CN103160501A - 基因表达盒及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因表达盒，其包括依次连接的神经元特异性启动子、目的基因、γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列以及终止子。该基因表达盒目的基因的末端添加有γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列，由于γ-氨基丁酸能神经元中含有其特异性的miRNA，该miRNA会导致基因表达盒在γ-氨基丁酸能神经元中沉默，目的基因不能表达，而五羟色胺能神经元中则不含有该miRNA，不会受基因沉默的影响，可正常表达目的基因，特异性强。同时，采用整个神经元的特异性启动子，在神经元中启动目的基因的表达效率高。利用上述基因表达盒构建的重组表达载体或者基因表达盒本身可广泛应用在五羟色胺能神经元相关的神经环路研究领域。

Description

基因表达盒及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种基因表达盒及其构建方法和应用。 
背景技术
利用细胞特异性启动子或增强子来实现外源基因的选择性表达已广泛应用在基因治疗和光遗传学等生物工程领域。但传统技术也存在诸多缺点，如下： 
1).载体容量限制 
应用于神经科学研究的转基因载体主要是重组腺相关病毒和重组慢病毒。腺相关病毒允许携带的最大外源基因约5000个碱基对，慢病毒载体允许携带的最大外源基因约7000个碱基对。由于一些特异性启动子的序列过大，加上目的基因的长度超过了目前转基因载体的最大容量，从而限制了该技术的应用。 
2).转录活性限制 
某些启动子虽然细胞选择性好，但是转录活性低，不足以驱动外源基因的有效表达。 
3).某些细胞类型没有特异性启动子 
某些细胞类型没有适合的特异性启动子，不能利用该技术实现外源基因的选择性表达。 
五羟色胺能神经元主要位于低位脑干近中线区的中缝核内，与人体很多生理病理活动密切相关，在脑内可参与多种生理功能及病理状态的调节，如睡眠、摄食、体温、精神情感性疾病的调节。 
研究发现五羟色胺能神经元特异性启动子TPH2（Tryptophan hydroxylase-2，色氨酸羟化酶-2）的活性很弱，不足以驱动外源基因的有效表达，因此传统的常利用GAL4-p65系统放大了TPH2启动子的转录，然而该系统序列过长，受载体容量限制，无法再插入新的外源基因。 
因此，传统的五羟色胺能神经元特异性的基因表达盒普遍存在特异性差、 表达效率低的问题。 
发明内容
基于此，有必要提供一种特异性强、表达效率高的基因表达盒及其制备方法和应用。 
一种基因表达盒，包括依次连接的神经元特异性启动子、目的基因、γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列以及终止子。 
在其中一个实施例中，所述神经元特异性启动子的序列为序列表中SEQ IDNO.1的序列。 
在其中一个实施例中，所述目的基因为光敏感蛋白基因、细胞因子基因、自杀基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种。 
在其中一个实施例中，所述γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列。 
在其中一个实施例中，所述终止子的序列为序列表中SEQ ID NO.3的序列。 
一种含有上述基因表达盒的重组表达载体。 
在其中一个实施例中，所述重组表达载体是质粒或病毒载体。 
在其中一个实施例中，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。 
上述基因表达盒在研究五羟色胺能神经元相关的神经环路中的应用。 
一种基因表达盒的构建方法，包括如下步骤： 
合成miRNA448的靶序列，并在所述靶序列的两端分别连接上Bgl II和EcoR I基因序列，然后将合成好的含有Bgl II和EcoR I基因序列的所述靶序列连接到pCMV-MCS载体上，经酶切鉴定得到pCMV-MCS-靶序列的基因序列，其中，所述miRNA448的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列； 
使用Not I酶切所述pCMV-MCS-靶序列的基因序列，并使用Kpn I酶切构建好的SYN-ChR2-YFP基因序列，分别对两种酶切产物进行纯化并将两种酶切产物的末端补平，再使用EcoR I酶切酶分别对两种补平的酶切产物进行酶切，回收并纯化酶切产物； 
