CN110777146A - 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种PDGFB基因启动子活性报告质粒的构建方法，提取正常小鼠外周血液，利用DNA抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA，检测DNA纯度以及完整性后备用；数据库检索，得到小鼠PDGFB基因的启动子序列；PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3‑Basic‑vector，分别用Kpn I、Hind III双酶切；酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶16℃连接过夜；次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法。
背景技术
血小板衍生生长因子(PDGF)是目前已知最强的有丝分裂原，传统的PDGF家族包括PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD，PDGF具有强烈的促细胞的增殖、分化并导致肿瘤及肝纤维化等作用，其中PDGF-BB在肝纤维化过程中的作用尤为突出。PDGFB基因表达受很多因素调控，其中对其启动子活性的调控是最重要的调控方式。然而，目前并没有一个合适的研究PDGFB基因启动子活性的报告质粒。
发明内容
本发明提供一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，以解决现有技术中的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，包括以下步骤：
S1、提取正常小鼠外周血液，利用血液DNA 抽提试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）提取小鼠基因组DNA，检测DNA 纯度以及完整性后备用；
S2、数据库检索，小鼠PDGFB基因的转录起始位点(TSS)区域长600bp(-499-100bp)的启动子序列；
S3、PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；KpnI如SEQ ID:NO:3所示，HindⅢ如SEQ ID:NO:4所示；
S4、扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）回收纯化；
S5、回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3-Basic-vector（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于pGL3-Basic-vector），分别用Kpn I、Hind III双酶切；
S6、酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；
S7、回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）16℃连接过夜；
S8、次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜；
S9、挑单克隆菌落于LB液体培养基扩大培养；
S10、质粒小量提取试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）提取质粒，至此质粒构建完成。
S11、质粒鉴定步骤：质粒通过经限制性核酸内切酶双酶切初步鉴定，并进一步送测序公司测序对所构建质粒序列进行，并命名为pPDGFB-luc。
进一步的，所述步骤S3中，引物Primer F（KpnI）的序列如SEQ ID:NO:5所示，引物Primer R（HindⅢ）的序列如SEQ ID:NO:6所示。
进一步的，所述步骤S8中，LB培养基中AMP 的含量为80mg/L。
进一步的，所述步骤S11中，测序送至上海invitrogen公司进行。
进一步的，所述小鼠PDGFB基因的转录起始位点(TSS)区域长600bp(-499-100bp)的启动子序列如SEQ ID:NO:1所示。
进一步的，所述质粒序列，即pPDGFB-luc的序列如SEQ ID:NO:2所示。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明血小板衍生生长因子(PDGF) PDGF具有强烈的促细胞的增殖、分化并促进肿瘤及肝纤维化等发生作用，其中PDGF-BB在肝纤维化过程中的作用尤为突出。PDGFB基因表达受很多因素调控，其中对其启动子活性的调控是最重要的调控方式。然而，目前并没有一个合适的研究PDGFB基因启动子活性的报告质粒。本发明为研究各种因素调控PDGF基因表达提供了方便实用的工具。
附图说明
图1是实施例2的琼脂糖凝胶电泳图谱；
图2是实施例3的实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1
一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，所述小鼠PDGFB基因启动子序列如SEQID:NO:1所示，构建方法包括以下步骤：
S1、提取正常小鼠外周血液，利用血液DNA 抽提试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）提取小鼠基因组DNA，检测DNA 纯度以及完整性后备用；
S2、数据库检索，小鼠PDGFB基因的转录起始位点(TSS)区域长600bp(-499-100bp)的启动子序列如SEQ ID:NO:1所示；
S3、PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；KpnI的序列如SEQ ID:NO:3所示，HindⅢ的序列如SEQ ID:NO:4所示；引物Primer F（KpnI）的序列如SEQ ID:NO:5所示，引物Primer R（HindⅢ）的序列如SEQ ID:NO:6所示。
S4、扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）回收纯化；
S5、回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3-Basic-vector（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于pGL3-Basic-vector），分别用Kpn I、Hind III双酶切；
S6、酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；
S7、回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）16℃连接过夜；
S8、次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜，LB培养基中AMP 的含量为80mg/L；
S9、挑单克隆菌落于LB液体培养基扩大培养；
S10、质粒小量提取试剂盒（各生物试剂公司有售，本此实验所用购于生工生物工程(上海)股份有限公司）提取质粒，至此质粒构建完成。
实施例2
