CN101624592A - 牛基因组假attP位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个新的牛基因组中链霉菌噬菌体ΦC31整合酶可识别的假attP位点，本发明还提供一种利用该假attP位点的旁侧序列构建的定向整合载体及其构建方法。本发明首先从牛基因组中分离了一个能被高频率整合并高效表达外源基因的假attP位点，该位点位于牛4号染色体。在此基础上，构建含有该假attP位点旁侧序列的特异定向整合载体，使外源基因以90％以上的概率整合于该假attP位点上，并且外源目的基因也能获得高效表达。

Description

牛基因组假attP位点及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于牛基因组中能被链霉菌噬菌体ΦC31整合酶识别的假attP位点及其应用。

背景技术

哺乳动物细胞中导入外源基因的方法有很多种，物理方法主要有：受精卵原核显微注射法、电穿孔法；化学方法主要有：磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体介导法及生物学的病毒介导方法等等，但所有的外源基因导入方法均涉及到外源基因的随机整合及表达的问题，外源基因整合位点的随机性将给目的基因及宿主细胞带来不可预知的后果：1、外源基因的随机整合可能会造成位置效应影响，导致目的基因表达水平的不稳定甚至不表达；2、对宿主细胞的基因组而言，外源基因的随机性插入可能激活或抑制某些内源基因，改变其原先正常有序的基因表达调控模式，致使细胞癌变甚至死亡。

位点特异性重组是自然界中实现遗传物质重组的另一种形式，指在噬菌体整合酶的作用下，噬菌体基因组与细菌基因组在约几十个特定的碱基之间发生的重组反应。人们利用这一特定的整合方式而实现外源基因在哺乳动物基因组中进行定点修饰。Cre酶及Flp酶是目前在哺乳动物基因组修饰中较为常用的两种酶。尽管存在着一些局限如外源基因在整合后还可能解离反应，即已整合的外源基因在重组酶的作用下从染色体上切除等，这两种酶广泛地被运用于基因组的精确修饰(Nagy A，Genesis.2000 Feb；26(2)：99-109)(Nagy A，Methods Mol Biol.2001；158：95-106)(Kolb A F，Cloning Stem Cells.2002；4(1)：65-80)。

一种来源于ΦC31链霉菌(Streptomyces)噬菌体的整合酶即ΦC31整合酶，由于它是以单向整合方式，重组过程无须其他辅助因子，而且整合率高的特点，所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合。在自然界中ΦC31整合酶介导噬菌体基因组中39bp的attP位点(attachment site in phage genome)与细菌基因组中34bp的attB位点(attachment site in bacteria genome)发生特异性整合，ΦC31整合酶分别切断attP位点及attB位点的核心序列，在链发生交换后，四条链的末端重新连接，这样噬菌体基因组被稳定整合入细菌基因组中，噬菌体基因组的左右两端分别是两个杂合的短序列：attL、attR(Thorpe HM，Proc Natl Acad Sci U S A.1998 May 12；95(10)：5505-10)(Groth AC，ProcNatl Acad Sci U S A.2000 May 23；97(11)：5995-6000)。因为与其他的重组酶如Cre酶及Flp酶不同，ΦC31整合酶介导的整合是单向性，它不会发生回复切除，即当attB、attP两序列发生特异性重组后，所产生的attL和attR不会被ΦC31整合酶识别而被再次介导重组(Thorpe HM，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.1998 May 12；95(10)：5505-10)(Groth AC，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2000 May 23；97(11)：5995-6000)，这样的整合显得有效、稳定。而且，ΦC31整合酶介导的重组过程中无需其他辅助因子，这些优点使ΦC31整合酶在生物工程上具有重要的利用价值，有研究发现，ΦC31整合酶在哺乳动物中能有效介导携带有attB序列的外源基因与哺乳动物基因组发生高效重组反应，实现位点特异性整合(Thyagarajan B，Mol.Cell Biol.2001 Jun；21(12)：3926-34)。事实上，ΦC31整合酶介导的重组反应，广泛地被运用于诸多领域，包括转基因动物制备、基因治疗、基因组修饰等(Nimmo D D，Mol.Biol.2006 Apr；15(2)：129-36)(Allen BG，Nat.Protoc.2006；1(3)：1248-57)(Bertoni C，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.2006 Jan 10；103(2)：419-24)(Bateman J R，Genetics.2006 Jun；173(2)：769-77)(Ehrhardt A，Mol Ther.2007 Jan；15(1)：146-56)。

