttggtttgga taagaagtct catgcgattg cgatcattgc acgcgaactt ccggaggata 1200

tgagaccagc cagagcggcg gcgcgcgttg atgaaccata aagtgagctg atggacgtta 1260

agctgtttgt tgtcggaacg ggcggcagac tcgttggtaa cttcgacaag tgcttcttta 1320

tcgtcttgag agggataagg gtcatccagg gttgcgagga aatgcttccg catgtggtat 1380

gatggtaagc tctctgagag tggattttca ccttcagtat ccgaccgaag tagctggaat 1440

acttcttttg cagaatcatc tgctatgttc ttggattgtg cctccagttg cacaagtgct 1500

tccgagacca cagtgatgct cctaaccgtt tcttgaatct ttcgacggac atcaggatcc 1560

cctttgttgc tgattgctcc ttgtcggaat gcttcttgag cccactgtag acgggaaaga 1620

atgtcagggc tctggttatt cgatagcaat gatgcctgga tctcctccag atcagtgagt 1680

agttcgagga gttgcatttt ggtgaaacct ttctctgggt tggtggcagt aagaaaaaaa 1740

tggccacggt ccttacactg gtcagattcc aaaataatgc gcgtccacaa agcagatgta 1800

agaggttggg attggcccct tccctttgtt ccatcctacc ttatcataat ttgcgctcta 1860

gtctttcgac ccattcttga ccatcatcag ctcttgttcc gcc 1903

Claims (4)

1.一种如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的pSP107质粒。

2.如权利要求1所述的pSP107质粒作为菰黑粉菌UET2或UEMT2的表达载体的应用。

3.如权利要求1所述的pSP107质粒在菰黑粉菌UET2或UEMT2中表达获得UeTSP和UeMTSP菌株的应用，所述的UeTSP和UeMTSP菌株能够侵染茭白使茭白孕茭。

4.如权利要求1所述的pSP107质粒的构建方法，其特征在于包括以下工艺步骤：

1）获得菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA；

2）以菰黑粉菌UET1菌株基因组DNA为模板，以mfa1.2F和mfa1.2R，bE1F和bE1R为引物进行PCR，获得mfa1.2和bE1基因序列，所述的mfa1.2F的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，mfa1.2R的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，bE1F的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，bE1R的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；

3）用mfa1.2F和bE1R引物，以mfa1.2和bE1基因序列为模板，进行融合PCR，将mfa1.2和bE1基因连接成一个长片段；

4）将融合PCR产物和pUMa932质粒经限制性内切酶ECORⅤ和HindⅢ双酶切2h后的产物，连接后转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取单克隆培养后测序验证，提取重组质粒，即为表达质粒pSP107。

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