S11、质粒鉴定步骤：将步骤S10中构建的质粒通过经限制性核酸内切酶双酶切初步鉴定，并进一步送上海invitrogen公司测序对所构建质粒序列进行，并命名为pPDGFB-luc，构建质粒序列，即pPDGFB-luc的序列如SEQ ID:NO:2所示。
如图1所示，上述所提质粒用Kpn I、Hind III双酶切后经琼脂糖凝胶电泳检测得到约600bp和约5000bp两个条带，可初步验证本发明所构建的质粒，后经进一步测序证实所得质粒序列正确。
实施例3
S12、构建质粒的功能通过转染小鼠HSCs细胞后检测启动子荧光素酶活性来验证，结果进一步证实，所构建的PDGFB启动子活性报告质粒pPDGFB-luc是有功能的，并用于PDGFB启动子活性的研究。
所述步骤S12中通过转染小鼠HSCs细胞后检测启动子荧光素酶活性来验证构建质粒功能包括以下步骤：转染前1天将小鼠HSCs细胞接种于12孔板，培养至细胞密度达70%左右。用300 ul Optin-MEM 稀释1.6 ug质粒和30 ng 海肾，按Lipo 2000脂质体转染试剂说明书，分别将pPDGFB-luc（步骤S10中构建的）和pGL3-Basic-vector（阴性对照组）转染入细胞中，设3个复孔。24小时后，使用Promega 公司提供的双荧光试剂盒，PLB裂解液收集细胞，利用Biotek公司SYNERGY多功能酶标仪检测荧光。取10 uL 细胞裂解液加入50uL LARⅡ检测液，混匀后记录数据M1（转染质粒的荧光素酶活性），再加入50 μL Stop&Glo，混匀后记录数据 M2（海肾荧光素酶活性）。计算转染质粒的相对荧光素酶活性M1/M2，取3次独立重复试验的平均值，实验结果如图2所示。
小鼠PDGFB基因的转录起始位点(TSS)区域长600bp(-499-100bp)的启动子序列SEQ ID:NO:1：
>FP020223 Pdgfb_1 :+U EU:NC; range -499 to 100. CCTGGCCTTGGTCCTGGCCCTGCAGACAGGCCCCTAAACACTGTGCTAATGGGTGGGGCC GCAGTTCACCTTCAGTTCCTGCCAAGAGGCTAGATTCACAGTCACAGGGGCTGCGTAGTT CTCAGAGACCCCTCAAGCAGCAGTCTTTGCCTGAGGACCTCCCTTGGTTCCTGCCCCCTC CCGGCGCTGACTCCGGGCCAGGAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCTTGCACTCTCC CTTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAGGGTGGCAACTTCTCCTGCAGCCGGGAGC AGCCTGCCTGCCTCCCCCGCTGCCTCCCTGAGGGCTTCCCTCCGGCCGCCAGCGCCCATC TTTCTCCAGAGAGATATTTTGCGCACACACACATACACACACGCGCAAAAGGGAAAGGAG GAAAAAAAAAAAAAGCCCACCCTCTAGCTTCGTTGCAACGAGAAAGCCGGAGCAGCCGCA GCTCGAAACCCGCAGAGGAAGCCCAGAGTGGCGAGCGAGTGGGTAGATAGACAGACTGAC CCGAGCCGCGTCCACCTGTCGGCCCGGACCAGCCCAGCGCGCAGTGGGCGCGCCGCGCTC
小鼠PDGFB基因启动子序列SEQ ID:NO:2：
ggtacCCCGCCTGCAGACAGGCCCCTAAACACTGTGCTAATGGGTGGGGCCGCAGTTCACCTTCAGTTCCTGCCAAGAGGCTAGATTCACAGTCACAGGGGCTGCGTAGTTCTCAGAGACCCCTCAAGCAGCAGTCTTTGCCTGAGGACCTCCCTTGGTTCCTGCCCCCTCCCGGCGCTGACTCCGGGCCAGGAGAGGAAAGGCTGTCTCCACCCACCTCTTGCACTCTCCCTTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAGGGTGGCAACTTCTCCTGCAGCCGGGAGCAGCCTGCCTGCCTCCCCCGCTGCCTCCCTGAGGGCTTCCCTCCGGCCGCCAGCGCCCATCTTTCTCCAGAGAGATATTTTGCGCACACACACATACACACACGCGCAAAAGGGAAAGGAGGAAAAAAAAAAAAAGCCCACCCTCTAGCTTCGTTGCAACGAGAAAGCCGGAGCAGCCGCAGCTCGAAACCCGCAGAGGAAGCCCAGAGTGGCGAGCGAGTGGGTAGATAGACAGACTGACCCGAGCCGCGTCCACCTGTCGGCCCGGACCAGCCCAGCGCGCAGTGGGCGCGCCGCGCTCCCCAAGCTagcttggcattccggtactgttggtaaagccaccatggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatccgctggaagatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacgctgagtacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgggcatttcgcagcctaccgtggtgttcgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaagctcccaatcatccaaaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtgccagagtccttcgatagggacaagacaattgcactgatcatgaactcctctggatctactggtctgcctaaaggtgtcgctctgcctcatagaactgcctgcgtgagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcacggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttctgaggagccttcaggattacaagattcaaagtgcgctgctggtgccaaccctattctccttcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctggtggcgctcccctctctaaggaagtcggggaagcggttgccaagaggttccatctgccaggtatcaggcaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcaaagaggcgaactgtgtgtgagaggtcctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatcgttgaccgcctgaagtctctgattaagtacaaaggctatcaggtggctcccgctgaattggaatccatcttgctccaacaccccaacatcttcgacgcaggtgtcgcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagatcgccgtgtaattctagagtcggggcggccggccgcttcgagcagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaaagcaagtaaaacctctacaaatgtggtaaaatcgataaggatccgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcaatgctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagcccaagctaccatgataagtaagtaatattaaggtacgggaggtacttggagcggccgcaataaaatatctttattttcattacatctgtgtgttggttttttgtgtgaatcgatagtactaacatacgctctccatcaaaacaaaacgaaacaaaacaaactagcaaaataggctgtccccagtgcaagtgcaggtgccagaacatttctctatcgata
KpnI序列SEQ ID:NO:3：
CGGGGTACCCCGC
HindⅢ序列SEQ ID:NO:4：
CCCAAGCTTGGG
引物Primer F（KpnI）序列SEQ ID:NO:5：
CGGGGTACCCCGCCTGGCCTTGGTCCTGGC
引物Primer R（HindⅢ）序列SEQ ID:NO:6:
CCCAAGCTTGGGGAGCGCGGCGCGCCCAC
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南通大学
<120> 一种PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 600
<212> DNA
<213> 小鼠(Mice)
<400> 1
cctggccttg gtcctggccc tgcagacagg cccctaaaca ctgtgctaat gggtggggcc 60
gcagttcacc ttcagttcct gccaagaggc tagattcaca gtcacagggg ctgcgtagtt 120
ctcagagacc cctcaagcag cagtctttgc ctgaggacct cccttggttc ctgccccctc 180
ccggcgctga ctccgggcca ggagaggaaa ggctgtctcc acccacctct tgcactctcc 240
cttctccttt ataaaggccg gaacagctga agggtggcaa cttctcctgc agccgggagc 300
agcctgcctg cctcccccgc tgcctccctg agggcttccc tccggccgcc agcgcccatc 360
tttctccaga gagatatttt gcgcacacac acatacacac acgcgcaaaa gggaaaggag 420
gaaaaaaaaa aaaagcccac cctctagctt cgttgcaacg agaaagccgg agcagccgca 480
gctcgaaacc cgcagaggaa gcccagagtg gcgagcgagt gggtagatag acagactgac 540
ccgagccgcg tccacctgtc ggcccggacc agcccagcgc gcagtgggcg cgccgcgctc 600
<210> 2
<211> 5364
<212> DNA
<213> 小鼠(Mice)
<400> 2
ggtaccccgc ctgcagacag gcccctaaac actgtgctaa tgggtggggc cgcagttcac 60
cttcagttcc tgccaagagg ctagattcac agtcacaggg gctgcgtagt tctcagagac 120
ccctcaagca gcagtctttg cctgaggacc tcccttggtt cctgccccct cccggcgctg 180
actccgggcc aggagaggaa aggctgtctc cacccacctc ttgcactctc ccttctcctt 240
tataaaggcc ggaacagctg aagggtggca acttctcctg cagccgggag cagcctgcct 300
gcctcccccg ctgcctccct gagggcttcc ctccggccgc cagcgcccat ctttctccag 360
agagatattt tgcgcacaca cacatacaca cacgcgcaaa agggaaagga ggaaaaaaaa 420
aaaaagccca ccctctagct tcgttgcaac gagaaagccg gagcagccgc agctcgaaac 480
ccgcagagga agcccagagt ggcgagcgag tgggtagata gacagactga cccgagccgc 540
gtccacctgt cggcccggac cagcccagcg cgcagtgggc gcgccgcgct ccccaagcta 600
gcttggcatt ccggtactgt tggtaaagcc accatggaag acgccaaaaa cataaagaaa 660
ggcccggcgc cattctatcc gctggaagat ggaaccgctg gagagcaact gcataaggct 720
atgaagagat acgccctggt tcctggaaca attgctttta cagatgcaca tatcgaggtg 780
gacatcactt acgctgagta cttcgaaatg tccgttcggt tggcagaagc tatgaaacga 840
tatgggctga atacaaatca cagaatcgtc gtatgcagtg aaaactctct tcaattcttt 900
atgccggtgt tgggcgcgtt atttatcgga gttgcagttg cgcccgcgaa cgacatttat 960
aatgaacgtg aattgctcaa cagtatgggc atttcgcagc ctaccgtggt gttcgtttcc 1020
aaaaaggggt tgcaaaaaat tttgaacgtg caaaaaaagc tcccaatcat ccaaaaaatt 1080
attatcatgg attctaaaac ggattaccag ggatttcagt cgatgtacac gttcgtcaca 1140
tctcatctac ctcccggttt taatgaatac gattttgtgc cagagtcctt cgatagggac 1200
aagacaattg cactgatcat gaactcctct ggatctactg gtctgcctaa aggtgtcgct 1260
ctgcctcata gaactgcctg cgtgagattc tcgcatgcca gagatcctat ttttggcaat 1320
caaatcattc cggatactgc gattttaagt gttgttccat tccatcacgg ttttggaatg 1380
