CN114574376A - 一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用 - Google Patents

一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用 Download PDF

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项琪
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Abstract

本发明公开了一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta‑M3及其应用。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta‑M3，其于2022年2月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：GDMCC No:62247。本发明通过pCas9‑Delta质粒介导的基因组进化筛选获得一株酿酒酵母突变菌株Delta‑M3。该菌株在摇瓶发酵条件下，YPD培养基中类胡萝卜素含量可以达到7.7 mg/g，比出发菌株（酿酒酵母BL03，Cit1‑tHMG1，ΔAld6菌株）提高1.85倍。

Description

一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用。
背景技术
类胡萝卜素是一大类有颜色的类异戊二烯物质，由于其具有超强的抗氧化性，可以用于着色剂、营养品、抗氧化剂等。野生型酿酒酵母并不能合成类胡萝卜素，但是通过基因工程改造酿酒酵母用于类胡萝卜素合成已经获得了较高产量。但是，发现新的基因改造靶点，在已有报道的基础上进一步提高类胡萝卜素的合成还是很困难的。而自然诱变或者定向进化为进一步提高类胡萝卜素含量提供了重要的技术手段。例如，通过常温等离子诱变（ARTP）可以将虾青素的产量提高0.83倍；ARTP结合过氧化氢介导的实验室适应性进化可以将虾青素含量提高4倍。
重组酶催化短同源区域的DNA片段交换，可以实现DNA片段的缺失、重复、移位和反转等基因组结构变异，是基因组进化的重要驱动力之一。Cre和FLP分别识别loxP位点和FRT位点，是目前普遍使用的两种重组酶。近年来发展出一种利用Cre介导的同源重组驱动染色体重排和修饰的进化方法—SCRaMbLE；首先合成酵母染色体时在每个非必需基因后添加loxP位点，通过表达Cre重组酶实现多个loxP位点之间的随机重组，以创建随机的遗传多样性文库。利用SCRaMbLE技术，经过5个迭代循环和筛选，类胡萝卜素的产量提高了38.8倍。虽然此种基因组进化展现出强大的进化能力，然而此种方法需要特定的合成酿酒酵母菌株。由于基因组中存在大量loxP位点，菌株不稳定，不能直接用于生产应用，还需反向代谢工程确定变异位点并进行定向改造。
酿酒酵母基因组中存在大量Delta序列，而Cas9介导的基因组切割，可以诱发酿酒酵母细胞内的重组修复功能，导致酵母基因组发生重排，结合类胡萝卜素颜色特征，即可实现定向筛选。
发明内容
本发明的第一个目的是提供高产类胡萝卜素的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3，其于2022年2月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：GDMCCNo: 62247。
本发明的第二个目的是提供上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3在合成类胡萝卜素中的应用。
优选，是将酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3接种到YPD培养基中进行发酵培养，合成类胡萝卜素。
本发明的第三个目的是提供一种质粒载体pCas9-Delta，所述的质粒载体pCas9-Delta含有靶向酿酒酵母Delta序列的gRNA、G418抗性基因、CEN/ARS复制子和Cas9基因。
优选，所述的质粒载体pCas9-Delta的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第四个目的是提供上述的质粒载体pCas9-Delta在酿酒酵母基因组重排中的应用。所述的pCas9-Delta载体介导Cas9蛋白对酿酒酵母Delta序列进行切割，并以其它Delta序列作为模板进行重组修复，介导基因组重排。由此获得一株产类胡萝卜素酿酒酵母突变菌株-酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3，其于2022年2月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：GDMCC No: 62247。
本发明的第五个目的是提供一种上述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3的构建方法，包括以下步骤：将上述的质粒载体pCas9-Delta转入酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6菌株中，得到酿酒酵母Delta-M3。
优选的，所述的构建方法，包括以下步骤：将酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6菌株制成感受态细胞，然后与上述的质粒载体pCas9-Delta混合，电击转化后，培养筛选得到酿酒酵母Delta-M3。
本发明人以已授权专利（专利号：ZL2019103999462）中酿酒酵母BL03，Cit1-tHMG1，ΔAld6（BL03-D-4）菌株为出发菌株，通过pCas9-Delta质粒介导的基因组重排获得类胡萝卜素含量明显提升的酿酒酵母突变菌株Delta-M3。
本发明的第六个目的是提供一种用于基因组重排的试剂盒，该试剂盒含有上述的质粒载体pCas9-Delta。
本发明通过pCas9-Delta质粒介导的基因组进化筛选获得一株酿酒酵母突变菌株Delta-M3。该菌株在摇瓶发酵条件下，YPD培养基中类胡萝卜素含量可以达到7.7 mg/g，比出发菌株（酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6菌株）提高1.85倍。
Saccharomyces cerevisiae Delta-M3，其于2022年2月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：GDMCC No: 62247。
附图说明
图1是pCas9-Delta质粒图谱。
图2 是pCas9-Delta质粒介导的基因组重排筛选系统。