当携带attB序列的质粒在ΦC31整合酶的介导下，在attB序列的核心位点断裂并与哺乳动物基因组的某些位点发生特异性重组时，其基因组上的整合位点被称为假attP位点(Thyagarajan B，Mol Cell Biol.2001 Jun；21(12)：3926-34)。假attP位点与噬菌体中的attP位点有着部分同源性，广泛存在于多种物种的动物基因组中，而且研究发现每种物种往往存在着多个假attP位点。人们分别从人、小鼠、大鼠、兔、果蝇基因组中检测到31、57、3、3、3个假attP位点(Thyagarajan B，Mol Cell Biol.2001 Jun；21(12)：3926-34)(ChalbergT W，Invest Ophthalmol Vis Sci.2005 Jun；46(6)：2140-6)(Keravala A，J Gene Med.2006 Aug；8(8)：1008-17)(Groth A C，Genetics.2004 Apr；166(4)：1775-82)。多假attP位点的现象使外源基因的整合变得非特异性。这对于利用该重组系统进行遗传操作带来一定的麻烦。然而，进一步的研究结果表明在诸多的假attP位点中其整合频率往往不是均等的，存在着若干优先整合位点(热点)。据报道，在小鼠基因组中发现了一个高频整合位点mpsL1，位于2号染色体上，处在编码序列以外。与已发现的其他的假attP位点相比，mpsL1位点被整合的频率明显最高，在所有的受试小鼠中均能检测到该位点(Olivares E C，Nat Biotechnol.2002 Nov；20(11)：1124-8)(Held P K，Mol Ther.2005 Mar；11(3)：399-408)。而且，更为重要的是整合入该位点的外源基因均能得到持续高效地表达(Olivares E C，Nat Biotechnol.2002 Nov；20(11)：1124-8)。在人基因组中人们同样也检测到了一个热点，命名为假attP位点A。体内实验的结果表明，外源基因在该位点的整合率高达40％，在该位点整合的外源基因可保持稳定、高水平地表达，而且所表达的蛋白功能正常(Thyagarajan B，Mol Cell Biol.2001 Jun；21(12)：3926-34)(Ortiz-Urda S，Nat Med.2002 Oct；8(10)：1166-70)。

最近，本申请的发明人通过研究证实ΦC31整合酶同样能介导attB序列与牛基因组中的某些特定序列发生位点特异性重组，并且首次在牛基因组中发现了两个假attP位点BpsF1、BpsM1(中国发明专利申请，申请号200510111476.3)，他们均不存在于编码区，其中，BpsF1位于28号染色体上，BpsM1位于19号染色体上(Ma Q W，Biochem BiophysRes Commun.2006 Jul 7；345(3)：984-8)。

发明内容

本申请的发明人在已有研究结果的基础上，继续对牛基因组中假attP位点进行检测，在牛耳皮肤成纤维细胞中又发现一个新的假attP位点，该位点能以较高频率地被整合，然后利用同源重组的机制，使目的基因能更高频率地整合于该位点，而且整合于该位点的目的基因能高效稳定地表达。

因此，本发明的首要目的在于提供一个新的牛基因组中链霉菌噬菌体ΦC31整合酶可识别的假attP位点。

本发明的第二个目的在于提供一种利用该假attP位点的旁侧序列构建的定向整合载体。

本发明的第三个目的在于提供一种所述定向整合载体的构建方法。

本发明的第四个目的在于提供一种所述的牛基因组假attP位点的应用。

本发明的假attP位点位于牛基因组的第4号染色体上，其核心序列具有如SEQ IDNO.1所示的DNA序列；含所述假attP位点的旁侧序列具有如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

本发明的定向整合牛基因组假attP位点的载体，包括目的基因，假attP位点旁侧序列，attB位点核心序列。

其中，所述目的基因包括绿色荧光蛋白、人第九凝血因子、人血清白蛋白、人转铁蛋白。

本发明的定向整合牛基因组假attP位点的载体的构建方法，包括以下步骤：

a、构建含目的基因和attB位点的质粒载体；

b、构建含假attP位点旁侧序列的质粒载体；

c、将步骤b所得载体中含假attP位点核心序列的片段替换为含attB位点核心序列的片段，回收含attB位点核心序列的假attP位点旁侧序列的片段；

d、将步骤c所回收的片段与含目的基因的载体连接。

本发明的牛基因组假attP位点的应用，用于在牛细胞中整合目的基因。所述的整合目的基因的步骤包括：将所述载体和含链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因的质粒按一定比例混合后转染牛细胞，然后筛选阳性克隆细胞株。

利用本发明的假attP位点构建定向整合载体，将该载体与表达ΦC31整合酶的质粒pCMV-INT共转染牛耳皮肤成纤维细胞(FC)，可将目的基因以较高的整合率整合于牛基因组中，并且目的基因能得到较高水平地表达。本发明大大提高了目的基因的定向整合率，极大地减少筛选工作，并且目的基因还能高效表达，使获得的转基因细胞能在较短时间内用于下游的生产，如作为转基因克隆牛的供体细胞，促进目的基因的定向整合技术在转基因牛制备中的进一步应用。