连接上步骤得到的两种酶切产物，并在靶序列的末端加上终止子，得到结构为SYN-ChR2-YFP-靶序列-终止子的基因表达盒。 
上述基因表达盒利用神经元特异性启动子启动目的基因的表达，而目的基因的末端添加有γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列，从而当将该基因表达盒导入中缝核神经细胞中时，由于γ-氨基丁酸能神经元中含有其特异性的miRNA，该miRNA会导致基因表达盒在γ-氨基丁酸能神经元中沉默，目的基因不能表达，而五羟色胺能神经元中则不含有该miRNA，不会受基因沉默的影响，可正常表达目的基因，从而该基因表达盒的特异性强。同时，有启动子序列采用整个神经元的特异性启动子，在神经元中启动目的基因的表达效率高。 
利用上述基因表达盒构建的重组表达载体或者基因表达盒本身可广泛应用在五羟色胺能神经元相关的神经环路研究领域，具有特异性强和表达效率高的特点。 
附图说明
图1为一实施方式的基因表达盒的结构示意图； 
图2为Not I限制性内切酶酶切pCMV-MCS-miR448靶序列-EcoR I载体的酶切结果图，其中，通道M1为DL2000DNA marker，通道1为pCMV-MCS-miR448靶序列-EcoR I载体酶切结果，通道M2为λ-Hind III消化产物； 
图3为Kpn I限制性内切酶酶切含有pLenti-SYN-ChR2-YFP-EcoR I的载体的酶切结果图，其中，通道M2为λ-Hind III消化产物，通道1为pLenti-SYN-ChR2-YFP-EcoR I酶切结果； 
图4为免疫组织化学鉴定含有pLenti-SYN-ChR2-YFP-miR448靶序列的慢病毒特异性靶向五羟色胺能神经元电镜扫描图，其中ChR2-YFP表示与黄色荧光蛋白偶联的光敏感离子通道蛋白的表达结果图，TPH-IR为色氨酸羟化酶-2的染色结果图，Overlay为前两幅图的重合图； 
图5为统计学分析含有pLenti-SYN-ChR2-YFP-miR448靶序列的慢病毒特异性靶向五羟色胺能神经元结果图，其中，纵坐标表示细胞的比例，横坐标比例1表示黄色荧光蛋白偶联的光敏感离子通道蛋白阳性的细胞中色氨酸羟化酶-2染 色阳性的细胞所占的比例，横坐标的比例2表示色氨酸羟化酶-2染色阳性的细胞中黄色荧光蛋白偶联的光敏感离子通道蛋白阳性的细胞所占的比例；统计的细胞总数约420个。 
具体实施方式
下面主要结合附图及具体实施例对基因表达盒及其构建方法和应用作进一步详细的说明。 
如图1所示，一实施方式的基因表达盒，包括依次连接的神经元特异性启动子、目的基因、γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列以及终止子。 
在本实施方式中，神经元特异性启动子为synapsin（简称SYN），其序列为序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列。SYN启动子是一种强启动子，在中缝核的五羟色胺能神经元和γ-氨基丁酸能神经元中均广泛存在，表达效率非常高。 
目的基因可以为光敏感蛋白基因、细胞因子基因、自杀基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种。如目的基因是光敏感通道蛋白基因(channelrhodopsin-2，ChR2)。进一步，为检测方便，可以在目的基因的末端加上荧光蛋白基因，如黄色荧光蛋白（yellow fluorescent protein，YFP）基因等。 
γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA为miRNA448（简称miR448）。γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列编码的RNA能与miRNA448特异性结合，从而使编码的RNA沉默。在本实施方式中，γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列。 
终止子的序列为SV40poly A终止子，其序列为序列表中SEQ ID NO.3的序列。 
此外，本实施方式还提供了一种基因表达盒的构建方法，包括如下步骤： 
