JP2022137068A - 化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集 - Google Patents

化学的に修飾されたガイドｒｎａを使用する高特異性ゲノム編集 Download PDF

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Abstract

【課題】化学修飾を有するガイドＲＮＡおよびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系におけるその使用を提供する。【解決手段】（ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとを含む合成ガイドＲＮＡであって、前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から６の間の整数であり、前記ガイド配列が、前記ガイド配列の４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に位置する少なくとも１つの修飾を含む、合成ガイドＲＮＡである。化学修飾されたガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列に対する特異性が増強されたものである。【選択図】図１

Description

［関連出願の相互参照］
本願は、２０１６年６月８日に出願した米国特許仮出願第６２／３４７５５３号および
２０１７年４月２０日に出願した正規の米国特許出願第１５／４９３，１２９号の利益を
主張するものであり、前記出願の全体の内容は、参照により本明細書の一部をなすものと
する。
本発明は、分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、規則的な配置の短い回文配列
リピートのクラスター（ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐ
ａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）技
術に関する。
天然原核生物のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系は、一定の長さの可変配列が介在する短いリピ
ートのアレイ（すなわち、規則的な配置の短い回文配列リピートのクラスター（ｃｌｕｓ
ｔｅｒｓ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉ
ｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）、または「ＣＲＩＳＰＲ」）およびＣＲＩＳＰＲ関連
（「Ｃａｓ」）タンパク質を含む。転写されたＣＲＩＳＰＲアレイのＲＮＡは、Ｃａｓタ
ンパク質のサブセットによって小さいガイドＲＮＡへプロセシングされ、これは、一般に
、以下に論じられるような２つの成分を有する。少なくとも６つの異なる系、Ｉ型、ＩＩ
型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型およびＶＩ型がある。ＲＮＡの成熟したｃｒＲＮＡへのプロ
セシングに関与する酵素は、６つの系で異なっている。天然原核生物のＩＩ型系では、ガ
イドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）は、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）およびトラン
ス作動性ＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）と呼ばれる２つの短い非コーディングＲＮＡ種
を含む。例示的な系では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼと複合体を形成する。ｇＲＮ
Ａ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）および
ｇＲＮＡの部分と相補的である配列であるプロトスペーサーを有する標的ポリヌクレオチ
ド配列と結合する。ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体による標的ポリヌクレオチドの
認識および結合は、標的ポリヌクレオチドの切断を誘導する。天然ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
系は、原核生物において、ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体が、真核生物におけるＲ
ＮＡｉと類似の方法で外因性遺伝要素を認識し、サイレンシングし、それによって、プラ
スミドおよびファージなどの外因性遺伝要素に対する耐性を付与する免疫系として機能す
る。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが共有結合によって連結している単一ガイドＲＮＡ（「
ｓｇＲＮＡ」）が、天然に存在するｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ間で形成される複
合体の代わりになることができることは実証されている。
ｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡの開発に関連する考慮として、特異性、安定性および機能性
が挙げられる。特異性とは、特定のｇＲＮＡ：Ｃａｓヌクレアーゼ複合体が、所望の標的
配列と結合し、ニックを入れ、および／またはそれを切断する能力を指し、所望の標的と
は配列および／または位置が異なるポリヌクレオチドの結合、ニッキング、および／また
は切断は、ほとんどまたは全く生じない。したがって、特異性とは、ｇＲＮＡ：Ｃａｓヌ
クレアーゼ複合体のオフターゲット効果を最小化することを指す。オフターゲット効果の
低減を伴う標的ポリヌクレオチドに対する所望の結合親和性を有し、それにもかかわらず
、所望のｇＲＮＡ機能性を有するｓｇＲＮＡを含むｇＲＮＡを提供する必要がある。標的
ポリヌクレオチドに対する所望の結合親和性および／または所望のオフターゲット低減の
結合を有する、特異性が増強されたｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡを含む）を作製および使用する
ための改善された方法も必要である。
例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の説明図である。単一ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質によって複合体が形成され、その複合体が標的ポリヌクレオチドを認識し、結合する。Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列を認識する（ここで、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧの３ヌクレオチドの配列であり、ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであるが、ＮＡＧなどのその他のＰＡＭ配列も存在するとわかっている）。ｓｇＲＮＡは、ガイド配列、ｃｒＲＮＡ配列またはセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはセグメントを含む。ｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流のＤＮＡ標的とハイブリダイズする。 ｃｒＲＮＡセグメント２０３およびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント２０５を含む、例示的なガイドＲＮＡ２０１を示す図である。 ｃｒＲＮＡセグメント２０９およびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント２１１を含み、前記ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがループ２１３を介して連結される、例示的な単一ガイドＲＮＡ２０７を示す図である。 ガイドＲＮＡに含めることができる種々の化学修飾の一部についての構造を示す図である。もちろん、図３は、限定を意図したものではなく、本明細書において記載される多くのその他の修飾を使用することができる。 オリゴヌクレオチド二本鎖が加熱によって別個の鎖に分離するにつれて紫外線（ＵＶ）吸光度がどのように上昇するのかを示すグラフである。シグモイド曲線は、別個の鎖への二本鎖の解離を表し、シグモイド曲線の中点が、二本鎖のＴｍである。この曲線は、生理的塩濃度での２０ヌクレオチドＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度が、およそ５０℃であることを示す。 ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがハイブリダイズされた二本鎖を形成している、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２ピースのデュアルガイドＲＮＡ（「ｄｇＲＮＡ」）を示す図であって、ガイドＲＮＡの伸長領域、ロッキング領域、サンプリング領域、シード領域（通常、１０ｍｅｒ）、デュアルガイドステムまたは単一ガイドステム－ループ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域を示す図である。 ガイド配列と相補的ＤＮＡ配列とのシード部分間でのシード二本鎖の最初の形成後、ヌクレオチドの結合が、どうのようにして、サンプリング領域およびロッキング領域を通じて逐次的に進行して、融解温度を有するＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成するかを示す図である。 シード領域のヌクレオチドにおける化学修飾が、高い協同性レベルを維持しながら個々の塩基対の結合エネルギーを減少させ、それによって、サンプリング領域を伸長し、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度を低下させることができることを示す図である。図５Ｃは、サンプリング領域における化学修飾も示す。 ２０ヌクレオチドのガイド配列を有し、該ガイド配列内の種々の位置に組み込まれた種々の種類の化学修飾によって修飾されている例示的ｃｒＲＮＡポリヌクレオチドを示す図である。 修飾されていないｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す図である。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 ｘ軸上の負または正の整数によってそれぞれ示される、ガイド配列の漸増的な５’末端切除または５’ 末端伸長後の相補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされた（ｃｒＲＮＡ内の）ガイド配列の２０塩基対の二本鎖の融解温度の変化を示すグラフである。 ＣＬＴＡ１オンターゲット、ＣＬＴＡ１オフ１ターゲットおよびＣＬＴＡ１オフ３ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断ならびに「オフ１」および「オフ３」と呼ばれる２種の異なるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ１」配列に標的化されたｇＲＮＡの化学修飾の影響を示す図である。 図８Ａの切断結果を、アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比を算出したことに由来する図である。アッセイされたガイドＲＮＡごとに、それぞれのオンターゲット切断パーセンテージを各比に掛けることによって、「特異性スコア」も算出されている。陰付きの比および特異性スコアは、図８Ｂに示されている他のものより大きい値であることが注目に値する。 「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断ならびに「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」と呼ばれる３種の異なるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断（それぞれ、ＣＬＴＡ４オンターゲット、ＣＬＴＡ４オフ１ターゲット、ＣＬＴＡ４オフ２ターゲットおよびＣＬＴＡ４オフ３ターゲットを表す）に関する、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ４」配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置での２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾の影響を示す図である。 図９Ａの切断結果を、アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比を算出したことに由来する図である。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、１．５以上のスコアに陰が付けられている。オフターゲットポリヌクレオチドごとに３つの最高スコアが、より濃い陰を付けることによって示されている。 ＩＬ２ＲＧオンターゲットおよびＩＬ２ＲＧオフ３ターゲットをそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ３」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、２．０より大きいスコアに陰が付けられている。より濃い陰を付けることによって３つの最高スコアが示されている。 ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、２．０より大きいスコアに陰が付けられている。より濃い陰を付けることによって３つの最高スコアが示されている。 合成ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現プラスミドがトランスフェクトされたヒトＫ５６２細胞における、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡの種々の種類の修飾の影響であって、この図で「オン」と呼ばれる標的ゲノム遺伝子座の切断に関する影響を、「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」と呼ばれる３種の異なるオフターゲットゲノム遺伝子座の同時切断に関する影響を示す図であり、前記「オン」、「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」は、内因性ＨＢＢオンターゲット、ＨＢＢオフ１ターゲット、ＨＢＢオフ２ターゲットおよびＨＢＢオフ３ターゲット部位をそれぞれ表す。「Ｕｎｍｏｄｉｆ」は、化学修飾されていないｓｇＲＮＡを示す。「３ｘＭ」は、２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡ鎖の最初の３つおよび最後の３つのヌクレオチドに、すなわち、それぞれ５’および３’末端に組み込まれたことを示す。同様に、「３ｘＭＳ」は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端に同様に組み込まれたことを示し、それに対して「３ｘＭＳＰ」は、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端に同様に組み込まれたことを示す。すべてのｓｇＲＮＡを、トランスフェクトされた細胞における示されている遺伝子座の編集についてアッセイした。 図１１Ａに示されている同一のエントリー１～１７に関する結果を、該エントリーを特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけして、示す図である。エントリー１８～６４は、ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのさらなるＭＰ修飾の影響を示す。「１ｘＭＰ」は、５’末端と３’末端両方の末端ヌクレオチドが、ＭＰで修飾されていることを示す。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異性スコアは、図８Ｂについて説明したように算出されている。最高スコアに陰が付けられている。 内因性ＨＢＢオンターゲットゲノム遺伝子座およびＨＢＢオフ１ターゲット部位をそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドの切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットゲノム遺伝子座の同時切断に関する、トランスフェクト細胞におけるヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。合成ｓｇＲＮＡと組換えＣａｓ９タンパク質の複合体がトランスフェクトされた培養細胞において、どちらかまたは両方の部位で生じた切断のパーセンテージは、精製されたゲノムＤＮＡの別々のサンプルにおけるオンターゲットおよびオフターゲット遺伝子座をＰＣＲ増幅し、続いて、プールされたアンプリコンを次世代シークエンシングし、評価中のオンターゲットまたはオフターゲット切断部位付近にインデルが存在するか、存在しないかに従って配列リードをバイオインフォマティクスにより分割することによって、トランスフェクションの４８時間後に決定されている。トランスフェクトされた細胞の各サンプルにおいて生じたインデルは、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体ではなく、バッファーで処理されたｍｏｃｋトランスフェクト細胞の対照サンプルに対して正規化されている。標的部位インデルを示す配列リード数の、別途トランスフェクトされた各ｓｇＲＮＡについてのオフターゲット部位インデルを示すリード数に対する比が、算出されている。特異性スコアは、図８Ｂについて説明したように算出されている。「１ｘＭＰ」は、５’末端と３’末端両方の末端ヌクレオチドが、ＭＰで修飾されていることを示す。エントリー１～２１は、Ｋ５６２細胞にトランスフェクトし、該細胞を培養することによって得られた結果を示し、それに対してエントリー２２～４２は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知である）にトランスフェクトし、該細胞を培養することによって得られた結果を示す。エントリー１～１２は、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけされている。同様に、エントリー１３～１９、エントリー２２～３３、およびエントリー３４～４０は、特異性スコアによってグループごとに順位づけされている。２．０より大きい特異性スコアに陰が付けられている。 グループごとに最高比から最低比へと並べ替えられた、測定された比による図１２Ｂにおける結果の代替構成を示す図である。 図９Ａ、９Ｂ、１０および１１Ａに提示されている結果の比較を示す図である。図１３は、化学修飾されたガイドＲＮＡについての、Ｃａｓ系において標的ポリヌクレオチドを切断するために使用されたときの標的特異性に関する研究からの、いくつかの傾向を示す図である。これらの傾向によって裏付けられる概念は、オフターゲットポリヌクレオチドもＣａｓ系に存在するとき特に有用である。 Ｋ５６２細胞におけるＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡおよびＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡの種々のタイプの修飾の影響を示す図である。
本発明は、ｇＲＮＡへの特定の化学修飾が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系により許容され、
Ｃａｓ：ｇＲＮＡの標的ポリヌクレオチドとの結合、標的ポリヌクレオチドのニッキング
および／または切断の有効性を実質的に損なうことなく、Ｃａｓ：ｇＲＮＡ複合体形成の
オフターゲット効果を低減するという予期しない発見に、少なくとも幾分かは基づいてい
る。
本発明は、少なくとも１種の特異性を増強する修飾（特異性増強修飾）を含む合成ガイ
ドＲＮＡを提供する。特定の実施形態では、少なくとも１種の特異性増強修飾は、合成ガ
イドＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとの間の少なくとも１つのヌクレオチド対の会合を弱
化もしくは強化し、および／または合成ガイドＲＮＡと少なくとも１種のオフターゲット
ポリヌクレオチドとの間の少なくとも１つのヌクレオチド対の会合を弱化し、ここで、前
記オフターゲット弱化の少なくとも１つは、存在する場合にはオンターゲットの弱化より
大きい。合成ガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡ機能性を有する。特異性増強修飾（複数でもよい
）は、ガイド配列内に、例えば、ロッキング領域、サンプリング領域および／またはシー
ド領域内に、位置し得る。特定の実施形態では、特異性増強修飾（複数でもよい）は、ｇ
ＲＮＡと標的ポリヌクレオチド配列とオフターゲットポリヌクレオチド配列（複数でもよ
い）とによって形成される二本鎖の融解温度を低下させるか、またはｇＲＮＡ／標的二本
鎖の融解温度を上昇させ、少なくとも１種のｇＲＮＡ／オフターゲット二本鎖の融解温度
を低下させる。本発明は、これらの合成ガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質
複合体、前記合成ガイドＲＮＡを使用して標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニッ
クを入れる、また結合するための方法、ならびに前記合成ガイドＲＮＡを含むセット、ラ
イブラリー、キットおよびアレイも提供する。本発明は、合成ガイドＲＮＡを調製する方
法も提供する。
［Ｉ．定義］
本明細書において、用語「ガイドＲＮＡ」とは、一般に、Ｃａｓタンパク質と結合し、
Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子）内の
特定の位置に対して標的化するのに役立ち得るＲＮＡ分子（または集合的に、ＲＮＡ分子
の群）を指す。ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメン
トを含み得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡを含むが、ｔｒ
ａｃｒＲＮＡを含まない。本明細書において、用語「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡセ
グメント」とは、ポリヌクレオチドを標的化するガイド配列、ステム配列（さらに明確に
するために、該ステム配列は、単一ガイドＲＮＡ内でｔｒａｃｒＲＮＡの対応する部分を
有するステムを形成する、ステム形成配列を包含する）、任意選択的に、５’－オーバー
ハング配列を含むＲＮＡ分子またはその一部を指す。本明細書において、用語「ｔｒａｃ
ｒＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント」とは、タンパク質結合セグメント（例
えば、タンパク質結合セグメントは、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と相互
作用可能である）を含むＲＮＡ分子またはその一部を指す。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲ
ＮＡと部分的にまたは完全にハイブリダイズするセグメントも含む。用語「ガイドＲＮＡ
」は、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、同一ＲＮＡ分子また
は鎖中に位置する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を包含する。また、用語「ガイドＲＮ
Ａ」とは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが、別個のＲＮＡ分
子中に位置する２種以上のＲＮＡ分子の群を集合的に包含する。用語「ガイドＲＮＡ」は
、Ｃａｓ９以外のＣａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質）に結合するＲＮＡ分
子または好適な分子セグメント群であって、標的ポリヌクレオチド内の相補的配列（また
は「標的配列」）に結合すること、ニックを入れることおよび／またはそれを切断するこ
とができるｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するためのＣａｓタンパク質結合を
含むガイドＲＮＡの機能を有する、ＲＮＡの１本のまたはセグメント化された鎖内のガイ
ド配列を備えている、ＲＮＡ分子または好適な分子セグメント群も包含する。
用語「ガイド配列」とは、標的ポリヌクレオチド内の標的配列と部分的または完全な相
補性を有し、Ｃａｓタンパク質によって容易にされる塩基対形成によって標的配列とハイ
ブリダイズすることができる、ガイドＲＮＡ内の連続ヌクレオチド配列を指す。図１に示
されている例で説明されるように、標的配列は、ＰＡＭ部位（ＰＡＭ配列、およびＰＡＭ
部位を一緒に構成する、他の鎖上のその相補的配列）に隣接している。ＰＡＭ配列（ｃａ
ｓ９についてはＮＧＧ）のすぐ上流に、標的配列と相補的な配列（図１中の太字の、下部
の鎖）がある。ガイド配列とハイブリダイズする標的配列は、ＰＡＭ配列の成分（ｃａｓ
９についてはＣＣＮ）のすぐ下流にある。ガイド配列のヌクレオチド１（５’における最
初のヌクレオチド）は、標的配列の最後のヌクレオチドと相補的であり、その一方で、ガ
イド配列の最後のヌクレオチド（図１中のガイド配列のヌクレオチド２０）は、ＰＡＭ部
位の隣（およびＰＡＭ配列の相補体のすぐ下流）にある、標的配列の最初のヌクレオチド
と相補的である。Ｃｐｆ１などの他の例では、ガイド配列とハイブリダイズする標的配列
の位置は、ＰＡＭ配列の相補体の上流にあり得る。
ガイド配列は、約１０ヌクレオチド程度に短いこともあり、約３０ヌクレオチド程度に
長いこともある。通常のガイド配列は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２
２、２３および２４ヌクレオチド長である。合成ガイド配列は、通例は２０ヌクレオチド
長であるが、より長くてもよく、またはより短くてもよい。ガイド配列が２０ヌクレオチ
ドより短い場合、それは、通常、２０ヌクレオチドガイド配列と比較して５’末端からの
欠失である。例として、ガイド配列は、標的配列と相補的な２０ヌクレオチドからなり得
る。言い換えると、ガイド配列は、ＤＮＡとＲＮＡとの間のＡ／Ｕの相違を除いて、ＰＡ
Ｍ配列の上流の２０ヌクレオチドと同一である。このガイド配列が、５’末端から３ヌク
レオチド、末端切除されると、２０ヌクレオチドガイド配列のヌクレオチド４は、この場
合、その１７ｍｅｒのヌクレオチド１になり、２０ヌクレオチドのガイド配列であるヌク
レオチド５は、この場合、その１７ｍｅｒのヌクレオチド２になる、等々。この新たな位
置は、元の位置マイナス３である。同様に、ガイド配列は、標的部位における２０を超え
るヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、これらのさらなるヌクレオチドは、ガ
イド配列の５’末端に位置する。なぜなら、ガイド配列の３’末端は、ＰＡＭ部位の隣の
標的と相補的であるからである。かさねて例として、２２ヌクレオチドのガイド配列では
、２０ｍｅｒにおける元のヌクレオチド１は、この場合、ヌクレオチド３になり、２０ｍ
ｅｒにおける元のヌクレオチド２は、ヌクレオチド４になる、等々。この新たな位置は、
元の位置プラス２、またはマイナス（－２）である。したがって、ガイド配列は、５’末
端から数えると、ヌクレオチド１から「２０マイナスＮ」（２０－Ｎ）からなり、Ｎは、
－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整数である。ガイド
配列内の所与のヌクレオチド位置は、「位置番号マイナスＮ（番号－Ｎ）」と記載される
ことになる。例えば、位置５におけるヌクレオチドは、ガイド配列が５’末端においてＮ
ヌクレオチドだけ末端切除されたまたは伸長された場合に生じる、２０ヌクレオチドガイ
ド配列から得られる参照位置からの位置５のシフトを示すために、「５－Ｎ」（５マイナ
スＮ）と記載されることになる。ヌクレオチド位置は、正の整数である。したがって、負
またはゼロであるいずれの（番号－Ｎ）位置も非現実的であり、無視すべきである。ガイ
ド配列は、ｇＲＮＡを構成する鎖（１つまたは複数）内のどこに位置してもよい。通常の
ガイド配列は、ｇＲＮＡ鎖の５’末端もしくは３’末端に、またはその付近に位置する。
用語「スキャフォールド」とは、実質的に同一であるか、または天然の生物学的種にわ
たって高度に保存されている配列を含むガイドＲＮＡ分子の一部を指す。スキャフォール
ドは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント、およびｃｒＲＮＡセグメントの３’末端にまたはそ
の付近にポリヌクレオチドを標的化するガイド配列（リピート部分）以外のｃｒＲＮＡセ
グメントの一部を含む。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ分子
、ＲＮＡ分子またはその類似体を指す。本明細書において、用語「核酸」、「ポリヌクレ
オチド」および「オリゴヌクレオチド」は、これらに限定されないが、ｃＤＮＡ、ゲノム
ＤＮＡ、プラスミドもしくはベクトルＤＮＡ、または合成ＤＮＡなどのＤＮＡ分子および
ガイドＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡまたは合成ＲＮＡなどのＲＮＡ分子を含む。さらに
、本明細書において、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、一本鎖および二本鎖
形態を含む。当該技術分野での標準規定は、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、Ｒ
ＮＡ分子、ＤＮＡ分子の別個の鎖、および２つ以上のヌクレオチドを含む種々の核酸は、
一般に、それらの５’末端から番号づけされ、この規定は、そのような分子に共有結合に
よって連結している５’伸長部または「オーバーハング」の事例を含めて、全体を通して
使用される。
本明細書において「修飾」または「化学修飾」とは、最も一般的な４つの天然リボヌク
レオチドであるアデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジンリボヌクレオチドに見
られるものとは異なる化学部分、または化学構造の一部を指す。したがって、用語「修飾
」とは、アデノシン、グアノシン、シチジンまたはウリジンリボヌクレオチドの最も一般
的な天然分子構造のまたはそのような天然分子構造に関する分子変化を指す。用語「修飾
」は、核酸塩基のもしくは核酸塩基に関する変化、糖のもしくは糖に関する変化、および
／またはヌクレオチド間ホスホジエステル連結の変化を指すことがある。用語「修飾」は
、天然転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、例えば、これらに限定されないが、２’－Ｏ－メチル、
１－メチルアデノシン、２－メチルアデノシン、１－メチルグアノシン、７－メチルグア
ノシン、２－チオシトシン、５－メチルシトシン、５－フルオロシトシン、シュードリジ
ン、ジヒドロウリジン、リボチミジンなどにおいて起こる化学修飾などの、自然に起こる
リボヌクレオチドの化学構造変化を指すこともある。用語「修飾」は、通常は自然界に見
られない化学修飾、例えば、これらに限定されないが、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メト
キシエチル、２’－Ｏ－フェニルなどを指すこともある。用語「同一修飾」とは、糖のも
しくは糖に関する、またはヌクレオチド間結合の、同一種類の化学修飾を指し、例えば、
２’－Ｏ－メチルが、アデノシン、グアノシン、シチジンおよび／またはウリジンリボヌ
クレオチドの２’位に結合していることがあり、そのような修飾は、同一種類の修飾また
は「同一修飾」と呼ばれ得る。逆に言えば、核酸塩基への修飾は、修飾核酸塩基が同一の
分子構造で構成されていた場合にのみ「同一修飾」と同定されることになる。例を挙げて
差異を説明すると、１－メチルグアノシンおよび７－メチルグアノシンの両方は、最も一
般的な天然グアノシンのメチル基修飾を有するが、修飾核酸塩基が異なる分子構造を有す
るため、「同一修飾」ではない。さらなる例では、ＲＮＡの鎖は、３つの修飾ヌクレオチ
ド、例えば、各々が２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸によって修飾されている、グ
アノシンおよび２つのシチジンを含むことがあり、そのようなヌクレオチドは、同一の方
法で修飾されたまたは同一修飾で修飾されたと的確に説明することができる。逆に言えば
、ＲＮＡの異なる鎖は、５－メチルシチジン、および５－メチル置換基を欠くシチジンを
含むこともあり、両方のシチジンヌクレオチドが２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸
によって修飾されていることもあるが、それでもこれら２つのシチジンヌクレオチドは異
なる修飾を有し、同一の方法で修飾されているとは言われないだろう。
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの関連において、用語「修飾」とは、こ
れらに限定されないが、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾または３’末端修飾、（
ｂ）塩基の置換または除去を含む、核酸塩基（または「塩基」）修飾、（ｃ）２’、３’
および／または４’位での修飾を含む糖修飾、ならびに（ｄ）ホスホジエステル連結の修
飾または置換を含む骨格修飾を含む。用語「修飾されたヌクレオチド」とは、一般に、塩
基、糖およびホスホジエステル連結またはヌクレオチドホスフェートを含む骨格部分のう
ち１種以上の化学構造への修飾を有するヌクレオチドを指す。ガイドＲＮＡへの化学修飾
は、その全内容が参照により本明細書の一部をなす、２０１５年１２月３日に出願された
米国特許出願第１４／７５７，２０４号に開示されている。
用語「ｘＡ」、「ｘＧ」、「ｘＣ」、「ｘＴ」、「ｘＵ」または「ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ
、Ｕ）」および「ｙＡ」、「ｙＧ」、「ｙＣ」、「ｙＴ」、「ｙＵ」または「ｙ（Ａ、Ｇ
、Ｃ、Ｔ、Ｕ）」とは、その内容が参照によって全文が本明細書の一部をなす、Ｋｒｕｅ
ｇｅｒ ｅｔ ａｌ “Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓ
ｉｚｅ－Ｅｘｐａｎｄｅｄ ＤＮＡｓ：Ｔｏｗａｒｄ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ，Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ”，（２００７）Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ
．４０，１４１－５０によって記載されるようなヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基
類似体を指す。
用語「構造不定の核酸」または「ＵＮＡ」とは、参照によりその全文の内容が本明細書
の一部をなすものである米国特許第７，３７１，５８０号に記載されるような、ヌクレオ
チド、核酸塩基または核酸塩基類似体を指す。構造不定の核酸またはＵＮＡ、修飾はまた
、「偽相補性」ヌクレオチド、核酸塩基または核酸塩基類似体とも呼ばれる（例えば、Ｌ
ａｈｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６：１０，３
４０９－１９を参照のこと）。
用語「ＰＡＣＥ」および「チオＰＡＣＥ」とは、それぞれ、ホスホノ酢酸またはチオホ
スホノ酢酸基を含有するヌクレオチド間ホスホジエステル連結類似体を指す。これらの修
飾は、ホスホノカルボン酸部分、ホスホノカルボン酸エステル部分、チオホスホノカルボ
ン酸部分およびチオホスホノカルボン酸エステル部分を含む広いクラスの化合物に属する
。これらの連結は、それぞれ一般式Ｐ（ＣＲ１Ｒ２）ｎＣＯＯＲおよび（Ｓ）－Ｐ（ＣＲ
１Ｒ２）ｎＣＯＯＲによって記載することができ、式中、ｎは、０～６の整数であり、Ｒ
１およびＲ２の各々は独立に、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルからなる群から選択され
る。これらの修飾の一部は、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものであ
るＹａｍａｄａ，Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍａ
ｔｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ”（２００６）Ｊ．Ａｍ．
Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２８：１５，５２５１－６１によって記載されている。
本開示の一部の場所では、特に、合成ガイドＲＮＡの構造および配列ならびにそのよう
な合成ガイドＲＮＡに関する実験結果を開示する図では、特定の修飾を示すために特定の
略語が使用される。「Ｍ」は、本明細書では２’－Ｏ－メチル修飾を示すために使用され
、「Ｓ」は、本明細書では３’－ホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を示すため
に使用され、「Ｐ」は、本明細書では３’－ホスホノ酢酸（またはＰＡＣＥ）ヌクレオチ
ド間連結修飾を示すために使用され、「ＭＳ」は、本明細書では２’－Ｏ－メチル－３’
－ホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾を示すために使用され、「ＭＰ」は、本明
細書では２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（または２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡ
ＣＥ）ヌクレオチド間連結修飾を示すために使用され、「ＭＳＰ」は、本明細書では２’
－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結修飾を示すために使用される
。
「糖パッカー」とは、糖５員環の１または２個の原子を平面から出させる立体斥力のた
めに非平面である糖環を指す。リボフラノースの場合、平面Ｃ１’－Ｏ４’－Ｃ４’は、
固定されている。エンドパッカーとは、Ｃ２’またはＣ３’が、この面から外にＯ５’方
向へ変えられていることを意味する。エクソパッカーは、反対方向のシフトを記述するも
のである。Ｃ２’－エンドおよびＣ３’－エンドは、天然には平衡状態であるが、化学修
飾は、その糖を好ましいパッカーに至らせることができる。ＲＮＡでは、Ｃ３’－エンド
コンホメーションが優勢である。ＤＮＡは、両方のコンホメーションに適合することが可
能であり、それらのコンホメーションを取ることができる。
用語「シード領域」とは、標的核酸配列と相補的であるガイド配列の領域であって、ガ
イド配列と標的核酸配列とのハイブリダイゼーションを開始させる領域を指す。一部の事
例では、シード領域は、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質複合体によって補助さ
れる準安定性二本鎖を形成する。一般に、ｇＲＮＡのガイド配列内のシード領域という用
語は、２０ヌクレオチドのガイド配列内の、該ガイド配列の５’末端から数えて、ヌクレ
オチド１１～２０からなるが、この領域は、ヌクレオチド配列およびこの領域内のＲＮＡ
ヌクレオチドに対する化学修飾に依存して、または会合しているペプチド、タンパク質、
もしくはタンパク質複合体の修飾によって、より短いまたはより長い範囲にわたり得る。
用語「サンプリング領域」とは、シード領域に隣接する領域を指し、これらのヌクレオ
チドの結合は、二本鎖の結合エネルギーが、その結合が起こる温度と同等になるまで、進
行する。一般に、ｇＲＮＡ内のサンプリング領域という用語は、別段の指示がない限り、
２０ヌクレオチドガイド配列内の、該ガイド配列の５’末端から数えて、ヌクレオチド５
～１０からなるが、１つまたは複数の修飾によってサンプリング領域が機能的に伸長され
、その結果、ガイド配列内のヌクレオチド１～１０、あるいは２～１０、あるいは３～１
０、あるいは４～１０、あるいは１～１１、あるいは２～１１、あるいは３～１１、ある
いは４～１１、あるいは５～１１、あるいは１～１２、あるいは２～１２、あるいは３～
１２を包含する場合もあり得る。
用語「ロッキング領域」とは、サンプリング領域に隣接する領域であって、形成される
二本鎖の結合エネルギーが、その結合が起こる温度より高い領域を指す。一般に、ｇＲＮ
Ａ内のロッキング領域という用語は、別段の指示がない限り、２０ヌクレオチドガイド配
列内の、該ガイド配列の５’末端から数えて、ヌクレオチド１～４からなるが、１つまた
は複数の修飾によって、ロッキング領域が、ガイド配列の５’末端のヌクレオチド１、あ
るいはヌクレオチド１～２、あるいはヌクレオチド１～３へと機能的に短縮される場合も
あり得る。ロッキング領域は、１つまたは複数のヌクレオチドが、ガイド配列を通常の２
０ヌクレオチドから２１ヌクレオチドに、あるいは２２ヌクレオチドに、あるいは２３ヌ