附图说明

图1是半巢式反向PCR一扩产物电泳图：泳道1-泳道6依次为退火温度51.4℃、53.2℃、55.7℃、57.1℃、59.6℃、61.2℃的PCR扩增产物；泳道7为空白对照(水)；泳道8为1Kb DNA Marker。

图2是半巢式反向PCR二扩产物电泳图：泳道1为1Kb DNA Marker，泳道2-6依次为退火温度50.4℃、52.2℃、54.7℃、56.1℃、58.6℃、60.2℃的PCR扩增产物。

图3是pEGFP-N1-P4B载体的构建过程流程图。

具体实施方式

发明人在研究中发现在牛基因组中有一个能在ΦC31整合酶介导下与目的基因高频率整合并高效表达的假attP位点(BF4)，通过对BF4的旁侧序列进行扩增，进而将该片段转入目的基因载体中attB序列两侧的方法，使目的基因高效定向整合于该位点，并能稳定高效表达。

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。需要指出的是，本实施例仅用于解释本发明而不是对本发明范围的限制。

本发明的实施例中所用到的含目的基因绿色荧光蛋白(EGFP)和attB位点的质粒pEGFP-N1-attB、以及含链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因的质粒pCMVInt的构建参考申请号为20051011476.3的中国发明专利申请。

以下实施例中，所使用的限制性内切酶购自TakaRa公司；培养基购自吉诺生物公司；抗体购自KPL公司。

实验所用的牛耳皮肤成纤维细胞(FC)取自上海医学遗传研究所松江科研基地的奶牛。

实施例1、细胞转染、筛选

转染的前一天，接种0.5-2×10⁵个牛耳皮肤成纤维细胞于25cm²细胞培养瓶中培养以保证在转染时候细胞的丰度达到90％-95％。

转染包括如下步骤：

(1)在EP管中加入2μg的pEGFP-N1-attB及6μg的pCMV-INT质粒DNA，用500μl无血清的D/F12培养基稀释DNA，并轻轻混匀，室温下静置5分钟。

(2)在另一个EP管中加入20μl LipofectamineTM 2000(invitrogen公司)，用500μl无血清的D/F12培养基稀释，室温下静置5分钟。

(3)将LipofectamineTM 2000稀释液和DNA的稀释液(总体积为1000μl)轻轻混匀并在室温下静置20分钟。

(4)将1ml的混合液加入待转染的细胞中，混匀，置37℃、5％CO₂条件下继续培养。

(5)4-6小时后，对细胞进行换液，换成含10％胎牛血清的完全培养基。

(6)转染24小时后将细胞以1∶10(或更高的稀释度)稀释度转移到12孔板中。

筛选：1-2天后，换成选择培养基(300ng/μl G418+10％胎牛血清+D/F12培养基)对细胞进行选择培养。选择培养持续2周之后，在显微镜下，可见到一个个独立的细胞克隆。

G418抗性细胞的扩增：对在紫外灯下能发出绿色荧光的细胞克隆进行挑取。吸去培养液，用无钙镁的PBS洗1-2遍，并于显微镜下，在细胞克隆处加10-20μl 0.25％的胰酶溶液，待细胞逐渐变圆时，用20μl的枪吸出，转移到12孔板中继续培养。

实施例2、牛基因组假attP位点的克隆

(1)牛耳皮肤成纤维细胞基因组DNA的提取：选取实施例1中GFP表达水平最高(绿色荧光最强)的细胞克隆，按常规方法抽提取牛耳皮肤成纤维细胞基因组DNA。

(2)反向PCR模板的制备：取步骤(1)的1μg牛耳皮肤成纤维细胞基因组DNA，用EcoRI、BanHI、BglII进行酶解。酶解体系：10×Buffer(K)，20μl；EcoRI，5.5μl；BanHI，5.5μl；BglII，6μl；DNA，18μl；ddH₂O，145μl。共200μl反应体积，37℃过夜。

分别对酶解产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，最后用20μl TE溶解后进行自连接，体系：10×Buffer，15μl；酶解产物，9μl；T4DNA ligase(TaKaRa)，6μl；ddH₂O，120μl，共150μl。16℃过夜。对连接产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解后即可作为模板DNA用于反向PCR。

(3)半巢式反向PCR(iPCR)：

设计正向引物attB-F1、attB-F2位于attB核心序列的上游，EGFP为反向引物，位于attB-F1、attB-F2上游。

EGFP：TCG TCC ATG CCG AGA GTG ATG C

attB-F1：CTA GTA CTT CTC GAG GTC G

attB-F2：ATG TAG GTC ACG GTC TCG

PCR反应体系：10×Buffer(Mg²plug)，2.5μl；dNTP mixture(各2.5mM)，4μl；引物EGFP(10μmol)，1μl；引物attB-Fl(10μmol)，1μl；模板DNA 1μl；LATaqE(TaKaRa)(5U/μl)，0.3μl；ddH₂O，15.2μl；共25μl。