tttactacac tcggatattt gatatgtgga tttcgagtcg tcttaatgta tagatttgaa 1440
gaagagctgt ttctgaggag ccttcaggat tacaagattc aaagtgcgct gctggtgcca 1500
accctattct ccttcttcgc caaaagcact ctgattgaca aatacgattt atctaattta 1560
cacgaaattg cttctggtgg cgctcccctc tctaaggaag tcggggaagc ggttgccaag 1620
aggttccatc tgccaggtat caggcaagga tatgggctca ctgagactac atcagctatt 1680
ctgattacac ccgaggggga tgataaaccg ggcgcggtcg gtaaagttgt tccatttttt 1740
gaagcgaagg ttgtggatct ggataccggg aaaacgctgg gcgttaatca aagaggcgaa 1800
ctgtgtgtga gaggtcctat gattatgtcc ggttatgtaa acaatccgga agcgaccaac 1860
gccttgattg acaaggatgg atggctacat tctggagaca tagcttactg ggacgaagac 1920
gaacacttct tcatcgttga ccgcctgaag tctctgatta agtacaaagg ctatcaggtg 1980
gctcccgctg aattggaatc catcttgctc caacacccca acatcttcga cgcaggtgtc 2040
gcaggtcttc ccgacgatga cgccggtgaa cttcccgccg ccgttgttgt tttggagcac 2100
ggaaagacga tgacggaaaa agagatcgtg gattacgtcg ccagtcaagt aacaaccgcg 2160
aaaaagttgc gcggaggagt tgtgtttgtg gacgaagtac cgaaaggtct taccggaaaa 2220
ctcgacgcaa gaaaaatcag agagatcctc ataaaggcca agaagggcgg aaagatcgcc 2280
gtgtaattct agagtcgggg cggccggccg cttcgagcag acatgataag atacattgat 2340
gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt 2400
gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat 2460
tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttta aagcaagtaa 2520
aacctctaca aatgtggtaa aatcgataag gatccgtcga ccgatgccct tgagagcctt 2580
caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 2640
tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctcttcc gcttcctcgc 2700
tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2760
cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2820
gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2880
gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2940
gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 3000
ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 3060
aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 3120
tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 3180
ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 3240
gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 3300
ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 3360
ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3420
agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3480
ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 3540
aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 3600
tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 3660
cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 3720
tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 3780
cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 3840
ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 3900
gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 3960
gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 4020
gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 4080
gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 4140
tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 4200
aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 4260
cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 4320
caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 4380
cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 4440
ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 4500
aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 4560
tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 4620
cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta 4680
cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt 4740
tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg 4800
ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt agtgggccat 4860
cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac 4920
tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt gatttataag 4980
ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg 5040
cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcccattc gccattcagg ctgcgcaact 5100
gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagcccaag ctaccatgat 5160
aagtaagtaa tattaaggta cgggaggtac ttggagcggc cgcaataaaa tatctttatt 5220
ttcattacat ctgtgtgttg gttttttgtg tgaatcgata gtactaacat acgctctcca 5280
tcaaaacaaa acgaaacaaa acaaactagc aaaataggct gtccccagtg caagtgcagg 5340
tgccagaaca tttctctatc gata 5364
<210> 3
<211> 13
<212> DNA
<213> 小鼠(Mice)
<400> 3
cggggtaccc cgc 13
<210> 4
<211> 12
<212> DNA
<213> 小鼠(Mice)
<400> 4
cccaagcttg gg 12
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 小鼠(Mice)
<400> 5
cggggtaccc cgcctggcct tggtcctggc 30
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 小鼠(Mice)
<400> 6
cccaagcttg gggagcgcgg cgcgcccac 29
Claims (7)
1.一种PDGFB基因启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、提取正常小鼠外周血液，利用血液DNA 抽提试剂盒提取小鼠基因组DNA，检测DNA纯度以及完整性后备用；
S2、数据库检索，小鼠PDGFB基因的转录起始位点TSS区域长600bp，即-499-100bp的启动子序列；
S3、PCR扩增PDGFB基因启动子序列，引物两端加入相应限制性内切酶序列及保护碱基；KpnI的序列如SEQ ID:NO:3所示；HindⅢ的序列如SEQ ID:NO:4所示；
S4、扩增产物经DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；
S5、回收纯化的PCR产物和荧光素酶报告质粒载体pGL3-Basic-vector，分别用Kpn I、Hind III双酶切；
S6、酶切产物经凝胶回收试剂盒回收纯化；
S7、回收目的基因片段和载体片段，用T4连接酶16℃连接过夜；
S8、次日将连接产物转化感受态大肠杆菌，涂布固体LB培养基平板过夜；
S9、挑单克隆菌落于LB液体培养基扩大培养；
S10、质粒小量提取试剂盒提取质粒。
2.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于，还包括以下质粒鉴定步骤：
S11、质粒通过经限制性核酸内切酶双酶切初步鉴定，并进一步送测序公司测序对所构建质粒序列进行，并命名为pPDGFB-luc。
3.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：
所述步骤S3中，引物Primer F包含KpnI的序列如SEQ ID:NO:5所示，引物Primer R包含HindⅢ的序列如SEQ ID:NO:6所示。
4.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述步骤S8中，LB培养基中AMP 的含量为80mg/L。
5.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述步骤S11中，测序送至上海invitrogen公司进行。
6.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述小鼠PDGFB基因的转录起始位点TSS区域长600bp，即-499-100bp的启动子序列如SEQ ID:NO:1所示。
7.根据权利要求1所述的PDGFB启动子活性报告质粒的构建方法，其特征在于：所述质粒序列，即pPDGFB-luc的序列如SEQ ID:NO:2所示。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| CN201911187386.0A CN110777146A (zh) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法 |
| PCT/CN2020/099603 WO2021103528A1 (zh) | 2019-11-28 | 2020-06-30 | 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911187386.0A CN110777146A (zh) | 2019-11-28 | 2019-11-28 | 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法 |
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| WO2021103528A1 (zh) * | 2019-11-28 | 2021-06-03 | 南通大学 | 一种pdgfb启动子活性报告质粒的构建方法 |
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