图3是突变菌株（Delta-M3）及出发菌株（BL03-D-4）性能表征。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。除非特别说明，下面实施例中所用的技术均为本领域内的技术人员已知的常规技术，所使用的仪器设备和试剂等，均为本领域内的技术人员可以通过公共途径如商购等获得的。
实施例1：pCas9-Delta质粒构建
用引物pCas9-F和pCas9-R以pHCas9M （Molecular Cloud Cat. No.: MC_0000293）质粒为模板扩增质粒骨架，用引物CEN/ARS-F和CEN/ARS-R以pCSN067（AddgeneNo.: 101748）质粒为模板扩增CEN/ARS复制子，通过重组试剂盒，将质粒骨架和CEN/ARS复制子构建重组质粒pCas9-gRNA。通过引物gRNA-UP-F和gRNA-UP-R，以pCas9-gRNA质粒为模板扩增上游片段，引物gRNA-DOWN-Delta-F和gRNA-DOWN-Delta-R，以pCas9-gRNA为模板扩增下游片段，通过重组试剂盒，构建重组质粒pCas9-Delta，将已构建重组质粒gRNA序列换成靶向酿酒酵母Delta序列。并将新的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取氨苄青霉素平板上长出的菌落，提取质粒及测序后，将验证正确的重组质粒命名为：pCas9-Delta。所述的pCas9-Delta质粒图谱见图1，质粒pCas9-Delta的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，引物的具体序列如下：
pCas9-F：5'-cgtctaagaaactctttgaaaagataatgtatgattatgctt-3'
pCas9-R：5'-atgaaaaggacccatggcggcgttagtatcgaatcgac-3'
CEN/ARS-F：5'-taacgccgccatgggtccttttcatcacgtgctataa-3'
CEN/ARS-R：5'-tcttttcaaagagtttcttagacggatcgcttgcctg-3'
gRNA-UP-F：5'-ctagagatctgtttagcttgcctcgt-3'
gRNA-UP-R：5'-gatcatttatctttcactgcggagaagtttc-3'
gRNA-DOWN-Delta-F：5'-cttctccgcagtgaaagataaatgatctatactagaagttctcctcggttttagagc-3'
gRNA-DOWN-Delta-R：5'-cattttgaagctatgggatctgacattattattgttggaag-3'。
实施例2：pCas9-Delta质粒介导的基因组重排
本实施例的酿酒酵母发酵培养基为YPD液体培养基，配方为：酵母提取物10 g/L（OXOID公司），蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，溶剂为水。其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌制得。
基于酿酒酵母Delta序列特征及Cas9蛋白切割功能，我们推测Delta序列切割可以驱动酿酒酵母基因组重排，从而结合类胡萝卜素特性进行优良性状菌株筛选。所以我们设计了一套pCas9-Delta质粒介导的基因组重排筛选系统（如图2），基本原理是：以专利号为ZL2019103999462中酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6（BL03-D-4）菌株为出发菌株，以YPD液体培养基为发酵培养基，先从新鲜的YPD固体平板挑取单克隆，于5mL YPD液体培养基中，30℃培养过夜。按2%体积接种量，接种于50 mL YPD液体培养基中，待菌体进入对数生长中期，冰浴30 min。4℃，3000g离心5min。弃掉上清液，用预冷的无菌1 M山梨醇溶液重悬菌体，洗涤3次。最后加入1 mL预冷的山梨醇溶液重悬菌体，100 μL每管分装至预冷的1.5 mL无菌离心管中备用，得到BL03-D-4菌株感受态细胞。
取9 μLpCas9-Delta质粒与上述BL03-D-4菌株感受态细胞混合，冰浴5 min，将混合物转移至2 mm电击杯内进行转化，电击转化参数为：电压1.5 kV，25 μF，电阻200 Ω，典型电击持续时间为5 ms。电转化完毕后，立即将菌液转至1 mL YPD液体培养基中，复壮1 h，涂布于含400 μg/mL G418的YPD平板上，30℃培养48 h，观察菌株颜色变化。经过约10批次实验后，成功筛选到一株颜色明显变红的菌株，命名为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3，其于2022年2月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510070，保藏编号为：GDMCCNo: 62247。
实施例3：Delta-M3菌株生产性能测试
将出发菌株-酿酒酵母BL03-D-4和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3分别划线于新鲜YPD固体培养基中，48小时后，挑取单菌落接种于5mL YPD液体培养基中，过夜培养后，按体积比2%接种量分别接种到50 mLYPD液体培养基中。于30℃，200 rpm条件下培养96小时。培养结束，按标准的测定方法，测定突变菌株表达类胡萝卜素的含量。
从图3可以看出，酿酒酵母Delta-M3相比较出发菌株-酿酒酵母BL03-D-4，类胡萝卜素含量有明显提高。酿酒酵母Delta-M3在摇瓶发酵条件下，YPD液体培养基中类胡萝卜素含量可以达到7.7 mg/g细胞干重，比出发菌株BL03-D-4提高1.85倍。
以上对本发明进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 暨南大学
<120> 一种高产类胡萝卜素的酿酒酵母Delta-M3及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9577
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400> 1
catagcttca aaatgtttct actccttttt tactcttcca gattttctcg gactccgcgc 60
atcgccgtac cacttcaaaa cacccaagca cagcatacta aatttcccct ctttcttcct 120
ctagggtgtc gttaattacc cgtactaaag gtttggaaaa gaaaaaagag accgcctcgt 180
