CN102399810A - 一种携带attB高效定向整合假attP位点的载体及其转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种携带attB序列高效率定向整合基因组假attP位点的载体以及一种高效率定向整合基因组假attP位点的转基因方法。在携带外源功能基因的载体中插入多个互相间隔的attB序列，和表达噬菌体φC31整合酶的载体共转染宿主细胞，可以实现attB与基因组中的假attP位点的高效整合及外源基因的表达。载体携带3个attB和2个attB的整合率分别为携带1个attB载体的2.8和2.2倍。比不含整合酶的随机整合则分别提高了14.5和12倍多。有利于整合酶系统在基因治疗和转基因动物领域的应用。

Description

一种携带attB高效定向整合假attP位点的载体及其转基因方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种携带attB序列高效定向整合基因组中假attP位点的载体及其转基因方法。

背景技术

科学家们发展了多种转基因技术，以提高转基因动物的生产效率。但目前在大动物中转基因的整合率和表达率均不甚理想。当前国际通用的转基因方法是显微注射法，成本较高而成功率很低。就转基因动物-乳腺生物反应器而言，其成功率仅3％左右。显微注射导致外源基因在染色体上随机整合，转基因的表达极大地受周围宿主基因组的影响。

因此，发展外源基因的高效定点整合技术，提高外源基因在转基因动物体内的表达水平，即建立安全、高效以及操作简单的转基因家畜制备技术是解决上述问题的关键。

最近，链霉菌噬菌体φC31整合酶(phiC31 integrase)开始成为基因修饰研究中的有力工具。Cre、FLP和β等重组酶在同一靶位点既整合又剪切，因此，它们介导的净整合率很低。与这些酶不同的是，链霉菌噬菌体φC31整合酶在其靶位点仅仅执行整合反应，而由其介导的剪切反应需要附加因子才能完成(参见Thorpe HM.，Smith MC.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95(10)：5505-10)；因此在没有附加因子存在的情况下，其净整合率较高。这使φC31整合酶成为一个有吸引力的位点特异整合的候选酶。

链霉菌噬菌体φC31整合酶所识别的att位点结构比较简单，attB和attP重叠区只有约3bp的相同序列(TTG)，侧翼是两个反向重复序列。通过将长短不同的attP位点和attB位点装入载体中，考察整合酶催化这两个位点同源重组的效率，最终确定出整合酶所识别的attP和attB最短序列分别为39bp和34bp，称为核心序列。其attP位点核心的39bp序列为ccccaactggggtaacctTTGagttctctcagttggggg，attB位点核心的34bp序列为gtgccagggcgtgcccTTGggctccccgggcgcg(参见Groth A.C.，Olivares E.C.，Thyagarajan B.and Calos M.P.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(2000)：5995-6000)。

除了attP位点外，链霉菌噬菌体φC31整合酶还可催化attB位点和一些基因组中某些位点的整合，这些位点的核心序列与噬菌体attP位点的核心序列有一定的同源性，具有类似的功能，因此称为“假attP位点”。现已证实链霉菌噬菌体φC31的整合酶在人类细胞、小鼠细胞、大鼠细胞和果蝇细胞中均能有效地介导外源DNA的位点特异性整合(参见Groth AC.，Olivares EC.，Thyagarajan B.，Calos MP.Proc Natl Acad Sci USA，97(2000)：5995-6000；Thyagarajan B.，Olivares EC.，Hollis RP.Ginsburg DS.Calos MP.Mol Cell Biol，21(2001)：3926-34；Chalberg，T.W.，Genise，H.L.，Vollrath，D.Calos，M.P.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.，46(2005)，2140-2146；Groth AC.，Fish M.，Nusse R.andCalos MP.Genetics，166(2004)：1775-1782)。这些整合主要发生在一些热点位点(或称为优选位点)，亦即基因组中所谓的“假attP位点”。