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环；循环条件为：94℃ 45s，50-60℃ 45s，72℃ 5min，31个循环；最后72℃延伸10min。

将一扩PCR产物走电泳，电泳结果如图1所示。

取上述退火温度为57.1℃的产物1μl，用引物EGFP、attB-F2进行二扩，反应体系及扩增条件均同上，电泳结果如图2所示，其中1.8Kb处有条带。

实施例3、假attP位点旁侧序列的测定和分析

对假attP位点旁侧序列的分析，是通过将半巢式反向PCR扩增产物克隆进T载体后进行测序，然后将测序结果进行两次比对，第一次是与NCBI网站公布的牛基因组序列进行比对，第二次是与pEGFP-N1-attB载体序列进行比对。如果扩出的序列经两次比对之后，发现该序列含有一段pEGFP-N1-attB序列，并且在attB核心序列之后与pEGFP-N1-attB序列不一样，而是牛基因组的序列，则认为牛基因组中的该位点为假attP位点，具体测定和分析步骤如下：

将实施例2所得半巢式反向PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并对片段用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司)进行回收，操作步骤同说明书。

将回收片段与pMD19-T(TaKaRa)载体连接，体系：PCR片段，3μl；T载体，1μl；ligation mix(TaKaRa)，5μl；ddH₂O 1μl。共10μl。16℃过夜。

将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经质粒抽提，电泳检测后，将较大质粒的克隆送出测序。

在NCBI网站上，将测序的结果首先与公布的牛基因组的序列进行比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BtaBlast.html)，然后和pEGFP-N1-attB载体序列进行比对，结果发现，目的基因EGFP质粒载体中attB的核心序列发生断裂，表明目的基因与牛基因组发生了位点特异性重组，在该细胞克隆中目的基因整合于牛基因组的4号染色体上，将其命名为BF4假attP位点，该假attP位点核心的序列约39bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，与噬菌体attP位点的核心序列具有35％的同源性；包含该假attP核心位点的旁侧序列约4.7kb，其序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步对该位点进行分析，发现该假attP位点在Gli蛋白家族3(Hedgehog-Gli信号通路中的信号分子)基因的下游3’的UTR区，附近序列富含A-T碱基，与下游的一个功能未知的蛋白的基因相距17K多。

实施例4、pEGFP-N1-P4B载体的构建过程

从假attP位点两边旁侧序列扩增4.7kb的片段，经切除假attP的核心序列之后，连上attB(338bp)序列。将该片段与目的基因(绿色荧光蛋白，GFP)相连，构建携带有attB序列、BF4假attP位点的旁侧序列以及GFP基因的表达载体pEGFP-N1-P4B载体，具体构建过程见图3。

第一步，pcDNA3.1-(-)-neo-P1的构建

(1)、假attP旁侧序列的PCR扩增：

根据实施例3所得的位于牛4号染色体上的假attP位点的序列设计引物，用正常牛全基因组作为模板，对假attP位点BF4的旁侧序列进行扩增。上下游引物的5’分别加上MluI和NheI酶切位点。

引物1：NFIX-1L：TCA ACG CGT CAC CTG CGA AGG AGC TTA AC

引物2：NFIX-1R：TCA GCT AGC GTG CAG GAG GAG GAA GAC AG

PCR反应体系：10×Buffer，2.5μl；dNTP mixture(各2.5mM)，2μl；引物NFIX-1L(10μmol)，1μl；引物NFIX-1R(10μmol)1μl；牛基因组DNA2μl(300ng)；TaKaRa TaqE(5U/μl)0.2μl；ddH₂O 16.3μl；共25μl。

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环；循环条件为：94℃ 45s，57-67℃ 45s，72℃ 1m30s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物走0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并对4.7kb片段进行回收。

(2)将PCR的片段连入pMD19-T载体，连接体系：PCR片段，3μl；T载体，1μl；ligation mix(TaKaRa)，5μl；ddH₂O 1μl，共10μl，16℃过夜。

(3)连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，将阳性质粒命名为TP1。

(4)载体酶切：载体TP1及pcDNA3.1-(-)-neo(购自Invitrogen公司)分别用MluI和NheI双酶切。先进行NheI酶切，体系：载体，12μl；10×Buffer，10μl；NheI，2.5μl；ddH₂O，75.5μl。共100μl，37℃，2hr。乙醇沉淀，再用MluI酶切，体系：载体，0μl；10×Buffer，5μl；MluI，1.5μl；ddH2O，43.5μl。共50μl，37℃，2hr。酶切产物走0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并分别对载体TP1及pcDNA3.1-(-)-neo的4.7k左右的片段进行回收。