クレオチドに、あるは２４ヌクレオチドに、あるいは２５ヌクレオチド以上に伸長させる
ように、５’末端に共有結合によって連結された場合、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系の通常
のガイド配列の長さ２０ヌクレオチドを超えて伸長し得る。
本明細書において、用語「標的ポリヌクレオチド」または「標的」とは、標的核酸配列
を含有するポリヌクレオチドを指す。標的ポリヌクレオチドは、一本鎖である場合も二本
鎖である場合もあり、特定の実施形態では、二本鎖ＤＮＡである。特定の実施形態では、
標的ポリヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである。本明細書において、「標的核酸配列」ま
たは「標的配列」とは、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して結合し、ニックを入れ、または切断す
るよう望む、特定の配列またはその相補配列を意味する。特定の実施形態では、２つ以上
の標的配列は、例えば、相同組換えを目的として２つの特定の標的配列間の配列を置き換
えるために、同一の反応で結合させる、ニックを入れる、または切断することができるよ
うに選択され得る。あるいは、２つ以上の標的配列は、複数の標的を同時に結合および濃
縮すべき場合にも有用である。したがって、２つ以上の標的配列が使用される場合、それ
ぞれの標的ポリヌクレオチドは、目的に依存して、同一遺伝子内にあってもよく、または
なくてもよい。
「オフターゲットポリヌクレオチド」または「オフターゲット」とは、意図される標的
核酸と部分的に相同な酸配列を含有するポリヌクレオチドを指す。オフターゲットポリヌ
クレオチドは、一本鎖であってもよく、または二本鎖であってもよく、特定の実施形態で
は、二本鎖ＤＮＡである。本明細書において「オフターゲット核酸配列」または「オフタ
ーゲット配列」とは、ＣＲＩＳＰＲ系を使用して結合する、ニックを入れる、または切断
することが望まれない、特定の配列またはその相補体であって、標的核酸配列と実質的な
配列同一性を有するが同一ではない、特定の配列またはその相補体を意味する。例えば、
オフターゲット核酸配列は、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８
５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９０～９５％、少なくとも約９７％、またはそ
れより高いヌクレオチド（またはアミノ酸）配列同一性を有する場合、標的核酸配列と実
質的な配列同一性を有する。
用語「ＨＢＢポリヌクレオチド」、「ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド」、「ＩＬ２ＲＧポ
リヌクレオチド」、「ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド」、および「ＣＬＴＡ４ポリヌクレオ
チド」とは、遺伝子ＨＢＢ、ＶＥＧＦＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＬＴＡ１またはＣＬＴＡ４の少
なくとも一部をそれぞれ含む任意のポリヌクレオチドを指す。そのようなポリヌクレオチ
ドは、天然に存在するポリヌクレオチド、組換えポリヌクレオチド、または合成ポリヌク
レオチドを含む。そのようなポリヌクレオチドは、そのような遺伝子に関連するゲノム内
の遺伝子座に見られるポリヌクレオチド配列を含むことができ、したがって、そのような
遺伝子の対立遺伝子および変異体を包含する。
用語「特異性」とは、ガイド配列が、オンターゲットポリヌクレオチドと１つまたは複
数のオフターゲットポリヌクレオチドとを、どの程度十分に識別することができるかを指
す。ガイドＲＮＡの特異性は、例えば、オンターゲット切断、結合またはニッキングパー
センテージおよびオフターゲット切断、結合もしくはニッキングパーセンテージの算出、
オン：オフ比の算出、ならびに／または匹敵するオンおよびオフターゲットパーセンテー
ジから導き出される特異性スコアによって、決定することができる（本開示の実施例を参
照のこと）。用語「オンターゲットパーセンテージ」とは、アッセイサンプル中での標的
ポリヌクレオチドの切断、ニッキングまたは結合のパーセンテージを指し、したがって、
例として、ガイドＲＮＡは、アッセイ中に存在する標的ポリヌクレオチドの９０％の切断
、ニッキングまたは結合をもたらす場合、９０％のオンターゲットパーセンテージを有す
る。用語「オン：オフ比」とは、アッセイされるガイドＲＮＡごとのオンターゲットパー
センテージ対オフターゲットパーセンテージの比を指し、例として、８０％のオンターゲ
ットパーセンテージおよび８％のオフターゲットパーセンテージを有するガイドＲＮＡは
、１０のオン：オフ比を有する。用語「特異性スコア」とは、アッセイされるガイドＲＮ
Ａごとのオン：オフ比にそのそれぞれのオンターゲットパーセンテージを掛けることによ
って得られる数を指し、例として、８０％のオンターゲットパーセンテージおよび８％の
オフターゲットパーセンテージを有するガイドＲＮＡは、１０のオン：オフ比となり、８
の特異性スコアを有する。一部のアッセイでは、結合またはニッキングは、代替として切
断を使用して評価され、例えば、標的部位でのインデル形成をシークエンシングによって
定量して切断を評価するアッセイでは、そのようなアッセイを使用して、ｇＲＮＡの結合
またはニッキング活性も評価することができる。
用語「連続する特異性増強修飾」とは、ガイドＲＮＡ内の互いに隣接する２以上の特異
性増強修飾を指す。ガイドＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２
４の連続する特異性増強修飾を含み得る。広く使用されているＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系
におけるガイドＲＮＡは、ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０を含む
ガイド配列を含む。１つまたは複数の連続する特異性増強修飾は、例えば、ヌクレオチド
１および２、ヌクレオチド１～３、ヌクレオチド１～４、ヌクレオチド１～５、ヌクレオ
チド１～６、ヌクレオチド１～７、ヌクレオチド１～８、ヌクレオチド１～９、ヌクレオ
チド１～１０、ヌクレオチド２および３、ヌクレオチド２～４、ヌクレオチド２～５、ヌ
クレオチド２～６、ヌクレオチド２～７、ヌクレオチド２～８、ヌクレオチド２～９、ヌ
クレオチド２～１０、ヌクレオチド３および４、ヌクレオチド３～５、ヌクレオチド３～
６、ヌクレオチド３～７、ヌクレオチド３～８、ヌクレオチド３～９、ヌクレオチド３～
１０などに、修飾を含み得る。
用語「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、完全にまたは部
分的に相補的なポリヌクレオチド鎖が、適したハイブリダイゼーション条件下で一緒にな
って、２つの成分鎖が水素結合によって接合される二本鎖構造または領域を形成するプロ
セスを指す。本明細書において、用語「部分ハイブリダイゼーション」は、二本鎖構造ま
たは領域が、１つまたは複数のバルジまたはミスマッチを含有する場合を含む。水素結合
は、通常、アデニンとチミンまたはアデニンとウラシル（ＡとＴまたはＡとＵ）またはシ
トシンとグアニン（ＣとＧ）の間に形成するが、その他の非標準塩基対が形成し得る（例
えば、Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”，１１ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照のこと）。修飾さ
れたヌクレオチドは、非標準的な手法でハイブリダイゼーションを可能にする、または促
進する水素結合を形成し得ることが考慮される。
用語「切断」または「切断すること」とは、ポリヌクレオチドのホスホジエステル骨格
における共有ホスホジエステル連結の分断を指す。用語「切断」または「切断すること」
は、一本鎖分断および二本鎖分断の両方を包含する。二本鎖切断は、２つの別個の一本鎖
切断事象の結果として起こり得る。切断は、平滑末端または付着末端のいずれかの生成を
もたらし得る。
用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質」または「Ｃａｓタンパク質」とは、野生型Ｃａｓ
タンパク質、その断片またはその突然変異体または変異体を指す。用語「Ｃａｓ突然変異
体」または「Ｃａｓ変異体」とは、野生型Ｃａｓタンパク質のタンパク質またはポリペプ
チド誘導体、例えば、１つまたは複数の点突然変異、挿入、欠失、末端切除、融合タンパ
ク質またはそれらの組合せを有するタンパク質を指す。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突
然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性を実質的に
保持する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ヌク
レアーゼドメインの一方または両方が不活性であるように突然変異されている。特定の実
施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、ヌクレアーゼ活性を有す
る。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、その野生型
対応物のヌクレアーゼ活性の一部またはすべてを欠く。用語「ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク
質」または「Ｃａｓタンパク質」は、原核生物の種々の種の野生型Ｃｐｆ１タンパク質（
ならびにプレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）およびフランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌ
ｌａ）１リボ核タンパク質からの、クラスター化されて規則的な配置の短い回文配列リピ
ートにちなんで名付けられたもの、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１リボ核タンパク質）、
その断片、またはその突然変異体もしくは変異体も含む。
Ｃａｓタンパク質の用語「ヌクレアーゼドメイン」とは、ＤＮＡ切断のための触媒活性
を有するタンパク質内のポリペプチド配列またはドメインを指す。通常は、Ｃａｓ９は、
ＰＡＭ配列の上流の二本鎖切断を触媒する。ヌクレアーゼドメインは、単一ポリペプチド
鎖中に含有され得、または切断活性は、２種（またはそれを超える）ポリペプチドの会合
に起因し得る。単一ヌクレアーゼドメインは、所与のポリペプチド内の２つ以上の単離さ
れたアミノ酸のストレッチからなり得る。これらのドメインの例として、ＲｕｖＣ様モチ
ーフ（配列番号１中のアミノ酸７－２２、７５９－７６６および９８２－９８９）および
ＨＮＨモチーフ（アミノ酸８３７－８６３）が挙げられる。Ｇａｓｉｕｎａｓ ｅｔ ａ
ｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０９：３９，Ｅ２５
７９－Ｅ２５８６およびＷＯ２０１３１７６７７２を参照のこと。
「ｇＲＮＡ機能性」を有する合成ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と会合するなどの
天然に存在するガイドＲＮＡの機能またはＣａｓタンパク質と関連してガイドＲＮＡによ
って実施される機能のうち１つまたは複数を有するものである。特定の実施形態では、機
能性は、標的ポリヌクレオチドを結合することを含む。特定の実施形態では、機能性は、
Ｃａｓタンパク質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、標的ポリヌクレオチドに
標的化することを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニック
を入れることを含む。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断する
ことを含む。特定の実施形態では、機能性は、Ｃａｓタンパク質と会合することまたはそ
れと結合することを含む。例えば、Ｃａｓタンパク質は、融合しているタンパク質または
その（それらの）一部によって１つまたは複数の機能が遂行されるように、１つまたは複
数のタンパク質もしくはそれらの一部、例えば、転写因子エンハンサーまたはリプレッサ
ー、デアミナーゼタンパク質などと融合された、「デッド」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）になる
ように遺伝子操作され得る。特定の実施形態では、機能性は、遺伝子操作されたＣａｓタ
ンパク質を有する人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、Ｃａｓタンパク質を有するＣＲＩ
ＳＰＲ－Ｃａｓ系における、ガイドＲＮＡの任意のその他の公知の機能である。特定の実
施形態では、機能性は、天然ガイドＲＮＡの任意のその他の機能である。合成ガイドＲＮ
Ａは、天然に存在するガイドＲＮＡより大きなまたは小さなｇＲＮＡ機能性を有し得る。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、同様の天然に存在するガイドＲＮＡとの比較
において、ある特性についてより大きな機能性を、別の特性についてより小さな機能性を
有し得る。
一本鎖「ニッキング」活性を有するＣａｓタンパク質とは、野生型Ｃａｓタンパク質と
比較して、ｄｓＤＮＡの２つの鎖のうち一方を切断する能力が低減した、Ｃａｓ突然変異
体またはＣａｓ変異体を含むＣａｓタンパク質を指す。例えば、特定の実施形態では、一
本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（またはＨＮＨドメ
イン）の機能を低減し、結果として、標的ＤＮＡの一方の鎖を切断する能力を低減する突
然変異（例えば、アミノ酸置換）を有する。このような変異体の例は、化膿性連鎖球菌（
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｈ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａおよび／ま
たはＮ８６３Ａ置換を含み、また、その他の種のＣａｓ９酵素中の同等の部位での同一ま
たは同様の置換を含む。
「結合」活性を有する、または標的ポリヌクレオチドに「結合する」Ｃａｓタンパク質
とは、ガイドＲＮＡと複合体を形成するＣａｓタンパク質を指し、そのような複合体中に
あるとき、前記ガイドＲＮＡは、標的ポリヌクレオチド配列などの別のポリヌクレオチド
と、前記ガイドＲＮＡとその他のポリクレオチドの塩基間の水素結合によってハイブリダ
イズして、塩基対を形成する。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対形成によって起こ
ることもあり、または任意のその他の配列特異的な方法で起こることもある。そのハイブ
リッドは、二本鎖を形成する２本の鎖を含むこともあり、多重鎖の三本鎖（ｍｕｌｔｉ－
ｓｔｒａｎｄｅｄ ｔｒｉｐｌｅｘ）を形成する３本以上の鎖を含むこともあり、または
これらの任意の組合せを含むこともある。
「ＣＲＩＳＰＲ機能」とは、ＣＲＩＳＰＲ系によって達成され得る任意の機能または効
果を意味し、そのような機能または効果には、これらに限定されないが、遺伝子編集、Ｄ
ＮＡ切断、ＤＮＡニッキング、ＤＮＡ結合、遺伝子発現の調節、ＣＲＩＳＰＲ活性化（Ｃ
ＲＩＳＰＲａ）、ＣＲＩＳＰＲ干渉（ＣＲＩＳＰＲｉ）、およびｃａｓタンパク質を別の
エフェクターに連結させることによって達成され得る任意のその他の機能であって、それ
によってｃａｓタンパク質により認識される標的配列に対するエフェクター機能を達成す
ることができる機能が含まれる。例えば、ヌクレアーゼを含まないｃａｓタンパク質を転
写因子、デアミナーゼ、メチラーゼなどに融合させることができる。結果として得られる
融合タンパク質を標的のためのガイドＲＮＡの存在下で使用して、標的の転写を調節する
こと、標的を脱アミノ化することまたはメチル化することができる。
本明細書において、用語、配列の「一部」または「断片」とは、完全配列よりも小さい
配列の任意の一部（例えば、ヌクレオチド部分配列またはアミノ酸部分配列）を指す。ポ
リヌクレオチドの一部は、任意の長さ、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５
、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００または５００またはそれを
超えるヌクレオチドの長さであり得る。ガイド配列の一部は、ガイド配列の約５０％、４
０％、３０％、２０％、１０％、例えば、ガイド配列の３分の１またはそれより短い、例
えば、７、６、５、４、３または２ヌクレオチドの長さであり得る。
分子との関連において、用語「に由来する」とは、親分子または親分子に由来する情報
を使用して単離された、または作製された分子を指す。例えば、Ｃａｓ９単一突然変異体
ニッカーゼおよびＣａｓ９二重突然変異体ヌル－ヌクレアーゼ（不活性化されたＣａｓ９
、「デッド」Ｃａｓ９またはｄＣａｓ９としても知られる）は、野生型Ｃａｓ９タンパク
質に由来する。
２種以上のポリヌクレオチド（または２種以上のポリペプチド）との関連において、用
語「実質的に同一の」とは、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査によって
最大限対応するように比較されアラインされた場合に、少なくとも約６０％、少なくとも
約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、約９０～９５％、少なくとも約９
５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれを超えるヌクレオチド（また
はアミノ酸）配列同一性を有する配列または部分配列を指す。好ましくは、ポリヌクレオ
チド間の「実質的な同一性」は、少なくとも約２０ヌクレオチドの長さの、少なくとも約
５０ヌクレオチドの長さの、少なくとも約１００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約２
００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約３００ヌクレオチドの長さの、少なくとも約５
００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドの領域にわたって、またはポリヌクレオチド
の全長にわたって存在する。好ましくは、ポリペプチド間の「実質的な同一性」は、少な
くとも約５０個のアミノ酸残基の長さの、少なくとも約１００個のアミノ酸残基の長さの
ポリペプチドの領域にわたって、またはポリペプチドの全長にわたって存在する。
本明細書において開示されるように、いくつかの範囲の値が提供される。また、その範
囲の上限と下限の間に介在する値は各々、下限の単位の少数第１位まで、具体的に考慮さ
れることが理解される。述べられた範囲によって包含される、より小さい範囲または介在
する値も各々、具体的に考慮される。用語「約」とは、一般に、示された数のプラスまた
はマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は、９％～１１％の範囲を示し得、「約
２０」は、１８～２２を意味し得る。四捨五入することなど、「約」のその他の意味は、
文脈から明らかとなり得、そのため、例えば、「約１」は、０．５～１．４を意味するこ
ともある。
［ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ媒介性の配列特異的結合および／もしくは切断またはニッキング］
図１に示されるものは、ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性の配列特異的切断の図
である。ガイドＲＮＡは、５’ドメイン内の例示的な２０ヌクレオチド（または２０ｎｔ
、ヌクレオチドはしばしば「ｎｔ」と略される）のガイド配列（その他のガイド配列は、
例えば、約１５～約３０ｎｔの長さであり得る）、内部に位置する塩基対形成しているス
テム、および３’ドメインを有するｓｇＲＮＡとして表されている。ガイド配列は、ＤＮ
Ａ標的中の例示的な２０ｎｔ標的配列に対して相補的である。ステムは、ｃｒＲＮＡ中の
リピート配列に対応し、ｔｒａｃｒＲＮＡ中の配列に対して相補的である。ガイドＲＮＡ
の３’ドメインは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼと結合するｔｒａｃｒＲＮＡの３’ドメインに
対応する。Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体は、標的ＤＮＡ配列またはＣａｓ９によって認識さ
れるＰＡＭ配列のすぐ上流のプロトスペーサーと結合し、切断する。図１では、３ｎｔの
ＰＡＭ配列が例示されているが、４ｎｔ、５ｎｔおよびさらに長いＰＡＭ配列を含むその
他のＰＡＭ配列が公知である。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集のためのガイドＲＮＡは、ＲＮＡ－タンパク質複合体
で機能し、該複合体で、ＲＮＡは、タンパク質のスキャフォールドとしても、二本鎖ＤＮ
Ａ標的の配列認識としても働く。複合体は、先ずヌクレオチドＰＡＭ配列をスキャンする
ことによって、ゲノムＤＮＡを認識する。ＰＡＭ配列が同定されると、ＲＮＡ－タンパク
質複合体は、ゲノムＤＮＡ標的とガイドＲＮＡのガイド配列間でのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖
の形成を試みる。この二本鎖は、先ず、ｇＲＮＡの「シード領域」のＣａｓタンパク質媒
介性の塩基対形成によって開始され、前記シード領域は、およそ１０ヌクレオチドの長さ
であると考えられる。シード領域の結合後、安定したＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖が、ガイドＲ
ＮＡの５’末端に残存ヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって形成され、これは
、通常、２０ヌクレオチドのＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖をもたらし、続いてタンパク質複合体
による標的ＤＮＡの二本鎖切断が起きる。
ゲノム編集に対するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク質複合体の有用性を可能
にするための重要な態様は、配列特異性である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパ
ク質複合体は、修復または組換えによって遺伝子を不活性化または修飾するためのプロセ
スの第１段階として、ゲノムＤＮＡを切断する。このプロセスでは、意図していない「オ
フターゲット」部位でのゲノムＤＮＡの切断は、そのゲノム内の他の位置で配列突然変異
を生じさせるなどの、望ましくない結果をもたらし得る。現在、これらのオフターゲット
切断事象は、スクリーニング技術によって検出されるか、育種技術によって除去されるか
、または無視される。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク質複合体は、原核生物に
おいて適応免疫系として進化した。これらの複合体の配列特異性の改善は、真核生物ゲノ
ムにおけるツールとして幅広い有用性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＮＡ－タンパク
質複合体に向けての有意な前進および技術革新となるだろう。
配列特異性は、生物の全ゲノム内の標的部位または連続するヌクレオチドの連なりをス
キャンし、検出し、それと結合することができるｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によ
って始まる。これを行うために、標的配列は、連続するヌクレオチドの連なりまたは配列
が、対象の生物の全ゲノム内に１つだけ存在し、かつ所望のゲノム編集部位に位置するの
に十分な長さである必要がある。ゲノム内での唯一性を付与するために必要な連続するヌ
クレオチドの連なり、またはポリヌクレオチドの長さは、その特定のポリヌクレオチドの
「情報内容」によって決まる。大部分の真核細胞および生物について、標的ポリヌクレオ
チドは、全ゲノムにおいて唯一無二であるために十分な情報内容を有するために長さが１
８～２２ヌクレオチドの範囲である必要がある（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６），
１８８，４１５－４３１）。一般に、標的ポリヌクレオチドが長いほど、情報内容は多く
、その配列がゲノム内に１つだけ存在する可能性が高くなり、１９ヌクレオチド配列は、
１８ヌクレオチド配列より多くの情報内容を有し、２０ヌクレオチド配列は、１９ヌクレ
オチド配列より多くの情報内容を有する、等々である。しかし、唯一無二な２０ヌクレオ
チド配列は、そのゲノム内のどこかの異なる２０ｎｔ配列中の１ヌクレオチドではなく全
ヌクレオチドの配列とマッチする可能性もあり、単一のミスマッチを含有する配列は、オ
フターゲット部位を含む。２０ヌクレオチドターゲット配列に対するオフターゲット配列
へのガイド配列の相対的結合は、ガイド配列とオンターゲット配列の間およびオフターゲ
ット配列の間のそれぞれの結合エネルギーおよび速度論的平衡によって制御される。
オリゴヌクレオチドの結合エネルギー差は制御され、ＤＮＡおよびＲＮＡ結合の協同効
果によって最大化され得る。ＤＮＡおよびＲＮＡ結合についてハイブリダイゼーション中
の協同性が２つの方法で定義されている。第一に、オリゴヌクレオチドが、その個々のヌ
クレオチドサブユニットに結合し始めた場合、ヌクレオチドサブユニットの相補的核酸塩
基との結合は、オリゴヌクレオチド配列内の次の隣接サブユニットの逐次的結合にプラス
の効果をもたらす。同時に、個々のヌクレオチドの結合解除は、次の隣接ヌクレオチドの
結合にマイナスの効果をもたらす。ミスマッチが塩基対形成を試みた場合、ミスマッチ対
の結合解除は、隣接ヌクレオチド対の結合にマイナスの効果をもたらし、同様に、マッチ
したヌクレオチド対がうまく結合した場合、それは、隣接ヌクレオチド対の結合にプラス
の効果をもたらす。全体的なエネルギーの観点から、オリゴヌクレオチドが、漸増するい
くつもの段階を踏んで結合し、かつ結合解除を起こす個々のヌクレオチドサブユニットと
して結合し始めた場合、中間状態は、それらの段階が互いに独立して起こるシステムと比
較して確率的に割合が少なくなる。言い換えると、結合状態または非結合状態以外の動力
学的状態の自由度はわずかであり、数もわずかである。分子の観点から、ヌクレオチドの
連なりは、やや剛性であり、ヌクレオチドが結合すると、隣接ヌクレオチドには、結合に
つながるもの以外に採用することができるエネルギーの確証（ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ ｃｏ
ｎｆｉｒｍａｔｉｏｎｓ）がほとんどない。ＤＮＡとＲＮＡの協同的結合を保持するため
の分子の剛性の必要性は、ほぼ３０年前にＺ．Ａ．Ｓｈａｂａｒｏｖａ（１９８８）Ｂｉ
ｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．１４：１２，１６５６－６２によって初めて実証された。化学ライ
ゲーションを使用することによって１，３－ジアミノプロパンまたは１，３－プロパンジ
オール結合により共有結合によって連結された、各々が７ヌクレオチドの長さの２つのオ
リゴヌクレオチドから、１４ヌクレオチドの長さを有するＤＮＡオリゴヌクレオチドが構
築された。その可動性オリゴヌクレオチドを、相補的な１４ヌクレオチドのＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドと結合させ、結合エネルギーが測定された。天然ＤＮＡ主鎖の剛性がないと
き、可動性１４ヌクレオチドＤＮＡの一本鎖は、協同性を欠く２つの独立した７ヌクレオ
チドＤＮＡオリゴヌクレオチドであるかのごとく、有意により低いエネルギーで結合した
。協同性として公知のこの観察された現象は、非協同的な系で見られるであろうものより
高いマッチ対ミスマッチの区別を可能とするものであり、およびヌクレオチド配列の特異
性を増大させるための重要な構成要素である。Ｃａｓタンパク質は、シード領域の１０ヌ
クレオチドをＡ型ヘリックスの一本鎖部分に事前に秩序づけることが結晶構造によって示
されてきた。ＲＮＡのＡ型ヘリックスへの事前の秩序づけは、ｇＲＮＡのガイド配列が採
ることができる動力学的状態の数を制限し、したがって、シード領域におけるＤＮＡ／Ｒ
ＮＡハイブリダイゼーションの協同性を増大させる。
ヌクレオチドの連なりと前記ヌクレオチドの相補的な連なりとの全結合エネルギーは、
通常は融解温度（Ｔｍ）によって定義される。融解温度は、結合している２本のヌクレオ
チドの連なりまたは鎖（すなわち、塩基対形成またはハイブリダイゼーションによって結
合しているもの）を、それらが５０％結合しており、５０％非結合であるところまで解離
させるのに必要な温度である。融解温度は、濃色効果として公知の現象によって測定され
る。ＵＶ吸収は、２本の結合しているオリゴヌクレオチド鎖が加熱によって分離されてい
るときに増大される。オリゴヌクレオチドの熱変性に起因して二重ヘリックス構造が巻き
戻されて一本鎖オリゴヌクレオチドが形成される。溶液中の結合している２つのオリゴヌ
クレオチドが、それらの融解温度より高い温度に加熱されると、二本鎖は巻き戻って、二
本鎖より多くの光を吸収する２本の一本鎖を形成する。ＵＶ吸光度が、温度の関数として
グラフに描かれる場合、二本鎖が解離し始める時点でシグモイド曲線が得られ、そのシグ
モイド曲線の中点がＴｍとして定義される。
図４は、オリゴヌクレオチド二本鎖が加熱によって別個の鎖に分離するにつれてＵＶ吸
光度がどのように上昇するのかを実証するグラフである。シグモイド曲線は、別個の鎖へ
の二本鎖の解離を表し、シグモイド曲線の中点が、二本鎖のＴｍである。この曲線は、生
理的塩濃度での２０ヌクレオチドＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度が、およそ５０℃であ
ることを示す。
オリゴヌクレオチド二本鎖は、二本鎖の５０％しか形成されない融解温度で最大のマッ
チ対ミスマッチ特異性を有する。この温度で、二本鎖の結合および結合解除が高い協同度
を有するか、または急勾配のシグモイド曲線を示す場合、オフターゲットポリヌクレオチ
ドでの単一のミスマッチによって、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが阻止
されることになる。遺伝子編集実験が３７℃で実施される場合には、その標的との結合が
３７℃のＴｍを有することになるガイドＲＮＡを使用してマッチ対ミスマッチの最良の判
別が達成されることになる。ここでの問題点は、この態様が、一本鎖核酸の熱力学のみに
基づいており、これとは対照的に、３７℃のＴｍを有するガイドＲＮＡが、その二本鎖標
的と部分的にしか結合せず、その結果、低い全活性または遺伝子編集をもたらすことにな
る点である。それでもなお、活性をモニターしながら漸進的にガイドＲＮＡのその標的へ
の全Ｔｍを低下させることによって、特異性は増大されるはずである。この原理は、Ｙａ
ｎｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２，２７９－
２８４によって、ガイドＲＮＡを２０ヌクレオチドから１７ヌクレオチドの長さに末端切
除することによって実証され、彼らは、オンターゲットゲノム変種効率を犠牲にすること
なく特定のオフターゲット部位での特異性の５，０００倍増大を主張した。生理的塩条件
でのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖中のＲＮＡの末端切除は、その二本鎖のＴｍを塩基対あたり約
２℃低下させる。ｇＲＮＡ中のガイド配列の１７ヌクレオチドへの末端切除は、およそ６
℃、結合エネルギーを減少させ、その結果として二本鎖Ｔｍはおよそ４２℃になる。しか
し、ガイド配列が２０ヌクレオチドから１７ヌクレオチドに末端切除された場合、有意な
情報内容が失われ、その結果、全ゲノムにわたって１７ｎｔガイド配列と同一または同様
のオフターゲット部位数の増加をより容易に見いだすことができる。より有用なアプロー
チは、結合と結合解除の協同性を保持しながら化学修飾によって２０ヌクレオチドＲＮＡ
／ＤＮＡ二本鎖の結合エネルギーを減少させるアプローチであるだろう。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓゲノム編集のためのガイドＲＮＡ、または標的ポリヌクレオチド
の切断またはニッキングのためのガイドＲＮＡは、単一ガイドＲＮＡまたは２ピースデュ
アルガイドＲＮＡのいずれかとして存在し、前記２ピースは、ｃｒＲＮＡ（クラスター化
したリピートＲＮＡ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｐｅａｔ ＲＮＡ））およびｔｒａｃｒ
ＲＮＡ（トランス活性化性のクラスター化したリピートＲＮＡ（ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｖ
ａｔｉｎｇ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｐｅａｔ ＲＮＡ））とも称される。上記図２Ａ
および２Ｂを参照のこと。図５Ａもまた、単一ガイドＲＮＡまたは２ピースのデュアルガ
イドＲＮＡ５０１（この場合、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント
は、ハイブリダイズされた二本鎖を形成する）を示す。左から右へ（すなわち、ガイドＲ
ＮＡの５’末端から３’末端へ）進めて、図５Ａは、一般に、ガイドＲＮＡ上の伸長部５
０３（オーバーハングと称されることもある）と、サンプリングおよびロッキング領域５
０５と、Ｃａｓタンパク質結合シード領域５０７（通常は１０ｎｔ部分）と、デュアルガ
イドステム５０９またはシングルガイドステムループ５１１と、ｔｒａｃｒＲＮＡ領域５
１３とを示す。Ｃａｓ９タンパク質は、おそらく５０３を除いて、これらのｇＲＮＡ領域
のいずれかまたはすべてに結合することができる。ガイド配列は、ロッキング、サンプリ
ングおよびシード領域を含む。単一ガイドＲＮＡとデュアルガイドＲＮＡの両方について
、ガイドＲＮＡの５’末端上の約２０ヌクレオチドのガイド配列は、標的ＤＮＡと結合し
、安定した二本鎖を形成するものである。同様の配列のその他の部位との競合ハイブリダ
イゼーションに対するこのハイブリダイゼーション結合が、標的に対するｇＲＮＡの全特
異性、およびしたがってｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によるゲノム編集またはゲノ
ム不活性化の特異性を決める。
ガイドＲＮＡのそれらの標的ポリヌクレオチドとの結合は、ガイド配列の３’末端によ
り開始されるＣａｓ９媒介性シードＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖形成によって起こる。最初のシ
ード二本鎖が形成されると、ｇＲＮＡは、その５’末端に向かってジッパーのようにハイ
ブリダイズし続けるはずである。
図５Ｂは、ｇＲＮＡ５０１およびゲノムＤＮＡ５１５からのシード二本鎖５１７の最初
の形成後にヌクレオチドの結合が続いてサンプリング領域を通って進行する方法を示す。
サンプリング領域は、シード領域に隣接する領域であり、これらのヌクレオチドのハイブ
リダイゼーション結合は、二本鎖の結合エネルギーが、その結合が起こる温度とほぼ同等
になるまで、進行する。この領域における結合および結合解除の速度は、結合対非結合Ｒ
ＮＡ（例えば、５０１対５１９、または５０１対５２１）のより大きい平衡によって制御
され、この平衡もまた、Ｃａｓ９タンパク質の相互作用によって制御される。生理的塩濃
度かつ３７℃においてゲノムＤＮＡとともにＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成するガイドＲＮ
Ａの場合、通常のサンプリング領域は、１５～１６ヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖
がおおよそ３７℃のＴｍを有するという事実に基づいて、１０ヌクレオチドのシード領域
のすぐ５’側の５～６ヌクレオチドにわたる。結合ヌクレオチド数がＴｍ閾値を超えると
、結合は、ロッキング領域を通って、ガイド配列の２０ヌクレオチドが結合した状態にな
るまで、逐次的に継続し、標的相補的伸長部または５’ハングがガイド配列の５’末端に
存在する場合、結合はさらに進行し得る。結合がロッキング領域に達すると、結合ＲＮＡ
対非結合ＲＮＡ（例えば、５０１対５２３）間の平衡は、その結合解除、または標的ポリ
ヌクレオチドの放出が、そのときには有意に結合またはハイブリダイズ状態の方向にある
結合対非結合ＲＮＡの全平衡によってマイナスの影響を受けるように、変化する。結合対
非結合ＲＮＡのより大きい平衡が特異性にもたらす効果が、Ｓｌａｙｍａｋｅｒ ｅｔ
ａｌ．（２０１６），“Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕ
ｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ３５１，８４－８によって明らかにされた。Ｓｌａｙｍａｋｅｒらは、タンパク質
の核酸結合溝（またはｎｔ溝）中の正の電荷を有するアミノ酸を、中性電荷を有するアラ
ニン残基に変換することによって、オフターゲットのインデル形成が減少したＣａｓ９タ
ンパク質を遺伝子操作により作製したことを報告した。これらの変化は、Ｃａｓ９によっ
て媒介されるガイドＲＮＡの二本鎖標的ＤＮＡに対する全親和性を低下させ、塩基対認識
を含むＲＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションに親和性がより大きく依存するようにさせ
る。
図５Ｃは、個々の塩基対の結合エネルギーを減少させるが、高い協同性レベルを保持す
るヌクレオチドの化学修飾を、ｇＲＮＡ５２５のシードおよびサンプリング領域において
使用して、５または６ヌクレオチドを超えてサンプリング領域を伸長する方法を示す。こ
の効果は、化学修飾が、結合が起こる温度と同等のハイブリダイゼーション結合エネルギ
ーを獲得するために必要なヌクレオチドの数を増加させるので、ガイドＲＮＡ５２５のゲ
ノムＤＮＡ５１５との結合の特異性を有意に増大させることができる。同様の効果で、結
合対非結合ＲＮＡ（５２５対５２７、または５３１対５３３）のより大きい平衡をシフト
させるために必要なヌクレオチドの総数が増加され、これは、配列特異性の全体的増加が
結果として得られるように計算される。
ヌクレオチド修飾を使用して、複素環式核酸塩基、糖、およびヌクレオチド間リン酸連
結の、ガイド配列部分内の３つの異なるモチーフのいずれかによって、部分的に相補的な
オフターゲットポリヌクレオチドに向けてのｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の活性を
減少させることができるという発見は、驚くべきことであり、予期されなかった。化学修
飾（複数でもよい）を有するｇＲＮＡでは、修飾が、非特異的結合を有意に増加させない
ことまたはハイブリダイゼーションの協同性を有意に低下させないことが重要である。ど
ちらかまたは両方ともが、Ｃａｓタンパク質によるオフターゲット結合、ニッキングまた
は切断を促進することができ、これは望ましくないからである。
ガイド配列中の核酸塩基の中で、塩基対形成に利用可能な原子の数を減少させ、このよ
うにして、ハイブリダイゼーションを駆動する水素結合の可能性を低下させることができ
る。しかし、水素結合の可能性を低下させることはまた、代替塩基対形成によるオフター
ゲットポリヌクレオチド配列の認識を増加させ得る。これを回避するために、ガイド配列
中の高特異性塩基対形成を使用することが重要である。高い特異性を促進するための核酸
塩基の修飾の例は、ガイド配列中のウリジンの代わりに２－チオウリジンを組み込むこと
である。２つの水素結合によってアデノシンヌクレオチドと通常は結合するウリジンヌク
レオチドは、その代わりにグアニンヌクレオチドと結合して、かなり弱い塩基対を生じさ
せることができ、この塩基対は、Ｇ－Ｕゆらぎ対と称されることが多い。２－チオウリジ
ンがウリジンの代わりに使用される場合、２－チオウリジンは、安定したＧ－Ｕゆらぎ対
を形成するとしても少数のみである。なぜなら、ウラシル塩基のＣ２位の硫黄置換基は水
素結合アクセプターとして役立つことができないからである。
Figure 2022137068000002
この同一の戦略は、例えば、２－チオシチジンまたは４－チオグアノシンのどちらかを
使用することにより、可能性ある水素結合の数を３から２に低減させることによって、通
常のグアノシン／シチジン塩基対の水素結合の可能性を低下させるために使用することが
できる。修飾Ｇ－Ｃ塩基対中で水結合を形成するそれらの減少の可能性が、ここで例証さ
れる。
Figure 2022137068000003
リボヌクレオチドの糖部分の修飾もまた、相補的ＤＮＡ鎖へのガイド配列の親和性を低
下させるために使用することができる。これは、２つの方法で行うことができ、第１の方
法は、糖パッカーを変化させる方法であり、第２の方法は、立体的な混み合いによってＲ
ＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を変形させる方法である。一般に、糖パッカーは、２’－エンド（ｓ
ｏｕｔｈ、ＤＮＡ様）糖パッカー、または３’－エンド（ｎｏｒｔｈ、ＲＮＡ様）糖パッ
カーの、２つの状態のうちのどちらか一方であるするように記載される。２’－エンドパ