ttctttttct tcgtcgaaaa aggcaataaa aatttttatc acgtttcttt ttcttgaaaa 240
tttttttttt tgattttttt ctctttcgat gacctcccat tgatatttaa gttaataaac 300
ggtcttcaat ttctcaagtt tcagtttcat ttttcttgtt ctattacaac tttttttact 360
tcttgctcat tagaaagaaa gcatagcaat ctaatctaag ttttaattac aaaatgcctc 420
caaaaaagaa gagaaaggtc gacaagaagt actccattgg gctcgatatc ggcacaaaca 480
gcgtcggctg ggccgtcatt acggacgagt acaaggtgcc gagcaaaaaa ttcaaagttc 540
tgggcaatac cgatcgccac agcataaaga agaacctcat tggcgccctc ctgttcgact 600
ccggggagac ggccgaagcc acgcggctca aaagaacagc acggcgcaga tatacccgca 660
gaaagaatcg gatctgctac ctgcaggaga tctttagtaa tgagatggct aaggtggatg 720
actctttctt ccataggctg gaggagtcct ttttggtgga ggaggataaa aagcacgagc 780
gccacccaat ctttggcaat atcgtggacg aggtggcgta ccatgaaaag tacccaacca 840
tatatcatct gaggaagaag cttgtagaca gtactgataa ggctgacttg cggttgatct 900
atctcgcgct ggcgcatatg atcaaatttc ggggacactt cctcatcgag ggggacctga 960
acccagacaa cagcgatgtc gacaaactct ttatccaact ggttcagact tacaatcagc 1020
ttttcgaaga gaacccgatc aacgcatccg gagttgacgc caaagcaatc ctgagcgcta 1080
ggctgtccaa atcccggcgg ctcgaaaacc tcatcgcaca gctccctggg gagaagaaga 1140
acggcctgtt tggtaatctt atcgccctgt cactcgggct gacccccaac tttaaatcta 1200
acttcgacct ggccgaagat gccaagcttc aactgagcaa agacacctac gatgatgatc 1260
tcgacaatct gctggcccag atcggcgacc agtacgcaga cctttttttg gcggcaaaga 1320
acctgtcaga cgccattctg ctgagtgata ttctgcgagt gaacacggag atcaccaaag 1380
ctccgctgag cgctagtatg atcaagcgct atgatgagca ccaccaagac ttgactttgc 1440
tgaaggccct tgtcagacag caactgcctg agaagtacaa ggaaattttc ttcgatcagt 1500
ctaaaaatgg ctacgccgga tacattgacg gcggagcaag ccaggaggaa ttttacaaat 1560
ttattaagcc catcttggaa aaaatggacg gcaccgagga gctgctggta aagcttaaca 1620
gagaagatct gttgcgcaaa cagcgcactt tcgacaatgg aagcatcccc caccagattc 1680
acctgggcga actgcacgct atcctcaggc ggcaagagga tttctacccc tttttgaaag 1740
ataacaggga aaagattgag aaaatcctca catttcggat accctactat gtaggccccc 1800
tcgcccgggg aaattccaga ttcgcgtgga tgactcgcaa atcagaagag accatcactc 1860
cctggaactt cgaggaagtc gtggataagg gggcctctgc ccagtccttc atcgaaagga 1920
tgactaactt tgataaaaat ctgcctaacg aaaaggtgct tcctaaacac tctctgctgt 1980
acgagtactt cacagtttat aacgagctca ccaaggtcaa atacgtcaca gaagggatga 2040
gaaagccagc attcctgtct ggagagcaga agaaagctat cgtggacctc ctcttcaaga 2100
cgaaccggaa agttaccgtg aaacagctca aagaagacta tttcaaaaag attgaatgtt 2160
tcgactctgt tgaaatcagc ggagtggagg atcgcttcaa cgcatccctg ggaacgtatc 2220
acgatctcct gaaaatcatt aaagacaagg acttcctgga caatgaggag aacgaggaca 2280
ttcttgagga cattgtcctc acccttacgt tgtttgaaga tagggagatg attgaagaac 2340
gcttgaaaac ttacgctcat ctcttcgacg acaaagtcat gaaacagctc aagaggcgcc 2400
gatatacagg atgggggcgg ctgtcaagaa aactgatcaa tgggatccga gacaagcaga 2460
gtggaaagac aatcctggat tttcttaagt ccgatggatt tgccaaccgg aacttcatgc 2520
agttgatcca tgatgactct ctcaccttta aggaggacat ccagaaagca caagtttctg 2580
gccaggggga cagtcttcac gagcacatcg ctaatcttgc aggtagccca gctatcaaaa 2640
agggaatact gcagaccgtt aaggtcgtgg atgaactcgt caaagtaatg ggaaggcata 2700