噬菌体整合酶催化含attB位点的DNA片段在这些位点的整合效率是随机整合的5-10倍。而且，有实验表明，在小鼠体内，φC31整合酶介导的凝血因子IX(FIX)基因以位点特异性方式整合后，其表达水平是以慢病毒载体介导的基因转移后表达水平的20倍(参见Olivares EC.，Hollis RP.，ChalbergTW.，Meuse L.，Kay MA.，Calos MP.Nat Biotechnol.20(2002)：1124-1128)。φC31整合酶以单向整合方式，重组过程无须其他辅助因子，而且整合率高等特点，所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合，用于基因治疗和转基因研究。

相对于Cre、FLP和β等重组酶，虽然φC31整合酶的整合过程不需添加附加因子也不会导致恢复剪切，但是φC31整合酶的效率不高，相对于随机整合仅提高2.1倍，因此φC31整合酶系统的应用受到了很大的制约。

为提高φC31整合酶系统的效率的和特异性整合，一些研究通过在整合酶中加入核定位信号，筛选突变整合酶提高了整合效率。还有一些研究与功能基因方向相反插入的attB，在整合酶的作用下提高了整合酶系统的效率。但是这些方法所得整合酶系统的效率还有待进一步提高。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对φC31整合酶效率不高的不足，提供一种携带attB序列高效定向整合基因组中假attP位点的载体及其转基因方法。

本发明的第一方面提供一种携带attB序列高效率定向整合基因组假attP位点的载体，该载体含有两个或者两个以上互相间隔的attB序列。

优选的，该载体含有两个或者三个attB序列。

优选的，该载体中相邻的两个attB序列之间的间隔是300bp以上的序列长度。

优选的，该载体中attB的方向是正向或者反向。

优选的，该载体的出发载体是质粒pEGFP-N1。

所述的attB的序列优选如SEQ ID NO：1所示。所述的attB也可以是attB核心序列，即如SEQ ID NO：1所示序列的第46位到第79位。

优选的，该载体是attB分别在载体pEGFP-attB-N1的EcoO109I位点、AseI位点和PciI位点中的一个或多个插入获得的。更优选携带2个attB的载体，pattBP-EGFP-attB-N1，pattBA-EGFP-attB-N1，pattBPA-EGFP-attB-N1及pattBE-EGFP-attB-N1，或者携带3个attB的载体，pattB-attB-EGFP-attB-N1。

本发明的第二方面提供一种利用噬菌体φC31整合酶系统转基因方法，包括将含有attB序列的携带外源基因的载体和表达φC31整合酶的载体共转染宿主细胞，其中所述的含有attB序列的携带外源基因的载体中含有的两个或两个以上互相间隔的attB序列。

所述的宿主细胞优选真核细胞，更优选人细胞、牛细胞或者羊细胞。

所述的表达φC31整合酶的载体与含有attB序列的携带外源基因的载体的转染比例优选1∶1～1∶50更优选1∶10。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明的积极进步效果在于，在φC31整合酶系统介导的定点整合中，通过在载体中增加间隔attB的数目，有效提高了整合酶系统的整合效率，实现外源基因的高效整合和表达。在整合酶作用下含2个和3个attB位点的pattB-EGFP-attB-N1和pattB-attB-EGFP-attB-N1比含有1个attB位点的pEGFP-attB-N1整合率分别提高了2.8和2.2倍，比不含整合酶的随机整合则分别提高了14.5和12倍多。本发明通过在载体中控制attB的数目来调节整合酶的效率，是一种省时省力的方法。本发明促进了整合酶系统在基因治疗和转基因动物领域的进一步应用。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是pattB-EGFP-attB-N1酶切鉴定电泳图：泳道M为1Kb DNAMarker；泳道1为质粒pattB-EGFP-attB-N1；泳道2为Eco0109I酶切pattB-EGFP-attB-N1。

图2是pattB-attB-EGFP-attB-N1酶切鉴定电泳图：泳道M为1Kb DNAMarker；泳道1为pattB-attB-EGFP-attB-N1；泳道2为AseI，PciI双酶切鉴定pattB-attB-EGFP-attB-N1。