(5)将回收的片段进行连接，体系：TP1的回收片段，12μl(0.6μg)；pcDNA3.1-(-)-neo4μl(0.2μg)；10×Buffer，2μl；T4DNA ligase(TaKaRa)，1.5μl；ddH₂O 0.5μl。共10μl。16℃过夜。

(6)连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，经酶切鉴定后送出测序，将阳性质粒命名为pcDNA3.1-(-)-neo-P1。

第二步，pcDNA3.1-(-)-neo-P1B载体构建

(1)载体酶切：对pcDNA3.1-(-)-neo-P1用AgeI，PshAI双酶切，先进行AgeI酶切，体系：载体，90μl(15μg)；10×Buffer，15μl；AgeI(NEB)，3μl；ddH₂O，42μl。共150μl，37℃，2hr。乙醇沉淀，再用PshAI酶切，体系：10×Buffer，15μl；PshAI，3μl；载体DNA；ddH₂O，132μl。共150μl，37℃，2hr。同时对pEGFP-N1-attB进行AflII酶切，体系：载体，7μl(15μg)；10×Buffer，15μl；100×BSA，1.5μl；AflII(NEB)，3μl；ddH₂O，123.5μl。共150μl，37℃，2hr。分别对酶切产物进行乙醇沉淀。

(2)对酶切片段补平：体系：10×T4polBuffer，5μl；0.1％BSA，5μl；dNTP，5μl；酶切产物；ddH2O，33μl，总体积48μl。70℃水浴，5-10min；在37℃水浴中加入T4Pol酶，2μl，温浴5-10min；振荡，使酶失活。对pEGFP-N1-attB的AflII酶切产物走0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并回收338bp的片段。对pcDNA3.1-(-)-neo-P1的酶切产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后去磷酸化处理，体系：10×CIAPBuffer，5μl；碱性磷酸酶CIAP，2μl；乙醇沉淀酶切后的载体DNA；ddH2O，43μl。总体积50μl。37℃水浴，45min。之后走回收胶，对8633bp的片段进行回收。

(3)将回收的片段进行连接，体系：attB的回收片段，4μl(212ng)；pcDNA3.1-(-)-p1，2μl(112ng)；10×Buffer，1μl；T4DNA ligase(TaKaRa)，1μl；ddH₂O，2μl。共10μl。16℃过夜。

(4)连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，经PmacI酶切鉴定后送出测序，将阳性质粒命名为pcDNA3.1-(-)-neo-P1B。

第三步，pEGFP-N1-P4B载体的构建

(1)对pcDNA3.1-(-)-neo-P1B用MluI，载体TP1及pcDNA3.1-(-)-neo分别用MluI和NheI双酶切。先进行NheI酶切，体系：载体，20μl；10×Buffer，15μl；NheI，3μl；ddH₂O，120μl。共150μl，37℃，2hr。乙醇沉淀，再用MluI酶切，体系：10×Buffer，15μl；MluI，3μl；载体；ddH2O，132μl。共150μl，37℃，2hr。酶切产物进行乙醇沉淀；同时对pEGFP-N1-attB进行AflII酶切，体系：载体，7μl(15μg)；10×Buffer，15μl；100×BSA，1.5μl；AflII(NEB)，3μl；ddH₂O，123.5μl。共150μl，37℃，2hr。对酶切产物进行乙醇沉淀。

(2)对酶切片段补平，体系：10×T4polBuffer，5μl；0.1％BSA，5μl；dNTP，5μl；酶切产物；ddH₂O，33μl，总体积48μl。70℃水浴，5-10min；在37℃水浴中加入T4Pol酶，2μl，温浴5-10min；振荡，使酶失活。对pcDNA3.1-(-)-neo-P1B的酶切产物走0.8％的琼脂糖凝胶电泳，并回收4207bp的片段。对pEGFP-N1-attB的酶切产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后去磷酸化处理，体系：10×CIAPBuffer，5μl；碱性磷酸酶CIAP，2μl；乙醇沉淀酶切后的载体DNA；ddH₂O，43μl。总体积50μl。37℃水浴，45min。之后走回收胶，对4733bp的片段进行回收。

(3)将回收的片段进行连接，体系：10×Buffer，1μl；P1B的回收片段，2μl(88ng)；pEGFP-N1，4μl(88ng)；T4DNA ligase(TaKaRa)，1μl；ddH₂O，2μl。共10μl。16℃过夜。

(4)连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，经BanHI酶切鉴定后送出测序，将阳性质粒命名为pEGFP-N1-P4B。

