CN1826411A - 一种用于神经元细胞基因表达的启动子构建体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种嵌合的启动子构建体，可用于神经元细胞特异性基因表达。本发明提供了一种重组核酸分子，其中含有一种神经元细胞特异性启动子例如血小板衍生生长因子β－链启动子，该启动子可操作地连接于一种能提高该启动子转录活性的异源的增强子，例如巨细胞病毒立即早期基因增强子。本发明所述启动子构建体能够提高和延长神经元细胞中的基因表达，可以有效地用于基因治疗神经元性疾病。

Description

一种用于神经元细胞基因表达的启动子构建体

技术领域

本发明涉及一种可用于细胞特异性基因表达的启动子构建体，更具体而言为可用于神经元细胞中表达的启动子构建体。

背景技术

神经系统疾病，例如中风、癫痫、头和脊髓外伤、帕金森氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化，以及许多神经系统遗传性疾病，不仅会对个体产生毁灭性的影响，而且还会因长期护理和劳动力带来很高的社会成本。这些疾病的共同特征就是神经元丢失。上述病症中的许多与一种或多种基因的机能紊乱或作用丧失有关，对常规治疗手段不能很好应答。因此，向中枢神经系统(CNS)中转移入基因被认为是一种治疗这些病症的有效方法，这其中包括一种治疗基因的递送和表达。该方法可以调节神经营养性因子、抗-凋亡蛋白、抗氧化分子以及其他治疗因子的表达水平，从而修复，阻止或预防神经元的退化。基因治疗还为CNS恶性肿瘤的治疗提供了很大的希望。

CNS是体内最复杂的器官，其独一无二的特点为CNS中基因治疗的成功设置了许多障碍。这些特点包括由于颅骨和血脑屏障的物理障碍使得很难到达CNS；神经元分化完全的特点以及用治疗基因有效转染CNS的困难。而且，发现于CNS中的细胞类型非常多种多样，其中许多都对生理功能发挥着关键作用并且对任一种变化都高度敏感。这就要求只能局限于具体CNS细胞类型的CNS基因治疗要不断发展，从而确保只在目的细胞中发挥疗效，同时限制因非一目的CNS细胞中基因表达引发的副作用。

所选细胞类型中的特异性基因表达可以通过使用配体-相连递送载体在靶基因递送水平实现，这种递送载体通过所述配体与靶细胞上的独一无二的细胞表面受体结合。特异性基因表达还可以通过使用细胞-特异性启动子及增强子在靶转录本的水平上实现。细胞-特异性启动子是将特定细胞功能限制在特定分化细胞类型的主要方法之一。这些启动子指导相关基因转录的能力可以通过特定类型细胞中转录因子的胞内浓度及活性来调节。

将转基因导入某些细胞有时会因转基因产物的过量破坏或干扰细胞功能。由于其特异性，所以细胞-特异性启动子能够使转基因的转录维持在细胞代谢可接受的水平，从而避免耗损蛋白质合成材料以及对转染细胞有毒的转基因产物的过度累积。因为细胞-特异性启动子源自于基因组序列，所以还可能减少活化宿主细胞防卫机制的机率，对细胞因子-诱导启动子失活的敏感性往往低于病毒启动子。通过使用细胞-特异性启动子，基因表达的稳定性可望得到提高。但是，由于细胞特异性的细胞启动子的转录活性往往很弱，因而大大限制了其在基因治疗中的使用。

发明内容

本发明一个方面提供了一种重组核酸分子，其中含有一种可操作地连接于一种异源增强子的神经元细胞特异性启动子，其中所述增强子提高了所述启动子的神经元细胞特异性转录活性。一些实施方案中，所述启动子是血小板衍生生长因子β-链启动子，所述增强子是巨细胞病毒立即早期基因增强子元件。各种实施方案中，所述重组核酸分子还可以进一步包含一可操作连接的治疗基因编码序列。

本发明的另一个方面，提供了一种提高神经元特异性启动子转录活性的方法，其中包括在神经元特异性启动子上可操作地连接一种异源增强子。

本发明的另一个方面，提供了一种试剂盒，其中含有一种神经元细胞或细胞-系，上述权利要求中任一项所述的表达载体，以及用于指导稳定转化所述细胞-系和表达重组基因产物的说明书。

本发明进一步还提供了其中含有本发明所述重组核酸的表达载体、转基因细胞和非人动物。另外还提供了一种在神经元细胞中表达基因的方法，该方法包括用所述表达载体转化神经元细胞。

本发明还提供了一种治疗受试者神经元性疾病的方法，其中包括向所述受试者施用一种表达载体，该表达载体含有一种可操作地连接于治疗基因编码序列的上述重组核酸分子。

本发明的另一个方面，提供了一种增强神经元细胞特异性启动子转录活性的方法，其中包括在神经元细胞特异性启动子上可操作地连接一种异源增强子。

附图说明

图1.图示的是在PGL3载体中测试了的下列启动子的简图：全长的巨细胞病毒启动子(CMV)；CMV立即早期基因增强子(CMVIE)；和血小板-衍生生长因子β-链启动子(PDGF-β)；以及CMVIE-PDGF-β。另外还标出了荧光素酶基因(luc)和poly A尾(polyA)的位置。

图2.图示了瞬时转染后，神经元细胞PCI2和MTc17.2中下列每一种启动子构建体驱动的荧光素酶表达的荧光素酶活性水平：CMV，CMVIE，PDGF-β和CMVIE-PDGF-β。荧光素酶活性用RLU/mg蛋白质表示。

图3.pCMVIE-PDGF-β-luc注射2天后，大鼠海马免疫组织化学染色的显微照片。海马切片用抗荧光素酶蛋白质抗体(红)和NeuN标记物(绿色)染色。

图4.高倍放大显微照片显示了：注射pCMVIE-PDGF-β-luc(a、b、c)和pCMVluc(d、e、f)2天后，大鼠纹状体中荧光素酶(红)和NeuN(绿色)双重标记的结果。

图5.图示了立体定位注射入大鼠纹状体后，每一种质粒平均荧光素酶表达的时程测定。数值表示为平均值+SEM。

图6.A：图示了腺联病毒(AAV)和杆状病毒介导的转染后，大鼠原代皮质神经元中下列每一种启动子构建体驱动的荧光素酶表达的荧光素酶活性水平：CMV，CMVIE，PDGF-β和CMVIE-PDGF。荧光素酶活性用RLU/mg蛋白质表示。B：图示了将含启动子构建体的AAV载体立体定位注射入大鼠纹状体后，每一种启动子驱动的平均荧光素酶表达的时程测定。数值表示为平均值+SEM。

具体实施方式

在各个方面，本发明涉及基因表达和基因表达的调控。使用的术语″基因″与通常定义的含义相同，是指一段可操作连接的核酸序列。

本发明提供了一种重组核酸分子，其中含有一个嵌合的转录调控区域，当神经元细胞中的序列可操作地连接于调控区域时(″可操作连接序列″)，该区域能够活化该序列的转录。本发明所述的重组核酸分子其中含有一种可操作地连接于一种异源增强子的神经元细胞特异性启动子，其中所述增强子能够提高所述启动子的神经元细胞特异性转录活性。术语″神经元细胞″和″神经元″，本申请中可交互使用，采用其通常含义是指任一种神经系统的传导细胞，通常包括细胞体，几种树状突和轴突。术语″重组’是指重新组合在一起的物质，因此，一种重组核酸分子是指由连接在一起的核酸序列组成的分子或者是利用分子生物学技术制备的分子。

所述异源的增强子可以是满足下列要求的任一核苷酸序列：天然状态下不与神经元细胞特异性启动子连接在一起，但是可操作地连接后能提高神经元细胞特异性启动子的神经元细胞特异性转录活性。提高转录活性是指：与单独使用神经元细胞特异性启动子时的转录水平相比，可操作连接的序列的转录水平的任一种可检测的升高，这种升高可以用常规转录试验检测，包括使用实施例所述的报道基因构建体。

因此，所述增强子含有至少一段能增强可操作连接启动子的神经元细胞特异性转录活性的核苷酸序列。通常，增强子和启动子一旦与合适的分子例如转录因子结合，就能够升高和/或活化转录，因此本发明包括提供了这样的分子的实施方案，无论是体外或体内。举例，但不限制本发明，真核转录因子包括，但不限于NFAT，AP1，AP-2，Spl，OCT-I，OCT-2，OAP，NF-KB，CREB，CTF，TFIIA，TFIIB，Pit-I，C/EBP，SRF(Mitchell P J and Tijan R(1989)Science 245：371；Eukaryotic transcriptionfactor-DNA complexes.Patikoglou G，Burley SK.Annu Rev Biophys Biomol Struct1997；26：289-325.)。一些实施方案中，那些能有效增强转录活性的核苷酸序列保留有作为增强子的序列所需的转录因子的最小结合位点。由于为了将可操作连接序列的转录水平提高到所需要的程度，一些实施方案中，所述重组核酸可以包含多个拷贝的相同序列，或者两个或多个不同的核苷酸序列，其中的每一个都能有效增加转录。对于可以使用的不同增强子而言，转录因子结合位点可以是已知的，或者也可以是本领域普通技术人员使用已知方法鉴定出的，例如通过DNA足迹法，凝胶迁移率改变试验等。所述因子还可以根据已知的共有序列基序预先确定。