图3是载体酶切鉴定电泳图。泳道1，2为PciI酶切pattBP-EGFP-attB-N1；泳道3，4为AseI酶切pattBA-EGFP-attB-N1；泳道5，6分别为PciI，AseI酶切pattBPA-EGFP-attB-N1泳道7，8为EcoO109I酶切pattBE-EGFP-attB-N1；泳道M为100bp marker。

图4是质粒构建图。

图5显示整合酶系统比例与效率之间的关系。

图6显示整合酶系统比例与H2AX表达水平的关系。C组：对照(50ngpEGFP-attB-N1 and 2000ng pcDNA3.1/Zeo(+))；B组：空白(不转染)。

图7显示载体内不同位置的attB对整合效率的影响。

图8是四组质粒经lipfectamine2000转染HeLa细胞后，第二天加筛选药物G418(Promega公司)，使其浓度为400μg/ml。筛选14天，至阴性细胞全部死亡，转染细胞中的阳性克隆逐渐长出。用含有1％亚甲基蓝的70％酒精染色10分钟，在去离子水中过夜，自然干燥后。

图9是四组质粒经lipfectamine2000转染HeLa细胞后，第二天收集细胞计数并通过FACS测定转染率，加筛选药物G418(Promega公司)，使其浓度为400μg/ml。筛选14天，用含有1％亚甲基蓝的70％酒精染色10分钟，在去离子水中过夜，自然干燥后计数算出整合率。

图10四组质粒经lipfectamine2000转染HeLa细胞后，第二天收集细胞计数并通过FACS测定转染率，根据FACS的转染效率和细胞的数目，将四组细胞按照一定的比例分别铺入6孔板中，使得每孔的初始EGFP表达水平相当；根据FACS的转染效率和细胞的数目，将四组细胞按照一定的比例分别铺入6孔板中，使得每孔的初始EGFP表达水平相当；3天后收集细胞进行FACS测定的测定结果。

具体实施方式

本发明人经过大量的研究和反复的试验，发现在φC31整合酶系统中增加attB的数目能够显著提高整合酶的效率。为此，本发明人构建了含有多个attB序列及外源基因的载体，将构建好的载体与整合酶载体混合后转染宿主细胞，检测转染率，发现含有多个attB的载体具有更高的整合效率和外源基因的表达量。

携带attB的载体

本发明提供了一种含有attB序列定向整合基因组假attP位点的载体。其中含有两个或者两个以上互相间隔的attB序列。较佳的含有两个或者三个attB序列。也可以含有三个以上的attB序列，本发明并不限制。相邻的两个attB序列之间具有一定的间隔，较佳的间隔300bp以上的序列长度。本发明对最长间隔的距离并不限制，只要该载体可以承受即可。

attB的方向本发明也不限制。正向和反向都可以实现本发明的目的。

attB序列在载体中的位置、和外源基因的位置关系等本发明也不限制，只要该载体中的各个功能元件能够正常工作即可，如attB序列的插入位置不会导致外源基因的中断，导致不能正常表达即可。

本发明中所述的含有attB序列定向整合基因组假attP位点的载体，可以是本领域的现有载体，比如宿主细胞是真核细胞的各种载体，商业质粒等，较佳的如质粒pEGFP-attB-N1。所述的载体的出发载体较佳的是质粒pEGFP-N1。

本发明中所述的attB的序列可以是已知的噬菌体attB位点序列，较佳的是SEQ ID NO：1所示。也可以是attB的核心序列。该attB的核心序列较佳的为SEQ ID NO：1的第46位到第79位。同样的插入的相邻attB核心序列相距300bp以上，每个attB与整合酶的结合才不会互相干扰。

本发明中，所述的“以上”是指包括本数。

本发明一较佳的实施例是将attB分别插入到载体pEGFP-attB-N1(参见中国专利200510111476.3)的EcoO109I位点和AseI与PciI位点之间，获得携带2个attB(pattBP-EGFP-attB-N1，pattBA-EGFP-attB-N1，pattBPA-EGFP-attB-N1及pattBE-EGFP-attB-N1)和3个attB的载体(pattB-attB-EGFP-attB-N1)。