容易理解，本领域的技术人员通过类似的分子生物学方法，利用载体中的多克隆位点可以将人第九凝血因子、人血清白蛋白、人转铁蛋白等目的基因构建到pEGFP-N1-P4B表达载体中，进一步构建表达目的基因的载体。

实施例5、目的基因在牛基因组假attP位点(BF4)处整合的检测

将载体pEGFP-N1-P4B与表达ΦC31整合酶的质粒pCMV-INT共转染牛耳皮肤成纤维细胞(FC)，经克隆筛选，检测整合位点，同时以不加旁侧序列载体作为对照，分析其整合率，具体步骤如下：

(1)按实施例1所述方法，将pEGFP-N1-P4B与pCMV-INT(质量比10∶1)共转染牛耳皮肤成纤维细胞，经G418筛选获得各细胞克隆。

(2)按常规方法抽提各细胞克隆基因组DNA。

(3)PCR检测：根据该假attP位点和载体上的attB序列设计引物：

5L：GCT GGA CGT GTA ACC CCT TA

5R：GGA TCA ACT ACC GCC ACC T

PCR反应体系：10×Buffer(Mg2plug)，2.5μl；dNTP mixture(各2.5mM)，2μl；引物5L(10μmol)，1μl；引物5R(10μmol)，1μl；模板DNA，1μl；LATaqE(TaKaRa)(5U/μl)，0.3μl；ddH2O，16.3μl。共25μl。

PCR反应条件：94℃预变性5min，进入循环；循环条件为：94℃ 45sec，65℃ 45sec，72℃ 30s，32个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增条带，302bp的条带为阳性，表明该细胞克隆中目的基因整合于BF4位点。

经检测发现转染GFP载体的细胞克隆中整合在BF4假attP位点的细胞克隆数占93％(55/59)，比不加旁侧序列载体的整合率(42/57，74％)提高19％。

实施例6、双夹心ELISA法测定目的基因(GFP)的表达水平

样品的制备：将实施例5中整合在假attP位点(BF4)的细胞用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天生物公司)抽提蛋白，作为待测样品进行检测，具体步骤如下：

1、将鼠抗GFP抗体用0.2M碳酸盐缓冲液(PH 9.6)1∶4000稀释，酶标板中每孔加入120μl上述稀释的抗体，37℃，2hr。倾去包被抗体，用含0.5％Tween20的PBS室温洗涤5次。

2、每孔加入150μl含2％BSA的PBS，4℃封闭过夜，倾去封闭液，洗涤4次。

3、酶标板上每孔依次加入100μl PBS(空白对照)、GFP浓度为100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ql、6.25ng/ml、3.13ng/ml、1.56ng/ml的标准品，以及待测的GFP样品。37℃温育2hr，倒去样品，洗涤5次。

4、每孔中均加入100μl用含2％BSA的PBS 1∶32000稀释的生物素标记的羊抗GFP抗体，37℃温育2hr。倒去一抗，洗涤5次。

5、每孔中均加入100μl用含2％BSA的PBS 1∶4000稀释的羊抗生物素HRP抗体(abcam公司，UK)，37℃温育2hr。倒去二抗，洗涤5次。

6、每孔中均加入100μl TMB显色，待标准品显色梯度明显后加入100μl 1M H₂SO₄，终止反应。

7、用酶标仪上测定每孔的OD值，读取数据。

经过计算，结果显示整合在BF4位点的GFP基因的表达水平可高达280μg/ml左右。结果表明目的基因依然能得到较高水平地表达，比整合于别的位点如位于10号染色体上的位点高四倍左右。

通过本发明的策略，大大提高了目的基因的定向整合率，极大地减少筛选工作，并且目的基因还能高效表达，使获得的转基因细胞能在较短时间内用于下游的生产。

序列表

<110>上海市儿童医院

<120>牛基因组假attP位点及其应用

<130>P5081034

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>39

<212>DNA

<213>Bos taurus

<220>

<221>gene

<222>(1)..(39)

<400>1

aaggactctg aaaaacccta aagtattcta gggagaaac                            39

<210>2

<211>4684

<212>DNA

<213>Bos taurus

<220>

<221>gene

<222>(1)..(4684)