所述增强子可以是一种巳知的强的病毒增强子或启动子元件例如Rous肉瘤病毒(RSV)启动子(Gorman CM，Merlino GT，Willingham MC，Pastan I，Howard BH.TheRous sarcoma virus long terminal repeat is a strong promoter when introducedinto a variety of eukaryotic cells by DNA-mediated transfection.Proc NatlAcad Sci USA 1982；79：6777-6781)，SV40启动子(Ghosh PK，Lebowitz P，FrisqueRJ，Gluzman Y.Identification of a promoter component involved in positioningthe 5’termini of simian virus 40 early mRNAs.Proc Natl Acad Sci USA 1981；78：100-104)，包含CMV立即早期(IE)基因增强子(CMVIE增强子)的CMV增强子或启动子(Boshart M，Weber F，Jahn G，Dorsch-Hasler K，Fleckenstein B，SchaffnerW.A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene ofhuman cytomegalovirus.Cell 1985；41：521-530；Niwa H，Yamamura H，MiyazakiJ.Efficient selection for high-expression transfectants with a noveleukaryotic vector.Gene 1991；108：193-200；还可参见美国专利5,849,522和5,168,062)。在一个具体实施方案中，所述增强子是人CMVIE增强子，一个实施方案中含有代表来自人CMV立即早期基因TATA框中的第573-187位核苷酸所示的下列序列：

  1  CCTGGGTCGA CATTGATTAT TGACTAGTTA TTAATAGTAA TCAATACGGG

 51  GTCATTAGTT CATAGCCCAT ATATGGAGTT CCGCGTTACA TAACTTACGG

101  TAAATGGCCC GCCTGGCTGA CCGCCCAACG ACCCCCGCCC ATTGACGTCA

151  ATAATGACGT ATGTTCCCAT AGTAACGCCA ATAGGGACTT TCCATTGACG

201  TCAATGGGTG GACTATTTAC GGTAAACTGC CCACTTGGCA GTACATCAAG

251  TGTATCATAT GCCAAGTACG CCCCCTATTG ACGTCAATGA CGGTAAATGG

301  CCCCCTGGCA TTATGCCCAG TACATGACCT TATGGGACTT TCTACTTGGC

351  AGTACATCTA CGTATTAGTC ATCGCTATTA CCATGGT(SEQ ID NO.9)

所述增强子还可以是该核苷酸序列的等位变体和衍生物(例如序列的缺失，插入，倒置，取代或添加)，这类变体或衍生物提供的其他已知增强子序列能够增加可操作连接序列的神经元细胞-特异性转录。

不同实施方案中，这类变体和衍生物是基本上同源的，所以能够与SEQ ID N0：9或其他增强子序列在中度或严谨条件下杂交。中度严谨条件下与滤膜-结合序列的杂交可以例如65℃下在0.5M NaHPO4，7％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中完成，然后用0.2×SSC/0.1％(w/v)SDS在42℃下洗涤(参见，Ausubel，et cas.(eds)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.，and John Wiley & Sons，Inc.，New York，at p.2.10.3)。替代地，严谨条件下与滤膜-结合序列的杂交可以例如65℃下在0.5M NaHPO4，7％(w/v)SDS，1mM EDTA中完成，然后用O.1×SSC/0.1％(w/v)SDS在68℃下洗涤(参见，Ausubel，et al.(编著)，1989，同上)。杂交条件可以根据目的序列的情况用巳知方法进行调整(参见，Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter2″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probeassays″，Elsevier，New York)。通常，严谨条件是在一定的离子强度和pH条件下将温度选定为比特定序列的热解链温度低约5℃。严谨杂交还可以是例如：5×SSC和50％甲酰胺中42℃下杂交，然后用由0.1×SSC组成的缓冲液℃下杂交。严谨杂交的洗涤时间为例如至少15分钟，30分钟，45分钟，60分钟，75分钟，90分钟，105分钟或120分钟。

还可以将序列之间的同源程度表示为将序列最佳对齐时的同一性百分比，意指所述序列之间正确配对的概率。用于同一性比较的序列最佳对齐可以使用多种算法执行，例如Smith和Waterman的局部同源性算法，见1981，Adv.Appl.Math 2：482，thehomology alignment algorithm ofNeedleman and Wunsch，1970，J.MoL Biol.48：443，the search for similarity method of Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444，以及这些算法的电脑执行形式(例如，GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A.)。序列对齐还可以用BLAST算法执行，描述见Altschuletal.，1990，J.AM.M.215：403-10(使用公开的设置默认值)。用于执行BLAST分析的软件可以获自the National Center for Biotechnology Information(通过国际互联网网址http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。不同实施方案中，使用这类算法测定时，所述变体和衍生物具有大于50％，80％-100％，至少80％，至少90％或至少95％的序列同源性。

所述神经元细胞特异性启动子可以是能够活化神经元细胞特异性转录的任一核苷酸序列，意味着该序列能够活化神经元细胞中可操作连接序列的转录。如果可操作连接序列在任一这类细胞中的转录足够低以致不影响所述细胞的生理功能，那么就可以认为该启动子基本上不活化转录。神经元细胞特异性启动子可以包括神经元基因，例如神经突触素I，神经元-特异性烯醇酶，神经丝-L和神经肽Y使用的启动子和特异性针对特定类型神经元细胞的启动子。例如：，酪氨酸羟化酶基因启动子(4.8kb 5’UTR)特异性用于含儿茶酚胺的和CNS神经元，多巴胺-p-羟化酶基因启动子特异性用于肾上腺素和noradrenegic神经元，L7 Purkinje细胞蛋白质启动子特异性用于视网膜圆柱细胞两极神经元。对于这些及其他神经元细胞特异性启动子，包括D1A多巴胺受体基因启动子，人次黄嘌呤磷酸核糖转移酶启动子，SCG10启动子，Tα1α-微管蛋白启动子，醛缩酶C启动子，β-微管蛋白基因启动子，GnRH基因增强子和启动子，谷氨酸脱羧酶65基因启动子，β-半乳糖苷α1，2-岩藻糖基转移酶基因启动子，神经元性尼古丁乙酰胆碱受体β3基因启动子，GABA(A)受体Δ亚单位基因启动子，神经元-特异性FE65基因启动子，N-型钙通道α1B亚单位基因启动子和微管-相关蛋白1B基因启动子，参见下列文献：Harrington CA，Lewis EJ，Krzemien D，ChikaraishiDM.Identification and cell type specificity of the tyrosine hydroxylase genepromoter.Nucleic Acids Res 1987，15：2363-2384；CokerGT3rd，Vinnedge L，O’Malley KL；Characterization of rat and human tyrosine hydroxylase genes：functional expression of both promoters in neuronal and non-neuronal cell types.Biochem Biophys Res Commun 1988，157：1341-1347；Banerjee SA，Hoppe P，BrilliantM，Chikamishi DM.5’Banking sequences of the rat tyrosine hydroxylase genetarget accurate tissue-specific，developmental，andtranssynaptic expression intransgenic mice.J Neurosci 1992，12：44604467；Morita S，KobayashiK，MizuguchiT，YamadaK，Nagatsu I，TitaniK，Fujita K，Hidaka H，Nagatsu T.The 5’-flankingregion of the human dopamine beta-hydroxylase gene promotes neuronsubtype-specific gene expression in the central nervous system of transgenicmice.Brain Res Mol Brain Res 1993；17：239-244；IshiguroH，Kim KT，Joh TH，Kim KS.Neuron-specific expression of the human dopamine beta-hydroxylase generequires both the cAMP-response element and a silencer region.J Biol Chem 1993；268：17987-17994；Hoyle GW，Mercer EH，Palmiter RD，Brinster RL.Cell-specificexpression from the human dopamine beta-hydroxylase promoter in transgenicmice is controlled via a combination of positive and negative regulatoryelements.J Neurosci 1994，14：2455-2463；Severynse DM，Colapietro AM，Box TL，Caron MG.The humanD1A dopamine receptor gene promoter directs expression ofa reporter gene to the central nervous system in transgenic mice.Brain ResMol Brain Res 1995，30：336-346；Mouradian MM，Minowa MT，Minowa T.Promoterstructure of the human gene coding for theD1A dopamine receptor.Adv Neurol1993，60：343-345；Stout JT，Chen HY，Brennand J，Caskey CT，Brinster RL.Expression of human HPRT in the central nervous system of transgenic mice.Nature 1985；317：250-252；Rincon-Limas DE，Geske RS，Xue JJ，Hsu CY，OverbeekPA，Patel PI.5’-flanking sequences of the human HPRT gene direct neuronalexpression in the brain of transgenic mice.J Neurosci Res 1994；38：259-267；Schwartz ML，Bruce J，Shneidman PS，Schlaepfer WW.Deletion of 3’-untranslatedregion alters the level ofmRNA expression of aneurofilament light subunittransgene.J Biol Chem 1995；270：26364-9；Forss-Petter S，Danielson PE，Catsicas S，Battenberg E，Price J，Nerenberg M，Sutcliffe JG.Transgenic miceexpressingbeta-galactosidase in mature neurons under neuron-specific enolasepromoter control.Neuron1990；5：187-197；Twyman RM，Jones EA.Sequencesin the proximal 5’flanking region of the rat neuron-specific enolase(NSE)geneare sufficient for cell type-specific reporter gene expression.J MolNeurosci1997；8：63-73；Andersen JK，Garber DA，Meaney CA，Breakefield XO.Gene transfer into mammalian central nervous system using herpes virus vectors：extended expression of bacterial lac in neurons using tle neuron-specificenolase promoter.Hum(ene Ther 1992；3：487-499；Wuenschell CW，Mori N，Anderson DJ.Analysis ofSCG10 gene expression in transgenic mice reveals thatneural specificity is achieved through selective derepression.Neuron1990；4：595-602；Mori N，Stein R，Sigmund 0，Anderson DJ.A cell type-preferredsilencer element that controls the neural-specific expression of theSCG10 gene.Neuron 1990；4：583-594；Hoesche C，Sauerwald A，Veh RW，Krippl B，KilimannMW.The 5’-flanking region of the rat神经突触素I gene directs neuron-specificand developmentally regulated reporter gene expression in transgenic mice.JBiol Chem 1993；268：26494-26502；Kilic E，Hermann DM，Kugler S，Kilic U，Holzmuller H，Schmeer C，Bahr M.Adenovirus-mediated Bcl-X(L)expression usinga neuron-specificsynapsin-1 promoter protects against disseminated neuronalinjury and brain infarction following focal cerebral ischemia in mice.Neurobiol Dis 2002；11：275-284；Gloster A，Wu W，Speelman A，Weiss S，CausingC，Pozniak C，Reynolds B，Chang E，Toma JG，Miller FD.The T alpha 1 alpha-tubulin promoter specifies gene expression as a function of neuronal growthand regeneration in transgenic mice.J Neurosci 1994；14：7319-7330；ThomasM，Makeh I，Briand P，Kahn A，Skala H.Determinants of the brain-specificexpression of the rat aldolase C gene：ex vivo and in vivo analysis.Eur J Biochem1993；218：143-151；Thomas M，Skala H，Kahn A，TuyFP.Functional dissectionof the brain-specific rat aldolase C gene promoter in transgenic mice.Essentialrole of two GC-rich boxes and an HNF3 binding site.J Biol Chem 1995；270：20316-20321；DennisK，Uittenbogaard M，Chiaramello A，Moody SA.Cloning andcharacterization of the 5’-flanking regi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所述启动子含有至少一段核苷酸序列，该序列能活化可操作连接序列的神经元细胞特异性表达，一些实施方案中，所述核苷酸序列保留有作为增强子的序列所需的转录因子的最小结合位点。一些实施方案中，所述重组核酸包含多个拷贝的相同序列，或者两个或多个不同的核苷酸序列，其中的每一个都能有效激活转录活性。对于可以使用的各种启动子而言，转录因子结合位点可以是巳知的或者本领域普通技术人员可以通过上述本领域巳知方法鉴定出来。