φC31整合酶介导的转基因方法

本发明还提供了一种利用噬菌体φC31整合酶系统转基因方法，包括将含有attB序列的携带外源基因的载体和表达φC31整合酶的载体共转染宿主细胞，其中，所述的含有attB序列的携带外源基因的载体中含有的两个或两个以上互相间隔的attB序列。

质粒pEGFP-attB-N1，也称为pEGFP-N1-attB，参见中国专利200510111476.3。本发明引用中国专利200510111476.3全文。

本发明中所述的利用噬菌体φC31整合酶系统转基因方法是已知的方法，将含有attB序列的携带外源基因的载体和表达φC31整合酶的载体共转染宿主细胞。其中，携带外源基因的载体的含有的attB序列和宿主细胞基因组中的假attP位点具有同源性。而φC31整合酶可以识别并催化attB和attP的同源重组。表达φC31整合酶的载体表达出φC31整合酶，使该同源重组发生，从而将载体携带的外源基因重组进入宿主细胞的基因组中。

本发明中所述的表达φC31整合酶的载体可以是现有技术中的已知载体。

本发明中所述的宿主细胞可以是任何细胞，只要载体能够导入即可，一般是真核细胞。优选的如人细胞、牛细胞、羊细胞。

本发明对表达φC31整合酶的载体与含有attB序列的携带外源基因的载体的转染比例(1∶1～1∶50)的比例进行了摸索，结果发现随着整合酶载体的增加，整合效率不断提高。但是相应的随着整合酶载体的不断增加，H2AX(反应DNA链损伤的一种标志物)表达水平也在不断升高。因此整合酶载体与携带attB及外源基因的载体比例应该控制在一定范围之内，既可实现高效整合也要兼顾安全性问题，本发明中优选的比例为1∶10。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。图4是实施例中的载体构建图。

实施例1构建载体pattBP-EGFP-attB-N1，pattBA-EGFP-attB-N1及pattBPA-EGFP-attB-N1

一、获得attB片段

从质粒pBCPB(即pBCPB+，参见中国专利200510111476.3)中获得attB，连接至质粒pMD-19T中，以Eco0109I酶切，回收310bp的酶切片段。

1)以质粒pBCPB+为模板，用PCR方法扩增attB。

引物序列为：

以pBCPB+为模板，若以P1，P2为引物(引物携带PciI酶切位点)，扩增出PCR产物中携带PciI位点；以A1，A2为引物，扩增出PCR产物中携带AseI位点；以PA1，PA2为引物，扩增出PCR产物中5’和3’分别携带PciI和AseI位点。

PCR反应体系：1×PCR缓冲溶液(TaKaRa公司)，1.5mM Mg²⁺，引物各10μM，200μM dNTPs，模板DNA 100～200ng，2.5U Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司)。

PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，62℃1min，72℃3min，30个循环；72℃10min。

2)以凝胶回收试剂盒(北京天根生物技术公司，凝胶回收纯化试剂盒)纯化所得的310bp的PCR产物，操作步骤按产品说明书进行。

3)取纯化产物5μl，连接至质粒pMD-19T(Takara公司)中，连接条件为：纯化产物5μl，pMD-19T载体1μl，5μl solution I(Takara公司)，总反应体积10μl。16℃过夜。

4)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。将转化子扩增培养，提取质粒。所得质粒分别命名为PMD-19PB，PMD-19AB和PMD-19PAB。分别以Pci I和AseI酶切。

酶切反应体系为：

37℃酶切2.5小时。

5)对酶切产物进行电泳，电泳条件为：将9μl酶切产物与1μl含有溴酚蓝的上样缓冲液(10×上样缓冲液：1％SDS，50％甘油，0.05％溴酚蓝)混合后，通过2％的琼脂糖凝胶电泳分离。电泳缓冲液为TAE(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.3)，在约90V左右电压下电泳约40分钟，取出凝胶，于含有溴化乙锭的水溶液中(0.5μg/m1)浸泡约15分钟。