<400>2

cacctgcgaa ggagcttaac tcatccaggg agttgttact gctttgttta agccagggaa     60

tccaccactg cagcctgcca cctgctcacc caccccctta cttcatcact ggcccttcga    120

cattgcaggg caggggtggg tcaccgtgac cagactggtc atggtttggt ttggtttggt    180

ttggtttcgg gccccagaac ctgtgttgtc atcccgaggt aaacccgtgt ctcccacgct    240

gtctctgcag gcacgcagcc cagtaccagc tgcagtctgg gcgggcccat gcccctcctc    300

ccgaacagaa gcgacctgtc tggggtggac atcaccatgt tgaacatgct caaccggagg     360

gacagcagca ccagcaccgt cagctccgcc tacctgagca gccgccgctc ctctggcatc     420

tcgccctgct tctccagccg ccggtccagc gaggcgtccc aggccgaggg gcgaccccag     480

aacgtgagcg tggccgactc ttacgacccc atctccaccg acgcctctcg caggtccagc     540

gaggccagcc agggcgacgg tctgcccagc ctgctcagcc tcactcccgc ccagcagtac     600

cgcctgaaag ccaagtacgc tgccgccacg ggcggccccc cgcccacccc gctgcccaac     660

atggagagga tgagcctcaa gacccggatg gccctgttgg gagatggcag ggagccggcg     720

gggaccctgc ctcccgtgca tcctcctcgg agatgcagcg acggcggggc ccacggttac     780

agccggcgcc cactgctgcc ccaggatgcg ctgggcaacg gcgtgagaag agccagcgac     840

ccggtgagga cggtttcgga gagcctctct ctgccccggg tacagcggtt caacagcctt     900

aacagcttca accctccggt gttgcctcca tccctggaaa agcgcaacct cgtgcttcag     960

aactacacgc ggcccgatgg gggccaggcc cgccacttcc actcctctcc ctgtcccccg    1020

agcatcactg agaatgtcac cctggagtcc ctgaccatgg acgccgacgt gagcctgaac    1080

gatgaggacc tcctgcctga tgacgtggtg cagtatttaa attcccagaa cccagccggg    1140

tatgagcagc acttcccagg caccttctct gatgacagca aagtgcccca tggcttaggg    1200

agtggacccg gggactttga cccactgggg ctgcccgaca gccacgccag ccacaccggc    1260

agccagcagt accgcagcct ggagcagccc tgccccgatg ccagtaaatc cgacctgccc    1320

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ggccagcggt ccatggggca gcaggcccgg gccttcgggt cgtacagcca catgggtgtt    1440