ッカーは、塩基対形成に対する不安定化効果があると考えられ、これは、グリコシド結合
のねじれ角の変化の結果であり、したがって、親和性が最も高い塩基スタッキング構造の
形成を防止すると考えられる。塩基対形成に対する不安定化効果を生じさせる結果となり
得るＲＮＡへの修飾の例は、デオキシリボース、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビ
ノフラノシル、２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル、２’－Ｏ－フェニル、
２’－チオフェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プ
ロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチル
オキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルア
ミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノおよび２’－Ｏ－置換フェニル置換基である。
ヌクレオチド間結合の修飾は、塩基対ハイブリダイゼーションの協同性を維持しながら
ヌクレオチドの結合親和性を低下させることもできる。これらの例は、ホスホノ酢酸、チ
オホスホノ酢酸、ホスホノカルボン酸、チオホスホノカルボン酸、ホスホノプロピオン酸
、チオホスホノプロピオン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネート、およびボ
ラノホスホネートである。
特定の実施形態では、全ガイドＲＮＡの結合エネルギーを増加または減少させる糖修飾
または核酸塩基修飾を加えて、ガイドＲＮＡへのその他の修飾の組込みからの結合エネル
ギーを調節またはさらに微調整することができる。一例として、２’－Ｏ－メチル－チオ
ホスホノ酢酸（ＭＳＰ）の組込みは、非修飾ガイド配列と比較して≒１．５度、ガイドＲ
ＮＡの結合エネルギーを減少させることになる。２’－Ｏ－メチルヌクレオチドは、ガイ
ド配列の他の箇所に組み込まれると、全結合エネルギーを≒０．２度増加させることにな
り、結果として得られるガイドＲＮＡは、非修飾ガイドＲＮＡと比較して≒１．３度の全
結合エネルギーの減少を有することになる。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－Ｏ－
Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ
－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含み、これは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２
’－ＭＯＥとしても公知である。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－ハロ、例えば、
２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌ、または２’－Ｉを含む。特定の実施形態では、糖修
飾は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－Ｈ（例えば、２’－
デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－アラビノまたは
２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖修飾は、２’－ＬＮＡまたは２’－
ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む。
特定の実施形態では、全ガイドＲＮＡの結合エネルギーを増加または減少させるヌクレ
オチド糖修飾または核酸塩基修飾を同一ヌクレオチドに組み込むことができ、この場合、
修飾ヌクレオチドの結合エネルギーを調節するためにホスホジエステル連結が修飾される
。一例として、３’－ホスホノカルボン酸連結を、糖修飾、例えば、２’－Ｏ－メチル、
２’－Ｆ、または２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）とともに使用することができる。特
定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、例えば
、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）を含み、これは、２’－
Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても公知である。特定の実施形態で
は、糖は、２’－ハロ、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌ、または２’－Ｉを
含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖は、２
’－Ｈ（例えば、２’－デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖は、２
’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＬＮ
Ａまたは２’－ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む
。
［ＩＩＩ．ガイドＲＮＡ］
少なくとも１つの態様では、本発明は、ガイドＲＮＡ機能性を有する化学修飾されたガ
イドＲＮＡを含む。化学修飾されたガイドＲＮＡは、少なくとも１つの特異的増強性修飾
を含み、特異性増強より多くの機能または特異性増強とは異なる機能を有するその他の化
学修飾を含むこともある。
非天然であるか天然であるかに関わらず４種の標準リボヌクレオチド、すなわち、Ａ、
Ｃ、ＧおよびＵ以外の任意のヌクレオチド（例えば、シュードリジン、イノシンまたはデ
オキシヌクレオチド）を含むガイドＲＮＡは、化学修飾されたガイドＲＮＡである。同様
に、天然ホスホジエステルヌクレオチド間連結以外の任意の骨格またはヌクレオチド間連
結を含むガイドＲＮＡは、化学修飾を有し、従って、化学修飾されたガイドＲＮＡである
。特定の実施形態では、保持される機能性として、Ｃａｓタンパク質と結合することが挙
げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、標的ポリヌクレオチドと結合
することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、Ｃａｓタンパク
質またはｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を、標的ポリヌクレオチドに標的化すること
が挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性として、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパ
ク質複合体によって標的ポリヌクレオチドにニックを入れることが挙げられる。特定の実
施形態では、保持される機能性として、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって標的
ポリヌクレオチドを切断することが挙げられる。特定の実施形態では、保持される機能性
は、遺伝子操作されたＣａｓタンパク質を有する人工ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系を含む、Ｃ
ａｓタンパク質を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系におけるガイドＲＮＡの任意のその他の
公知の機能である。特定の実施形態では、保持される機能性は、天然ガイドＲＮＡの任意
のその他の機能である。
［Ａ．例示的修飾］
特定の実施形態では、特異性増強修飾は、デオキシリボースヌクレオチド；２’－デオ
キシ－２’－フルオロアラビノフラノシルヌクレオチド；２’－デオキシ－２’－フルオ
ロリボフラノシルヌクレオチド；２’－Ｏ－フェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－
メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’－
メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エ
チルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノもしくは２’－Ｏ－置
換フェニルを有する糖；またはそれらの組合せである。特定の実施形態では、特異性増強
修飾は、ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピ
オン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネートもしくはボラノホスホネート、ま
たは前述のもののいずれかの組合せである。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド糖修飾は、デオキシリ
ボース；２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル；２’－デオキシ－２’－
フルオロリボフラノシル；ならびに２’－Ｏ－フェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’
－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル、２’－アリルフェニル、２’
－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－
エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロピルアミノおよび２’－Ｏ－置
換フェニルを有する糖からなる群から選択される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中
に組み込まれるヌクレオチド間連結修飾は、ホスホロチオエート「Ｐ（Ｓ）」（Ｐ（Ｓ）
）、ホスホノ酢酸「ＰＡＣＥ」（Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ－））などのホスホノカルボン酸（Ｐ
（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、チオホスホノ酢酸「チオＰＡＣＥ」（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２ＣＯＯ
－））などのチオホスホノカルボン酸（（Ｓ）Ｐ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ）、メチルホスホ
ネート－Ｐ（ＣＨ３）などのアルキルホスホネート（Ｐ（Ｃ１－３アルキル）、ボラノホ
スホネート（Ｐ（ＢＨ３））およびジチオリン酸（Ｐ（Ｓ）２）からなる群から選択され
る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡに組み込まれるヌクレオチド間連結修飾は、ホス
ホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピオン酸、メチ
ルホスホネート、メチルチオホスホネートおよびボラノホスホネートからなる群から選択
される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる核酸塩基（「塩基」）修飾は、２
－チオウラシル（「２－チオＵ」）、２－チオシトシン（「２－チオＣ」）、４－チオウ
ラシル（「４－チオＵ」）、６－チオグアニン（「６－チオＧ」）、２－アミノプリン、
シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニ
ン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシトシン（「５－
メチルＣ」）、５－メチルウラシル（「５－メチルＵ」）、５－ヒドロキシメチルシトシ
ン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－エチニルシトシン
、５－アミノアリルウラシル（「５－アミノアリルＵ」）、５－アミノアリル－シトシン
（「５－アミノアリルＣ」）、脱塩基ヌクレオチド、構造不定の核酸（「ＵＮＡ」）、イ
ソグアニン（「イソＧ」）、イソシトシン（「イソＣ」）［“Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｉｎ
ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｅｗ Ｂａｓｅ ｐａｉｒ ｉｎｔｏ ＤＮＡ
ａｎｄ ＲＮＡ Ｅｘｔｅｎｄｓ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｌｐｈａｂｅｔ．”Ｐｉ
ｃｃｉｒｉｌｌｉ，Ｊ．Ａ．；Ｋｒａｕｃｈ，Ｔ．；Ｍｏｒｏｎｅｙ，Ｓ．Ｅ．；Ｂｅｎ
ｎｅｒ，Ｓ．Ａ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４３，３３に記載されるような］、５－
メチル－２－ピリミジン（Ｒａｐｐａｐｏｒｔ，Ｈ．Ｐ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ，３２，３０４７に記載されるような）、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）およびｙ（
Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、１種または複数の同位体的修飾が、ヌクレオチド糖、核酸塩基、
ホスホジエステル連結および／またはヌクレオチドホスフェート上に導入される。このよ
うな修飾として、トレーサーとして使用される１種または複数の１５Ｎ，１３Ｃ、１４Ｃ
、重水素、３Ｈ、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ原子またはその他の原子または元素を含む
ヌクレオチドが挙げられる。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中に組み込まれる「末端」修飾は、ＰＥＧ（ポリエ
チレングリコール）、炭化水素リンカー（ヘテロ原子（Ｏ，Ｓ，Ｎ）置換炭化水素スペー
サー、ハロ置換炭化水素スペーサー、ケト－、カルボキシル－、アミド－、チオニル－、
カルバモイル－、チオノカルバマオイル含有炭化水素スペーサーを含む）、スペルミンリ
ンカー、例えば、６－フルオレセイン－ヘキシルなどのリンカーと結合している蛍光色素
（例えば、フルオレセイン、ローダミン、シアニン）を含む色素、クエンチャー（例えば
、ダブシル、ＢＨＱ）およびその他の標識（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、アクリ
ジン、ストレプトアビジン、アビジン、ペプチドおよび／またはタンパク質）からなる群
から選択される。特定の実施形態では、「末端」修飾は、ガイドＲＮＡの、オリゴヌクレ
オチド（デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、ペプチド、タ
ンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンおよび／またはその他の分
子を含む別の分子とのコンジュゲーション（または連結）を含む。特定の実施形態では、
ガイドＲＮＡ中に組み込まれる「末端」修飾は、例えば、ホスホジエステル連結として組
み込まれており、ガイドＲＮＡ中の２つのヌクレオチド間のどこにでも組み込まれ得る、
２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエ
ステル）リンカー（以下に表される）などのリンカーを介してガイドＲＮＡ配列中の内部
に位置する。
Figure 2022137068000004
その他のリンカーとして、例えば、例として、これに限定されないが
Figure 2022137068000005
 を含む。
特定の実施形態では、末端修飾は、アミン、チオール（またはスルフヒドリル）、ヒド
ロキシル、カルボキシル、カルボニル、チオニル、チオカルボニル、カルバモイル、チオ
カルバモイル、ホスホリル、アルケン、アルキン、ハロゲンまたは官能基で終端したリン
カーなどの末端官能基を含み、そのいずれかは続いて、所望の部分、例えば、蛍光色素ま
たは非蛍光標識またはタグまたは例えば、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオ
キシヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タン
パク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂質、葉酸、ビタミンなどの任意のその他の分子と
コンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、これらに限定されないが、Ｎ－ヒドロ
キシスクシンイミド、イソチオシアネート、ＤＣＣ（またはＤＣＩ）を介したカップリン
グを含む当技術分野で周知の標準化学および／または任意のその他の標準方法を使用する
。
特定の実施形態では、標識または色素は、ｇＲＮＡ中の修飾されたヌクレオチドに結合
またはコンジュゲートされる。蛍光色素または非蛍光標識もしくはタグ（例えば、ビオチ
ン、アビジン、ストレプトアビジンまたは１５Ｎ，１３Ｃ、１４Ｃ、重水素、３Ｈ、３２
Ｐ、１２５Ｉなどといった同位体標識を含有する部分）などのその他の部分または例えば
、オリゴヌクレオチド（アプタマーを含む、デオキシヌクレオチドおよび／またはリボヌ
クレオチドを含む）、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖、オリゴ糖、ステロイド、脂
質、葉酸、ビタミンもしくはその他の分子などの任意のその他の分子のコンジュゲーショ
ンは、いわゆる「クリック」ケミストリーまたはいわゆる「スクレート」コンジュゲーシ
ョンケミストリーを使用して実現され得る。「クリック」ケミストリーとは、例えば、参
照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである、Ｅｌ－Ｓａｇｈｅｅｒ，Ａ
．Ｈ ａｎｄ Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．“Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ
”，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．，２０１０，３９，１３８８－１４０５ ａｎｄ Ｍｏ
ｊｉｂｕｌ，Ｈ．Ｍ．ａｎｄ ＸｉａｏＨｕａ，Ｐ．，ＤＮＡ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｃｉ．Ｃｈｉｎａ Ｃｈｅｍ．，２０１４，５７：
２，２１５－３１に記載されるような以下のスキーム：
Figure 2022137068000006
 によって示されるような２つの部分間のトリアゾロ連結につながる、アジド部分を用いる
アルキン部分の［３＋２］環化付加を指す。
特定の実施形態では、コンジュゲーションは、π－コンジュゲートジエン部分の、アル
ケン部分を用いるディールズ・アルダー［４＋２］環化付加などの代替的な環化付加によ
って実現され得る。
「スクアレート」コンジュゲーションケミストリーは、スクアレート誘導体を介し、そ
れぞれがアミンを有している２つの部分を連結して、スクアレート部分を含有するスクア
レートコンジュゲートをもたらす（例えば、参照によりその全文の内容が本明細書の一部
をなすものである、Ｔｉｅｔｚｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１２
４，１２１５－２１を参照のこと）。例えば、以下のスキームに記載されるように、リン
カーアミンを含有するフルオレセインが、スクアレートリンカーを介してアミンを含有す
るオリゴリボヌクレオチドにコンジュゲートされる。スクアレートリンカーの一例は、以
下のスキーム中に表されている。
Figure 2022137068000007
［Ｂ．少なくとも１つの特異性増強修飾を有するガイドＲＮＡ］
一態様では、本技術は、修飾されたｇＲＮＡおよび任意選択的に特異性増強修飾により
構成される、少なくとも１つの特性増強性修飾を有するガイドＲＮＡを提供する。
特定の実施形態では、少なくとも１つの特異性増強修飾は、ガイドＲＮＡのガイド配列
またはｃｒＲＮＡセグメント内にある。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒＲＮＡのガイ
ド配列内にある。特定の実施形態では、修飾は、ガイド配列またはｃｒＲＮＡセグメント
の５’末端の最初の５つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、修飾は、ガイド
配列またはｃｒＲＮＡセグメントの最初の４つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態
では、修飾は、ガイド配列またはｃｒＲＮＡセグメントの最初の３つのヌクレオチド内に
ある。特定の実施形態では、修飾はまた、ｃｒＲＮＡセグメントの５’－オーバーハング
内にある。ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎ
からなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整
数である、特定の実施形態では、少なくとも１つの特異性増強修飾は、ヌクレオチド４－
Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド５－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１０
－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド
１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１９－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１
４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１８－Ｎ内にある。特定の実施形態では、修飾は、ヌクレオチ
ド４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、または
それらの組合せにおけるものである。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、ｇＲＮＡのガイド配列部分に１、２、３
、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、
１９または２０の特異性増強修飾されたヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡの他の部分または
セグメントに１００以下のさらなる修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では
、修飾されたｇＲＮＡは、ガイド配列部分上に５’伸長部またはオーバーハングを含み、
前記伸長部は、１～２０ヌクレオチドの長さであり、これは、ｇＲＮＡのガイド配列部分
中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６
、１７、１８、１９または２０の特異性増強修飾されたヌクレオチドに加えて、１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８
、１９または２０の特異性増強修飾されたヌクレオチドを含み、ｇＲＮＡの他の部分に１
００以下のさらなる修飾されたヌクレオチドを任意選択的に含む。特定の実施形態では、
ｇＲＮＡのすべてのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態では、すべての修飾は同
一である。特定の実施形態では、すべての修飾されたヌクレオチドは、同一種類の修飾を
有する。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、異なって修飾されたヌクレオチド
の組合せを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、２つ以上の修飾されたヌ
クレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、３つ以上の修飾された
ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは連続して配置され
る。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、修飾されたヌクレオチドの少なくとも
１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも
２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、
１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３
１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４
、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチ
を含む。修飾されたヌクレオチドは各々、１種または複数の種類の修飾を独立に含み得る
。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡの配列中、修飾されたヌクレオチドは連続し
ないか、すべてではなく一部が連続している。
特定の実施形態では、化学修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分内である。ガイドＲＮＡが
、デュアルガイドＲＮＡである場合、５’部分内の化学修飾は、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮ
Ａセグメントの５’部分内の修飾を指し、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの５’部分内の修
飾を指さない。ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである場合、そのガイドＲＮＡは、ｃ
ｒＲＮＡセグメント内に位置する１つの５’部分を有する。特定の実施形態では、修飾は
、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、
修飾は、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態
では、修飾は、ガイドＲＮＡの３’部分内である。特定の実施形態では、修飾は、ガイド
ＲＮＡの３’部分の最後の５つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修飾は、
ガイドＲＮＡの３’部分の最後の３つのヌクレオチド内である。特定の実施形態では、修
飾は、ガイドＲＮＡの内部領域内（すなわち、５’末端と３’末端の間）である。
特定の実施形態では、化学修飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護
するために、またはその他の目的のために、ガイドＲＮＡの５’部分または３’部分中に
、特に、５’部分の最初の５もしくは１０のヌクレオチド内に、または３’部分の最後の
５もしくは１０のヌクレオチド内に組み込まれる。いくつかのその他の実施形態では、修
飾は、例えば、ＲＮＡをヌクレアーゼによる分解から保護するために、またはその他の目
的のために、ガイドＲＮＡの５’部分および３’部分の両方中に、特に、５’部分の最初
の５または１０のヌクレオチド内および３’部分の最後の５または１０ヌクレオチド内に
ある。特定の実施形態では、２以上の種類の修飾が、ガイドＲＮＡの５’部分および３’
部分の両方中に存在する。特定の実施形態では、修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端に、３
’末端におよび内部配列内に位置する。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲ
ＮＡの５’または３’部分中に４０個以下の、あるいは２０個以下の、あるいは１５個以
下の、あるいは１０個以下の、あるいは５個以下の、あるいは３個以下のデオキシリボヌ
クレオチド残基を含む。ガイドＲＮＡが、デュアルガイドである場合、各ＲＮＡ分子は、
５’末端、３’末端、または両方に修飾を含むことができる。特定の実施形態では、末端
（５’、３’、または両方）の連続するヌクレオチド、例えば、２、３、４、５またはそ
れより多くの連続するヌクレオチドが、修飾されている。
一般に、ガイド配列は、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎは、－１０から１０の間（
任意選択的に１０～６の間）の整数である。Ｎは、－１０、－９、－８、－７、－６、－
５、－４、－３、－２、－１、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から
選択することができる。例えば、ガイド配列は、２０ヌクレオチド長（Ｎ＝０）、１９ヌ
クレオチド長（Ｎ＝１）、２１ヌクレオチド長（Ｎ＝－１）などであり得る。特定の実施
形態では、ガイド配列は、ヌクレオチド位置（ガイド配列の５’末端から出発して）４－
Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎもしくは１６－Ｎ、またはそれらの組
合せの位置に少なくとも１つの特異性増強修飾を含む。２、３の例が下記で説明される。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～２０からなり、位置４、５、７、９、１０および１１から選択される少なくとも１つ
のヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌク
レオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５に
ある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実
施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、
化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガ
イド配列のヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１
つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸
長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１９からなり、位置３、４、６、８、９および１０から選択される少なくとも１つの
ヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレ
オチド４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある
。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形
態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修
飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド
配列のヌクレオチド３にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの
末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部
またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１８からなり、位置２、３、５、７、８、および９から選択される少なくとも１つの
ヌクレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレ
オチド３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある
。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形
態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修
飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配
列のヌクレオチド２にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末
端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部ま
たはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１７からなり、位置１、２、４、６、７および８から選択される少なくとも１つのヌ
クレオチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオ
チド２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４にある。
特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態
では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾
は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列
のヌクレオチド１にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端
修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部また
はオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１６からなり、位置１、３、５、６および７から選択される少なくとも１つのヌクレ
オチドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド
１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では
、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、
ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも
１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’
伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１５からなり、位置２、４、５および６から選択される少なくとも１つのヌクレオチ
ドに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２に
ある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４にある。特定の実
施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化
学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、
少なくとも１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の
上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～２１からなり、ヌクレオチド５、６、８、１０、１１および１２のうちの少なくとも
１つに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１
２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８にある。特定の実施形態では
、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は
、ガイド配列のヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列
のヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端
修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部また
はオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～２２からなり、ヌクレオチド６、７、９、１１、１２および１３のうちの少なくとも
１つに化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１
３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９にある。特定の実施形態では
、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は
、ガイド配列のヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列
のヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの末端
修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’伸長部また
はオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
２０－Ｎ（ここでのＮは、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正また
は負の整数である）からなり、４－Ｎ～２０－Ｎの任意のヌクレオチドに少なくとも１つ
の化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎ
から選択される少なくとも２つのヌクレオチドに修飾を含む。特定の実施形態では、ガイ
ド配列は、ヌクレオチド４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－
Ｎ、または１６－Ｎに少なくとも１つの修飾を含み、４－Ｎ～２０－Ｎから選択される（
しかし１５－Ｎではない）ヌクレオチドに少なくとも別の修飾も含む。特定の実施形態で
は、４－Ｎ～２０－Ｎから選択されるヌクレオチドは、５－Ｎ、６－Ｎ、７－Ｎ、８－Ｎ
、９－Ｎ、１０－Ｎ、１６－Ｎ、または１７－Ｎである。特定の実施形態では、ガイドＲ
ＮＡは、少なくとも１つの末端修飾をさらに含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは
、ガイド配列の上流に５’伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～２０からなり、位置５、６、７、８、９、１０、１６および１７から選択されるヌク
レオチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド
配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は
、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１７にある。特定の実施形態では、化
学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド７にある。特定の実施形態で
は、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０およびヌクレオチド１７にある。特定の
実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１６にある
。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１０およびヌクレオチド
１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌク
レオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９およ
びヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチ
ド８およびヌクレオチド１７にある。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも
１つの末端修飾を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ガイド配列の上流に５’
伸長部またはオーバーハングを含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１９からなり、位置４、５、６、７、８、９、１５および１６から選択されるヌクレ
オチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配