现已查明血小板衍生生长因子-链(PDGF-β)启动子(Sasahara M，Fries JW，Raines EW，Gown AM，Westrum LE，Frosch MP，Bonthron DT，Ross R，Collins T.PDGF-β-chain in neurons of the central nervous system，posterior pituitary，andin a transgenic model.Cell 1991；64：217-227)对于包括多巴胺能神经元在内的神经元细胞来说是特异性的，一个实施方案中，所述神经元细胞特异性启动子是PDGF-β启动子。在一个具体的实施方案中，所述神经元细胞特异性启动子是人PDGF-β启动子，一个实施方案中，所述神经元细胞特异性启动子含有下列这段对应于人PDGF-β基因转录起始位点第-1492～-5位核苷酸的序列：

  1  CTAGAGGATC CACAGTCTCC TGAGTAGCTG GGACTACAGG AGCTTGTTAC

 51  CACACCCAGC TCCAGTTTAT AAATTCATCT CCAGTTTATA AAGGAGGAAA

101  CCGAGGTACT GAGAGGTTAA AAAACCTTCC TGCAGACACT TGTCCAGCAA

151  GTGGCCACTC CAGGATTTGG ACCAAGGTGA TGTGTCTTCA GGCTGTGTCT

201  CTGCCACTGT GCCACGCTGC TGGGTGGTAG GCAGCAGTGG GTGGGTGCCT

251  GCAGTGGTCT GTAAAGACCA CCTGAGATGT CCTTCCTCCT CTGTTCCACC

 301  CTGTCCAGGT CCAAGAAGAC AGTCTATGAA GAGAGAGCAG GTGTGACTCT

 351  CTCAGTGTGC TCCTCTGTGA GAACCAGGCT GACATCCCAA AGGGAAGGGC

 401  GGATAACAGA GACAGTGCAA GCGGAGGAGA TGAGGGTGCC TCAAAGCCGG

 451  GAGGCTGGGT GATGCAGGAG CCTGCGTGTC CCGAGGGGGG TGCTGGGCCC

 501  AGTGTGAGTA CGTGTGACTG TGACTGAGAC AGTGTGACTG CTGAAGGCAG

 551  GGACACAGCA GCTCCCTGAC TGGGGGCAGA AGGCGTTAAC TGTGTGAAGG

 601  CTGGTTGTGG GTGGGTGGGC TCTGGGCCTC GAACCCGGGG GCTGAGGGAG

 651  ATAGTAAACA GCAGGGTGAC TGACGGGAAG ATCATGTTGG TAGCCCTGCG

 701  AAGATGCTGC AGGGCTGTGG GGGTTTGTGT GACTTTGCAG TTCAACAAAT

 751  TCAAATTCAG CCAACGCTGG CAGGGCCTGT TGTGCCAGGC AACCAGCTAG

 801  GAGGAGGAGA CTCGGACCCA GCTTGCAGCT GAAGGGCGCT GGCTGCCGGG

 851  TTCTGTGGGT TCACCTTGCG GTGTCTTCCC TTGCTAACAC TGAGTCCTTA

 901  CAATAGCCCC ATCTCCAGGT TGAGGCTAGA TGGAGGGGAC AGAGGGAAGT

 951  GACTTGCCCA AGGTGACCCA AGCTCCCGAG TGCCAGGGCA GGATCTGAAT

1001  TCAGGCTCTC AGACTGCAGA GCCTGAGTCC CTCCCTGCCA TGCCTGTGCC

1051  AGGGTGGAAA TGTCTGGTCC TGGAGGGGAG CGTGGACTCC TGGCCTTGGC

1101  TCTGGAGACA TCCCCCTAGA CCACGTGGGC TCCTAACCTG TCCATGGTCA

1151  CTGTGCTGAG GGGCGGGACG GTGGGTCACC CCTAGTTCTT TTTTCCCCAG

1201  GGCCAGATTC ATGGACTGAA GGGTTGCTCG GCTCTCAGAG ACCCCCTAAG

1251  CGCCCCGCCC TGGCCCCAAG CCCTCCCCCA GCTCCCGCGT CCCCCCCCTC

1301  CTGGCGCTGA CTCCGGGCCA GAAGAGGAAA GGCTGTCTCC ACCCACCTCT

1351  CGCACTCTCC CTTCTCCTTT ATAAAGGCCG GAACAGCTGA AAGGGTGGCA

1401  ACTTCTCCTC CTGCAGCCGG GAGCGGCCTG CCTGCCTCCC TGCGCACCCG

1451  CAGCCTCCCC CGCTGCCTCC CTAGAGTCGA GGAACTAA (SEQ ID NO.10)

所述启动子还可以包含该核苷酸序列的等位变体和衍生物(例如序列的缺失，插入，倒置，取代或添加)，这类变体或衍生物提供的其他神经元细胞特异性启动子序列能够活化可操作连接序列的神经元细胞-特异性转录。各种实施方案中，使用该术语时这类可变区和衍生物是基本上同源的，或者用上述算法测定时同源性大于50％，80％-100％，至少80％，至少90％或至少95％。

当第一核酸序列和第二核酸序列处于一种功能相关状态时，这两核酸序列就是可操作地连接在一起的。例如，如果一种启动子能活化一种编码序列的转录，那么该编码序列就是可可操作地连接于该启动子。类似地，当一种异源增强子能够增加可操作连接序列的神经元细胞特异性转录时，那么该增强子与神经元细胞特异性启动子之间就是可操作连接。与启动子隔开时增强子能够发挥作用，同样地，增强子可以可操作地连接于神经元细胞特异性启动子但是可以不必是邻接的。但是，通常，可操作连接序列是邻接的。

本发明的一个实施方案中，CMVIE增强子可操作地连接于PDGF-β启动子的上游。另一个实施方案中，CMVIE增强子可操作地连接于PDGF-β启动子的上游，而且二者是邻接的。

本发明的一个实施方案中，所述重组核酸分子包含由SEQ ID NO.10和位于其上游的SEQ ID NO.9以及二者之间的接头序列组成的下列序列：

5′CCTGGGTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATACGGGGTCATTAGTTCATAGCC

CATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCC

GCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAAT

GGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCC

CTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCT

ACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGAGCTCCTAGAGGATCCACAGTCTC

CTGAGTAGCTGGGACTACAGGAGCTTGTTACCACACCCAGCTCCAGTTTATAAATTCATCTCCAGTTTA

TAAAGGAGGAAACCGAGGTACTGAGAGGTTAAAAAACCTTCCTGCAGACACTTGTCCAGCAAGTGGCCA

CTCCAGGATTTGGACCAAGGTGATGTGTCTTCAGGCTGTGTCTCTGCCACTGTGCCACGCTGCTGGGTG

GTAGGCAGCAGTGGGTGGGTGCCTGCAGTGGTCTGTAAAGACCACCTGAGATGTCCTTCCTCCTCTGTT

CCACCCTGTCCAGGTCCAAGAAGACAGTCTATGAAGAGAGAGCAGGTGTGACTCTCTCAGTGTGCTCCT

CTGTGAGAAGCAGGCTGACATCCCAAAGGGAAGGGCGGATAACAGAGACAGTGCAAGCGGAGGAGATGA

GGGTGGCCTCAAAGCCGGGAGGCTGGGTGATGCAGGAGCCTGCGTGTCCCGAGGGGGTGCTGGGCCCAG

TGTGAGTACGTGTGACTGTGACTGAGACAGTGTGACTGCTGAAGGCAGGGACACAGCAGCTCCCTGACT

GGGGGCAGAAGGCGTTAACTGTGTGAAGGCTGGTTGTGGGTGGGTGGGCTCTGGGCCTCGAACCCGGGG

GCTGAGGGGAGATAGTAAACAGCAGGGTGACTGACGGGAAGATCATGTTGGTACCCTGCGAAGATGCTG

CAGGGCTGTGGGGGTTTGTGTGACTTTGCAGTTCAACAAATTCAAATTCAGCCAACGCTGGCAGGGCCT

GTTGTGCCAGGCAACCAGCTAGGAGGAGGAGACTCGGACCCAGCTTGCAGCTGAAGGGCGCTGGCTGCC

GGGTTCTGTGGGTTCACCTTGCGGTGTCTTCCCTTGCTAACACTGAGTCCTTACAATAGCCCCATCTCC

AGGTTGAGGCTAGATGGAGGGGACAGAGGGAAGTGACTTGCCCAAGGTGACCCAAGCTCCCGAGTGCCA

GGGCAGGATCTGAATTCAGGCTCTCAGACTGCAGAGCCTGAGTCCCTCCCTGCCATGCCTGTGCCAGGG

TGGAAATGTCTGGTCCTGGAGGGGAGCGTGGACTCCTGGCCTTGGCTCTGGAGACATCCCCCTAGACCA

CGTGGGCTCCTAACCTGTCCATGGTCACTGTGCTGAGGGGCGGGACGGTGGGTCACCCCTAGTTCTTTT

TTCCCCAGGGCCAGATTCATGGACTGAAGGGTTGCTCGGCTCTCAGAGACCCCCTAAGCGCCCCGCCCT

GGCCCCAAGCCCTCCCCCAGCTCCCGCGTCCCCCCCCTCCTGGCGCTGACTCCGGGCCAGAAGAGGAAA

GGCTGTCTCCACCCACCTCTCGCACTCTCCCTTCTCCTTTATAAAGGCCGGAACAGCTGAAAGGGTGGC

AACTTCTCCTCCTGCAGCCGGGAGCGGCCTGCCTGCCTCCCTGCGCACCCGCAGCCTCCCCCGCTGCCT

CCCTAGAGTCGAGGAACTAA3′(SEQ ID NO.11)

所述重组核酸分子还可以包含至少一段可操作连接的编码序列。不同实施方案中，所述可操作连接序列可以编码一种报道物蛋白例如荧光素酶或者绿色荧光蛋白或者可以本身是一段有治疗作用的基因序列。

就可操作连接而言，一些实施方案中，所述神经元细胞特异性启动子和所述异源增强子可以与可操作连接序列位于同一条链上，一些实施方案中，位于可操作连接序列的5’端一侧。这类实施方案中，所述启动子可以直接连接在可操作连接序列的5’端一侧，或者也可以在这些区域之间存在有插入序列。一些实施方案中，所述启动子和增强子可以位于可操作连接序列的3’端。一个实施方案中，一种或多种编码序列连接于PDGF-β启动子的下游。另一个实施方案中，一种或多种编码序列以邻接的方式连接于PDGF-β启动子的下游。

本发明所述重组核酸分子可以通过本领域技术人员已知的常规方法构建，描述参见，例如，Sambrook et al.(2001)in Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring Harbor，Laboratory Press，及其他实验手册。在本发明的各个方面，核酸分子可以使用例如下列文献所述的技术化学合成：Itakura等人的美国专利US4,598,049；Caruthers等人的美国专利US4,458,066；以及Itakura的美国专利US4,401,796和4,373,071。这类合成核酸实质上(by their nature)是″重组的″，当在本申请中使用了该术语时(是将该分子构成部分逐步合并在一起得到的产物)。

在另一些实施方案中，可将分离的核酸结合。所谓的分离，是指分离的物质已经基本上从其他成分例如生物成分分离或者纯化出来从而可以对其本身进行操作或处理，在其他情况下例如体内时，它们是连接在一起的。因此，术语’分离的’包括用常规纯化方法纯化得到的物质，通过在宿主中重组表达制备得到的物质，以及化学合成的物质。例如，当一种启动子不再紧紧邻接于(即，共价键连接至)在其来源生物体天然生成基因组中通常邻接的编码序列时，那么这种启动子就是分离的。许多方法都可以用于克隆或连接DNA的片段，这取决于DNA片段末端的特点，选择合适的方法对于本领域技术人员来说是显而易见的。

本发明的另一个方面，提供了一种其中含有本发明所述重组核酸分子的表达载体。所述载体可以是一种质粒或者一种病毒或者病毒衍生物。另外，用常规方法构建这类载体也已为本领域普通技术人员所熟知。本发明所述载体还可以含有有助于宿主细胞中载体繁殖和筛选的其他序列元件，例如，本领域技术人员已知的可筛选标记物的编码序列和报道基因。此外，本发明所述载体还可以包含用作一个或多个限制酶识别位点的序列。

一个实施方案中，可以将CMVIE增强子和PDGF-β启动子插入pGL3质粒(Promega)多克隆位点构建出一种质粒表达载体，如实施例所述。在上述得到的载体中，本发明所述启动子构建体可操作地连接于合并在pGL3质粒内的荧光素酶报道基因。一些实施方案中，可以将CMVIE增强子和PDGF-β启动子插入AAV和杆状病毒构建一种病毒表达载体，如实施例所述。

可以将本发明的表达载体导入一种宿主细胞，所述宿主细胞可以包括能够表达所述表达载体编码的蛋白质。所述宿主细胞包括培养的神经元细胞和位于活生物体内的神经元细胞，所述的培养的神经元细胞包括神经元细胞系，培养的神经元干细胞和原代神经元。因此，本发明还提供了含有本发明表达载体的宿主细胞。术语″宿主细胞″不仅指特定的受试者细胞而且也指这类细胞的后代或可能的后代。由于细胞分化，突变或环境影响会使后代体内发生某些改变，所以，这样的后代实际上不一定与亲代细胞完全相同，但是也包括在本申请使用的该术语的范围之内。

可以通过常规的转化或转染技术，将载体DNA导入细胞。术语″转化″和″转染″是指用于将外源核酸导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共-沉淀，DEAE-葡聚糖-介导的转染，脂染法(lipofection)，电穿孔，微注射和病毒-介导转染。适于转化或转染宿主细胞的方法已为本领域所熟知，可以参见例如，Sambrook et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd Edition，Cold Spring HarborLaboratory press(2001))，及其他实验手册。

一种细胞、组织、器官或生物体当其中导入了一种外源核酸时，就可以认为是″经转化的″，″经转染的″或者″转基因的″。转基因的或经转化的细胞或生物体还包括所述细胞或生物体的后代以及通过使用转基因生物体作为亲体的育种方法制备的后代，由于重组核酸构建体的存在而表现出一种改变了的表型。因此，一种转基因生物是一种经异源核酸转化的生物体，或者包含所述转基因的该生物体的后代。

在各个方面本发明提供了其中含有本发明各种实施方案所述重组核酸分子的转基因细胞和非-人动物。

就哺乳动物细胞的稳定转染而言，大家都知道，这取决于使用的表达载体和转染技术，只有一种小部分细胞才可以在其基因组中插入外源DNA。为了鉴定和筛选这些整合体，可以将一种可筛选标记物的编码基因随同目的基因一起导入宿主细胞。

优选地，可筛选标记物包括能赋予抗药性的可筛选标记物，例如，G418，潮霉素和甲氨蝶呤(methotrexate)。编码可筛选标记物的核酸可以与编码肽化合物的核酸位于同一载体上或者分别位于不同的载体上，导入宿主细胞。可以通过药物筛选鉴定出被引入的核酸稳定转染了的细胞。

正如在下面实施例中描述的那样，本发明的一个将CMVIE增强子与PDGF-β启动子联合在一起的实施方案，在保持神经元细胞特异性的同时，可以提高转录水平，包括体内和体外。

PDGF-β大量表达于中枢神经系统的神经元，现已查明PDGF-β启动子片段可将转基因靶向至转基因动物中的分化神经元。但是，与其他神经元-特异性启动子相比，PDGF-β启动子是一种相对较弱的转录激活剂。