agcccgagaa tatcgttatc gagatggccc gagagaacca aactacccag aagggacaga 2760
agaacagtag ggaaaggatg aagaggattg aagagggtat aaaagaactg gggtcccaaa 2820
tccttaagga acacccagtt gaaaacaccc agcttcagaa tgagaagctc tacctgtact 2880
acctgcagaa cggcagggac atgtacgtgg atcaggaact ggacatcaat cggctctccg 2940
actacgacgt ggatcatatc gtgccccagt cttttctcaa agatgattct attgataata 3000
aagtgttgac aagatccgat aaaaatagag ggaagagtga taacgtcccc tcagaagaag 3060
ttgtcaagaa aatgaaaaat tattggcggc agctgctgaa cgccaaactg atcacacaac 3120
ggaagttcga taatctgact aaggctgaac gaggtggcct gtctgagttg gataaagccg 3180
gcttcatcaa aaggcagctt gttgagacac gccagatcac caagcacgtg gcccaaattc 3240
tcgattcacg catgaacacc aagtacgatg aaaatgacaa actgattcga gaggtgaaag 3300
ttattactct gaagtctaag ctggtctcag atttcagaaa ggactttcag ttttataagg 3360
tgagagagat caacaattac caccatgcgc atgatgccta cctgaatgca gtggtaggca 3420
ctgcacttat caaaaaatat cccaagcttg aatctgaatt tgtttacgga gactataaag 3480
tgtacgatgt taggaaaatg atcgcaaagt ctgagcagga aataggcaag gccaccgcta 3540
agtacttctt ttacagcaat attatgaatt ttttcaagac cgagattaca ctggccaatg 3600
gagagattcg gaagcgacca cttatcgaaa caaacggaga aacaggagaa atcgtgtggg 3660
acaagggtag ggatttcgcg acagtccgga aggtcctgtc catgccgcag gtgaacatcg 3720
ttaaaaagac cgaagtacag accggaggct tctccaagga aagtatcctc ccgaaaagga 3780
acagcgacaa gctgatcgca cgcaaaaaag attgggaccc caagaaatac ggcggattcg 3840
attctcctac agtcgcttac agtgtactgg ttgtggccaa agtggagaaa gggaagtcta 3900
aaaaactcaa aagcgtcaag gaactgctgg gcatcacaat catggagcga tcaagcttcg 3960
aaaaaaaccc catcgacttt ctcgaggcga aaggatataa agaggtcaaa aaagacctca 4020
tcattaagct tcccaagtac tctctctttg agcttgaaaa cggccggaaa cgaatgctcg 4080
ctagtgcggg cgagctgcag aaaggtaacg agctggcact gccctctaaa tacgttaatt 4140
tcttgtatct ggccagccac tatgaaaagc tcaaagggtc tcccgaagat aatgagcaga 4200
agcagctgtt cgtggaacaa cacaaacact accttgatga gatcatcgag caaataagcg 4260
aattctccaa aagagtgatc ctcgccgacg ctaacctcga taaggtgctt tctgcttaca 4320
ataagcacag ggataagccc atcagggagc aggcagaaaa cattatccac ttgtttactc 4380
tgaccaactt gggcgcgcct gcagccttca agtacttcga caccaccata gacagaaagc 4440
ggtacacctc tacaaaggag gtcctggacg ccacactgat tcatcagtca attacggggc 4500
tctatgaaac aagaatcgac ctctctcagc tcggtggaga cagcagggct gaccccaaga 4560
agaagaggaa ggtgtgattt tggacctcga gtcattggac ctcgagtcat gtaattagtt 4620
atgtcacgct tacattcacg ccctcccccc acatccgctc taaccgaaaa ggaaggagtt 4680
agacaacctg aagtctaggt ccctatttat ttttttatag ttatgttagt attaagaacg 4740
ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacagac gcgtgtacgc atgtaacatt 4800
atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcggccgg 4860
taccctagag atctgtttag cttgcctcgt ccccgccggg tcacccggcc agcgacatgg 4920
aggcccagaa taccctcctt gacagtcttg acgtgcgcag ctcaggggca tgatgtgact 4980
gtcgcccgta catttagccc atacatcccc atgtataatc atttgcatcc atacattttg 5040
atggccgcac ggcgcgaagc aaaaattacg gctcctcgct gcagacctgc gagcagggaa 5100
acgctcccct cacagacgcg ttgaattgtc cccacgccgc gcccctgtag agaaatataa 5160
aaggttagga tttgccactg aggttcttct ttcatatact tccttttaaa atcttgctag 5220