列のヌクレオチド５およびヌクレオチド９にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガ
イド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形態では、化学修
飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、
化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９およびヌクレオチド１６にある。特定の実施形
態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１５にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド９およびヌクレオチド１５にあ
る。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド
８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレ
オチド１５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およ
びヌクレオチド１６にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１８からなり、位置３、４、５、６、７、８、１４および１５から選択されるヌクレ
オチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配
列のヌクレオチド４およびヌクレオチド８にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガ
イド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形態では、化学修
飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、
化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレオチド１５にある。特定の実施形
態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１４にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド８およびヌクレオチド１４にあ
る。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド
７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレ
オチド１４にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およ
びヌクレオチド１５にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１７からなり、位置２、３、４、５、６、７、１３および１４から選択されるヌクレ
オチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配
列のヌクレオチド３およびヌクレオチド７にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガ
イド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形態では、化学修
飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド４にある。特定の実施形態では、
化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレオチド１４にある。特定の実施形
態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド１３にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド７およびヌクレオチド１３にあ
る。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド
６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレ
オチド１３にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およ
びヌクレオチド１４にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１６からなり、位置１、２、３、４、５、６、１２および１３から選択されるヌクレ
オチドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配
列のヌクレオチド２およびヌクレオチド６にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガ
イド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形態では、化学修
飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド３にある。特定の実施形態では、
化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１３にある。特定の実施形
態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド１２にある。特定
の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド６およびヌクレオチド１２にあ
る。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド
５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレ
オチド１２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およ
びヌクレオチド１３にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１５からなり、位置１、２、３、４、５、１１および１２から選択されるヌクレオチ
ドに少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列の
ヌクレオチド１およびヌクレオチド５にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド
配列のヌクレオチド１およびヌクレオチド２にある。特定の実施形態では、化学修飾は、
ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１２にある。特定の実施形態では、化学
修飾は、ガイド配列のヌクレオチド５およびヌクレオチド１１にある。特定の実施形態で
は、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１１にある。特定の実
施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１２にある。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１４からなり、位置１、２、３、４、１０および１１から選択されるヌクレオチドに
少なくとも２つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配列のヌク
レオチド４およびヌクレオチド１１にある。特定の実施形態では、化学修飾は、ガイド配
列のヌクレオチド４およびヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学修飾は、
ガイド配列のヌクレオチド３およびヌクレオチド１０にある。特定の実施形態では、化学
修飾は、ガイド配列のヌクレオチド２およびヌクレオチド１１にある。
特定の実施形態では、化学修飾は、５’末端修飾または３’末端修飾などの末端修飾を
含む。末端修飾の例として、これらに限定されないが、リン酸化（例えば、アルキルホス
ホネート、ホスホノカルボキシレート、ホスホノ酢酸、ボラノホスホネート、ホスホロチ
オエート、ジチオリン酸などといった、天然リン酸基またはポリリン酸基としてまたは修
飾されたリン酸基として）、ビオチン化、コンジュゲート化またはコンジュゲートされた
分子、リンカー、色素、標識、タグ、官能基（例えば、これらに限定されないが、５’－
アミノ、５’－チオ、５’－アミド、５’カルボキシなど）、逆連結、またはエーテル、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エステル、ヒドロキシル、アリール、ハロ、ホスホ
ジエステル、二環式、複素環式もしくはその他の有機官能基を含み得る炭化水素部分を含
む。特定の実施形態では、末端修飾は、ジメトキシトリチルを含む。
特定の実施形態では、化学修飾は、修飾された塩基を含む。本明細書において、「非修
飾」塩基として、プリン塩基アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）ならびにピリミジン塩
基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾された塩基の
例は、これらに限定されないが、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２
－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニ
ン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニ
ン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチ
ルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラ
シル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５
－アミノアリル－ウラシルおよび５－アミノアリル－シトシンなどの合成および天然塩基
を含む。特定の実施形態では、修飾は、脱塩基ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では
、修飾は、ＺまたはＰ、イソＣまたはイソＧ、ＵＮＡ、５－メチルピリミジン、ｘ（Ａ、
Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）またはｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）などの非標準プリンまたはピリミジン
構造を含む。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７
、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１
、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、
３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４
８、４９または５０個の修飾された塩基を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲ
ＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、
１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された塩基を含む。特定の実施形態では、
ｇＲＮＡ中のすべての塩基が、修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された糖を含む。修飾された糖の例は、これらに限
定されないが、２’位に修飾または４’位に修飾を有する糖を含む。例えば、特定の実施
形態では、糖は、２’－Ｏ－メチル（２’－ＯＭｅ）などの２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル
を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－Ｍ
ＯＥとしても公知である２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）な
どの２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルを含む。特定の実施形態では、
糖は、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌまたは２’－Ｉなどの２’－ハロを含む。特定
の実施形態では、糖は、２’－ＮＨ２を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－Ｈ（例
えば、デオキシヌクレオチド）を含む。特定の実施形態では、糖は、２’－アラビノまた
は２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、糖は、２’－ＬＮＡまたは２’－Ｕ
ＬＮＡを含む。特定の実施形態では、糖は、４’－チオリボシルを含む。特定の実施形態
では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、
２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３
９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾さ
れた糖を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、
６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または１
４０の修飾された糖を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されて
いる。
特定の実施形態では、修飾は、修飾された骨格（すなわち、天然ホスホジエステル以外
のヌクレオチド間連結）を含む。修飾されたヌクレオチド間連結の例は、これらに限定さ
れないが、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、キラルホスホロチオエートヌクレオ
チド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結
、メチルホスホネートヌクレオチド間連結などのＣ１－４アルキルホスホネートヌクレオ
チド間連結、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結
などのホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連
結などのホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結、例えば、チオホスホノ酢酸ヌ
クレオチド間連結などのチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸
エステルヌクレオチド間連結などのチオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結
を含む。種々の塩、混合塩および遊離酸形態も含まれる。特定の実施形態では、修飾され
たｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、
１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２
８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１
、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０の修飾されたヌクレオチ
ド間連結を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０
、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０または
１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべ
てのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ
１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２
’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、
２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラ
シル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デア
ザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ＭｅＣ、５－ＭｅＵ、５－ヒドロキシ
メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロ
ピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシ
ル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シ
トシン、脱塩基ヌクレオチド、Ｚヌクレオチド、Ｐヌクレオチド、ＵＮＡ、イソＣ、イソ
Ｇ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）ヌクレオチド、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ
、Ｔ、Ｕ）ヌクレオチド、３’－ホスホロチオエート基、３’－ホスホノ酢酸基、３’－
ホスホノ酢酸エステル基、３’－チオホスホノ酢酸基、３’－チオホスホノ酢酸エステル
基、３’－メチルホスホネート基、３’－ボラノホスホネート基、もしくは３’－ホスホ
ロジチオリン酸基またはそれらの組合せである、またはこれらを含む。
特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ
酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル－３’
－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－
Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオ
チドは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、
修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形
態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－ホスホロチオエートを含む
。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’－チオホスホ
ノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－デオキシ－３’
－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’
－ハロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチ
ドは、２’－ハロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレ
オチドは、２’－ハロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾され
たヌクレオチドは、２’－ハロ－３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態で
は、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエートを含む。特
定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸を
含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－３’－チオホ
スホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、２’－フルオロ－
３’－ホスホノカルボン酸塩を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、
Ｚ塩基を含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、Ｐ塩基を含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（Ｉ）
Ｗ－ＹまたはＹ－Ｗ（Ｉ）
［式中、Ｗは、少なくとも１つの特異性増強修飾を含むオリゴヌクレオチドのヌクレオチ
ドまたはヌクレオチドのストレッチを表し、Ｙは、オリゴヌクレオチドの非修飾部分を表
す］によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの５’部分内にある。特定の実施形態では、
Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある
。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡの５’部分の最初の４つ
のヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的にガイドＲＮＡ
の５’部分の最初の３つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくと
も部分的にヌクレオチド４～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド５～２０内、あ
るいはガイド配列のヌクレオチド１０～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３
～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１９内、あるいは
ガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１８内にある。
特定の実施形態では、Ｗは、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｈ、２’－Ｏ－Ｃ１
－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビノ、２’
－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡ、４’－チオリボシル、２－チオＵ、２
－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシ
ル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザ
アデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－ＭｅＣ、５－ＭｅＵ、５－ヒドロキシメ
チルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピ
ニルシトシン、５－プロピニルウラシル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル
、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シト
シン、脱塩基ヌクレオチド、Ｚヌクレオチド、Ｐヌクレオチド、ＵＮＡ、イソＣ、イソＧ
、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ホ
スホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸
エステルヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ酢酸
エステルヌクレオチド間連結、メチルホスホネートヌクレオチド間連結、ボラノホスホネ
ートヌクレオチド間連結、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む
。
特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホス
ホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチル
および３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチ
ド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、
Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の
実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む
。特定の実施形態では、Ｗは、同一ヌクレオチド上に２’－Ｆおよび３’－チオホスホノ
酢酸基を含む。
特定の実施形態では、Ｗは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２
、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の修飾されたヌクレオチドを含
む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは各々、同一修飾を含む。特定の実施
形態では、Ｗは、多様に修飾されたヌクレオチドの組合せを含む。特定の実施形態では、
Ｗは、２以上の修飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ｗは、３以上の修
飾されたヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、１つま
たは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して配置されない、ま
たは少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、修飾されたヌクレ
オチドは、連続して配置される。特定の実施形態では、Ｗは、修飾されたヌクレオチドの
少なくとも１つの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも３つの
修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、少なくと
も４つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。特定の実施形態では、Ｗは、
少なくとも５つの修飾されたヌクレオチドの連続ストレッチを含む。
特定の実施形態では、修飾は、安定性変更性修飾である。安定性とは、ヌクレアーゼな
どの酵素ならびに細胞内および細胞外環境中に存在するその他の物質による分解に抵抗す
るｇＲＮＡの能力を指す。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと
比較して、ガイドＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増大し、したがって、ガイドＲＮＡの安定
性を増強する。特定の実施形態では、安定性を変更する修飾は、安定性を増強する修飾（
安定性増強修飾）である。例えば、特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－Ｏ－
メチルまたは２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安
定性増強修飾は、２’－Ｆ、２’－Ｂｒ、２’－Ｃｌまたは２’－Ｉなどの２’－ハロヌ
クレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２’－ＭＯＥまたは２’－
Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３アルキルを含む。特定の実施形態では、安定性増強
修飾は、２’－ＮＨ２ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、２
’－Ｈ（または２’－デオキシ）ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強
修飾は、２’－アラビノまたは２’－Ｆ－アラビノを含む。特定の実施形態では、安定性
増強修飾は、４’－チオリボシル糖部分を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は
、３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－
ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－チオホスホノ酢
酸基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、３’－メ
チルホスホネート基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、安定性増強修
飾は、３’－ボラノホスフェート基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施形態では
、安定性増強修飾は、３’－ジチオリン酸基を含有するヌクレオチドを含む。特定の実施
形態では、安定性増強修飾は、アンロックド核酸（「ＵＬＮＡ」）ヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよ
び３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌ
クレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の実施形態で
は、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－Ｏ－メチルおよび３’－チオホスホ
ノ酢酸基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－
フルオロおよび３’－ホスホロチオエート基を含む。特定の実施形態では、安定性増強修
飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－ホスホノ酢酸基を含む。特定の
実施形態では、安定性増強修飾は、同一ヌクレオチド上に２’－フルオロおよび３’－チ
オホスホノ酢酸基を含む。
特定の実施形態では、修飾は、特異性を変更する修飾（特異性変更修飾）である。いく
つかの実施形態では、特異性の増強は、オンターゲット結合および／もしくは切断を増強
すること、またはオフターゲットの結合および／もしくは切断を低減すること、または両
方の組合せによって達成され得る。いくつかのその他の実施形態では、特異性の低減は、
例えば、オンターゲット結合および／もしくは切断を低減すること、またはオフターゲッ
トの結合および／もしくは切断を増大すること、または両方の組合せによって達成され得
る。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２’－Ｏ－メチルを含む。特定の実施形態で
は、特異性変更修飾は、２’－フルオロなどの２’－ハロを含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－チオウラシル塩基（２－チオＵ）を含む
。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－チオＣを含む。特定の実施形態では、特
異性変更修飾は、４－チオＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、６－チオ
Ｇを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、２－アミノＡを含む。特定の実施形
態では、特異性変更修飾は、２－アミノプリンを含む。特定の実施形態では、特異性変更
修飾は、シュードウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ヒポキサン
チンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、７－デアザグアニンを含む。特定
の実施形態では、特異性変更修飾は、７－デアザ－８－アザグアニンを含む。特定の実施
形態では、特異性変更修飾は、７－デアザアデニンを含む。特定の実施形態では、特異性
変更修飾は、７－デアザ－８－アザアデニンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修
飾は、５－メチルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－メチルＵを含
む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－ヒドロキシメチルシトシンを含む。特
定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－ヒドロキシメチルウラシルを含む。特定の実
施形態では、特異性変更修飾は、５，６－デヒドロウラシルを含む。特定の実施形態では
、特異性変更修飾は、５－プロピニルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更
修飾は、５－プロピニルウラシルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－
エチニルシトシンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－エチニルウラシ
ルを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－アリルＵを含む。特定の実施形
態では、特異性変更修飾は、５－アリルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾
は、５－アミノアリルＵを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－アミノア
リルＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、脱塩基ヌクレオチドを含む。特
定の実施形態では、特異性変更修飾は、Ｚ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更
修飾は、Ｐ塩基を含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ＵＮＡ塩基を含む。特
定の実施形態では、特異性変更修飾は、イソＣを含む。特定の実施形態では、特異性変更
修飾は、イソＧを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、５－メチル－ピリミジ
ンを含む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）を含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）を含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含
む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、メチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む
。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ボラノホスフェートヌクレオチド間連結を含
む。特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ジチオリン酸ヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、ＵＬＮＡを含む。特定の実施形態では、特異性
変更修飾は、ＬＮＡを含む。
特定の実施形態では、修飾は、例えば、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイ
ドＲＮＡの融解温度（Ｔｍ）を変更することによって、ＲＮＡ塩基対形成を変更する。特
定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのＴ
ｍを低下させる。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して
、ガイドＲＮＡのＴｍを上昇させる。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることが
できるガイド配列を含み、ガイド配列は、修飾を有しない同様の二本鎖と比較して、ｇＲ
ＮＡ：標的ポリヌクレオチド二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を変更することによって、標的ポ
リヌクレオチド内のガイド配列の塩基対形成を変更する、１つまたは複数の修飾を含む。
特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しない同様の二本鎖と比較して、ｇＲＮＡ：標的
ポリヌクレオチド二本鎖のＴｍを低下させる。
特定の実施形態では、特異性変更修飾は、塩基対形成相互作用のＴｍを低下させる。特
定の実施形態では、特異性増強修飾は、ガイドＲＮＡと標的ポリヌクレオチドとを含む第
１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、例えば、該Ｔｍを約１℃～約１３℃、あるいは約１
℃～約６℃低下させることによって、少なくとも約１℃、あるいは少なくとも約２℃、少
なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、および／または約６℃以下、あ
るいは約８℃以下、あるいは約１０℃以下、あるいは約１３℃以下、低下させる。特定の
実施形態では、特異性増強修飾は、ガイドＲＮＡとのオフターゲットポリヌクレオチドと
を含む第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、例えば、該Ｔｍを約１℃～約１３℃、ある
いは約１℃～約６℃低下させることによって、少なくとも約１℃、あるいは少なくとも約
２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、および／または約６℃
以下、あるいは約８℃以下、あるいは約１０℃以下、あるいは約１３℃以下、低下させる
。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、
ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を変更する化学修飾を含む。特定の実施形態で
は、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクシ
ョン効率を増大させる。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比
較して、ガイドＲＮＡのトランスフェクション効率を減少させる。特定の実施形態では、
修飾は、リン酸上の陰イオン電荷を中和し、細胞への受動拡散を可能にする。特定の実施
形態では、電荷中和性修飾は、ホスホノ酢酸メチルエステルヌクレオチド間連結などのホ
スホノ酢酸アルキルエステルヌクレオチド間連結を含む。ｇＲＮＡの開発に関連するさら
なる考慮事項としては、トランスフェクト能力および免疫賦活特性が挙げられる。特定の
実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、細胞への、特に真核細胞の核への効率的で滴定可能
なトランスフェクト能力を促進する、およびトランスフェクトされた細胞における免疫賦
活特性を低減させる、化学修飾を含む。特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、意図
される細胞、組織、体液または生物内に有効に送達すること、および所望のｇＲＮＡ機能
性を可能にするのに十分な期間、そこで維持することを促進する、化学修飾を含む。特定
の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイド
ＲＮＡの免疫賦活性効果を変更する化学修飾を含む。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、
ガイドＲＮＡの安定性と特異性の両方を増強する化学修飾を含む。特定の実施形態では、
修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性とトランスフェ
クション効率の両方を増強する。特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲ
ＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの特異性とトランスフェクション効率の両方を増強する。