一个公开的实施方案中，通过将CMVIE增强子与PDGF-β启动子联合，本发明人首次获得了这样一种启动子构建体，该启动子构建体特异性用于神经元细胞，而且与单独使用PDGF-β启动子相比，可以更高水平和更长时间活化可操作连接序列的转录。此前已经查明含有PDGF--β启动子的重组腺联病毒载体能够比携带CMV启动子的滴度-竞争(titer-matched)载体转导明显更多的多巴胺能神经元。因此，令人奇怪的是，当CMVIE增强子与PDGF-β启动子联合时，能够提高神经元细胞中转录活性的水平。

现已发现CMV启动子在神经系统的不同细胞中其活性是可变的，这一结果也是出人意料的。一种被CMV启动子驱动的转基因倾向于表达于发育中大脑的脑室区，辐射性纤维和移动性成神经细胞，而不是成熟的神经元。这一结果与下述发现是一致的：CMV传染对成人大脑的影响很小，但是对发育中人脑内的作用是灾难性的，这部分是由于CMV启动子在发育中神经元内的表达水平较高。

成熟鼠脑的转基因试验表明CMV启动子限制性表达于限制类型的神经元中。最近的一篇论文报道了使用鼠CMV启动子时的星形细胞-特异性表达。类似地，含CMV启动子的杆状病毒载体主要介导成熟大脑的胶质细胞中的表达，而当使用Rous肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)启动子时发现了神经元中的表达。这些报道之间的差别可能与下述发现有关：CMV启动子序列的轻微变化能够在CNS神经元中产生完全不同的表达模式。这些序列-特异性表达部分是由于CMV启动子的复杂程度，其中含有cAMP，CREB/ATF，NF-KB，SPI，YY1，视黄酸，AP-1，NF1的结合位点，其自身立即早期蛋白产物，以及含有一种甲基化信号肽。

但是，显然当与一种神经元细胞特异性启动子例如PDGF-β启动子联合时，CMVIE增强子能够提高和延长可操作连接序列的神经元细胞特异性转录。因此，本发明消除了基因治疗中使用神经元细胞特异性启动子时的主要的限制。

尽管用CMVIE增强子和PDGF-β启动子的构建体举例说明了本发明的一种实施方案，当时本领域技术人员显然能够认识到通过常规表达试验可以很容易地鉴定其他构建体。PDGF-β启动子和CMVIE增强子中间每一个与一种合适的增强子或者启动子联合时，视情况而定(as the case may be)能够提供一种适合于神经元细胞中基因表达的启动子构建体。此外，还应该认识到的是，CMVIE增强子和PDGF-β启动子的联合可以用于其他实施方案。因此可以通过下述操作鉴定出其他合适的神经元启动子：将一种能够激活神经元细胞特异性表达的启动子与CMVIE增强子联合，然后测定神经元细胞中可操作连接序列增强子的表达是否升高。类似地，可以通过下述操作鉴定出其他合适的增强子：将一种异源增强子与PDGF-β启动子联合，然后测定神经元细胞中可操作连接序列的表达是否升高。可以将所述的其他合适的增强子和启动子联合形成本发明的其他范例性实施方案。

本发明的一个方面，提供了一种提高强神经元细胞特异性启动子转录活性的方法，其中包括在神经元细胞特异性启动子上可操作地连接一种异源增强子。不同实施方案中，所述增强子和所述启动子可以是如上所述的增强子和启动子，包括人CMVIE增强子和人PDGF-β启动子。本发明的一个实施方案中，所述增强子可操作地连接于神经元细胞特异性启动子的上游。

所述重组核酸分子，在其不同的实施方案中可用于在神经元细胞中表达外源DNA序列，例如，研究神经元细胞中的基因功能和基因表达调控。

高水平、长期且细胞特异性的基因表达是通过基因治疗有效治疗神经系统疾病所必需的。因此一个实施方案中，所述重组核酸分子可以有效地用于基因治疗以治疗神经元性疾病，包括中风、局部缺血、癫痫、头和脊髓外伤、帕金森氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化，以及神经系统遗传性疾病。例如：，帕金森氏病中，黑质中多巴胺能神经元的进行性丢失最终导致多巴胺不足和相关运动神经元(motor)损伤。因此其中含有CMVIE增强子和PDGF-β启动子构建体的表达载体可用于发展帕金森氏病的基因治疗，通过借助最佳载体将治疗基因转移入多巴胺能神经元。

本发明一个方面提供了一种治疗受试者神经元性疾病的方法，其中包括向所述受试者施用一种表达载体，该表达载体含有一种可操作地连接于治疗基因编码序列的本发明所述重组核酸分子。治疗基因包括生长因子基因(包括成纤维细胞生长因子基因家族的基因、神经生长因子基因家族和胰岛素-样生长因子基因)，和抗凋亡基因(包括bcl-2基因家族)在内。

用于将DNA导入体内哺乳动物细胞的方法是已知的，包括用于基因治疗的方法，可用于将本发明的表达载体DNA施用给因神经系统疾病而需要基因治疗的受试者。可以使用下列方法将本发明的核酸递送至体内细胞，例如DNA的直接注射，受体-介导的DNA摄入，病毒-介导的转染或者非-病毒转染以及以脂类为基础的转染，所有这些方法都涉及使用基因治疗载体。可以使用一种递送装置(例如，″基因枪″)将DNA注射入体内的细胞。这类装置可以从市场上购买(例如，购自BioRad)。一个实施方案中，通过将表达载体直接注射入中枢神经系统或脑脊髓液的方式，施用所述表达载体。

用作基因治疗的反转录病毒-介导的基因递送已经研究的很清楚，用于制备重组反转录病毒的方法以及用所述病毒体外或体内感染细胞的方法可以参见CurrentProtocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.et al.(eds.)Greene PublishingAssociates，(1989)，及其他实验手册。用于基因治疗的其他巳知病毒载体包括腺病毒和腺联病毒，美国专利US 6,180,613中所述的用于将DNA递送至神经系统细胞的病毒载体，以及Sarkis C et al.，(Efficient transduction of neural cells invitro and in vivo by a baculovirus-derived vector.Proc Natl Acad Sci USA 2000Dec 19；97：14638-43)一文报道的杆状病毒-衍生载体。

在为获得细胞-特异性基因表达需要大量DNA的情况下，可以使用能够插入大的DNA质粒的非-病毒的多聚基因载体。这些载体包括阳离子聚合物或者脂类描述见下列文献：Davis ME，Non-viral gene delivery system；Current opinion inbiotechnology 2002，13：128-131；Niidome T and Huang L，Hene therapy progressand prospects：nonviral vectors.Gene Therapy，2002，9：1647-1652；Li S andHuang L，Nonviral gene therapy：promises and challenges.Gene Therapy，2000，7：31-34；Boussif O，Lezoualc’h，Zanta MA，Mergny MD，Scherman D，Demeneix B，BehrJ-P.A versatile vector for gene andoligonucleotide transfer into cells inculture and in vivo：聚乙烯亚胺.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995；92：7297-7302；Abdallah B，Hassan A，Benoist C，Goula D，Behr JP，Demeneix BA.A powerfulnonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain：聚乙烯亚胺.Hum Gene Ther.1996；7：1947-1954；Goula D，Remy JS，Erbacher P，Wasowicz M，Levi G，Abdallah B，Demeneix BA.Size，diffusibility andtransfection performance of linear PEI/DNA complexes in the mouse centralnervous system.Gene Therapy，1998；5：712-717。

可以将与阳离子聚合物例如聚乙烯亚胺(PEI)形成复合物的质粒DNA递送至神经元细胞，一个实施方案中，治疗神经元性疾病的方法还包括下列步骤：在施用前，将所述表达载体与一种聚合的基因载体混合。一个实施方案中，所述聚合的基因载体是PEI。

为了将所述载体特异性地递送至中枢神经系统特定区域中的神经元细胞，可以使用本领域巳知的立体定位微注射，描述见实施例。对于人类患者而言，将所述立体定位框架底座固定在颅骨内，然后使用高分辨率MRI让带有立体定位框架底座的大脑成像。使用合适的立体定位软件，将图像转换为适合于用于靶向注射载体DNA的立体定位框架的三维坐标。

所有文献在此引入作为参考。

尽管本申请中公开了本发明的各种实施方案，但是仍然可以根据本领域技术人员的公知常识作出不脱离本发明范围的调整和修改。这类改动包括为了以基本相同方式获得同样结果，而用已知等效物替换本发明任一个方面。除另有说明外，本申请中的所有科技术语的都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。