6)在紫外灯下切回310bp片段，操作步骤按产品说明书，以凝胶回收试剂盒(北京天根生物技术公司，凝胶回收纯化试剂盒)纯化所得的310bp的酶切产物，备用。经测序验证，其attB序列见SEQ ID NO：1。

二、线性化并去磷酸化pEGFP-attB-N1

抽提质粒pEGFP-attB-N1(也称为pEGFP-N1-attB，参见中国专利200510111476.3)，用Eco0109I酶切，得5kb的线性化质粒。去磷酸化。

1)以小提中量质粒抽提试剂盒(北京天根生物技术有限公司，提中量质粒抽提试剂盒)抽提质粒pEGFP-attB-N1，操作步骤按产品说明书。

2)将抽提质粒进行酶切。酶切反应体系为：

37℃酶切2.5小时。

3)对酶切产物进行电泳，电泳条件为：将酶切产物与4μl含有溴酚蓝的上样缓冲液(10×上样缓冲液：1％SDS，50％甘油，0.05％溴酚蓝)混合后，通过1％的琼脂糖凝胶电泳分离。电泳缓冲液为TAE(0.04M Tris-acetate，0.001M EDTA，pH 8.3)，在约90V左右电压下电泳约40分钟，取出凝胶，于含有溴化乙锭的水溶液中(0.5μg/ml)浸泡约15分钟。在紫外灯下切回5kb片段，以凝胶回收试剂盒(北京天根生物技术公司)纯化所得的5kb的线性化质粒。

4)去磷酸化。反应体系：

在50℃，30min反应，然后65℃，30min灭活。酚氯仿法回收纯化各线性化载体，备用。

三、连接及鉴定

将attB片段和去磷酸化pEGFP-attB-N1载体连接，即得载体pattB-EGFP-attB-N1。

1)连接体系：去磷酸化pEGFP-attB-N1载体：3.5μl；切胶回收的attB片段：3.5μl；T4 DNA连接酶：2μl；T4 DNA连接酶缓冲液：1μl，放置于16℃过夜连接。

2)将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。转化子扩增培养，抽提质粒。

3)质粒酶切。酶切反应体系同第二步中的第2)节。

4)对酶切产物进行电泳，电泳条件为：将9μl酶切产物与1μl含有溴酚蓝的上样缓冲液(10×上样缓冲液：1％SDS，50％甘油，0.05％溴酚蓝)混合后，通过2％的琼脂糖凝胶电泳分离。电泳图见图3，酶切产生5.0kb和310bp条带者为所需的质粒分别为pattBP-EGFP-attB-N1，pattBA-EGFP-attB-N1及pattBPA-EGFP-attB-N1。

实施例2构建载体pattBE-EGFP-attB-N1

引物设计，引物序列为

上游5′-AAGGACCTTC GAGGTCGACG ATGTAGGT-3′；

下游5′-AAGGACCTG AGGGGCCCAAGCTTATC-3′。

采用该引物，以质粒pBCPB+为模板，PCR扩增得到attB基因，克隆到pMD-19T中。用Eco0109I酶切所得质粒，将酶切后的约310bp的片段纯化，并与线性化并去磷酸化的pEGFP-attB-N1连接，获得载体pattBE-EGFP-attB-N1。其他步骤同实施例1，酶切产生5.0kb和310bp条带的质粒为pattBE-EGFP-attB-N1。电泳图见图1。

实施例3构建载体pattB-attB-EGFP-attB-N1

一、引物设计，引物序列为

上游5′-AAGGACCTTCGAGGTCGACGATGTAGGT-3′；

下游5′-AAGGACCTGAGGGGCCCAAGCTTATC-3′。采用该引物，以质粒pBCPB+为模板，PCR扩增得到attB基因，克隆到pMD-19T中。用Eco0109I酶切所得质粒，将酶切后的约310bp的片段纯化。