特定の実施形態では、修飾は、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの
全体的な有効性を増強する。
特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、１より大きい特異性ス
コアを有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくと
も約１．１の特異性スコアを有する。したがって、特定の実施形態では、本願の化学修飾
を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．１、少なくとも約１．５、少なくとも約２、
少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、
少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約
１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少
なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも
約４５、少なくとも約５０、または少なくとも約５５の特異性スコアを有する。特定の実
施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約２～約６０の特異性スコアを有
する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約１０～約６０の
特異性スコアを有する。
特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１％のオ
ンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡ
は、少なくとも約５％のオンターゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学
修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１０％のオンターゲット切断を有する。特定
の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク
質複合体は、少なくとも約３０％のオンターゲット切断を有する。したがって、特定の実
施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約３０％、少なくとも
約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも
約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも
約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、または少なくとも約９０％、少な
くとも約９５％、または少なくとも約９９％のオンターゲット切断を有する。特定の実施
形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約２５％～約９９．９％のオンター
ゲット切断を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、約
５０％～約９９．９％のオンターゲット切断を有する。
特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、１より大きいオン：オ
フ比を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくと
も約１．１：１のオン：オフ比を有する。したがって、特定の実施形態では、本願の化学
修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１．１：１、少なくとも約１．５：１、少な
くとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少な
くとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少な
くとも約１０：１、少なくとも約１５：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約２５：
１、少なくとも約３０：１、少なくとも約３５：１、少なくとも約４０：１、少なくとも
約４５：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約６０：１、少なくとも約７０：１、少
なくとも約８０：１、少なくとも約９０：１、少なくとも約９５：１、または少なくとも
約９９：１のオン：オフ比を有する。特定の実施形態では、本願の化学修飾を有するガイ
ドＲＮＡは、少なくとも約１．５：１～約９９．９：１のオン：オフ比を有する。特定の
実施形態では、本願の化学修飾を有するガイドＲＮＡは、少なくとも約１０：１～約９９
．９：１のオン：オフ比を有する。
［Ｃ．修飾の組合せを有するガイドＲＮＡ］
一態様では、本技術は、２以上の修飾の組合せを有するガイドＲＮＡを提供する。特定
の実施形態では、２つの修飾は、同一ヌクレオチド上にある（例えば、１つのヌクレオチ
ドは、２’－Ｏ－メチルおよび３’－ホスホノ酢酸部分を含む）。その他の実施形態では
、２つの修飾は、２つの異なるヌクレオチド上にある（例えば、１つのヌクレオチドが、
２’－Ｏ－メチル基を有し、別のヌクレオチドが３’－ホスホノ酢酸部分を有する）。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ中の各修飾は、同一である。特定の実施形態では、
ガイドＲＮＡ中の少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡ中のその他の修飾の少なくとも
１つとは異なっている。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、異なる種類の修飾の組合
せを含み、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、ガイドＲＮＡ中の複数の場所に存在
する。特定の実施形態では、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、ガイドＲＮＡ中に
１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１
７、１８、１９または２０回現れる。
特定の実施形態では、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが、２つ以上の修飾された
ヌクレオチド中に現れる。特定の実施形態では、少なくとも１つの種類の修飾の組合せが
、３つ以上の修飾されたヌクレオチドに現れる。特定の実施形態では、修飾されたヌクレ
オチドは、１つまたは複数の非修飾ヌクレオチドが間に入り得るので、配列中に連続して
配置されない、または少なくとも完全には連続して配置されない。特定の実施形態では、
修飾されたヌクレオチドは、連続して配置される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは
、同一種類の連続する修飾されたヌクレオチドのストレッチを含む。特定の実施形態では
、ストレッチは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３
、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、
２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９また
は４０の修飾されたヌクレオチドを有する。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された糖を含む
。特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、
１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２
３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６
、３７、３８、３９または４０個の修飾された糖を含む。その他の実施形態では、修飾さ
れたｇＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、
１００、１１０、１２０、１３０または１４０個の修飾された糖を含む。特定の実施形態
では、ｇＲＮＡ中のすべての糖が修飾されている。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾された骨格（す
なわち、天然ホスホジエステル以外のヌクレオチド間連結）を含む。特定の実施形態では
、修飾されたｇＲＮＡは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１
３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６
、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９ま
たは４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。その他の実施形態では、修飾されたｇ
ＲＮＡは、少なくとも５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００
、１１０、１２０、１３０または１４０の修飾されたヌクレオチド間連結を含む。特定の
実施形態では、ｇＲＮＡ中のすべてのヌクレオチド間連結が修飾されている。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、連続する修飾を含む。特定の実施形態では、ガ
イド配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１
５、１６、１７、１８、１９または２０の連続する化学修飾を含む。特定の実施形態では
、化学修飾は、ヌクレオチド１および２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１
～８、１～９、１～１０、２および３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～
９、または２～１０にある。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル、
２’－フルオロ、２’－アミノ、２’－デオキシ、２’－アラビノ、２’－Ｆ－アラビノ
、２－チオウラシル、２－アミノアデニン、５－メチルシトシン、５－アミノアリルウラ
シル、Ｚ塩基、３’－ホスホロチオエート、３’－ホスホノ酢酸、３’－ホスホノ酢酸エ
ステル、３’－チオホスホノ酢酸、３’－チオホスホノ酢酸エステル、３’－メチルホス
ホネート、３’－ボラノホスホネート、３’－ジチオリン酸またはそれらの組合せを含む
。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル、
２’－デオキシ、Ｚ塩基、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホノ酢酸ヌクレ
オチド間連結、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せを含む。特定
の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｆ、２－チオＵ、４
－チオＵ、２－アミノＡ、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－アミノアリルＵまたはそれ
らの組合せを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、末
端ホスフェート、ＰＥＧ、末端アミン、炭化水素リンカーなどの末端リンカー、置換炭化
水素リンカー、スクアレートリンカー、トリアゾロリンカー、２－（４－ブチルアミドフ
ルオレセイン）プロパン－１，３－ジオールビス（ホスホジエステル）リンカーなどの内
部リンカー、色素とコンジュゲートしているリンカー、非蛍光標識とコンジュゲートして
いるリンカー、タグとコンジュゲートしているリンカーまたは例えば、ビーズもしくはマ
イクロアレイなどの固相支持体とコンジュゲートしているリンカーなどの「末端」修飾で
ある。特定の実施形態では、組合せ中の修飾の少なくとも２つは、２’－Ｏ－メチルヌク
レオチドおよびホスホロチオエートヌクレオチド間連結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド
およびホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結または２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオ
ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾の少なく
とも２つは、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連
結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連
結、２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、
２’－Ｏ－メチルヌクレオチドおよびチオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連
結またはそれらの組合せを含む。その他の実施形態では、組合せ中の修飾は、２－チオウ
ラシル、２－チオシトシン、４－チオウラシル、６－チオグアニン、２－アミノアデニン
、２－アミノプリン、シュードウラシル、イノシン、７－デアザグアニン、７－デアザ－
８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルシ
トシン、５－メチルウラシル、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウ
ラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル
、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルウラシル、５－アリルシト
シン、５－アミノアリル－ウラシル、５－アミノアリル－シトシンまたは脱塩基ヌクレオ
チドをさらに含む。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－
３’－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なく
とも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合
せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸を含
む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’
－ホスホロチオエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも
１つは、２’－ハロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾
のうちの少なくとも１つは、２’－ハロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。特定の実施形
態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－ホスホロチ
オエートを含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、２’
－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸を含む。特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの
少なくとも１つは、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸を含む。少なくとも２つま
たは３つの修飾の可能性ある組み合わせは、それぞれ、図６および図７に表されており、
参照により本明細書の一部をなすものとする。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、式（ＩＩＩ）または式（ＩＶ）
Ｗ－Ｙ－Ｑ（ＩＩＩ）、または
Ｙ－Ｗ－Ｘ－Ｑ（ＩＶ）
［式中、ＱおよびＷは各々独立に、少なくとも１つの特異性増強修飾を含むオリゴヌクレ
オチドのヌクレオチドまたはヌクレオチドのストレッチを表し、ＹおよびＸは各々独立に
、オリゴヌクレオチドの非修飾部分を表す］
によって表されるオリゴヌクレオチドを含む。
特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡ５’部分内にある。特定の実施形態では、Ｗ
は、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の５つのヌクレオチド内にある
。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分的に、ガイドＲＮＡの５’部分の最初の３
つのヌクレオチド内にある。特定の実施形態では、Ｗは、ガイドＲＮＡの内部領域（すな
わち、５’末端と３’末端の間）内にある。特定の実施形態では、Ｗは、少なくとも部分
的にヌクレオチド４～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド５～２０内、あるいは
ガイド配列のヌクレオチド１０～２０内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～２０
内、あるいはガイド配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１９内、あるいはガイド
配列のヌクレオチド１３～１４または１６～１８内にある。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有しないガイ
ドＲＮＡと比較して、ガイドＲＮＡの安定性および特異性を増強する。特定の実施形態で
は、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して
、ガイドＲＮＡの安定性およびトランスフェクション効率を増強する。特定の実施形態で
は、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、修飾を有しないガイドＲＮＡと比較して
、ガイドＲＮＡの特異性およびトランスフェクション効率を増強する。
特定の実施形態では、組合せ中の修飾のうちの少なくとも１つは、ガイドＲＮＡの二次
構造を変更する。この修飾は、ガイドＲＮＡ中のＲＮＡ／ＲＮＡ内部二本鎖のいずれかの
塩基対形成を変更する。これらの修飾のうちいくつかは、ＲＮＡ／ＲＮＡ構造の塩基対形
成を増大するか、あるいは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを増大するのに対し、その他の
修飾は、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖（複数でもよい）の塩基対形成（またはＴｍ）を減少させ
る。このような修飾は、塩基修飾されたヌクレオチド、特に、２－チオウリジンおよび２
－アミノアデノシン対などのＵＮＡヌクレオチド、Ｚ／Ｐヌクレオチド対、イソＣ／イソ
Ｇ対、６－チオＧ／５－メチルピリミジン対および糖上に修飾を有するヌクレオチドまた
は上記で開示されるようなヌクレオチド間連結を含む。
特定の実施形態では、組合せは、特異性を増大する（すなわち、オフターゲット効果を
低減する）少なくとも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すな
わち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施
形態では、組合せは、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを上昇させる少なく
とも１つの修飾または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を
増大する、少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合
せは、ガイドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを低下させる少なくとも１つの修飾
または修飾のセットとともに、ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なく
とも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアー
ゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセット、ガイ
ドＲＮＡ中のいくつかの塩基対形成のＴｍを増大する少なくとも１つの修飾または修飾の
セットおよびガイドＲＮＡ中のいずれかの場所でのいくつかの塩基対形成のＴｍを減少さ
せる少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、
ヌクレアーゼ耐性（すなわち、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセ
ットおよびガイドＲＮＡのＣａｓタンパク質との結合を増大する少なくとも１つの修飾ま
たは修飾のセットを含む。特定の実施形態では、組合せは、ヌクレアーゼ耐性（すなわち
、安定性）を増大する少なくとも１つの修飾または修飾のセットおよびガイドＲＮＡのＣ
ａｓタンパク質との結合を減少させる少なくとも１つの修飾または修飾のセットを含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、異なる種類の修飾の組合せを含む。
［Ｄ．ガイドＲＮＡ構造］
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質と複合体を形成で
きる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ＲＮＡによってガイドされ
るポリヌクレオチド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ
ＩＩ型の系によって提供されるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、ＣＲＩ
ＳＰＲ関連タンパク質は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９突然変異体またはＣａｓ９変異体である。
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形態
では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質は、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌ
ｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）に由来するＣａｓ９ヌクレアーゼである。特定の実施形
態では、合成ガイドＲＮＡまたは合成ガイドＲＮＡ：ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質複合体
は、修飾されたヌクレオチドを有しない天然ガイドＲＮＡまたは複合体の機能性を維持す
る。特定の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドと結合することを含む。特定
の実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドにニックを入れることを含む。特定の
実施形態では、機能性は、標的ポリヌクレオチドを切断することを含む。特定の実施形態
では、標的ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏの核酸内にある。特定の実施形態では
、標的ポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞のゲノム内に
ある（生物から単離された培養された細胞（複数でもよい）の中など）。特定の実施形態
では、標的ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ中のプロトスペーサーである。
特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、２５から８０ヌクレオチドを含む。特
定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、標的配列とハイブリダイズ可能であるガイ
ド配列を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、標的配列またはその一部と相補的で
ある。特定の実施形態では、ガイド配列は、１５から３０ヌクレオチドを含む。特定の実
施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、ステム配列を含む。特定の実施形態では、ステム
配列は、１０から５０ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメント
は、５’－オーバーハング配列を含む。特定の実施形態では、５’－オーバーハング配列
は、１から１０ヌクレオチド、あるいは、１～５ヌクレオチド、あるいは、１、２または
３ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）標的配列とハイブリ
ダイズ可能であるガイド配列および（ｉｉ）ステム配列の両方を含む。特定の実施形態で
は、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）５’－オーバーハング配列、（ｉｉ）標的配列とハイブリダイ
ズ可能であるガイド配列および（ｉｉｉ）ステム配列を含む。ｃｒＲＮＡセグメントがス
テム配列を含む特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、ｃｒＲＮＡセグメ
ントのステム配列と部分的にまたは完全に相補的であるヌクレオチド配列を含む。特定の
実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、少なくとももう１つの二本鎖構造を含む
。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡ
セグメントがループＬを介して連結されている単一ガイドＲＮＡである。特定の実施形態
では、ループＬは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含む
。特定の実施形態では、ループＬは、ＧＮＲＡのヌクレオチド配列を含み、ここで、Ｎは
、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを表し、Ｒは、ＡまたはＧを表す。特定の実施形態では、ループＬ
は、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、２以上
のループを含む。
ガイドＲＮＡは、５’部分（すなわち、５’の半分）および３’部分（すなわち、３’
の半分）を含む。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡセグメントは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグ
メントの５’（すなわち、上流）である。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメ
ントは、ｃｒＲＮＡセグメントに対して５’である。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つの別個のＲＮＡ鎖、例えば、ｃ
ｒＲＮＡ鎖および別個のｔｒａｃｒＲＮＡ鎖を含む。例えば、図２Ａを参照のこと。特定
の実施形態では、鎖の各々は、１つまたは複数の修飾を含む合成鎖である。特定の実施形
態では、鎖の少なくとも一方は、１つまたは複数の修飾を含む合成鎖である。特定の実施
形態では、鎖は一緒に機能して、Ｃａｓ９などのＣａｓタンパク質による標的ポリヌクレ
オチドの結合、ニッキングまたは切断をガイドする。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡ配
列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、別個の鎖上にあり、２つの相補的配列によって互いに
ハイブリダイズし、ステムまたは二本鎖を形成する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を
含む単一ガイドＲＮＡである。例えば、図２Ｂを参照のこと。特定の実施形態では、ｃｒ
ＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、ループ配列または「ループ」によって接続さ
れる。特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、５’部分および３’部分を含み、ここ
で、ｃｒＲＮＡ配列は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の上流である。特定の実施形態では、ガイ
ドＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントを含まないｃｒＲＮＡを含み。
特定の実施形態では、２つのＲＮＡ片の総長は、約５０～２２０（例えば、約５５～２
００、６０～１９０、６０～１８０、６０～１７０、６０～１６０、６０～１５０、６０
～１４０、６０～１３０および６０～１２０）ヌクレオチドの長さ、例えば、約６０、７
０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、
１８０、１９０、２００または２２０ヌクレオチドの長さであり得る。同様に、単一ガイ
ドＲＮＡ（例えば、図２Ｂ）は、約５０～２２０（例えば、約５５～２００、６０～１９
０、６０～１８０、６０～１７０、６０～１６０、６０～１５０、６０～１４０、６０～
１３０および６０～１２０）ヌクレオチドの長さ、例えば、約６０、７０、８０、９０、
１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、
２００または２２０ヌクレオチドの長さであり得る。
図２Ａおよび２Ｂに示されるように、合成ガイドＲＮＡは、（ｉ）（ａ）核酸中の標的
配列とハイブリダイズ可能なガイド配列（例えば、セグメントＧ１～Ｇｎ、式中、各Ｇは
、ガイド配列中のヌクレオチドを表す）、（ｂ）第２のステム配列と部分的または完全に
ハイブリダイズ可能な第１のステム配列（例えば、セグメントＸ１～Ｘｎ、式中、各Ｘは
、第１のステム配列中のヌクレオチドを表す）および任意選択的に、（ｃ）５’－オーバ
ーハング配列（例えば、セグメントＯ１～Ｏｎ、式中、各Ｏは、オーバーハング配列中の
ヌクレオチドを表す）を含むｃｒＲＮＡ配列と、（ｉｉ）第２のステム配列（例えば、セ
グメントＹ１～Ｙｎ、式中、各Ｙは、第２のステム配列中のヌクレオチドを表す）を含む
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを含む。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、セグメントＴ１～Ｔｎ（式中
、各Ｔは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列中のヌクレオチドを表す）をさらに含む。図２Ａ中に示
される合成ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含む。同様に、図２Ｂ中に示される
合成ガイドＲＮＡは、１つまたは複数の修飾を含む。特定の実施形態では、修飾は、ｃｒ
ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡセグメント、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントお
よび任意選択的に、ループを含む単一ガイドＲＮＡの長さに沿って任意の点に位置する。
特定の実施形態では、図２Ａおよび２Ｂに示される合成ガイドＲＮＡ中のＯ、Ｇ、Ｘ、Ｙ
またはＴによって表される任意のヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドであり得る。
図２Ｂ中に示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグ
メントが、配列ＧＮＲＡを有するループによって接続しており、Ｎが、Ａ、Ｃ、Ｇまたは
Ｕを表し、Ｒが、ＡまたはＧを表す単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を表す。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡセグメントは、２５～７０（例えば、
３０～６０、３５～５０または４０～４５）ヌクレオチドの長さである。特定の実施形態
では、ガイド配列は、１２～３０（例えば、１６～２５、１７～２０または１５～１８）
ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡの５’部分は、標的配
列とハイブリダイズしないか、または部分的にしかハイブリダイズしない。例えば、ｃｒ
ＲＮＡセグメント上に５’－オーバーハングがあり得る。
特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡセグメントのステム配列、ｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントのステム配列および任意選択的に、ｃｒＲＮＡセグメントをｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと共有結合によって接続するループを含む中央部分を含む。特定
の実施形態では、単一ガイドＲＮＡの中央セグメントは、８～６０（例えば、１０～５５
、１０～５０または２０～４０）ヌクレオチドの長さである。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、１０～１３０（
例えば、１０～１２５、１０～１００、１０～７５、１０～５０または１０～２５）ヌク
レオチドの長さである。特定の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメントは、中央セグ
メント中の任意のヘアピンまたは二本鎖構造に加えて、１つまたは複数のヘアピンまたは
二本鎖構造を含む。
［Ｅ．ガイドＲＮＡの合成］
特定の実施形態では、単一ガイドＲＮＡを含むガイドＲＮＡが、合成有機化学の技術分
野を使用する化学合成によって製造される。非天然であるか天然であるかに関わらず、シ
ュードリジン、イノシンまたはデオキシヌクレオチドなどの、４種の主なリボヌクレオチ
ド、すなわち、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ以外の任意のヌクレオチドを含むガイドＲＮＡは、Ｒ
ＮＡ中の４種の主なヌクレオチドのいずれかと、化学的に／構造的に異なるヌクレオチド
に化学修飾または置換を有する。
本明細書において記載される合成ガイドＲＮＡは、当該技術分野で周知の方法（例えば
、ＴＢＤＭＳ化学、ＴＯＭ化学、ＡＣＥ化学など）を使用して化学合成することができる
。例えば、合成ガイドＲＮＡは、参照によりその全文の内容が本明細書の一部をなすもの
であるＤｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
３３，１１５４０、米国特許第８，２０２，９８３号、および米国特許出願第２０１０／
００７６１８３Ａ１号に記載された方法によってＴＣケミストリーを使用して合成され得
る。「ＴＣケミストリー」とは、チオノカルバメート保護基によって２’－ヒドロキシル
部分で保護されたＲＮＡ単量体ヌクレオチド前駆体を使用して、非修飾ＲＮＡまたは１つ
もしくは複数の修飾されたヌクレオチドを含む修飾ＲＮＡを合成する組成物および方法を
指す。ＴＣ－ＲＮＡケミストリーを使用して比較的長いＲＮＡ（２００マー以上にも及ぶ
）を化学的に合成する能力によって、４種の主なリボヌクレオチド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＵ
）によって可能となるものをしのぐことが可能な、特別な特徴を有するガイドＲＮＡを製
造することが可能となる。本明細書に記載されたいくつかの合成ガイドＲＮＡはまた、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ転写および細胞ベースの発現を含む当技術分野で公知の方法を使用して作
製することができる。例えば、細胞ベースの発現によって製造された合成ガイドＲＮＡ中
に、２’－フルオロＮＴＰを組み込むことができる。
ガイドＲＮＡの合成はまた、ＲＮＡ配列の化学的または酵素的合成によって達成され得
、その後、これが酵素によって一緒にライゲートされるか、またはこれらに限定されない
が、臭化シアンケミストリー、Ｒ．Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ａｍ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２９，６８５９－６４によって公開されたような「クリック」ケミス
トリーまたは「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｃｏｎｊ
ｕｇａｔｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題されたＷＯ２０１３１７６８
４４においてＫ．Ｈｉｌｌによって記載されたようなスクアレートコンジュゲーションケ
ミストリーを含む化学ライゲーションによってライゲートされる。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡを調製するための方法が提供される。方法は、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと、ゲノム内の１つまたは複数のオ
フターゲットポリヌクレオチドを同定するステップと、前記標的ポリヌクレオチドと前記
オフターゲットポリヌクレオチドの両方に存在する１つまたは複数の共有ヌクレオチド残
基を同定するステップと、ガイド配列が特異性増強修飾を含む合成ガイドＲＮＡを設計す
るステップとを含む。方法は、設計されたガイドＲＮＡを合成するステップを含むことが
できる。特定の実施形態では、オフターゲットポリヌクレオチドは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｍ．ｊｅ
ｆｆｅｒｓｏｎ．ｅｄｕ／Ｏｆｆ－Ｓｐｏｔｔｅｒ；もしくはｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐ
ｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで見付けられるものなどの、オフターゲット部位はもちろんそれらの
重要度も予測するためのアルゴリズム；またはＴｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａ
ｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１８７－９７；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎ
ａｔｕｒｅ ５２０，１８６－９１；Ｆｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１７９－８６において開示されているような、実際の事例で
オフターゲット部位の活性化を同定および定量するためのその他の技術によって、同定さ
れる。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌ
クレオチドの配列間の少なくとも１つの識別位置であって、前記標的ポリヌクレオチドお
よびオフターゲットポリヌクレオチドが異なるヌクレオチド残基を有する、少なくとも１
つの識別位置を同定するステップと、および前記標的ポリヌクレオチド内の前記少なくと
も１つの識別位置におけるヌクレオチドとマッチする（すなわち、それと相補的である）
ヌクレオチドを合成ガイドＲＮＡに含めるステップとをさらに含む。
以下にさらに記載されるように、修飾されたヌクレオチドおよび／または修飾されたヌ
クレオチド間連結を含むものを含む、本明細書において開示されるガイドＲＮＡを使用し
て、細胞不含アッセイにおいて、インタクトな細胞において、または全生物においてなど
、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの種々のＣＲＩＳＰＲ媒介性機能（これらに
限定されないが、遺伝子を編集すること、遺伝子発現を調節すること、標的配列を切断す
ることおよび標的配列と結合することを含む）を実施することができる。ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ適用のために、ＲＮＡを、当技術分野で公知の任意の方法で細胞
または全生物中に送達することができる。