″包含″一词作为一种含义开放的术语使用，基本上等同于短语″包括但不限于″。下列实施例是为了说明本发明的各个方面，而决不对本申请中公开的本发明的各个方面构成限制。

实施例

1.材料与方法

质粒构建

PGL3-基础载体购自Promega。psubPDGF-EGFP(Paterna et al.，2000)为Prof.HBueler(Institute of Molecular Biology，University of Zurich，Switzerland)友情惠赠。荧光素酶构建体pCMVIE-PDGF-luc，pCMVIEluc，pPDGFluc，pCMVIuc是在pGL3-基础载体基础上构建而成的。为了制备pCMVIE-PDGF-luc，使用PCR从psubPDGF-EGFP和pRc/CMV2(Invitrogen life technologies，California，USA)分别扩增出PDGF-β启动子和CMV立即早期(CMVIE)增强子，然后分别插入pGL3-基础载体多克隆位点中Sac I/Hind III和Kpn I/Sac I之间。PCMVIEluc和pPDGFluc是通过将CMVIE增强子和PDGF启动子的PCR产物插入pGL3-基础载体的Kpn I/Sac I和SacI/Hind III位点。为了构建pCMVluc，从pRc/CMV2扩增出CMV全长启动子，插入pGL3-基础载体的Kpn I/Hind III位点。本试验中使用的这四种不同的质粒载体的图解结构显示于图1。

所有质粒DNA都用大肠杆菌DH5a扩增，然后用常规方法(Qiagen，Hilden，Germany)纯化。通过DNA测序验证PCR扩增获得的质粒。PCR扩增使用的寡核苷酸如下所列，用斜体字母标示出限制酶切位点。

CMVIE增强子：

正向引物，5′-ATTCGGTACC CCTGGGTCGACATTGA-3′ (SEQ.ID NO.1)

反向引物，5′-CAACGAGCTC ACCATGGTAATAGCGATG-3′(SEQ.ID NO.2)

CMV启动子：

正向引物，5′-ATTAGGTACC CGATGTACGGGCCAGATATACG-3′(SEQ.ID NO.3)

反向引物，5′-TAATAAGCTT ACTAGTGGATCCGAGCTCGGTA-3′(SEQ.ID NO.4)

PDGF-β启动子：

正向引物，5′-AATTGAGCTCCTAGAGGATCCACAGTCT-3′ (SEQ.ID NO.5)

反向引物，5′-CAGCAAGCTTTTCAGTTCCTCGACTCTAG-3′(SEQ.ID NO.6)

DNA/聚合物复合物的制备：

质粒DNA用5％葡萄糖稀释。PEI(25kDa；Sigma-Aldrich，San Diego，CA)以10mM含水原液使用。细胞转染和动物试验中，PEI与DNA之间的相对用量分别为为每一当量DNA磷酸酯对应于10和14当量的PEI氮。PEI的需要量是根据下列因素得出的：1μg DNA含有3nmol的磷酸酯，1μl 10mM PEI含有10nmol胺氮(aminenitrogen)。通过下述得到复合物：向DNA溶液中加入适量PEI溶液，简单涡旋混合，室温下放置30分钟。

病毒载体的制备

重组杆状病毒构建体使用Bac-To-Bac Baculovirus Expression System(GibcoBRL，Life Technologies，Gaithersburg，MD，USA)而成。将置于CMV启动子下的荧光素酶cDNA或CMVIE增强子和PDGF-β启动子插入转移质粒pFastBacl，CMV或CMVIE增强子和PDGF-β启动子插入Notl & Xbal之间，荧光素酶cDNA插入Xhol & HindIII之间。将制备的重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中增殖，使用O’Reilly DR，Miller LK，and Luchow VA(Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual.New York：W.H.Freeman and Company，1992)公开的常规方法。将来自昆虫细胞培养物的出芽(Budded)病毒用0.2-μm孔径的滤膜过滤，然后通过超速离心浓缩。将病毒沉淀重悬于PBS，然后通过Sf9细胞噬斑试验测定感染滴度。

重组腺联病毒(AAV)构建体使用AAV Helper-Free System(Stratagene，La Jolla，CA)构建而成。将CMV、PDGF-β和CMVIE增强子-PDGF-β启动子构建体插入Kpn I和III之间的pAAV-荧光素酶，制得AAV表达质粒pAV-CMV-luc、pAAV-PDGF-luc和pAAV-C1 VIE/PDGF-luc。全部质粒都在大肠杆菌DH5α株中扩增，使用Qiagen plasmidMaxiprep试剂盒(Qiagen，Ontario，Canada)制备。通过使用PEI方法将上述三种AAV表达质粒其中之一、AAV包装质粒pAAV-RC以及腺病毒辅助质粒pHelper(1∶1∶1摩尔比)共一转染入HEK293细胞。转染后三天，收集细胞，然后通过两轮冻/融循环使AAV从细胞中释放出来。通过一-步重力流(gravity flow)肝素亲和层析柱纯化AAV颗粒，描述见Auricchio A et al.(Isolation of highly infectious andpureadeno-associated virus type 2 vectors with a single-step gravityflow column.Hum Gene Ther.2001；12：71-76)。使用购自Progen，Germany的ELISA试剂盒测定纯化后的AAV颗粒的滴度。

细胞培养

体外转染试验在大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞、新生小鼠小脑干细胞MTC 17.2以及大鼠原代皮层神经元中完成。MTC 17.2和原代神经元在37℃ 5％CO2条件下培养于添加了10％FBS的DMEM中，PC12细胞培养于含有15％FCS的RPMI 1640。

转染入培养细胞及荧光素酶活性试验

对于PC12和MTC 17.2的转染而言，转染前一天将细胞脱落下来，使用0.5毫升上述培养基，将细胞以5×10⁴/孔细胞密度平铺于24-孔平板。孵育过夜后，将培养基更换为300μl Opti-HEM，向平板的每一孔中加入10μl一等份的含0.1pmole DNA的DNA/PEI复合物。37℃下用DNA/PEI复合物孵育细胞3小时。用0.5ml新鲜的完全培养基替换每个孔中的培养基，然后再继续孵育细胞24小时。孵育后，用100μl细胞裂解缓冲液(Promega)使细胞通透性增加。对于大鼠原代皮质神经元的转染而言，将细胞种植入46-孔平板用于杆状病毒感染或96-孔平板用于AAV感染。使用荧光素酶试验试剂盒(promega)测量细胞提取物中的荧光素酶活性。将相对发光单位用细胞提取物中蛋白质浓度归一化，该蛋白质浓度是用蛋白质测定试剂盒(Bio-Radlabs，Hercules，Calif)测得的。

体内试验

-动物

本试验使用成熟雄性Wistar大鼠(重量为250-320g)。将这些大鼠分成几组：对于荧光素酶提取试验，每一时间间隔使用4只大鼠：pCMVIE-PDGF-luc(n＝32)，pCMVIEIuc(n＝4)，pPDGFluc(n＝4)，pCMVluc(n＝12)；对于免疫组织化学试验：假操作组(n＝6)，pCMVIE-PDGF-luc注射组(n＝6)，pCMVluc注射组(n＝6)；对于PCR试验(n＝3)，在注射后的不同时间将大鼠随机分配给每个组。将大鼠以一笼4只，置于光-暗循环(12h/12h)、22℃恒温和60％湿度的条件下，用普通试验室大鼠食物饲喂。在所有动物的操作和护理中，遵照由世界卫生组织制定的(1985)并且被新加坡国立大学实验动物中心采用的the International Guiding Principles forAnimal Research进行。所有大鼠全部由新加坡国立大学实验动物中心繁育和供给，在实验前后都圈养于动物中心。

-注射方法

通过腹膜内注射戊巴比妥钠的方式将大鼠麻醉(60mg/kg体重)，然后置于脑立体定位装置，压尺(nose bar)设定在0或-3.5毫米(用于海马注射)。将DNA分别双侧3点注射入纹状体[坐标(从前囟点和硬膜算起)：前面(A)，+1.5毫米，外侧(lateral)(L)，+2.0mm，腹侧(ventral)(V)，5.0mm；A，+0.5mm，L，+3mm，V，-5.0mm以及A，-0.3mm，L，+3mm，V，-5.0mm]或者注射入海马(坐标：A，-4.4mm，L，+3.2mm，V，-2.5mm)。就每一注射而言，注射量都为5μl，其中含有置于PEI/DNA复合物中的1μg DNA。注射速率为1ul/分钟，每次注射结束让针头在原位保持5分钟然后慢慢拔出。

-PCR检测来自组织样本的荧光素酶基因

在纹状体注射pCMVIE-PDGF-luc后2天，从大鼠大脑采集纹状体、海马、皮层和黑质组织样本。通过用刀片剁碎的方式将组织均质化，然后按照DNAeasy Tissue试剂盒(Qiagen)的常规方法提取质粒DNA。荧光素酶PCR扩增用的寡核苷酸引物如下：

5’引物：5’-ATTGC TCA ACA GTA TGG GCA-3’(SEQ.ID NO.7)

3’引物：5’-CGA AGA AGG AGA ATA GGG TTG-3’(SEQ.ID NO.8)

扩增产物的预期大小为540bp。扩增循环如下：94℃5min，1个循环；94℃，45s，55℃30s，72℃，30s，35个循环，最后72℃延伸7分钟。为了排除整个过程中的污染，对注射了PEI的普通大鼠大脑同时设置双份进行处理。

荧光素酶试验

深度麻醉后，通过心内灌注0.1M磷酸盐缓冲盐水PBS(pH7.4)处死大鼠。摘出大脑，解剖为包括纹状体、海马、皮层和黑质的四个不同部分，收集入eppendorf管。将组织样本-80℃保存备用。分别加入PBS缓冲液(每50mg组织加100μlPBS)后，通过置于冰上超声处理10秒钟将组织样本均质化，然后在微量离心机中4℃下以13,000rpm离心。取10微升上清室温下用于荧光素酶活性试验，使用购自Promega的测定试剂盒。测量在一种单-孔光度计(Berthold Lumat LB 9501)中10秒钟完成。