步骤S1，合成miRNA448的靶序列，并在靶序列的两端分别连接上Bgl II和EcoR I两种限制性内切酶的基因序列，然后将合成好的含有Bgl II和EcoR I基因序列的靶序列连接到pCMV-MCS载体上，经酶切鉴定得到pCMV-MCS-靶序列的基因序列，其中，miRNA448的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列。 
步骤S2，使用Not I酶切pCMV-MCS-靶序列的基因序列，并使用Kpn I酶 切构建好的SYN-ChR2-YFP基因序列，分别对两种酶切产物进行纯化并将两种酶切产物的末端补平，再使用EcoR I酶切酶分别对两种补平的酶切产物进行酶切，回收并纯化酶切产物。 
步骤S3，连接上步骤得到的两种酶切产物，并在靶序列的末端加上终止子，得到结构为SYN-ChR2-YFP-靶序列-终止子的基因表达盒。 
该基因表达盒利用神经元特异性启动子启动目的基因的表达，而目的基因的末端添加有γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列，从而当将该基因表达盒导入中缝核神经细胞中时，由于γ-氨基丁酸能神经元中含有其特异性的miRNA，该miRNA会导致基因表达盒在γ-氨基丁酸能神经元中沉默，目的基因不能表达，而五羟色胺能神经元中则不含有该miRNA，不会受基因沉默的影响，可正常表达目的基因，从而该基因表达盒的特异性强。同时，有启动子序列采用整个神经元的特异性启动子，在神经元中启动目的基因的表达效率高。 
利用上述基因表达盒构建的重组表达载体或者基因表达盒本身可广泛应用在五羟色胺能神经元相关的神经环路研究领域，具有特异性强和表达效率高的特点。 
以下为具体实施例部分： 
一、实验材料： 
1.质粒和菌株 
pCMV-MCS购自Cell BioLab公司； 
pLenti-SYN-ChR2-YFP来源于斯坦福大学生物工程和精神病学James H.Clark中心； 
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5a购自takara公司； 
含pLenti-SYN-ChR2-YFP-miR448靶序列-终止子的载体构建在Takara公司构建。 
2.分子克隆主要相关试剂 
限制性内切酶Not I、EcoR I、Bgl II、Kpn I、Blunting Kination Enzyme Mix及连接酶solution I，购自takara公司； 
质粒提取试剂盒，购自Qiagen公司。 
3.细胞株及实验动物 
人胚胎肾细胞，HEK293FT来自于美国Invitrogen公司； 
C57小鼠，购自于广东省医学实验动物中心。 
4.慢病毒包装所需试剂 
DMEM，来源于GIBCO公司； 
胎牛血清（FBS），来源于GIBCO公司； 
胰酶，来源于GIBCO公司； 
磷酸盐缓冲液（PBS）来源于Hyclone公司； 
转染试剂为FuGENE HD transfection reagent； 
细胞培养皿及移液管，购自Corning公司。 
5.免疫组织化学所需抗体均购自Abcam公司。 
二、实验步骤： 
1.构建含有pLenti-SYN-ChR2-YFP-miR448靶序列-终止子的载体： 
（1）首先合成miR448靶序列的DNA片段，片段两端带有Bgl II和EcoR I限制性内切酶片段，DNA片段的合成由Takara公司完成，将合成好的DNA片段按照表1体系连接到pCMV-MCS载体上，酶切鉴定确定阳性克隆。 
表1  连接反应体系 
Figure DEST_PATH_GDA00003052430400061
转化，挑取单克隆，提取质粒，测序确认阳性克隆，得到含有pCMV-MCS-miR448靶序列的载体。 
（2）按照表2体系使用NotI酶切上步构建好的含pCMV-MCS-miR448靶序列的载体，同时按照表3条件使用Kpn I酶切pLenti-SYN-ChR2-YFP载体。 
表2  pCMV-MCS-miR448靶序列的酶切反应体系 
Figure BDA00002658216500062
表3  pLenti-SYN-ChR2-YFP载体的酶切反应体系: 
Figure 417095DEST_PATH_GDA00003052430400072
使用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807A)对上述两种酶切产物进行纯化，酶切结果如图2所示。 
（3）将上述两种酶切产物按照表4体系将末端补平，然后在按照表5体系进行EcoR I酶切，酶切结果如图3所示，回收并纯化酶切产物。 
表4  末端平滑化反应体系 
Figure BDA00002658216500073