［ライブラリーおよびアレイ］
一態様では、本発明は、複数のガイドＲＮＡのセットまたはライブラリーを提供する。
特定の実施形態では、ライブラリーは、本明細書において開示される２つ以上のガイドＲ
ＮＡを含有する。ライブラリーは、約１０～約１０７の個々のメンバー、例えば、約１０
～約１０２、約１０２～約１０３、約１０３～約１０５、約１０５～約１０７のメンバー
を含有し得る。ライブラリーの個々のメンバーは、ライブラリーのその他のメンバーとは
、少なくとも、ガイド配列、すなわち、ｇＲＮＡのＤＮＡを標的化するセグメントにおい
て異なる。他方、特定の実施形態では、ライブラリーの各個々のメンバーは、ライブラリ
ーのすべてのその他のメンバーとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントについて同一または実質的
に同一のヌクレオチド配列を含有し得る。このような方法で、ライブラリーは、１種また
は複数のポリヌクレオチド中の異なるポリヌクレオチドまたは異なる配列を標的化するメ
ンバーを含み得る。
特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０２種の唯一無二なガイド配列を
含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０３種の唯一無二なガイド配
列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０４種の唯一無二なガイ
ド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５種の唯一無二な
ガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０６種の唯一無
二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０７種の唯
一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０種の
異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくと
も１０２種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリー
は、少なくとも１０３種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実施形態では、
ライブラリーは、少なくとも１０４種の異なるポリヌクレオチドを標的化する。特定の実
施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０５種の異なるポリヌクレオチドを標的化す
る。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０６種の異なるポリヌクレオチ
ドを標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０７種の異なるポ
リヌクレオチドを標的化する。
特定の実施形態では、ライブラリーは、ライブラリー中のメンバーの配列を横断する連
続的にシフトしたウィンドウ中に同一配列および同一修飾を有するガイドＲＮＡの収集物
を含む。特定の実施形態では、ウィンドウは、ＲＮＡの全長を集合的に対象とする。
特定の実施形態では、ライブラリーによって、ハイスループット、多重標的ゲノム操作
および分析を実施することが可能となる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡにおけるＤ
ＮＡを標的化するセグメントのみが変わり、Ｃａｓタンパク質結合セグメントは同一であ
る。特定の実施形態では、ライブラリーの第１の部分は、特定のＣａｓタンパク質を認識
し、それと結合し、それを指向するＣａｓ結合セグメントを有するガイドＲＮＡを含み、
ライブラリーの第２の部分は、異なるＣａｓタンパク質（例えば、異なる種に由来するＣ
ａｓタンパク質）を認識し、それと結合し、それを指向する異なるＣａｓ結合性セグメン
トを含み、それによって、ライブラリーが、２種以上の直交性Ｃａｓタンパク質とともに
機能することが可能となる。特定の実施形態では、第１の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導
された発現は、第１の直交性Ｃａｓタンパク質と相互作用するライブラリーの一部を利用
する。特定の実施形態では、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導された発現
は、それぞれ、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質と相互作用するライブラリーの
一部を利用する。特定の実施形態では、第１および第２の直交性Ｃａｓタンパク質の誘導
された発現は、異なる時点で起こる。したがって、具体的には、ライブラリーにおいて特
定されるような複数の標的を遺伝子操作することまたは修飾することによって、大規模な
遺伝子編集または遺伝子調節を実施することができる。
特定の実施形態では、ライブラリーは、「アレイド」ライブラリー、すなわち、アドレ
ス可能な配置中の異なる特徴または特徴のプールの収集物である。例えば、アレイの特徴
を、選択的に切断し、プレート中の各ウェルが、公知の特徴または公知の特徴のプールを
含有するようにマイクロタイタープレートに移すことができる。いくつかのその他の実施
形態では、ライブラリーは、４８ウェルまたは９６ウェルマイクロタイタープレート形式
で、または３８４ウェルプレート中で合成される。
特定の実施形態では、本発明のガイドＲＮＡの合成は、化学物質が結合し得る表面を有
する固相支持体上で実施され得る。いくつかの実施形態では、合成されているガイドＲＮ
Ａが、同一固相支持体に直接的または間接的に結合され、アレイの部分を形成し得る。「
アレイ」は、各配列の位置が公知であるように、空間的に規定され、物理的にアドレス可
能な方法で固相支持体上に各々配置された公知の単量体配列の別個の分子の収集物である
。本明細書において同義的に使用される「アレイ」または「マイクロアレイ」は、その領
域と会合している特定の化学部分（複数でもよい）（リガンド、例えば、ポリヌクレオチ
ドまたはオリゴヌクレオチド配列（核酸）、ポリペプチド（例えば、タンパク質）、炭水
化物、脂質などといったバイオポリマーなど）を有する、アドレス可能な領域の任意の１
次元の、２次元のまたは実質的に２次元の（ならびに３次元の）配置を含む。アレイは、
アレイ上の特定の所定の位置（すなわち「アドレス」）で、領域（すなわち、アレイの「
特徴」）が、特定の標的または標的のクラスを検出するように（特徴は、その特徴の非標
的を偶発的に検出し得るが）、異なる部分（例えば、異なるポリヌクレオチド配列）の複
数の領域を有する場合に「アドレス可能」である。アレイ特徴は、通常、介在する空間に
よって分かれているが、必要ではない。アレイ上に含有され得る特徴の数は、大きくは、
基板の表面積、特徴のサイズおよび特徴間の間隔によって決定される。アレイは、２，５
００～２００，０００特徴／ｃｍ２など、１ｃｍ２あたり最大数十万以上の特徴の密度を
有し得る。特徴は、共有結合によって基板と結合される場合もされない場合もある。
適した固相支持体は、種々の形態および組成を有し、天然に存在する材料、相性的に修
飾されている天然に存在する材料または合成材料に由来し得る。適した支持材料の例は、
これらに限定されないが、シリカ、ケイ素および酸化ケイ素、テフロン（登録商標）、ガ
ラス、アガロース（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製のセファロース（登録商標））および
デキストラン（例えば、同様にＰｈａｒｍａｃｉａ製のセファデックス（登録商標）およ
びセファシル（登録商標））などの多糖、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニ
ルアルコール、メタクリル酸ヒドロキシエチルおよびメタクリル酸メチルのコポリマーな
どを含む。いくつかの実施形態では、固相支持体は、複数のビーズである。
基板表面上で合成されるべきガイドＲＮＡの最初の単量体をリンカーと結合することが
でき、これは、順に、シリカ基板上に存在する表面親水基、例えば、表面ヒドロキシル部
分と結合する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルリンカーを使用する。いくつかの
その他の実施形態では、最初の単量体を、表面ヒドロキシル部分、表面アミノまたはその
他の反応性の官能基と直接反応させる。あるいは、ガイドＲＮＡを、本発明に従ってまず
合成することができ、合成後、当技術分野で公知の任意の方法によって固体基板と結合さ
せる。したがって、本発明を使用して、オリゴヌクレオチドがアレイ上で合成されるか、
または合成後にアレイ基板に結合される、ガイドＲＮＡのアレイを調製できる。その後、
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡのプールもしくは複数のプールを、アレイ基板から任意
かつ選択的に切断し、ライブラリー（複数でもよい）として使用できる。
［Ｆ．ｃｒＲＮＡ］
本発明は、本明細書において記載されるような、ガイドＲＮＡについて記載されるよう
な化学修飾（複数でもよい）を含む多様なｃｒＲＮＡも提供する。ｃｒＲＮＡは、デュア
ルガイドなどの、マルチセグメントガイドＲＮＡにおいて機能することができる。特定の
実施形態では、ｃｒＲＮＡは、例えばＣｐｆ１系において、ｔｒａｃｒＲＮＡセグメント
がないガイドＲＮＡとして機能する。したがって、特定の実施形態では、本発明は、（ｉ
）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすること
ができるガイド配列と、（ｉｉ）ステム配列とを含む合成ｃｒＲＮＡであって、前記ガイ
ド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１
０～６の間）の整数であり；前記ガイド配列が、少なくとも１つの修飾を含み、合成ｃｒ
ＲＮＡが、修飾を有しない対応するｃｒＲＮＡより、標的ポリヌクレオチドに対する高い
特異性、または高いｇＲＮＡ機能性をもたらす、合成ｃｒＲＮＡを提供する。ここで、ｃ
ｒＲＮＡは、該ｃｒＲＮＡが、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ：ｃａｓタンパク質複合体に
含まれているとき、前記ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ：ｃａｓタンパク質複合体が、ｃｒ
ＲＮＡが修飾を欠く対応するガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡ：ｃａｓタンパク質複合体より
、標的ポリヌクレオチドに対する高い特異性、または高いｇＲＮＡ機能性を有する場合、
修飾を有しない対応するｃｒＲＮＡより、標的ポリヌクレオチドに対する高い特異性、ま
たは高いｇＲＮＡ機能性をもたらす。
ガイド配列の、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎにおけるまたは４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ
、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択される少なくとも１つ
のヌクレオチドにおける少なくとも１つの修飾を含むがこれらに限定されない、対象の修
飾は、本開示の他の場所で説明される。特定の修飾（複数でもよい）および標的ポリヌク
レオチドの種々の実施形態も、本明細書において記載される。
［ＩＶ．Ｃａｓタンパク質］
上記のように、機能的ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はまた、標的結合または標的ニッキング
／切断などの所望の活性を提供するタンパク質成分（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼであり
得るＣａｓタンパク質）を必要とする。特定の実施形態では、所望の活性は、標的結合で
ある。特定の実施形態では、所望の活性は、標的ニッキングまたは標的切断である。特定
の実施形態では、所望の活性はまた、本明細書において開示されるようなＣａｓタンパク
質と共有結合によって融合しているポリペプチドによって提供される機能を含む。特定の
実施形態では、所望の活性はまた、本明細書において開示されるようなヌクレアーゼ欠損
Ｃａｓタンパク質と共有結合によって融合しているポリペプチドによって提供される機能
を含む。このような所望の活性の例として、以下に記載されるような転写調節活性（活性
化または抑制のいずれか）、エピジェニック修飾活性または標的可視化／同定活性が挙げ
られる。Ｃａｓタンパク質は、精製もしくは非精製（ｉ）Ｃａｓタンパク質または（ｉｉ
）Ｃａｓタンパク質の発現のためにコードされるｍＲＮＡまたは（ｉｉｉ）タンパク質の
発現のためにコードされる直鎖もしくは環状ＤＮＡとしてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ
ｖｉｖｏ系の中に導入され得る。Ｃａｓタンパク質を提供するこれらの３種の方法のいず
れも当技術分野で周知であり、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質の使用の言及が
本明細書においてなされる場合には、同義的に暗示される。特定の実施形態では、Ｃａｓ
タンパク質は、ｍＲＮＡまたはＤＮＡから構成的に発現される。特定の実施形態では、ｍ
ＲＮＡまたはＤＮＡからのＣａｓタンパク質の発現が誘導可能であるか、または誘導され
る。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は化学合成される（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏ
ｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ”，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ＮＹ，１９８３を参照のこと
）か、または本明細書において記載されるように組換えＤＮＡ技術によって製造される。
さらなる指針については、当業者は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ
ａｌ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ
ｏｇｙ”，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，２００３；およびＳａｍｂｒｏｏｋ
ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１を参考にしてもよい。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製された、または単離された形態で提供
される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、約８０％、約９０％、約９５％また
は約９９％の純度で提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、組成物の一
部として提供される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによってガイド
されるヌクレアーゼ反応のための組成物として使用するのに、または組成物中に含めるの
に適した水性組成物中で提供される。当業者は、このようなヌクレアーゼ反応組成物中に
含まれ得る種々の物質を十分に承知している。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、組換えポリペプチドとして提供される。特
定の実施例では、組換えポリペプチドは、融合タンパク質として調製される。例えば、特
定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、融合パートナー、例えば、グ
ルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ－ＨｉｓエピトープタグまたはＭ
１３遺伝子３タンパク質をコードする別の核酸と連結される。適した宿主細胞は、融合タ
ンパク質を発現するために使用され得る。特定の実施形態では、融合タンパク質は、当技
術分野で公知の方法によって単離される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合
パートナーを除去してＣａｓタンパク質を得るために、例えば、酵素消化によってさらに
処理され得る。あるいは、Ｃａｓタンパク質：ｇＲＮＡ複合体は、当技術分野で公知の宿
主細胞系またはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳転写系を使用して組換え技術を用いて作成され得る
。このような系および技術の詳細は、例えば、参照によりその全文の内容が本明細書の一
部をなすものである、ＷＯ２０１４１４４７６１、ＷＯ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０
１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およびＵＳ２０１４０２７３２３３に見
出すことができる。
［野生型Ｃａｓタンパク質］
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡによってガイドされるポリヌクレオ
チド結合および／またはヌクレアーゼ活性を有する、ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓＩ型、ＩＩ型
またはＩＩＩ型の系に由来するタンパク質を含む。適したＣａｓタンパク質の限定されな
い例として、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（またはＣａｓＤ）、Ｃａｓ６
、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａ
ｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ
１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（またはＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（またはＣａｓＢ）、
Ｃｓｅ３（またはＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（またはＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓ
ａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍ
ｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃ
ｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓ
ｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４およびＣｕ１９６６が挙げられる。例えば、参照に
よりその全文の内容が本明細書の一部をなすものである、ＷＯ２０１４１４４７６１、Ｗ
Ｏ２０１４１４４５９２、ＷＯ２０１３１７６７７２、ＵＳ２０１４０２７３２２６およ
びＵＳ２０１４０２７３２３３を参照のこと。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系に由来する
。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれ
に由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＷＯ２０１４１４４７６１にお
いて同定されるものを含む、細菌Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）の
種またはブドウ状球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の種のＣａｓ９タンパク質であ
るか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコ
ッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃ
ａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパ
ク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９
タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は
、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質
であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプ
トコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
）Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。
特定の実施形態では、野生型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。特定の
実施形態では、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）
由来のＣａｓ９タンパク質（配列番号１１５）である。特定の実施形態では、タンパク質
またはポリペプチドは、配列番号１１５の断片を含み得る、それからなり得るまたは本質
的にそれからなり得る。
一般に、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡと相互作用する、少なくとも１つのＲＮＡ
結合ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の核酸結合
親和性および／または特異性を増大し、酵素活性を変更し、および／または別の特性を変
化させるように修飾される。例えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮ
アーゼ、ＲＮアーゼ）ドメインは、修飾、突然変異、欠失または不活性化され得る。ある
いは、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質の機能にとって必須ではないドメインを除去する
ように末端切除型であり得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、エフェクター
ドメインの活性を最適化するように、末端切除型であるか、または修飾され得る。特定の
実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＮＬＳタグが付けられたＣａｓタンパク質の生存細
胞の核への移入を達成する核局在性配列（ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、Ｃａｓ
タンパク質は、２つ以上の修飾を含む。
［突然変異体Ｃａｓタンパク質］
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ９な
ど）またはその断片の突然変異体であり得る。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質
は、突然変異体Ｃａｓタンパク質に由来し得る。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸
配列は、タンパク質の１つまたは複数の特性（例えば、ヌクレアーゼ活性、結合親和性、
プロテアーゼに対する安定性など）を変更するように修飾され得る。あるいは、ＲＮＡに
よってガイドされる切断に関与していないＣａｓ９タンパク質のドメインは、修飾された
Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ9タンパク質より小さいように、タンパク質から排
除され得る。例えば、Ｃａｓ９コード配列のサイズの低減によって、そうでなければ、中
でもＡＡＶベクターなどの野生型配列に適応させることができないトランスフェクション
ベクター内に適合することが可能となる。いくつかの実施形態では、本系は、細菌中にコ
ードされるような、または真核細胞における発現のためにコドン最適化された、化膿性連
鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を利用する。野生型化膿性連
鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質配列のアミノ酸配列（配列番号１１
５、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｑ９９ＺＷ２で入手可能）が、
以下に示される。
Figure 2022137068000008
Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、少なくとも２種のヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ
）ドメインを有する。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン
およびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを有し得る。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは一緒
に働いて、標的部位中の両鎖を切断し、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断を作製する
（Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－２１）。特定の実施形
態では、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、１つのみの機能的ヌクレアーゼドメイン（Ｒ
ｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）を含有するように修飾される
。例えば、特定の実施形態では、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼドメイ
ンのうち１つが、欠失または突然変異され、その結果、もはや機能的ではない（すなわち
、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように修飾される。ヌクレアーゼドメインの１つが不
活性であるいくつかの実施形態では、突然変異体は、二本鎖ポリヌクレオチド中にニック
を導入可能である（このようなタンパク質は、「ニッカーゼ」と呼ばれる）が、二本鎖ポ
リヌクレオチドを切断できない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸か
らアラニンへの（Ｄ１０Ａ）変換は、Ｃａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。
同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの（Ｈ８４０Ａ）変換は、Ｃ
ａｓ９由来タンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるアスパ
ラギン（ａｒｓｐａｒａｇｉｎｅ）からアラニンへの（Ｎ８６３Ａ）変換は、Ｃａｓ９由
来タンパク質をニッカーゼに変換する。
特定の実施形態では、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼド
メインの両方が、突然変異体Ｃａｓ９タンパク質が、標的ポリヌクレオチドにニックを入
れることができない、または切断できないように修飾されるか、または排除される。特定
の実施形態では、Ｃａｓ９由来タンパク質のすべてのヌクレアーゼドメインが、Ｃａｓ９
由来タンパク質が、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾されるか、または排除さ
れる。特定の実施形態では、それにもかかわらず、一部のまたはすべてのヌクレアーゼ活
性を欠くＣａｓ９タンパク質は、野生型対応物と比較して、標的認識活性をより高いまた
はより低い程度に維持する。
上記の実施形態のいずれにおいても、ヌクレアーゼドメインのいずれかまたはすべてが
、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ媒介突然変異誘発および全遺伝子合成並びに当技術分
野で公知のその他の方法などの周知の方法を使用する１つまたは複数の欠失突然変異、挿
入突然変異および／または置換突然変異によって不活性化され得る。
特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、配列番号１１
５に対して少なくとも５０％（例えば、５０％から１００％の間（両端を含む）の任意の
数字、例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％
）同一である。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異体」または「Ｃａｓ変異体」は、
ＲＮＡ分子（例えば、ｓｇＲＮＡ）と結合する。特定の実施形態では、「Ｃａｓ突然変異
体」または「Ｃａｓ変異体」は、ＲＮＡ分子を介して特定のポリヌクレオチド配列に標的
化される。
［融合タンパク質］
特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質と異種の別のタンパク質
またはポリペプチドと融合されて、融合タンパク質が作製される。特定の実施形態では、
異種配列は、切断ドメイン、転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメインまたはエピ
ジェニック修飾ドメインなどの１つまたは複数のエフェクタードメインを含む。エフェク
タードメインのさらなる例は、核局在性シグナル、細胞透過性または転位置ドメインまた
はマーカードメインを含む。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、融合タンパ
ク質のＮ末端、Ｃ末端にまたは内部位置中に位置する。特定の実施形態では、融合タンパ
ク質のＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質であるか、またはそれに由来する。特定
の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパク質は、すべてのヌクレアーゼドメイン
が不活性化または欠失されている、修飾された、または突然変異されたＣａｓタンパク質
であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、融合タンパク質のＣａｓタンパ
ク質は、ヌクレアーゼ活性を欠く、修飾された、または突然変異されたＣａｓタンパク質
であるか、またはそれに由来する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質のＲｕｖＣお
よび／またはＨＮＨドメインは、もはやヌクレアーゼ活性を有しないように修飾される、
または突然変異される。
［切断ドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、切断ドメインである
。本明細書において、「切断ドメイン」とは、ＤＮＡを切断するドメインを指す。切断ド
メインは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。
切断ドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの限定されない例として、制限エンドヌク
レアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ
ａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓのカタログ、またはＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３７９－８８を参照のこと。ＤＮＡを切
断するさらなる酵素は、公知である（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレア
ーゼ、膵臓ＤＮアーゼＩ、小球菌ヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。Ｌｉｎ
ｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）“Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと。これらの酵素（
またはその機能的断片）のうちの１種または複数を、切断ドメインの供給源として使用で
きる。
特定の実施形態では、切断ドメインは、ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼに由来し得る。
ＩＩ－Ｓ型エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡを、通常、エンドヌクレアーゼのＤＮＡ認識部
位から数塩基対離れた部位で特異的に切断し、そのようなものとして、分離可能な認識お
よび切断ドメインを有する。これらの酵素は、一般に、一時的に会合して二量体を形成し
、捻じれた位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。適したＩＩ－Ｓ型エンドヌクレ
アーゼの限定されない例として、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ
、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏｌＩおよびＳａｐＩが挙げられる。特定の実
施形態では、融合タンパク質の切断ドメインは、ＦｏｋＩ切断ドメインまたはその断片ま
たは誘導体であるＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．２５，７７８－８５；Ｓｚｃｚｐｅｋ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．２５，７８６－９３；Ｄｏｙｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ，８，７４－８１を参照のこと。
［転写活性化ドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写活性化ドメイン
である。一般に、転写活性化ドメインは、転写制御エレメントおよび／または転写調節タ
ンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用し、遺伝子の転写
を増大および／または活性化する。特定の実施形態では、転写活性化ドメインは、単純ヘ
ルペスウイルスＶＰ１６活性化ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、
ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭ
Ｐ反応エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメインまたはＮＦＡ
Ｔ（活性化されたＴ細胞の核因子）活性化ドメインである。特定の実施形態では、転写活
性化ドメインは、Ｇａｌ４、Ｇｃｎ４、ＭＬＬ、Ｒｔｇ３、Ｇｌｎ３、Ｏａｆ１、Ｐｉｐ
２、Ｐｄｒ１、Ｐｄｒ３、Ｐｈｏ４またはＬｅｕ３である。転写活性化ドメインは、野生
型であり得る、または元の転写活性化ドメインの修飾された型もしくは末端切除型であり
得る。
［転写リプレッサードメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、転写リプレッサード
メインである。一般に、転写リプレッサードメインは、転写制御エレメントおよび／また
は転写調節タンパク質（すなわち、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼなど）と相互作用して
、遺伝子の転写を減少させるおよび／または妨げる。特定の実施形態では、転写リプレッ
サードメインは、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅ
ｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレ
ッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐＩ）リプレッサー、ＩκＢリプレッサ
ーまたはＭｅＣＰ２である。
［エピジェニック修飾ドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質のエフェクタードメインは、エピジェニック修飾
ドメインである。一般に、エピジェニック修飾ドメインは、ヒストン構造および／または
染色体構造を修飾することによって遺伝子発現を変更する。特定の実施形態では、エピジ
ェニック修飾ドメインは、ヒストンアセチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデア
セチラーゼドメイン、ヒストンメチルトランスフェラーゼドメイン、ヒストンデメチラー
ゼドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼドメインまたはＤＮＡデメチラーゼドメイ
ンである。
［さらなるドメイン］
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなるドメインをさらに
含む。適したさらなるドメインの限定されない例として、核局在性シグナル（ＮＬＳ）、
細胞透過性または転位置ドメインおよびマーカードメインが挙げられる。ＮＬＳは、一般
に、塩基性アミノ酸のストレッチを含む。例えば、Ｌａｎｇｅ ｅｔ ａｌ．（２００７
）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８２，５１０１－５を参照のこと。例えば、特定の実施
形態では、ＮＬＳは、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１６）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番
号１１７）などのモノパータイト（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列である。特定の実施形
態では、ＮＬＳは、ビパータイト（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列である。特定の実施形態で
は、ＮＬＳは、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１１８）である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つの細胞透過性ドメインを含む
。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１のＴＡＴタンパク質に由来す
る細胞透過性ペプチド配列である。例として、ＴＡＴの細胞透過性配列は、ＧＲＫＫＲＲ
ＱＲＲＲＰＰＱＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１１９）であり得る。特定の実施形態では、細
胞透過性ドメインは、ＴＬＭ（ＰＬＳＳＩＦＳＲＩＧＤＰＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２
０）、これはヒトＢ型肝炎ウイルス由来の細胞透過性ペプチド配列である。特定の実施形
態では、細胞透過性ドメインは、ＭＰＧ（ＧＡＬＦＬＧＷＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＰＫＫＫ
ＲＫＶ、配列番号１２１またはＧＡＬＦＬＧＦＬＧＡＡＧＳＴＭＧＡＷＳＱＰＫＫＫＲＫ
Ｖ、配列番号１２２）である。特定の実施形態では、細胞透過性ドメインは、Ｐｅｐ－１
（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ、配列番号１２３）、ＶＰ２２、単純ヘ
ルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチドまたはポリアルギニンペプチド配列である。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのマーカードメインを含む。
マーカードメインの限定されない例は、蛍光タンパク質、精製タグおよびエピトープタグ
を含む。特定の実施形態では、マーカードメインは、蛍光タンパク質である。適した蛍光
タンパク質の限定されない例として、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２
、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅ
ｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）
、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰ
ｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、
ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－
ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｃ
ｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（
ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ
１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－Ｔ
ａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳ
ｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、橙色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕ
ｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒ
ｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）および任意のその他の適した蛍光タンパク質が挙げられる。
特定の実施形態では、マーカードメインは、精製タグおよび／またはエピトープタグであ
る。例示的タグとして、これらに限定されないが、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラー
ゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレド
キシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍ
ｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆ
ｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ
、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアータンパ
ク質（ＢＣＣＰ）およびカルモジュリンが挙げられる。
［Ｖ．使用および方法］
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質を用いて切断する方
法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガ
イドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させ
ることを含む。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をも
たらす。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａ
ｓタンパク質である。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に一本鎖切
断をもたらす。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび一本鎖ニッキング活性を有する
Ｃａｓタンパク質を含む複合体は、配列によって標的化される一本鎖ＤＮＡ切断、すなわ
ち、ニッキングのために使用される。
一態様では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドを、Ｃａｓタンパク質を用い
て切断する方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において
記載されるガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質を接触させること
を含む。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に二本鎖切断をもたらす
。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタン
パク質である。特定の実施形態では、方法は、標的ポリヌクレオチド中に一本鎖切断をも
たらす。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよび一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓ
タンパク質を含む複合体は、配列によって標的化される一本鎖ＤＮＡ切断、すなわち、ニ
ッキングのために使用される。
一態様では、本発明は、標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質と結合するための方
法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載されるガ
イドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させ
て、標的ポリヌクレオチドのＣａｓタンパク質との結合をもたらすことを含む。特定の実
施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓ変
異体は、対応物野生型Ｃａｓタンパク質と比較して、一部またはすべてのヌクレアーゼ活
性を欠く。
一態様では、本発明は、２つ以上の標的ポリヌクレオチドをＣａｓタンパク質と結合さ
せる方法を提供する。方法は、標的ポリヌクレオチドを、（ｉ）本明細書において記載さ
れるＲＮＡ分子のセットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と接触させて、標的ポリヌクレ
オチドのＣａｓタンパク質との結合をもたらすことを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓ
タンパク質は、Ｃａｓ変異体である。特定の実施形態では、Ｃａｓ変異体は、対応物野生
型Ｃａｓタンパク質と比較して、一部またはすべてのヌクレアーゼ活性を欠く。
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質を、標的ポリヌクレオチドに標的化するため
の方法を提供する。方法は、Ｃａｓタンパク質を、本明細書において記載されるガイドＲ
ＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットと接触させるステップを含む。特定の実施形態では
、方法は、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の形成をもたらす。特定の実施形態で
は、Ｃａｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａ
ｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質の突然変異体または変異体である。特定の実施形態
では、Ｃａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特
定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例
えば、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ欠損突然変異体）である。特定の実施形態では、
Ｃａｓタンパク質は、融合タンパク質（例えば、（ｉ）Ｃａｓタンパク質および（ｉｉ）
異種ポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部である。
一態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質を、２種以上の標的ポリヌクレオチドに標的
化するための方法を提供する。方法は、Ｃａｓタンパク質を、本明細書において記載され
るガイドＲＮＡ分子のセットと接触させるステップを含む。特定の実施形態では、方法は
、ガイドＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体の形成をもたらす。特定の実施形態では、Ｃａ
ｓタンパク質は、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパ
ク質は、Ｃａｓ９タンパク質の突然変異体または変異体である。特定の実施形態では、Ｃ
ａｓタンパク質は、一本鎖ニッキング活性を有するＣａｓタンパク質である。特定の実施
形態では、Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓタンパク質（例えば、Ｃ
ａｓタンパク質のヌクレアーゼ欠損突然変異体）である。特定の実施形態では、Ｃａｓタ
ンパク質は、融合タンパク質（例えば、（ｉ）Ｃａｓタンパク質またはおよび（ｉｉ）異
種ポリペプチドを含む融合タンパク質）の一部である。
一態様では、本発明は、合成ガイドＲＮＡを選択する方法を提供する。方法は、ＭＰ修
飾の位置に起因して特異性を増強するガイド配列内の位置（１つまたは複数）を同定する
ための、ｇＲＮＡのガイド配列部分を横断するＭＰ修飾の「ウォーキング」を含む。オン
ターゲット対オフターゲット切断比、標的部位での切断パーセンテージ、および１つもし
くは複数のオフターゲット部位での切断パーセンテージ、ならびに／または特異性スコア
を用いて試験した各位置について特異性増強の大きさを評価し、このようにして、ｇＲＮ
Ａの特異性を変更する修飾位置（１つまたは複数）および変更する程度を決定することが
できる。ガイド配列を横断する単一ＭＰの漸進的なウォーキングによって、試験した位置
の中から、化学修飾の１つまたは複数の組合せの結果として生じる特異性の可能性ある相
乗的改善のための位置を同定することもできる。
ある実施形態では、方法は、少なくとも第１の合成ガイドＲＮＡおよび第２の合成ガイ
ドＲＮＡを用意するステップと（前記合成ガイドＲＮＡの両方は、（ａ）（ｉ）標的ポリ
ヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含む
ｃｒＲＮＡセグメントと、（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌク
レオチド配列を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとを含み、前記第１の合成ガイドＲＮＡ
は、前記ガイド配列の第１の位置にＭＰ修飾を含み、前記第２の合成ガイドＲＮＡは、前
記ガイド配列の第２の位置にＭＰ修飾を含む）；Ｃａｓタンパク質と前記第１の合成ガイ
ドＲＮＡとを含む第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成し、前記標的ポリヌク
レオチドを前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌク
レオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップと；Ｃａｓタンパク
質と前記第２のガイドＲＮＡとを含む第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成し
、前記標的ポリヌクレオチドを前記第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ
、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップ
と；前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合することに
おける、前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体および前記第２の合成ｇＲＮＡ：
Ｃａｓタンパク質複合体の特異性を判定するステップと；ガイドＲＮＡのどちらが前記標
的ポリヌクレオチドに対してより大きい特異性を有するかを同定するステップとを含む。
特定の実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体は、例えば第
１および第２のｇＲＮＡを異なるフルオロフォアで標識することによって、競合アッセイ
で一緒に試験される。特定の実施形態では、第１および第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク
質複合体は、並行してまたは逐次的にアッセイされる同等のまたは別々のサンプルにおい
て、個々に試験される。
一態様では、本発明は、特異性増強修飾を含むガイドＲＮＡなどの、ガイドＲＮＡを使
用することによって遂行される、ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を分析するための方法を提供
する。方法は、サンプル中の標的配列および１つまたは複数のオフターゲット配列を同定
するステップと（ここで、前記標的配列は、標的ポリヌクレオチドに含まれ、前記オフタ
ーゲット配列は、１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドに含まれている）；
ガイドＲＮＡを使用してＣＲＩＳＰＲ機能を遂行するステップと；前記標的ポリヌクレオ
チドおよびオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されている
オリゴヌクレオチドベイトのライブラリーを使用することによって、標的ポリヌクレオチ
ドおよびオフターゲットポリヌクレオチドを捕捉するステップと；捕捉されたポリヌクレ
オチドを単離し、分析して、標的配列およびオフターゲット配列がＣＲＩＳＰＲ機能に起
因して変化したかどうかを評価するステップとを含む。標的配列と非標的配列間の変化の
相対的な程度は、ガイドＲＮＡによって媒介されるＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を示す。一
部の実施形態では、捕捉されたポリヌクレオチドは、シークエンシングによって分析され
る。
ポリヌクレオチドベイトは、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計さ
れたベイト、およびオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計さ
れたベイトを含む。ベイトは、標的（またはオフターゲット）配列と直接ハイブリダイズ
することができ、または標的（もしくはオフターゲット）配列の５’もしくは３のいずれ
かにまたは両方における、標的（もしくは非標的）配列付近の配列、例えば、標的（もし
くはオフターゲット）配列の２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、
６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４
０、３０もしくは２０塩基対以内の配列とハイブリダイズすることができることが企図さ
れる。一部のベイトは、部分的に標的（またはオフターゲット）配列と、および部分的に
標的（またはオフターゲット）配列外と、ハイブリダイズすることができる。一部の実施
形態では、ベイトのライブラリーは、標的（またはオフターゲット）配列とハイブリダイ
ズするベイト、および標的（またはオフターゲット）配列付近とハイブリダイズするベイ
トの両方を含むことができる。一部の実施形態では、ライブラリーは、標的（またはオフ
ターゲット）配列付近とハイブリダイズする標的のみを含み、標的（またはオフターゲッ
ト）配列とハイブリダイズするベイトを含まないか、または逆に、標的（またはオフター
ゲット）配列とハイブリダイズするベイトのみを含み、標的（またはオフターゲット）配
列付近とハイブリダイズするベイトを含まない。一部の実施形態では、ベイトは、標的配
列を中心とする約１０００ｂｐの領域、および各オフターゲット配列を中心とする約１０
００ｂｐの領域とハイブリダイズする。一部の実施態様では、ベイトは、タイリングされ
る。
特定の実施形態では、特異性増強修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（Ｍ
Ｐ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－
ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそ
れらの組合せを含む。特定の実施形態では、化学修飾は、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付
与する２’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む。特定の実
施形態では、２’修飾は、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択さ
れる。特定の実施形態では、第１および第２の合成ガイドＲＮＡは、ガイド配列部分内の
異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を含む。特定の実施形態では、特異性は、オンター
ゲット切断活性、オフターゲット切断活性、オン：オフ比、特異性スコア、またはそれら
の組合せに基づいて判定される。特定の実施形態では、方法は、ガイド配列部分内の異な
るヌクレオチドに特異性増強修飾を含む第１～第２０の合成ガイドＲＮＡを用意するステ
ップと；前記合成ガイドＲＮＡの各々を使用してｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形
成するステップと；標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接
触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断するか、それにニックを入れるかまたは結合さ
せ、各合成ガイドＲＮＡの特異性を測定するステップと；最大の特異性増強をもたらす１
つまたは複数の修飾された部分を同定するステップとを含む。特定の実施形態では、ｇＲ
ＮＡは、安定性増強性末端修飾をさらに含む。特定の実施形態では、安定性増強性末端修
飾は、ｇＲＮＡの５’末端および／または３’末端に２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ
酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチ
ル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）
、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホ
ノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ
－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、またはそれらの組合せを含む。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、トランスフェクションによって細胞中に導入さ
れる。ＲＮＡトランスフェクションのための技術は、当技術分野で公知であり、エレクト
ロポレーションおよびリポフェクションを含む。ＲＮＡトランスフェクションのための有
効な技術は、主に、細胞型に応じて変わる。例えば、ＨＴＣ－１１６結腸癌細胞のトラン
スフェクションを記載し、商業的に得られた修飾されたｍｉＲＮＡまたは前駆体ｍｉＲＮ
Ａのトランスフェクションのためにオリゴフェクタミン（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ
）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する、Ｌｕｊａｍｂｉｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｐａｎｉ
ｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｆｅｂ
．２００７を参照のこと。また、Ｋ５６２細胞のトランスフェクションを記載し、転写さ
れたｓｇＲＮＡ（約６０ｎｔ長）のトランスフェクションのために４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆ
ｅｃｔｉｏｎ（商標）（Ｌｏｎｚａ）エレクトロポレーションを使用する、Ｃｈｏ ｅｔ
ａｌ．（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ．）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．Ｍａｒ．２０１３も参照のこと。ＲＮＡのトランスフェクションの技術もまた、当技術
分野で公知である。例えば、治療用ＲＮＡは、インベイシンタンパク質を用いてコーティ
ングされた非病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に送達されており（β－１インテグリンタ
ンパク質を発現する細胞中への取り込みを容易にするために）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
は、ｓｈＲＮＡが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から細胞質へ通過することを可能にするリステ
リオリシンＯ孔形成性タンパク質を発現するようにコードされる。Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．
（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖ．）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｍａｒ
．２０１３も参照のこと。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞中に導入され、送達される。ガイドＲＮＡ
の送達のために使用され得る技術として、生分解性ポリマー、リポソームまたはナノ粒子
によるカプセル封入を利用するものが挙げられる。このようなポリマー、リポソームおよ
びナノ粒子は、静脈内に送達され得る。特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のため
に、ガイドＲＮＡは、組織部位中に注射される場合も、または全身に投与される場合もあ
る。ｉｎ ｖｉｖｏ送達はまた、その全文が参照により本明細書の一部をなす、米国特許
第５，０３２，４０１号および同５，６０７，６７７号および米国特許出願第２００５／
０２８１７８１号に記載されるものなどのβグルカン送達系によって達成され得る。特定
の実施形態では、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡを含有する送達ビヒクルは、特定の組
織または身体コンパートメントに標的化される。例えば、特定の実施形態では、外因性Ｒ
ＮＡをその他の組織に標的化するために、合成担体は、受容体取り込みのために細胞特異
的リガンドまたはアプタマーを用いて修飾される（例えば、ＰＥＧを用いてコーティング
され、腫瘍細胞において高度に発現されるトランスフェリン受容体を介した取り込みのた
めにヒトトランスフェリンタンパク質を用いて官能基付与されたシクロデキストリンナノ
粒子中に包まれたＲＮＡ）。さらなるアプローチが、本明細書において以下に記載されて
いるか、または当技術分野で公知である。
本発明は、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
３３：９，９８５－９（その全文が本願の一部をなす）に記載されるようにヒト細胞に
おいて試験されている。引用された文献では、修飾されたガイドＲＮＡは、Ｋ５６２細胞
、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）中に導入される
。修飾されたガイドＲＮＡは、非修飾ガイドＲＮＡと比較して、ヒト初代Ｔ細胞およびＣ
Ｄ３４＋ＨＳＰＣを含むヒト細胞におけるゲノム編集効率を大幅に増強した。
その他の使用の例として、以下に記載されるようなゲノム編集および遺伝子発現調節が
挙げられる。
［ゲノム編集］
一態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ（「ｉｎ ｖｉｔｒｏ
」は、限定されるものではないが、無細胞系、細胞溶解物、細胞の単離された成分、およ
び生存している生物の外側の細胞を含む）において、ＤＮＡ配列を修飾するためにゲノム
編集するための方法を提供する。ＤＮＡ配列は、染色体配列、エピソーム配列、プラスミ
ド、ミトコンドリアＤＮＡ配列またはエンハンサー配列または非コーディングＲＮＡのＤ
ＮＡ配列などの機能的遺伝子間配列を含み得る。方法は、ＤＮＡ配列を、（ｉ）本明細書
において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセットと（ｉｉ）Ｃａｓタン
パク質とを接触させるステップを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞外にて
接触する。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、細胞内のゲノム中に位置し、ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて接触する。特定の実施形態では、細胞は、生物または組
織内にある。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、幹細胞、非
哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、単細胞生物または胚である。特定の
実施形態では、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質を、ＤＮＡ配列中の標的化される部位
に標的化するのに役立つ。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、標的化される部位
でＤＮＡ配列の少なくとも１つの鎖を切断する。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質
は、標的化される部位でＤＮＡ配列の両鎖を切断する。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質を細胞または別の系の中に導入するこ
とをさらに含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製された、または精製さ
れていないタンパク質として導入される。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃ
ａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡによって導入される。特定の実施形態では、Ｃａｓ
タンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする直鎖または環状ＤＮＡによって導入される
。特定の実施形態では、細胞または系は、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコ
ードする核酸を含む。
特定の実施形態では、二本鎖切断は、エラーが起こりやすい（ｅｒｒｏｒ－ｐｒｏｎｅ
）非相同末端結合（「ＮＨＥＪ」）の修復プロセスによって修復され得る。特定の実施形
態では、二本鎖切断は、相同性指向修復（ＨＤＲ）プロセスによって修復され得、その結
果、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列は、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ
るか、それと交換され得る。
特定の実施形態では、方法は、少なくとも１種のドナーポリヌクレオチドを細胞または
系の中に導入するステップをさらに含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチド
は、ＤＮＡ配列中の標的化される部位のいずれかの側の配列と実質的な配列同一性を有す
る少なくとも１種の相同配列を含む。特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは相
同組換えなどの相同性指向修復によって、ＤＮＡ配列中に組み込まれる、またはそれと交
換されるドナー配列を含む。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、上流相同配列および下流相同配列を
含み、その各々は、それぞれ、ＤＮＡ配列中の標的化される部位の上流および下流に位置
する配列に対して実質的な配列同一性を有する。これらの配列類似性によって、例えば、
ドナーポリヌクレオチドと標的化されるＤＮＡ配列間の相同組換えが可能となり、その結
果、ドナー配列が、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ得る（またはそれと交換され
得る）。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列中の標的部位（複数でもよい）は、障害を引き起こす
か、またはそれと関連し得る、突然変異、例えば、点突然変異、転位置または逆位に広が
るか、または隣接する。特定の実施形態では、方法は、細胞または系の中に、（ｉ）突然
変異の野生型対応物と（ｉｉ）ＤＮＡ配列中の標的化される部位の片側上の配列と実質的
な配列同一性を有する少なくとも１つの相同配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌク
レオチドとを導入することによって、突然変異を補正するステップを含む。特定の実施形
態では、ドナーポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列中の標的化される部位の両鎖上の配列と
実質的な配列同一性を有する相同配列を含む。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えなどの相同性指向修復プ
ロセスによって、標的化されるＤＮＡ配列中に組み込まれ得るまたはそれと交換され得る
外因性配列を含む。特定の実施形態では、外因性配列は、任意選択的に、外因性プロモー
ター制御配列と作動可能に連結されるタンパク質コーディング遺伝子を含む。したがって
、特定の実施形態では、外因性配列の組込みの際に、細胞は、組み込まれた遺伝子によっ
てコードされるタンパク質を発現し得る。特定の実施形態では、外因性配列は、レシピエ
ント細胞または系におけるその発現が外因性プロモーター制御配列によって調節されるよ
うに、標的化されたＤＮＡ配列中に組み込まれる。標的化されたＤＮＡ配列中への外因性
遺伝子の組込みは、「ノックイン」と呼ばれる。その他の実施形態では、外因性配列は、
転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコード配列などであり得る。
特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドは、標的化される部位の、またはその付
近のＤＮＡ配列の一部と本質的に同一であるが、少なくとも１つのヌクレオチド変更を含
む配列を含む。例えば、特定の実施形態では、ドナー配列は、標的化される部位の、また
はその付近のＤＮＡ配列の修飾された、または突然変異された型を含み、その結果、標的
化される部位の組込みまたはそれとの交換の際に、得られた標的化される部位の配列は、
少なくとも１つのヌクレオチド変更を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのヌク
レオチド変更は、１つまたは複数のヌクレオチドの挿入、１つまたは複数のヌクレオチド
の欠失、１つまたは複数のヌクレオチドの置換またはそれらの組合せである。修飾された
配列の組込みの結果として、細胞は、標的化されたＤＮＡ配列から修飾された遺伝子産物
を生成し得る。
特定の実施形態では、方法は、マルチプレックス適用のためのものである。特定の実施
形態では、方法は、細胞または系の中にガイドＲＮＡライブラリーを導入することを含む
。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０種の唯一無二なガイド配列を含
む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００種の唯一無二なガイド配列
を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１，０００種の唯一無二なガ
イド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０，０００種の唯
一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１００，
０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なく
とも１，０００，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブ
ラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０種の異なるポリヌクレ
オチドまたは少なくとも１０種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブ
ラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００種の異なるポリヌク
レオチドまたは少なくとも１００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ラ
イブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００種の異なる
ポリヌクレオチドまたは少なくとも１，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施
形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０，０
００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０，０００種の異なる配列を標的化
する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少
なくとも１００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００，０００種
の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポ
リヌクレオチド内の少なくとも１，０００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少
なくとも１，０００，０００種の異なる配列を標的化する。
［ヒトおよび哺乳動物細胞におけるゲノム編集］
本発明の実施形態は、哺乳動物細胞において、標的ポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ
配列を修飾するためのゲノム編集するための方法において有用である。
特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、染色体配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡ
配列は、タンパク質コード配列である。特定の実施形態では、ＤＮＡ配列は、エンハンサ
ー配列または非コード配列などの機能的遺伝子間配列である。特定の実施形態では、ＤＮ
Ａは、ヒト遺伝子の一部である。いくつかのこのような実施形態では、ヒト遺伝子は、ク
ラスリン軽鎖（ＣＬＴＡ１）遺伝子、ヒトインターロイキン２受容体γ（ＩＬ２ＲＧ）遺
伝子、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＬＴＡ４）遺伝子、ヒト血管内皮
増殖因子Ａ遺伝子（ＶＥＧＦＡ）、または、鎌形赤血球貧血およびサラセミアに関与する
突然変異を有し得るヒトヘモグロビンβ（ＨＢＢ）遺伝子である。したがって、特定の実
施形態では、標的ポリヌクレオチドは、ＨＢＢポリヌクレオチド、ＶＥＧＦＡポリヌクレ
オチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、またはＣＬＴＡ４
ポリヌクレオチドである。
特定の実施形態では、合成ガイドＲＮＡは、ＨＢＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＣＬＴＡ１、ＶＥＧ
ＦＡまたはＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる、ガイド配列
を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレ
オチド１～２０－Ｎからなり、Ｎは、－１０から０の間の整数であり、前記ガイド配列は
、ヌクレオチド４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、１４－Ｎまたは
１６－Ｎに少なくとも１つの特異性増強修飾を含む。特定の実施形態では、上記標的ポリ
ヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチ
ド１１－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうち
の１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド５－Ｎに化学修飾
を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイ
ズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド７－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施
形態では、上記標的ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガ
イド配列は、ヌクレオチド１０－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的
ポリヌクレオチドのうちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレ
オチド９－Ｎに化学修飾を有する。特定の実施形態では、上記標的ポリヌクレオチドのう
ちの１つとハイブリダイズすることができるガイド配列は、ヌクレオチド４－Ｎに化学修
飾を有する。特定の実施形態では、Ｎは、ゼロである。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド
１～１９からなり、ヌクレオチド３、４、６、８、９または１０のうちの１つに少なくと
も１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端
から数えてヌクレオチド１～１８からなり、ヌクレオチド２、３、５、７、８または９の
うちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該
ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１７からなり、ヌクレオチド１、２、
４、６、７または８のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。特定の実施形態で
は、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１６からなり、
ヌクレオチド１、３、５、６または７のうちの１つに少なくとも１つの化学修飾を含む。
特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１
～１５からなり、ヌクレオチド２、４、５または６のうちの１つに少なくとも１つの化学
修飾を含む。特定の実施形態では、ガイド配列は、該ガイド配列の５’末端から数えてヌ
クレオチド１～１４からなり、ヌクレオチド１、３、４または５のうちの１つに少なくと
も１つの化学修飾を含む。特定の実施形態では、化学修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－
ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－
デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（Ｄ
ＳＰ）、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、化学修飾は、Ｃ３’－エン
ド糖パッカーを付与する２’修飾；およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾
を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエ
チル）から選択される。
特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。いくつかのこのような実施形
態では、ヒト細胞は、初代ヒト細胞である。さらなる実施形態では、初代ヒト細胞は、ヒ
ト初代Ｔ細胞である。ヒト初代Ｔ細胞は、刺激されている場合も、刺激されていない場合
もある。特定の実施形態では、ヒト細胞は、ＣＤ３４＋造血幹および前駆体細胞（ＨＳＰ
Ｃ）などの幹／前駆体細胞である。特定の実施形態では、ヒト細胞は、培養細胞株、例え