二、用Eco0109I酶切载体pattBPA-EGFP-attB-N1得到线性化载体。将该载体

去磷酸化。方法同实施例1。

三、将attB基因和线性化去磷酸化的pattBPA-EGFP-attB-N1进行连接反应。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞以进行扩增，扩增的质粒以Eco0109I酶切。对酶切产物进行电泳分析。如图2所示，酶切产生5.3kb和310bp条带者为构建正确的质粒pattB-attB-EGFP-attB-N1。

实施例4载体整合实验

子宫颈癌上皮细胞株(HeLa细胞)，ATCC，Cat.No.CCL-2。

细胞在含10％小牛血清(Hyclone公司)和50U/ml的青霉素及50mg/ml的链霉素(Gibco BRL公司)的DMEM(Gibco BRL公司)培养液中培养，进行外源基因的整合，包括如下步骤：

1)转染：按照脂质体Lipofectamine 2000试剂盒(invitrogen公司)的操作说明书转染HeLa细胞。50ng载体(pEGFP-attB-N1)分别与50g～2500ng的pCMV-Int(参见中国专利200510111476.3)用3μl lipfectamine 2000包裹后共转染HeLa细胞。添加质粒pcDNA3.1/Zeo(+)(Invitrogen公司)使各组中质粒分子数相同。对照组用50ng pEGFP-attB-N1和400ng pcDNA3.1/Zeo(+)共转。

2)筛选：转染第二天，收集细胞计数。一部分做FACS测定转染率。一部分以1∶100的稀释比例铺入10cm的培养板中，第二天加筛选药物G418(Promega公司)，使其浓度为400μg/ml，每3天换培养液(含10％小牛血清、50U/ml的青霉素、50mg/ml链霉素、400μg/mlG418的DMEM培养液)一次，并观察细胞的死亡情况。筛选14天，至阴性细胞全部死亡，转染细胞中的阳性克隆逐渐长出。

3)染色。PBS洗涤克隆两次，用含有1％亚甲基蓝的70％酒精染色10分钟，在去离子水中过夜，自然干燥，然后计数细胞克隆数目。

本发明整合率计算如下：

整合率结果见图5。由图可见，50ng载体(pEGFP-attB-N1)分别与50g～2500ng的pCMV-Int，随着转入整合酶载体的不断增加，获得G418克隆数也在不断增加(由23个逐渐增加到448个)，这表明φC31整合酶系统不存在过剩抑制现象。随着整合酶比例的提高，整合酶系统整合率也在不断提高。

实施例5 H2AX的表达水平

实验所用细胞及培养方法与实施例4中相同。

1)转染。实验步骤与实施例4中相同。

2)RNA抽提及逆转录

转染48小时后，收集细胞用TRIZOL(TAKARA公司)抽提RNA，用不含RNA酶的DNaseI消化后65℃5分钟置于冰盒中。用cDNA合成试剂盒(Promega公司)和oligo(dT)-18引物参照说明合成cDNA第一链。

3)Realtime-PCR

利用primer3设计H2AX及内参β-actin的引物。

内参β-actin引物：

5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′；

5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′(285bp，β-actin)。

H2AX引物：

5′-CGGGCGTCTGTTCTAGTGTT-3′；

5′-AGCTT GTTTGAGCTCCT CGTC-3′(345bp，H2AX)。

在SYBR Green I(Applied Biosystems)加入每组样本的cDNA和引物，在SDS 7500 Fast instrument(Applied Biosystems)扩增各组中的H2AX及β-actin产物。

扩增条件：94℃4分钟预变性；94℃，1分钟；60℃30秒；72℃30秒共31循环，72℃延伸5分钟。

所用仪器SDS7500(Applied Biosysytem，USA)，每个样本重复三次。

结果如图6所示，随着整合酶添加比例的提高，H2AX的表达水平也显著升高。这表明随着整合酶的不断增加，细胞染色体的损伤就越严重，因此整合酶的效率和安全需要兼顾。本发明中采用的整合酶的比例与携带attB的载体的比例控制在10∶1为最佳。