表5  酶切反应体系 
Figure DEST_PATH_GDA00003052430400074
Figure DEST_PATH_GDA00003052430400081
连接、转化挑取单克隆，提取质粒测序确定阳性克隆，得到含有pLenti-SYN-ChR2-YFP-miR448靶序列-终止子的载体。 
2.将上述构建好的载体包装成病毒颗粒 
(1)传293FT细胞于4个175cm2的细胞瓶中，细胞密度控制在约20-24h后细胞汇合度可以达到80%以上。 
（2）转染：将构建好的88ug含pLenti-SYN-ChR2-YFP-miR448靶序列-终止子的载体、60ug pdelta质粒、28ug pCMV-VSVG质粒溶解在6ml的无血清DMEM中，混匀后，加入400ul的转染试剂FugeneHD transfection reagent，混匀，室温静置40min，然后平均加到四个细胞瓶中。然后将培养瓶放回细胞培养箱。 
（3）病毒收集及纯化：以1000rpm离心5min收集上清液，然后用0.45um滤膜过滤，滤液转移到超离管中，配平后在4℃以25000rpm超速离心2h。 
(4)取出超离管，去掉上清，加预冷PBS溶解沉淀，-80℃保存。 
3.脑立体定位注射慢病毒至C57小鼠大脑中缝核。 
4.待病毒表达后，切脑片，进行免疫组织化学染色，如图4所示，确定病毒靶向效率。 
如图5所示，根据免疫组织化学染色与统计分析，病毒有效靶向五羟色胺能神经元达到90%以上，证实了该表达盒载体的对五羟色胺能神经元细胞特异性。 
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 
Figure IDA00002658217400011
Figure IDA00002658217400021

Claims (10)

1.一种基因表达盒，其特征在于，包括依次连接的神经元特异性启动子、目的基因、γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列以及终止子。
2.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述神经元特异性启动子的序列为序列表中SEQ ID NO.1的序列。
3.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述目的基因为光敏感蛋白基因、细胞因子基因、自杀基因、离子通道基因、受体基因及细胞凋亡基因中的至少一种。
4.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述γ-氨基丁酸能神经元特异性miRNA的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列。
5.如权利要求1所述的基因表达盒，其特征在于，所述终止子的序列为序列表中SEQ ID NO.3的序列。
6.一种含有权利要求1-5中任一项所述的基因表达盒的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体是质粒或病毒载体。
8.如权利要求7所述的重组表达载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体。
9.如权利要求1-5中任一项所述的基因表达盒在研究五羟色胺能神经元相关的神经环路中的应用。
10.一种基因表达盒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成miRNA448的靶序列，并在所述靶序列的两端分别连接上Bgl II和EcoR I基因序列，然后将合成好的含有Bgl II和EcoR I基因序列的所述靶序列连接到pCMV-MCS载体上，经酶切鉴定得到pCMV-MCS-靶序列的基因序列，其中，所述miRNA448的靶序列为序列表中SEQ ID NO.2的序列；
使用Not I酶切所述pCMV-MCS-靶序列的基因序列，并使用Kpn I酶切构建好的SYN-ChR2-YFP基因序列，分别对两种酶切产物进行纯化并将两种酶切产物的末端补平，再使用EcoR I酶切酶分别对两种补平的酶切产物进行酶切，回收并纯化酶切产物；
连接上步骤得到的两种酶切产物，并在靶序列的末端加上终止子，得到结构为SYN-ChR2-YFP-靶序列-终止子的基因表达盒。
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