gatacagttc tcacatcaca tccgaacata aacaaccatg ggtaaggaaa agactcacgt 5280
ttcgaggccg cgattaaatt ccaacatgga tgctgattta tatgggtata aatgggctcg 5340
cgataatgtc gggcaatcag gtgcgacaat ctatcgattg tatgggaagc ccgatgcgcc 5400
agagttgttt ctgaaacatg gcaaaggtag cgttgccaat gatgttacag atgagatggt 5460
cagactaaac tggctgacgg aatttatgcc tcttccgacc atcaagcatt ttatccgtac 5520
tcctgatgat gcatggttac tcaccactgc gatccccggc aaaacagcat tccaggtatt 5580
agaagaatat cctgattcag gtgaaaatat tgttgatgcg ctggcagtgt tcctgcgccg 5640
gttgcattcg attcctgttt gtaattgtcc ttttaacagc gatcgcgtat ttcgtctcgc 5700
tcaggcgcaa tcacgaatga ataacggttt ggttgatgcg agtgattttg atgacgagcg 5760
taatggctgg cctgttgaac aagtctggaa agaaatgcat aagcttttgc cattctcacc 5820
ggattcagtc gtcactcatg gtgatttctc acttgataac cttatttttg acgaggggaa 5880
attaataggt tgtattgatg ttggacgagt cggaatcgca gaccgatacc aggatcttgc 5940
catcctatgg aactgcctcg gtgagttttc tccttcatta cagaaacggc tttttcaaaa 6000
atatggtatt gataatcctg atatgaataa attgcagttt catttgatgc tcgatgagtt 6060
tttctaatca gtactgacaa taaaaagatt cttgttttca agaacttgtc atttgtatag 6120
tttttttata ttgtagttgt tctattttaa tcaaatgtta gcgtgattta tatttttttt 6180
cgcctcgaca tcatctgccc agatgcgaag ttaagtgcgc agaaagtaat atcatgcgtc 6240
aatcgtatgt gaatgctggt cgctatactg ctgtcgattc gatactaacg ccgccatatc 6300
acgtgctata aaaataatta taatttaaat tttttaatat aaatatataa attaaaaata 6360
gaaagtaaaa aaagaaatta aagaaaaaat agtttttgtt ttccgaagat gtaaaagact 6420
ctagggggat cgccaacaaa tactaccttt tatcttgctc ttcctgctct caggtattaa 6480
tgccgaattg tttcatcttg tctgtgtaga agaccacaca cgaaaatcct gtgattttac 6540
attttactta tcgttaatcg aatgtatatc tatttaatct gcttttcttg tctaataaat 6600
atatatgtaa agtacgcttt ttgttgaaat tttttaaacc tttgtttatt tttttttctt 6660
cattccgtaa ctcttctacc ttctttattt actttctaaa atccaaatac aaaacataaa 6720
aataaataaa cacagagtaa attcccaaat tattccatca ttaaaagata cgaggcgcgt 6780
gtaagttaca ggcaagcgat ctctttgaaa agataatgta tgattatgct ttcactcata 6840
tttatacaga aacttgatgt tttctttcga gtatatacaa ggtgattaca tgtacgtttg 6900
aagtacaact ctagattttg tagtgccctc ttgggctagc ggtaaaggtg cgcatttttt 6960
cacaccctac aatgttctgt tcaaaagatt ttggtcaaac gctgtagaag tgaaagttgg 7020
tgcgcatgtt tcggcgttcg aaacttctcc gcagtgaaag ataaatgatc tatactagaa 7080
gttctcctcg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac 7140
ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct ttttttgttt tttatgtctg aattctgcag 7200
atatccatca cactggcggc cgctcgagca tgcatctaga gggccgcatc atgtaattag 7260
ttatgtcacg cttacattca cgccctcccc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 7320
ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttat agttatgtta gtattaagaa 7380
cgttatttat atttcaaatt tttctttttt ttctgtacag acgcgtgtac gcatgtaaca 7440
ttatactgaa aaccttgctt gagaaggttt tgggacgctc gaaggcttta atttgcggcc 7500
ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc 7560
gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct 7620
cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg 7680
tgagcaaaag gccagcaaaa gcccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc 7740
cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga 7800
aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct 7860
cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg 7920
gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag 7980
ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat 8040
cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac 8100
aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac 8160
tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc 8220
ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt 8280
tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc 8340
ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 8400
agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca 8460
atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca 8520
cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag 8580
ataactacga tacgggagcg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac 8640
ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc 8700
agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc attcagtcta ttaattgttg ccgggaagct 8760
agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttggcattgc tacaggcatc 8820
gtggtgtcac tctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg 8880
cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc 8940
gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat 9000
tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag 9060
tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat 9120
aatagtgtat cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg 9180
cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca 9240
cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga 9300
aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc 9360
ttcctttttc aatgggtaat aactgatata attaaattga agctctaatt tgtgagttta 9420
gtatacatgc atttacttat aatacagttt tttagttttg ctggccgcat cttctcaaat 9480
atgcttccca gcctgctttt ctgtaacgtt caccctctac cttagcatcc cttccctttg 9540
caaatagtcc tcttccaaca ataataatgt cagatcc 9577

Claims (9)

1.酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Delta-M3，保藏编号为：GDMCC No: 62247。
2.权利要求1所述的酿酒酵母Delta-M3在合成类胡萝卜素中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，是将酿酒酵母Delta-M3接种到YPD培养基中进行发酵培养，合成类胡萝卜素。
4.一种质粒载体pCas9-Delta，其特征在于，所述的质粒载体pCas9-Delta含有靶向酿酒酵母Delta序列的gRNA、G418抗性基因、CEN/ARS复制子和Cas9基因。
5.根据权利要求4所述的质粒载体pCas9-Delta，其特征在于，所述的质粒载体pCas9-Delta的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.权利要求4或5所述的质粒载体pCas9-Delta在酿酒酵母基因组重排中的应用。
7.一种权利要求1所述的酿酒酵母Delta-M3的构建方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的质粒载体pCas9-Delta转入酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6菌株中，得到酿酒酵母Delta-M3。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，将酿酒酵母BL03，Cit1- tHMG1，ΔAld6菌株制成感受态细胞，然后与质粒载体pCas9-Delta混合，电击转化后，培养筛选得到酿酒酵母Delta-M3。
9.一种用于基因组重排的试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有权利要求4或5所述的质粒载体pCas9-Delta。
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