-免疫组织化学分析

用pCMVIE-PDGF-luc、pCMVluc注射或假操作后2天，杀死大鼠(n＝3)。深度麻醉后，首先向所有大鼠灌注Ringer’s溶液，然后接着灌注2％的多聚甲醛0.1M PBS溶液(pH 7.4)。在灌注以后，取出含纹状体和海马的大脑皮层，在同样的固定液中再-固定2-4小时，然后转移入含15％蔗糖的0.1M PBS中，4℃保存过夜。将每一大脑切削为30m厚的冠状冰冻切片，收集后保存于0.1M PBS。

将Free-floating切片在含0.2％Triton X-100的pH 7.4的0.1M PBS中洗涤20分钟，然后用5％常用山羊血清PBS溶液封闭1小时。然后，将切片用第一抗体：抗荧光素酶抗体(Promega；1∶150稀释)和抗神经元-特异性核蛋白单克隆抗体(NeuN)(Chemicon International，USA；1∶500稀释)孵育过夜。切片用0.1M PBS洗涤，然后抗-兔IgG Tritc偶联物(Sigma-Aldrich，Inc.，USA；dilution 1∶100)和抗-鼠IgG Fitc偶联物(Sigma-Aldrich；dilution 1∶100)孵育1小时。在孵育以后，将切片用PBS洗涤3遍。然后，将其收集在明胶-包被过的载片上，用DAKO荧光封固剂固定然后盖上盖玻片。对照切片不用第一抗体孵育。

-用共焦扫描显微术目测双重标记

切片用Carl Zeiss LSM410共焦激光扫描显微镜检查。每一种切片首先用488nm激光谱线和发射滤片BP 510-525扫描，检测Fitc荧光素；然后用543nm激光谱线和一种发射滤膜LP 570扫描，检测Tritc荧光素。

-定量分析

3只大鼠中的每一个在细胞定量分析中都用NeuN共定位pCMVIE-PDGF-luc和pCMV-luc。每只大鼠各随机选取4张切片用于细胞计数。每张切片随机选取一共3个两侧区域进行检测。每一区域在Carl ZeissLSH410共焦激光扫描显微镜下用200x放大倍数观察。对每一画面中的共定位细胞计数，然后分别计算出NeuN在pCMVIE-PDGF-luc和pCMV-luc阳性细胞中的共定位百分数。使用Student’s t-检验测定不同质粒中共定位程度的统计显著性。

2.结果

表1.从纹状体或海马中再-注射入pCMVIE-PDGF-luc或pCMVluc后2天杀死的大鼠获取的、含有或不含神经元-标记物NeuN免疫反应性的、荧光素酶免疫反应活性阳性的细胞的数目。

注射位点	纹状体	海马
			每一区域内荧光素酶阳性的细胞的数目(平均值±S.E.M.)：CMVIE-PDGF-CMV	61.17±7.17106.17±5.89	31.94±1.5882.78±4.67
每一区域内荧光素酶和NeuN双标记细胞的数目(平均值±S.E.M.)：CMVIE-PDGF-CMV	55.89±8.3751.00±2.19	28.5±2.0341.78±2.34
			转染的神经元的百分比*(平均值±S.E.M.)：CMVIE-PDGF-CMV	91.28％±4.06％48.08％±1.08％	89.29％±2.83％50.54％±3.46％

*转染神经元的百分比＝双标记细胞的数目/荧光素酶免疫反应活性细胞的总数。

使用CMVIE-PDGF嵌合启动子提高体外基因表达

为了消除不同质粒骨架对基因表达的影响，所有荧光素酶报道质粒都用相同的pGL3-基础载体的骨架构建(图1)。神经元细胞转染过后，体外将pCMVIE-PDGF-luc的荧光素酶表达与pCMVluc、pPDGFluc和pCMVIEluc进行比较。如图2所示，在两种测试细胞中，与pPDGFluc和pCMVIEluc相比，pCMVIE-PDGF-luc使得表达显著提高。这些细胞中，与来自pPDGFluc的PDGF活性相比，pCMVIE-PDGF-luc中在PC12和MTC17.2中的PDGF活性分别升高了8倍和90倍。这种提高要比单用PDGF和CMVIE的简单加和表达显著的多。PC12细胞和MT C17.2细胞中pCMVIE-PDGF-luc与pCMVluc之比分别为0.88和2.92，表明所述嵌合启动子将基因表达提高至接近或者甚至超过了CMV启动子。

大脑中所述嵌合启动子CMVIE-PDGF的神经元-特异性

我们随后对CMVIE-PDGF启动子是否能够保持PDGF-β启动子的神经元特异性进行了研究。从接受了纹状体或海马注射pCMVIE-PDGF-luc和pCMVluc的大鼠制备切片，用抗荧光素酶和神经元标记物NeuN的抗体共-染色。海马中，CMVIE-PDGF-luc和CMV的表达模式差别很大。表达CMVIE-PDGF-luc的细胞主要位于颗粒状(granular)神经元细胞层。用NeuN标记物对CMVIE-PDGF-luc着染细胞进行免疫组织化学共定位，结果表明这些细胞中的大部分是神经元细胞(图3)。细胞计数表明海马中89％的含荧光素酶的细胞还含有NeuN(表1)。相反，CMV-luc表达细胞呈扩散的解剖学分布漫出了神经元细胞层，对应于神经元、星形细胞和胶质细胞。定量分析表明只有50％的荧光素酶染色细胞是神经元(表1)。纹状体中，CMV-luc着染细胞呈扩散分布，而CMVIE-PDGF-luc则只限于神经元(图4)，与海马中观察得到的结果一样。细胞计数表明：对于CMVIE-PDGF-Luc来说，表达luc的神经元所占比例为91％，显著高于CMV-Luc(48％)(表1)。

使用CMVIE-PDGF嵌合启动子提高体内基因表达

在注射入大鼠纹状体后，对CMVIE-PDGF、PDGF-β和CMVIE增强子启动子在诱导荧光素酶表达方面的效力进行了比较。从每一大鼠大脑采集组织样本用于荧光素酶试验。每一质粒表达的荧光素酶活性水平见图5。早在注射后24时所有四种质粒构建体中都已检测到了荧光素酶的表达。CMVIE-PDGF-luc的表达在5天中一直增加，然后保持稳定直至第14天。在注射后1天时CMVIE和PDGF-的表达水平很低，3天后变得检测不到(数据未显示)，表明这两种启动子的活性很弱。与体外试验观察到的结果类似，在体内，与CMVIE和PDGF-β启动子相比，CMVIE-PDGF的活性也升高。

通过ZAI病毒载体范围内的嵌合的启动子CMVIE-PDGF提高基因表达

上述试验使用质粒DNA载体。为了检验插入病毒载体后CMVIE增强子-PDGF-β启动子构成的嵌合启动子是否还能提高基因表达，我们制备了含有所述嵌合启动子的重组杆状病毒和腺联病毒，然后在大鼠原代皮质神经元的细胞培养物中和大鼠大脑中对其进行了检验。如图6A所示，与PDGF-β启动子相比，CMVIE增强子-PDGF-β启动子显著提高了基因表达，比用AAV载体时提高了19倍，比用杆状病毒载体时提高了15-倍。这种提高比单用PDGF-β启动子和CMVIE增强子简单相加的表达以及使用CMV启动子的表达要显著的多。在注射入大鼠纹状体之后，AAV载体中的CMVIE增强子-PDGF--β启动子驱动了比PDGF-β和CMV启动子更高水平的体内基因表达，增加了5倍(图6B)。

                        序列表

<110>Wang，Shu

     Liu，Beihui

     Wang，Xu

<120>一种启动子构建体及其在神经元基因转移中的用途

<130>93231-2

<160>11

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>1

attcggtacc cctgggtcga cattga                                         26

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>2

caacgagctc accatggtaa tagcgatg                                       28

<210>3

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>3

attaggtacc cgatgtacgg gccagatata cg                                  32

<210>4

<211>32

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>4

taataagctt actagtggat ccgagctcgg ta                                  32

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>5

aattgagctc ctagaggatc cacagtct                                       28

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>6

cagcaagctt ttcagttcct cgactctag                                      29

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>7

attgctcaac agtatgggca                                                20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>8

cgaagaagga gaatagggtt g                                              21

<210>9

<211>387

<212>DNA

<213>巨细胞病毒

<220>

<221>misc_feature

<223>巨细胞病毒立即早期增强子

<400>9

cctgggtcga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaatacggg gtcattagtt     60