实施例6载体内不同位置的两个attB对整合效率的影响。

实验所用细胞及培养方法与实施例4中相同。

1)转染：50ng的pattBP-EGFP-attB-N1，pattBA-EGFP-attB-N1，pattBPA-EGFP-attB-N1及pattBE-EGFP-attB-N1分别与500ng的pCMV-Int或400ng pcDNA3.1/Zeo(+)用3ul lipfectamine2000包裹后共转染HeLa细胞。按照脂质体Lipofectamine 2000试剂盒(invitrogen公司)的操作说明书转染HeLa细胞。

2)筛选：筛选方案与实施例4中筛选方案相同。

3)染色。PBS洗涤克隆两次，用含有1％亚甲基蓝的70％酒精染色10分钟，在去离子水中过夜，自然干燥后计算克隆数目。

结果如图7所示，表明载体内两个不同位置的attB在整合酶的作用下，介导的整合酶的效率没有显著差异。

实施例7载体整合实验及整合效率

实验所用细胞及培养方法与实施例4中相同。

1)转染：50ng pEGFP-attB-N1，50ng pattB-EGFP-attB-N1(即pattBPA-EGFP-attB-N1)，50ng pattB-attB-EGFP-attB-N1分别与500ng的pCMV-Int用3ul lipfectamine2000包裹后共转染HeLa细胞，对照组用50ngpEGFP-attB-N1+400ng pDNA3.1/Zeo(+)共转。按照脂质体Lipofectamine 2000试剂盒(invitrogen公司)的操作说明书转染HeLa细胞。

2)筛选：筛选方案与实施例4中筛选方案相同。

3)染色。PBS洗涤克隆两次，用含有1％亚甲基蓝的70％酒精染色10分钟，在去离子水中过夜，自然干燥后计算克隆数目，如图8所示。

整合率如图9所示，表明在整合酶存在的情况下，pattB-attB-EGFP-attB-N1，pattB-EGFP-attB-N1分别比pEGFP-attB-N1组的整合率分别提高了2.8和2.1倍；比随机整合率分别提高了14.5倍和12倍。

实施例8流式鉴定

1)按照实施例4质粒分为四组分别转染HeLa细胞。

2)转染24小时后，0.25％的胰酶消化细胞，用PBS洗涤两次计数并通过FACS测定转染率。

3)根据FACS的转染效率和细胞的数目，将四组细胞按照一定的比例分别铺入6孔板中，使得每孔的初始EGFP表达水平相当；3天后收集细胞进行FACS测定。测定结果见图10，表明pattB-attB-EGFP-attB-N1，pattB-EGFP-attB-N1组分别比pEGFP-attB-N1组的表达水平分别提高34.4％和24.4％。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种携带attB序列高效率定向整合基因组假attP位点的载体，其特征在于，该载体含有两个或者两个以上互相间隔的attB序列。

2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体中相邻的两个attB序列之间的间隔是300bp以上的序列长度。

3.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体中attB的方向是正向或者反向。

4.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体的出发载体是质粒pEGFP-N1。

5.如权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的attB的序列是SEQID NO：1所示，或者是attB核心序列，即如SEQ ID NO：1所示序列的第46位到第79位。

6.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体是attB分别在载体pEGFP-attB-N1的EcoO109I位点、AseI位点和PciI位点中的一个或多个插入获得的。

7.一种利用噬菌体φC31整合酶系统转基因方法，包括将含有attB序列的携带外源基因的载体和表达φC31整合酶的载体共转染宿主细胞，其特征在于，所述的含有attB序列的携带外源基因的载体中含有的两个或两个以上互相间隔的attB序列。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是真核细胞。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是人细胞、牛细胞或者羊细胞。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的表达φC31整合酶的载体与含有attB序列的携带外源基因的载体的转染比例是1∶1～1∶50。

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