cacccacaga atccattgag gagtggggct ggcccagctg gggggtatcc gacccttggg    1500

gagcatgcca gctccttcgg gggcccggaa cacttagtga gccacggtgg cggagctggc    1560

accaatggga atgccttcca tgaaccaccc tataaggccc agcagtatgg gaactgcctc    1620

aacaggcagc ctggtgcccc caccttactc gatggggcct gtggccctgg gatccaggcg    1680

gcaaagctga aaagcatcac catgcaaggg agcgggagcc atctggattt tggcctgtcg    1740

gtggtgccga atgagtcaac cggcagcacg gtgaatggca tacccacccc agaccccaca    1800

ggacaggggt acctggctca gcagctcctc ggtgacagca cacacaccca gggggcaggc    1860

cgctccgggc agaacctgct ggggcaggct agtgctacct cacacatcta tcaagggccg    1920

gagagcagcc tgcccgggcc tcccagcatc agcgtgcagc cgccaaacgt ggcagccgtc    1980

aggggctacc agccatgtgt tggctacggg ggcagccggc gccaggctgg gccgaggggt    2040

ggtctcgctc tgcagccagg acagtttagt gacccgagtc agacctgcag ggtgaatggc    2100

atcaagatgg agatgccagg acagccccat cagctctgtt cgaatgtgca gagttactct    2160

ggtcagttct atgaccaaac tgttggcttc ggtcagcaag acatgaaaac tggttccttc    2220

tccatgtcag aagccaactg cctgctccag ggggccggcg ccgaaaactc tgaattactc    2280

tccccaggtg ctaaccaggt gacaagcaca gttgacagcc tcgacagcca tgacctggaa    2340

ggggtgcaga ttgatttcga cgctatcata gacgacgggg accacgccag cctgatgtca    2400

ggagccctga gcccaagcat tattcagaac ctttctcata gctcctcccg actcaccacg    2460

ccgcgagccg cccttccgtt cccgcctctg tctttgagca ccaccaacat ggcaatcggg    2520

gacatgagct ctctgctgac ctccctcgcg gaagaaagca aattccttgc ggttatgcag    2580

taagcattag gggaaaaaaa cgactgccaa gagacctgaa actttaggag tttaaaagat    2640

taaattgacc cttttttgtt tggctgagtt tttttagttc tgtatgtatt ttagcgatct    2700

catctcacct aactgggatg tgtttcaagt atattccttt tatggaaaag gactctgaaa    2760

aaccctaaag tattctaggg agaaactgtc ttccatttca gttttgaatc agtattgtta    2820

cactcaaaac atcctcttaa aaaaaaaaag aaaactgtaa gcctattcct ccctccccct    2880

tctttttttt agtaaaccgg tgtaaatggt gatgtgcgcg ttctttcttt tcagagagag    2940

ggcaagtgaa aggatttgac gtgtctctcc gttattccaa ggaactagga agttggtgtg    3000

cttgtgacta aggggttaca cgtccagcgt ttttccattt tcctttacat atgctcaatg    3060

tttgtttttg tgttttgttt cttttgtttt tgaattccca cactgggctc aggagtcgga    3120

agttggagag tgagtttggg aatctcttgt gggtgtactg tagccgaggt aacaggcttt    3180

tgagaagctc ccaacccccg ttcagtttgg ggaatgcttc agacagatac acacaagtgg    3240

aaattcaggg ctcctgtgca gaggagatac aactttgccc acagttgggg gttaaaatcc    3300

ttcctgtcca tacgtgtgct ggacaggaag gtgggcacat ctatatgtca gttctcagtt    3360

atcgaccctg cctcccctct ctgtctgtcc aggagtgttc agcgctgttc cagggggaga    3420

cagggaggag tgttgggcga cgcccacaca cactgttact tccatctgtt ctggtaagaa    3480

ggtagatatg ttatagatta aagctattgc atagaatttg ggaaatattt gtgggttggc    3540

atatgattag ttccatctct cgccccattt tcatagataa cagagtaact gagaattgat    3600

tatatctagt tttgagtata taggtactta atcccacagc tggctatgtt atcaacaata    3660

tattaattcc actatagcaa aagagtattt ctattctaag tgccctattt taggggactc    3720

atgaaatttg gttgtaaaag aaaagctcat agaccaagat atttggaata aattgcttca    3780

aacattttca gtatttaaaa actctaaggg cacagtttca tagctgtgtg gatacattct    3840

taacactcta ttacattatg cagccgttta agaagctaag tcttctatgc agtttgtcct    3900

taaggtggac ttaagctaga ctttcagatg aaaaggttta aagacttaaa aagtgcagct    3960

actccccatg tgtacagttg ctacacataa aagacatacc atgtgtgcac agggtatgtg    4020

gactatccag cattttacct ttaaaaagta tgtaaactat gaaaatacaa catcagcact    4080

gcagtcgaca tgttgtattc tgccccattc atcttggagt tagatttatc caaagtgatt    4140

catgagtccg ttatgtgttt tttctccttt ctgccattta aattagtagt agacaaaaat    4200

caaataaaag tatgagataa tggaatatta ggaccagctc atttttctca ggtttatgtt    4260

ctcttatttg gaccaagaat ctcacgtggg gtaaaattcc cctctgaatt ttagactttt    4320

gggactttag ctgagacagt tgggtttgct ttcaactaga tgaaagcaga ggggtattga    4380

ggtcctcccg ctgttcccca tgtgcagcac cttcttttaa atcaaaggaa gcatcccctt    4440

tggaacagag ccccaaatca aaagacaagc agtgatctga gctagtagag ttgagtctct    4500

atcactcttc agtggaaaaa tcgaggcctt ttctgtattc ttcaaacggg tcatgatctg    4560

gtcacagaat cggcagtcca attcgctgaa tctcgtctct aggtgaactc aaagtcccaa    4620

ggtcctggtc tgagctcgcc tgctcttgtg gcttaaccgc ctttctgtct tcctcctcct    4680

gcac                                                                 4684

Claims (10)

1、一个牛基因组中假attP位点，其特征在于，所述假attP位点位于牛基因组的第4号染色体上，其核心序列具有如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。

2、如权利要求1所述的牛基因组假attP位点，其特征在于，含所述假attP位点的旁侧序列具有如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。

3、一种定向整合牛基因组假attP位点的载体，其特征在于，所述载体包括目的基因，假attP位点旁侧序列，attB位点核心序列。

4、如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述目的基因包括绿色荧光蛋白、人第九凝血因子、人血清白蛋白、人转铁蛋白。

5、一种如权利要求3所述载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、构建含目的基因和attB位点的质粒载体；

b、构建含假attP位点旁侧序列的质粒载体；

c、将步骤b所得载体中含假attP位点核心序列的片段替换为含attB位点核心序列的片段，回收含attB位点核心序列的假attP位点旁侧序列的片段；

d、将步骤c所回收的片段与含目的基因的载体连接。

6、如权利要求1所述牛基因组假attP位点的应用，其特征在于，用于在牛细胞中整合目的基因。

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述在牛细胞中整合目的基因的步骤包括：将权利要求3所述载体和含链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因的质粒按一定比例混合后转染牛细胞，然后筛选阳性克隆细胞株。

8、如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤中权利要求3所述载体和含链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因的质粒的质量比为10∶1。

9、如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤采用脂质体介导的细胞转染法。

10、如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述牛细胞为牛耳皮肤成纤维细胞。

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