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga    120

ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca    180

atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca    240

gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg    300

ccccctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tctacttggc agtacatcta    360

cgtattagtc atcgctatta ccatggt                                        387

<210>10

<211>1488

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>misc_feature

<223>人血小板-衍生的生长因子Beta-链启动子

<400>10

ctagaggatc cacagtctcc tgagtagctg ggactacagg agcttgttac cacacccagc     60

tccagtttat aaattcatct ccagtttata aaggaggaaa ccgaggtact gagaggttaa    120

aaaaccttcc tgcagacact tgtccagcaa gtggccactc caggatttgg accaaggtga    180

tgtgtcttca ggctgtgtct ctgccactgt gccacgctgc tgggtggtag gcagcagtgg    240

gtgggtgcct gcagtggtct gtaaagacca cctgagatgt ccttcctcct ctgttccacc    300

ctgtccaggt ccaagaagac agtctatgaa gagagagcag gtgtgactct ctcagtgtgc    360

tcctctgtga gaagcaggct gacatcccaa agggaagggc ggataacaga gacagtgcaa    420

gcggaggaga tgagggtgcc tcaaagccgg gaggctgggt gatgcaggag cctgcgtgtc    480

ccgagggggg tgctgggccc agtgtgagta cgtgtgactg tgactgagac agtgtgactg    540

ctgaaggcag ggacacagca gctccctgac tgggggcaga aggcgttaac tgtgtgaagg    600

ctggttgtgg gtgggtgggc tctgggcctc gaacccgggg gctgagggag atagtaaaca    660

gcagggtgac tgacgggaag atcatgttgg tagccctgcg aagatgctgc agggctgtgg     720

gggtttgtgt gactttgcag ttcaacaaat tcaaattcag ccaacgctgg cagggcctgt     780

tgtgccaggc aaccagctag gaggaggaga ctcggaccca gcttgcagct gaagggcgct     840

ggctgccggg ttctgtgggt tcaccttgcg gtgtcttccc ttgctaacac tgagtcctta     900

caatagcccc atctccaggt tgaggctaga tggaggggac agagggaagt gacttgccca     960

aggtgaccca agctcccgag tgccagggca ggatctgaat tcaggctctc agactgcaga    1020

gcctgagtcc ctccctgcca tgcctgtgcc agggtggaaa tgtctggtcc tggaggggag    1080

cgtggactcc tggccttggc tctggagaca tccccctaga ccacgtgggc tcctaacctg    1140

tccatggtca ctgtgctgag gggcgggacg gtgggtcacc cctagttctt ttttccccag    1200

ggccagattc atggactgaa gggttgctcg gctctcagag accccctaag cgccccgccc    1260

tggccccaag ccctccccca gctcccgcgt cccccccctc ctggcgctga ctccgggcca    1320

gaagaggaaa ggctgtctcc acccacctct cgcactctcc cttctccttt ataaaggccg    1380

gaacagctga aagggtggca acttctcctc ctgcagccgg gagcggcctg cctgcctccc    1440

tgcgcacccg cagcctcccc cgctgcctcc ctagagtcga ggaactaa                 1488

<210>11

<211>1881

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>CMVIE-PDGF-Beta嵌合启动子

<400>11

cctgggtcga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa tcaatacggg gtcattagtt     60

catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga    120

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gtacgtgtga ctgtgactga gacagtgtga ctgctgaagg cagggacaca gcagctccct     960

gactgggggc agaaggcgtt aactgtgtga aggctggttg tgggtgggtg ggctctgggc    1020

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agatggaggg gacagaggga agtgacttgc ccaaggtgac ccaagctccc gagtgccagg    1380

gcaggatctg aattcaggct ctcagactgc agagcctgag tccctccctg ccatgcctgt    1440

gccagggtgg aaatgtctgg tcctggaggg gagcgtggac tcctggcctt ggctctggag    1500

acatccccct agaccacgtg ggctcctaac ctgtccatgg tcactgtgct gaggggcggg    1560

acggtgggtc acccctagtt cttttttccc cagggccaga ttcatggact gaagggttgc    1620

tcggctctca gagaccccct aagcgccccg ccctggcccc aagccctccc ccagctcccg    1680

cgtccccccc ctcctggcgc tgactccggg ccagaagagg aaaggctgtc tccacccacc    1740

tctcgcactc tcccttctcc tttataaagg ccggaacagc tgaaagggtg gcaacttctc    1800

ctcctgcagc cgggagcggc ctgcctgcct ccctgcgcac ccgcagcctc ccccgctgcc    1860

tccctagagt cgaggaacta a                                              1881

Claims (43)

1.一种重组核酸分子，其中含有一种可操作地连接于一种异源增强子的神经元细胞特异性启动子，其中所述增强子能够提高所述启动子的神经元细胞特异性转录活性。

2.权利要求1所述的核酸分子，其中所述增强子是一种病毒增强子或启动子。

3.权利要求2所述的核酸分子，其中所述增强子是RSV启动子、SV40启动子或者CMV增强子或启动子。

4.权利要求3所述的核酸分子，其中所述启动子是PDGFβ启动子。

5.权利要求4所述的核酸分子，其中所述增强子是CMVIE增强子。

6.权利要求5所述的核酸分子，其中所述增强子包含SEQ ID NO.9所示序列。

7.权利要求1-6中任一项所述的核酸分子，其中所述启动子包含SEQ ID NO.10所示序列。

8.上述权利要求中任一项所述的核酸分子，其中所述启动子可操作地连接于所述增强子的下游。

9.权利要求8所述的核酸分子，其中含有SEQ ID NO.11所示的序列。

10.权利要求9所述的核酸分子，其中进一步还含有可操作地连接于所述启动子的编码序列。

11.权利要求10所述的核酸分子，其中所述编码序列是一种治疗性基因序列。

12.一种表达载体，其中含有权利要求10所述的核酸分子。

13.权利要求12所述的载体，其中所述的载体是一种质粒。

14.权利要求12所述的载体其中所述的载体是一种病毒或者病毒-衍生物。

15.权利要求14所述的载体，其中所述的载体是一种杆状病毒或者腺联病毒。

16.一种在神经元细胞中表达基因的方法，其中包括用权利要求12所述表达载体转化神经元细胞。

17.一种治疗受试者神经元性疾病的方法，其中包括向所述受试者施用一种含有权利要求11所述重组核酸分子的表达载体。

18.权利要求17所述的方法该方法进一步还包括将所述表达载体与一种聚合物的基因载体混合的步骤。

19.权利要求18所述的方法，其中所述聚合物的载体是一种阳离子聚合物或者脂类。

20.权利要求19所述的方法，其中所述载体是聚乙烯亚胺。

21.权利要求20所述的方法，其中通过将表达载体直接注射入中枢神经系统或脑脊髓液的方式，施用所述表达载体。

22.权利要求20所述的方法，其中所述表达载体通过立体定位的微注射施用至中枢神经系统。

23.权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述的神经元性疾病是中风、局部缺血、癫痫、头和脊髓外伤、帕金森氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化，或者神经系统遗传性疾病。

24.一种转基因细胞或者非-人动物其中包含权利要求9-11中任一项所述的重组核酸分子。

25.一种提高神经元特异性启动子转录活性的方法，其中包括在神经元特异性启动子上可操作地连接一种异源增强子。

26.权利要求25所述的方法，其中所述增强子可操作地连接于所述启动子的上游。

27.权利要求26所述的方法，其中所述增强子是RSV启动子、SV40启动子或者CMV增强子或启动子。

28.权利要求27所述的方法，其中所述神经元细胞特异性启动子是人PDGF-β启动子。

29.权利要求28所述的方法，其中所述增强子是人CMVIE。

30.一种试剂盒，其中含有一种神经元细胞或细胞-系，上述权利要求中任一项所述的表达载体，以及用于指导稳定转化所述细胞-系和表达重组基因产物的说明书。

31.权利要求11所述重组分子在制备用于治疗受试者神经元性疾病的药物中的用途。

32.权利要求31所述的用途，其中所述的神经元性疾病是中风、局部缺血、癫痫、头和脊髓外伤、帕金森氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化，或者神经系统遗传性疾病。

33.权利要求12所述表达载体在制备用于治疗受试者神经元性疾病的药物中的用途。

34.权利要求33所述的用途，其中所述的表达载体与一种聚合物的基因载体混合在一起。

35.权利要求34所述的用途，其中所述聚合物的基因载体是一种阳离子聚合物或者脂类。

36.权利要求35所述的用途，其中所述载体是聚乙烯亚胺。

37.权利要求30-36中任一项所述的用途，其中通过将表达载体直接注射入中枢神经系统或脑脊髓液的方式，施用所述表达载体。

38.权利要求37所述的用途，其中所述施用是通过立体定位微注射完成的。

39.权利要求33-38中任一项所述的在治疗神经元性疾病中的用途，其中所述的疾病是中风、局部缺血、癫痫、头和脊髓外伤、帕金森氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化，或者神经系统遗传性疾病。

40.一种通过下述方法表达于神经元细胞或细胞-系的重组蛋白质：用权利要求12所述载体转化所述细胞或细胞-系，然后使得经转化的细胞或细胞系表达所述重组蛋白质。

41.权利要求40所述重组蛋白在制备用于治疗受试者神经疾病的药物中的用途。

42.权利要求41所述的用途，其中所述的疾病是中风、局部缺血、癫痫、头和脊髓外伤、帕金森氏病、亨廷顿病、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性侧索硬化，或者神经系统遗传性疾病。

43.一种用于提高神经元细胞或细胞-系中转录活性的系统，该系统包括一种可操作地连接于一种异源增强子的下游的神经元细胞-特异性启动子，基本如本申请所述。

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