ば、商業的に得ることができるものなどに由来する。例示的な細胞株としては、ヒト骨髄
性白血病株であるＫ５６２細胞が挙げられる。
特定の実施形態では、細胞は、生存生物の内部にある。特定のその他の実施形態では、
細胞は、生存生物の外部にある。
方法は、（ｉ）本明細書において記載されるガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡ分子のセ
ットおよび（ｉｉ）Ｃａｓタンパク質と、ＤＮＡ配列を接触させるステップを含む。
特定の実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡを細胞中に導入または送達するステップを
さらに含む。いくつかのこのような実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞中にトランスフ
ェクションによって導入される。ＲＮＡトランスフェクションのための技術は、当技術分
野で公知であり、エレクトロポレーションおよびリポフェクションが挙げられる。その他
の実施形態では、ガイドＲＮＡは、細胞（より詳しくは、細胞核）中にヌクレオフェクシ
ョンによって導入される。ヌクレオフェクションのための技術は、当技術分野で公知であ
り、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂまたはＬｏｎｚａ ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅ
ｏｆｅｃｔｏｒなどのヌクレオフェクション装置および関連試薬を利用し得る。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質を細胞中に導入または送達するステッ
プをさらに含む。いくつかのこのような実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、精製または
非精製タンパク質として導入される。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａ
ｓタンパク質をコードするｍＲＮＡによって導入される。いくつかのこのような実施形態
では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞中にトランスフェクションによっ
て導入される。その他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、細胞
（より詳しくは、細胞核）中にヌクレオフェクションによって導入される。
特定の実施形態では、方法は、Ｃａｓタンパク質が、ガイドＲＮＡとの複合体で細胞中
に導入されるようなリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）ベースの送達を使用する。例えば
、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ複合体でガイドＲＮＡと複合体形成され得
、これは、ｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の同時送達を可能にする。例えば、Ｃａｓ：
ｇＲＮＡ複合体は、細胞中にヌクレオフェクトされ得る。
特定の実施形態では、方法は、すべてのＲＮＡ送達プラットフォームを使用する。例え
ば、いくつかのこのような実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコード
するｍＲＮＡは、同時にまたは実質的に同時に細胞中に導入される（例えば、同時トラン
スフェクションまたは同時ヌクレオフェクションによって）。特定の実施形態では、Ｃａ
ｓのｍＲＮＡおよび修飾されたｇＲＮＡの同時送達は、ＣａｓのｍＲＮＡおよび非修飾ｇ
ＲＮＡの同時送達と比較して、より高い編集頻度をもたらす。特に、５’および３’末端
の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオ
エート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－
メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較
してより高い編集頻度を提供する。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、
細胞中に逐次導入される、すなわち、ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質をコードする
ｍＲＮＡは、細胞中に異なる時点で導入される。各薬剤の導入間の期間は、数分（または
それ未満）から数時間または数日で変わり得る。例えば、いくつかのこのような実施形態
では、ｇＲＮＡは最初に送達され、続いて、ＣａｓのｍＲＮＡが４、８、１２または２４
時間後に送達される。その他のこのような実施形態では、ＣａｓのｍＲＮＡが最初に送達
され、続いて、ｇＲＮＡが４、８、１２または２４時間後に送達される。いくつかの特定
の実施形態では、最初の修飾されたｇＲＮＡの送達、続いてＣａｓのｍＲＮＡの送達が、
非修飾ｇＲＮＡとそれに続くＣａｓのｍＲＮＡの送達と比較して、より高い編集頻度をも
たらす。
特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、細胞中に、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡプ
ラスミドと一緒に導入される。いくつかのこのような実施形態では、ｇＲＮＡおよびＣａ
ｓタンパク質をコードするＤＮＡプラスミドは、細胞中にヌクレオフェクションによって
導入される。いくつかの特定の実施形態では、ＲＮＰベースの送達プラットフォームまた
は全ＲＮＡ送達プラットフォームは、ＤＮＡプラスミドベースの送達系よりも、初代細胞
において低い細胞毒性を提供する。
特定の実施形態では、方法は、ヒト初代Ｔ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＰＣを含むヒト細
胞において大幅に増強されたゲノム編集効率を提供する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、変異原性Ｎ
ＨＥＪおよび遺伝子破壊を示し得る、挿入または欠失（インデル）の頻度を増大する。特
に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチ
ル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「Ｍ
Ｐ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有する修飾された
ｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してインデルの頻度を増大する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡおよびＣａｓのｍＲＮＡの、ヒト初代Ｔ細胞
への同時送達は、非修飾ｇＲＮＡおよびＣａｓのｍＲＮＡの同時送達と比較して、インデ
ルの頻度を増大する。特に、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み
込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル
－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ
」）を有する修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、ヒト初代Ｔ細胞におい
てインデルの頻度を増大する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較してｇＲＮＡ安定
性を改善する。１つの例として、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに
組み込まれた２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡを上回っ
て、ヌクレアーゼに対する安定性を中程度に改善し、また塩基対形成の熱安定性を改善す
る。別の例として、５’および３’末端の両方の３つの末端ヌクレオチドに組み込まれた
２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）、２’－Ｏ－メチル－３’－
ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有
するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡと比較して、ヌクレアーゼに対する安全性を劇的に改善
する。ｇＲＮＡ末端修飾は、エキソヌクレアーゼに対する細胞内安定性を増強し、従って
、ＣａｓのｍＲＮＡおよびｇＲＮＡが、細胞または細胞溶解物中に同時送達されるか、逐
次送達される場合にゲノム編集の有効性の増大を可能にすることが考慮される。特定の実
施形態では、末端における安定性増強修飾は、ガイド配列が同一の末端を含む場合、特異
性増強修飾としても役立つことができる。特定の実施形態では、２’－Ｏ－メチル－３’
－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’
－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢
酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３
’－ホスホノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’
－フルオロ－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－
３’－ホスホノ酢酸、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）－チオホスホノ酢酸、２’－Ｏ
－（２－メトキシエチル）－３’－ホスホロチオエート、またはそれらの組合せを含む末
端修飾は、本発明の方法の安定性および特異性を増大させる。特定の実施形態では、修飾
されたｇＲＮＡは、標的遺伝子組換えを刺激し、これは、順に、例えば、相同組換えまた
はＮＨＥＪによる遺伝子編集を可能にする。特に、５’および３’末端の両方の３つの末
端ヌクレオチドに組み込まれた２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」
）、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）または２’－Ｏ－メチル－３’－チ
オＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）を有するｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡよりも高いレベルの相同
組換えを刺激する。
特定の実施形態では、修飾されたｇＲＮＡは、高い特異性を保持する。特定の実施形態
では、非修飾ｇＲＮＡと比較されるように、修飾されたｇＲＮＡを用いた場合に、オンタ
ーゲット対オフターゲットのインデル頻度の比は改善される。特定の実施形態では、Ｃａ
ｓタンパク質とのＲＮＰ複合体で送達された修飾されたｇＲＮＡは、ＤＮＡプラスミドベ
ースの送達系と比較して大幅に良好なオンターゲット対オフターゲット比を提供する。
［遺伝子発現調節］
特定の実施形態では、本明細書において記載されるガイドＲＮＡは、対象の遺伝子の転
写または発現を調節するために使用される。例えば、特定の実施形態では、遺伝子の転写
を増大するために、Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）および転写
アクチベーターポリペプチドを含む融合タンパク質が使用される。同様に、特定の実施形
態では、Ｃａｓタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９）およびリプレッサーポ
リペプチドを含む融合タンパク質は、遺伝子の転写を干渉することによって遺伝子発現を
ノックダウンするために使用される。
少なくとも１つの態様では、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで対象
の遺伝子の発現を調節するための方法を提供する。方法は、細胞または別の系の中に、（
ｉ）本明細書において記載される合成ガイドＲＮＡおよび（ｉｉ）融合タンパク質を導入
するステップを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、Ｃａｓタンパク質および
転写活性化ドメイン、転写リプレッサードメインまたはエピジェニック修飾ドメインなど
のエフェクタードメインを含む。特定の実施形態では、融合タンパク質は、ヌルヌクレア
ーゼであるＣａｓ９タンパク質などの突然変異したＣａｓタンパク質を含む。特定の実施
形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａおよび／またはＮ８６３Ａなどの
１つまたは複数の突然変異を含有する。
特定の実施形態では、融合タンパク質は、精製または非精製タンパク質として細胞また
は系の中に導入される。特定の実施形態では、融合タンパク質は、融合タンパク質をコー
ドするｍＲＮＡによって細胞または系の中に導入される。特定の実施形態では、融合タン
パク質は、融合タンパク質をコードする直鎖または環状ＤＮＡによって細胞または系の中
に導入される。
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡは、融合タンパク質を、染色体配列、エピソーム配
列、プラスミド、ミトコンドリアＤＮＡ配列またはエンハンサーなどの機能的遺伝子間配
列または非コーディングＲＮＡのＤＮＡ配列を含む特定の標的ポリヌクレオチドに指向さ
せるのに役立つ。特定の実施形態では、エフェクタードメインは、標的ポリヌクレオチド
において配列の発現を調節する。遺伝子発現を調節するためのガイドＲＮＡは、機能的Ｒ
ＮＡをコードする任意の所望の内因性遺伝子または配列を標的化するように設計され得る
。ゲノム標的配列は、内因性遺伝子の転写開始部位の付近で、あるいは、内因性遺伝子の
翻訳開始部位の付近で選択され得る。特定の実施形態では、標的配列は、遺伝子の「プロ
モーター近位」領域と伝統的に呼ばれるＤＮＡの領域中にある。特定の実施形態では、標
的配列は、転写開始部位の約１，０００塩基対上流から転写開始部位の約１，０００塩基
対下流の領域中にある。特定の実施形態では、標的配列は、遺伝子（例えば、別の染色体
上の）の転写のための開始部位から離れている。
特定の実施形態では、方法は、マルチプレックス適用のためのものである。特定の実施
形態では、方法は、ガイドＲＮＡのライブラリーを細胞または系の中に導入することを含
む。特定の実施形態では、ライブラリーは、少なくとも１０、少なくとも１００、少なく
とも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００または少なくとも
１，０００，０００種の唯一無二なガイド配列を含む。特定の実施形態では、ライブラリ
ーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０種の異なるポリヌクレオチ
ドまたは少なくとも１０種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリ
ーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１００種の異なるポリヌクレオ
チドまたは少なくとも１００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブ
ラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１，０００種の異なるポリ
ヌクレオチドまたは少なくとも１，０００種の異なる配列を標的化する。特定の実施形態
では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なくとも１０，０００
種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１０，０００種の異なる配列を標的化する
。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌクレオチド内の少なく
とも１００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なくとも１００，０００種の異
なる配列を標的化する。特定の実施形態では、ライブラリーは、１種または複数のポリヌ
クレオチド内の少なくとも１，０００，０００種の異なるポリヌクレオチドまたは少なく
とも１，０００，０００種の異なる配列を標的化する。
［キット］
一態様では、本発明は、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を製造するステップ、およ
び／または標的ポリヌクレオチドを結合、ニッキングもしくは切断するためのその活性を
支持するステップを含む、上記の方法を実施するための試薬を含有するキットを提供する
。特定の実施形態では、本明細書において開示される方法の１種または複数の反応成分、
例えば、１種または複数のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質は、使用のためのキット
の形態で供給され得る。特定の実施形態では、キットは、Ｃａｓタンパク質またはＣａｓ
タンパク質をコードする核酸および本明細書において記載される１種または複数のガイド
ＲＮＡまたはガイドＲＮＡのライブラリーのセットを含む。特定の実施形態では、キット
は、１種または複数のその他の反応成分を含む。特定の実施形態では、１種または複数の
反応成分の適当な量が、１つまたは複数の容器中で提供されるか、または基板上に保持さ
れる。
特定の実施形態では、本発明は、異なる修飾、またはガイド配列内の異なる位置での修
飾を除いて同一である、少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡを含む合成ガイドＲＮＡを選
択するためのキットを提供する。各ガイドＲＮＡは、（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチド
とハイブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセ
グメントと、（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列
を含むｔｒａｃｒＲＮＡセグメントとを含み；前記ガイド配列は、該ガイド配列の５’末
端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎ（Ｎは、－１０から１０の間、任意選択的に１０
から６の間の整数である）を含み、および該ガイド配列内のヌクレオチドに少なくとも１
つの特異性増強修飾を含み、前記少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡは、少なくとも１つ
の異なる特異性増強修飾を有する点、または前記ガイド配列内の少なくとも１つの異なる
位置に特異性増強修飾を有する点で、互いに異なる。キットはまた、Ｃａｓタンパク質を
含むか、またはＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態
では、キット内の各合成ガイドＲＮＡは、異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を含む。
特定の実施形態では、キットは、各々のものがガイド配列内の異なるヌクレオチド位置に
修飾を有する、一連の合成ガイドＲＮＡを含む。特定の実施形態では、キットは、ガイド
配列内のヌクレオチドの数と同数の異なるガイドＲＮＡを有する。特定の実施形態では、
Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。特定の実施形態では、特異性増強修飾は、２’－
Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸
（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、もしくは２’－デオキシ－
３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では
、特異性増強修飾は、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホスホノ酢
酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む。特定の実施形態では、２’修飾は、２’－Ｆ
および２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される。特定の実施形態では、ガイド
ＲＮＡは、合成単一ガイドＲＮＡである。
キットのさらなる成分の例は、これらに限定されないが、１種または複数の異なるポリ
メラーゼ、１種または複数の宿主細胞、外来核酸を宿主細胞中に導入するための１種また
は複数の試薬、ガイドＲＮＡおよび／もしくはＣａｓのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現
を検出するための、または標的核酸の状態を確認するための１種または複数の試薬（例え
ば、プローブまたはＰＣＲプライマー）およびバッファー、トランスフェクション試薬ま
たは反応のための培養培地（１×またはより濃縮された形態の）を含む。特定の実施形態
では、キットは、生化学的および物理的支持体、終結、修飾および／または消化試薬、浸
透圧調節物質ならびに反応、トランスフェクションおよび／または検出のための装置の成
分のうち、１種または複数を含む。
使用される反応成分は、種々の形態で提供され得る。例えば、成分（例えば、酵素、Ｒ
ＮＡ、プローブおよび／またはプライマー）は、水溶液中に懸濁されるか、またはビーズ
に結合されるか、またはフリーズドライもしくは凍結乾燥された粉末もしくはペレットと
してであり得る。後者の場合には、成分は、再構成されると、アッセイにおいて使用する
ための成分の完全混合物を形成する。本発明のキットは、任意の適した温度で提供され得
る。例えば、液体中にタンパク質成分またはその複合体を含有するキットの貯蔵のために
は、それらが０℃未満で、好ましくは、約－２０℃で、おそらくは、グリセロールまたは
その他の適した凍結防止剤を含有する凍結耐性溶液中で提供され、維持されることが好ま
しい。
キットまたは系は、少なくとも１種のアッセイにとって十分な量で、本明細書において
記載される成分の任意の組合せを含有し得る。いくつかの適用では、１種または複数の反
応成分は、個々の、通常、ディスポーザブルのチューブまたは同等の容器中に予め測定さ
れた単回使用量で提供され得る。このような配置を用いて、標的核酸または標的核酸を含
有するサンプルもしくは細胞を、個々のチューブに直接添加することによってＲＮＡによ
ってガイドされるヌクレアーゼ反応が実施され得る。キット中に供給される成分の量は任
意の適当な量であり得、製品が向けられる市場に応じて変わり得る。成分が供給される容
器（複数でもよい）は、供給された形態を保持可能である任意の従来の容器、例えば、マ
イクロチューブ、マイクロタイタープレート、アンプル、ボトルまたは流体装置、カート
リッジ、ラテラルフローまたはその他の同様の装置などの複合的試験装置であり得る。
キットはまた、容器または容器の組合せを保持するためのパッケージング材料を含み得
る。このようなキットおよび系の通常のパッケージング材料は、種々の立体配置のいずれ
かの中に（例えば、バイアル、マイクロタイタープレートウェル、マイクロアレイ中など
）反応成分または検出プローブを保持する固体マトリクス（例えば、ガラス、プラスチッ
ク、紙、ホイル、微粒子など）を含む。キットは、成分の使用のための有形の形態で記録
された使用説明書をさらに含み得る。
［実施例１］
生理的塩条件で結合エネルギーに対する化学修飾の効果を評価するために、２０ヌクレ
オチドガイド配列を有する４３ヌクレオチドのｃｒＲＮＡを作製した。ＤＮＡオリゴヌク
レオチドの各末端上に突出している１０ヌクレオチドを含む相補的４０ヌクレオチドＤＮ
ＡオリゴヌクレオチドとｃｒＲＮＡを混合することによって、二本鎖を形成した。その二
本鎖の融解温度（「Ｔｍ」）を測定した。サンプリングおよびロッキング領域にいくつか
の連続する修飾を有し、２０ｎｔガイド配列内の位置１０に介在または「スペーサー」ヌ
クレオチドを有する、７つのさらなる４３ｎｔのｃｒＲＮＡを作製した。図６Ａは、修飾
の種類および配置を示す。エキソヌクレアーゼ耐性修飾は、２’－Ｏ－メチル－３’－Ｐ
ＡＣＥ（「ＭＰ」）であり、スペーサーは、非修飾ＲＮＡヌクレオチドであった。各修飾
ｃｒＲＮＡ６０１を、相補的な４０ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド６０３と混合するこ
とによって二本鎖を個々に形成し、ＲＮＡ鎖に修飾を含有する各ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖６
０５の融解温度を測定して、種々の修飾が生理的塩条件下で結合エネルギーにもたらす効
果を定量した。
修飾が二本鎖融解の協同性にもたらす効果は、融解曲線の傾きを測定することによって
定量的に評価することができ、より大きい傾きは、結合解除に関して（およびしたがって
、平衡可逆性の十分に確証されている原理に従って逆過程中には同じく結合に関して）よ
り大きい協同性を示す。図６Ｂは、非修飾ｇＲＮＡについての融解曲線を示し、図６Ｃ～
６Ｇは、２０ｎｔガイド配列部分中のヌクレオチド６～９における種々の種類の修飾につ
いての融解曲線を示す。２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）および２’－Ｏ－メチルホスホロチ
オエート（「ＭＳ」）の付加は、修飾あたり約０．２℃、結合エネルギーを増加させたが
、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）は、修飾あたり１℃、Ｔｍを低下また
は結合エネルギーを減少させ、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）は
、修飾あたり１．４℃、Ｔｍを低下させた。図７は、ｇＲＮＡを、１７、１８もしくは１
９ヌクレオチドに末端切除した、または２１もしくは２２ヌクレオチドの長さに伸長した
ときの、２０塩基対ｇＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度の変化を示すグラフである。測定
は、生理的塩濃度で実施した。測定は、２０ヌクレオチドガイド配列の伸長または末端切
除について塩基対あたり約２℃の融解温度の変化を示した。
［実施例２］
ｃｒＲＮＡのガイド配列内のヌクレオチド９にリンカーまたはリンカー様修飾を含有す
る実験的ｃｒＲＮＡを使用して、さらなる融解温度測定を実施した。リンカーまたはリン
カー様修飾は、ＵＬＮＡ（アンロックド核酸）、脱塩基スペーサー、－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ
３ ２）ｍ－ＰＯ４Ｙ－を含むアルキレンスペーサー、または（－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２Ｃ
Ｒ３ ２Ｏ）ｎ－ＰＯ３Ｙ－）を含むエチレングリコールスペーサー（前記式中、ｍは、２
、３または４であり、ｎは、１、２または３であり、各Ｒ３は、Ｈ、アルキルおよび置換
アルキルからなる群から独立に選択され、各Ｙは、Ｈまたは負の電荷である）を含んだ。
例えば、特定の実施形態では、アルキレンスペーサーは、ｍが３である、「Ｃ３スペーサ
ー」である。その他の実施形態では、エチレングリコールスペーサーは、ｎが３である、
「トリＰＥＧスペーサー」である。これらの修飾はまた、ハイブリダイゼーションの協同
性を低下させる、鎖へのより大きい可動性の付与によって、結合エネルギーを減少させる
。
Figure 2022137068000009
これらの融解温度測定の結果を表１に示す。
Figure 2022137068000010
［実施例３～７］
化学合成されたガイドＲＮＡの、ＤＮＡ標的配列に結合し、切断する能力を評価するた
めに、およびＣａｓ９媒介性切断に対する種々の修飾の効果を評価するために、ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ切断アッセイを使用した。簡単に述べると、表２および７に示す標的ポリヌクレ
オチド配列（オン）またはオフターゲットポリヌクレオチド（オフ）を含む、ＰＡＭによ
りアドレス可能な（ＰＡＭ－ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）ＤＮＡ構築物を、種々の標的遺伝
子のプラスミドにより保持されるヒト配列の分取ＰＣＲ増幅によって調製した。遺伝子を
選択的に編集する本組成物および方法の能力を実証するための例示的な遺伝子として、ヒ
トクラスリン軽鎖ＣＬＴＡ遺伝子、ヒトヘモグロビンベータ（ＨＢＢ）遺伝子、ヒトイン
ターロイキン２受容体サブユニットガンマ（ＩＬ２ＲＧ）遺伝子、およびヒト細胞障害性
Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＬＴＡ４）遺伝子を、標的遺伝子として使用した。これ
らは、標的遺伝子を評価および編集するための本明細書において開示される一般的アプロ
ーチの代表である。
表３～６は、合成ガイドＲＮＡを示す。ガイドＲＮＡの大部分において、５’末端の最
初の２０ヌクレオチドは、標的ＤＮＡ内の標的配列と相補的であり、つまりこれらの相補
的ヌクレオチドがガイド配列を構成する。一部のガイドＲＮＡには、標的配列と相補的で
ないオーバーハングまたは伸長部が、ガイド配列の５’末端に存在した。一部のガイドＲ
ＮＡでは、ガイド配列の５’末端を、ヌクレオチド１、または１および２、または１およ
び２および３が存在しないように末端切除した。オンターゲット構築物（「オン」）は、
２０ｎｔ標的配列を含む。オフターゲット構築物（「オフ」）は、１、２または３ヌクレ
オチド異なる、標的ＤＮＡとほぼ同一の２０ヌクレオチドを含む。したがって、ｇＲＮＡ
は、オフターゲット構築物の配列と完全にではないがほぼ相補的であった。オフターゲッ
ト構築物は、ヒトゲノム内に存在することが公知の遺伝子配列に基づいている。
ｇＲＮＡを、Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓ
ｏｃ．，１３３，１１５４０－５６に記載される手順に従って２’－Ｏ－チオノカルバメ
ート保護されたヌクレオシドホスホラミダイトを使用してＡＢＩ ３９４ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）
で合成した。２’－Ｏ－メチルホスホラミダイトを、２’－Ｏ－チオノカルバメート保護
されたホスホラミダイトと同一の条件下でＲＮＡオリゴマー中に組み込んだ。チオホスホ
ノ酢酸（チオＰＡＣＥ）修飾されたＲＮＡの合成のために使用された２’－Ｏ－メチル－
３’－Ｏ－（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ酢酸－１，１－ジメチルシアノエチルエ
ステル－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルヌクレオシドは、公開された方法に本質的にした
がって合成した。Ｄｅｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．
Ｓｏｃ．１２５，９４０－５０およびＴｈｒｅｌｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｏ
ｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１０，７４－５４を参照のこと。
すべてのオリゴヌクレオチドを、逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使
用して精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ ６５２０ Ｑ－ＴＯＦ（飛行時間型）質量分析計（Ａｇ
ｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）に連
結されたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ｓｅｒｉｅｓ ＬＣ系を使用す
る液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）によって分析した。ｓｇＲＮＡの合成
および精製の収率は、ＬＣ－ＭＳ由来の総イオンクロマトグラムから得られた質量分析ス
ペクトルの逆重畳積分を使用して推定した。１００マーのｓｇＲＮＡの化学合成は、通常
、名目上１マイクロモル規模の合成から２５～３５％全長生成物をもたらした。イオン対
形成バッファー条件を使用する逆相ＨＰＬＣ精製は、通常、粗生成物からの２０％の収率
を与え、最終ｓｇＲＮＡの推定される純度は、９０％～９５％の範囲にある。
ＤＮＡ標的構築物は、表２に示す標的配列（オンターゲット配列としても公知であり、
「ＯＮ」として特定される）およびオフターゲット配列（「オフ」）を含んだ。オフター
ゲット配列中の標的配列と異なる部分は、太字のイタリック体であり、ＰＭＡ配列（示さ
れる場合）は、下線付きである。
Figure 2022137068000011
ＨＢＢオフ１は、可能性ある標的配列の最初の３つのヌクレオチドがＨＢＢオンと異な
ることに留意されたい。したがって、１７ｎｔのガイド配列を得るためにその２０ｎｔの
ガイド配列の５’末端の３ヌクレオチドを末端切除したｇＲＮＡは、ＨＢＢ－オン標的配
列とＨＢＢ－オフ１標的配列間の識別ができない。実施例３～７において使用したＤＮＡ
標的構築物の完全配列を下記の表８に示す。
比較のために、２０ヌクレオチドから１８または１７ヌクレオチドへのｇＲＮＡのガイ
ド配列の末端切除を有するガイドＲＮＡを、標的遺伝子部位の切断の公知オフターゲット
部位の切断に対する比の評価とともに含める。Ｙａｎｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４
）による教示および結論とは対照的に、末端切除は、特定のオフターゲット部位の切断に
は効果があるが、その他のオフターゲット部位での切断には効果がないことが分った。Ｙ
ａｎｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）の教示にもかかわらず、本発明者らは、増強さ
れた特異性を有し、ガイド配列の末端切除を有しない、標的ポリヌクレオチドを切断する
、それにニックを入れるまたは結合するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓのための新規化合物および
方法を模索し、同定した。
２０μＬの反応容量中で、２．５ｎＭの線形化ＤＮＡ標的を、５０ｎＭのｓｇＲＮＡ、
４０ｎＭの組換え精製Ｃａｓ９タンパク質（化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、
Ａｇｉｌｅｎｔ製）および０．８ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下、ｐＨ７．６で、３７℃で１
時間インキュベートした。完了し次第、０．５μＬのＲＮａｃｅ Ｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ
製）を添加し、インキュベーションを３７℃で５分間、次いで、７０℃で１５分間継続し
た。粗生成物を、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２２００で分析のためにＤ
ＮＡ １０００もしくはＤＮＡ ７５００ ＬａｂＣｈｉｐにロードするか、またはＡｇ
ｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ ２２００もしくは４２００での分析のためにゲノ
ムＤＮＡ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅもしくはＤ５０００ ＳｃｒｅｅｎＴａｐｅにロードし
た。精密検査ステップは、標的ＤＮＡとの結合からＣａｓ９を解放させるのに役立ち、こ
れを切断についてアッセイした。
切断収率は、式ａ／（ａ＋ｂ）×１００（式中、ａは、２種の切断生成物のバンド強度
の合計であり、ｂは、存在する場合、残存する未切断ＤＮＡである）によって算出した。
１００％の切断パーセンテージは、検出限界内で、標的ＤＮＡ構築物のすべてが切断され
たことを意味する。
［実施例３］
ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ１」遺伝子座を標的とする３２個の一連のｓｇＲＮ
Ａを作製した。簡単に言えば、個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオ
リゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全長鎖の純度および質量分析による化学組成に
基づいて品質管理承認した。表３は、種々のＣＬＴＡ１－ｓｇＲＮＡの配列を示す。表３
は、ｓｇＲＮＡの配列をエントリー１～３１として示し、この表は、１つまたは複数の特
異性増強修飾を含有する本ｇＲＮＡの特定の実施形態を開示する。エントリー１は、修飾
されておらず、比較例として役立つ。エントリー２は、ガイド配列内のヌクレオチド１、
２および３にＭＳ修飾を含有する。エントリー３は、ガイド配列内のヌクレオチド１、２
および３にＭＳＰ修飾を含有する。エントリー４は、ガイド配列のヌクレオチド１にＭＳ
Ｐ修飾を含有する。エントリー５および６は、その２０ｎｔガイド配列が５’末端で１８
ヌクレオチドガイド配列または１７ヌクレオチドガイド配列へと末端切除されたｇＲＮＡ
をそれぞれ有する比較例である。エントリー７および８は、２０ｎｔガイド配列の５’末
端にそれぞれ１または２ヌクレオチドオーバーハングがある非修飾ｇＲＮＡを有する比較
例である。エントリー９、１０、１１、１２および１３は、ガイド配列内のヌクレオチド
１、ヌクレオチド１～２、ヌクレオチド１～３、ヌクレオチド１～４、およびヌクレオチ
ド１～５にそれぞれＭＰ修飾を含有する。エントリー１４および１５は、ヌクレオチドを
一般にポリクレオチドの５’末端から数えることに留意して、ｇＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮ
Ａ内の、ｓｇＲＮＡの３’末端から数えてヌクレオチド２～５、またはｓｇＲＮＡの３’
末端から数えてヌクレオチド２～６に、ＭＰ修飾をそれぞれ含有する。したがって、エン
トリー１４および１５について記載する数え方は、通則の例外である。エントリー１６お
よび１７は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～２にＭＰ修飾を含有し、ＭＰ修飾
されたＣまたはＧヌクレオチドオーバーハングをそれぞれ有する。エントリー１８および
１９は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～３にＭＰ修飾を含有し、ＭＰ修飾され
たＵＣまたはＡＧジヌクレオチドオーバーハングをそれぞれ有する。エントリー２０およ
び２１は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～４にＭＰ修飾を含有し、ＭＰ修飾さ
れたＣＵＣまたはＧＡＧトリヌクレオチドオーバーハングをそれぞれ有し、加えて、ｇＲ
ＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ内の、ｓｇＲＮＡの３’末端にＭＰ修飾を有する。エントリー２
２～２５は、ガイド配列内のヌクレオチド２０、１９、１８または１７にＭＰ修飾を含有
する。エントリー２６は、ガイド配列内のヌクレオチド１８および１７にＭＰ修飾をそれ
ぞれ含有する。エントリー２７～２９は、ガイド配列内のヌクレオチド１９、１８または
１７にＭ修飾をそれぞれ含有する。エントリー３０は、ガイド配列内のヌクレオチド１８
および１７にＭ修飾を含有する。エントリー３１は、ガイド配列内のヌクレオチド１～２
０にＭ修飾を含有する。エントリー３２は、２０ｎｔガイド配列内のヌクレオチド１～７
、９～１１、１３～１４および２０にＭ修飾を含有し、加えて、ｓｇＲＮＡ配列の残部に
わたっていくつかの選ばれた位置に、特に、ヌクレオチド３０～３１、３３、３５～３６
、３９、４２、４５、４７、５０、６０、６５～６６、７０、７１、７６～７７、８０～
８２、９０、９３、９５～９６、１００～１０１、１０４、および１０６～１１２に、Ｍ
修飾を含有する。
Figure 2022137068000012
図８Ａは、Ｃａｓ９媒介性標的ポリヌクレオチド切断対オフターゲットポリヌクレオチ
ド切断に関しての表３からのｇＲＮＡ（配列番号１２～４２および１２４）における化学
修飾の影響を示す。より詳細には、ＣＬＴＡ１標的ポリヌクレオチド配列（オンターゲッ
ト配列、または「オン」）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ１およ
びオフ３）の切断パーセンテージを数値によっておよび棒グラフ形式で示す。アッセイし
た各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号１２～４２および１２４）について算出した、切断された
標的ポリヌクレオチドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比を用いて
、図８Ａの結果から図８Ｂを導き出す。アッセイしたｓｇＲＮＡごとにそれぞれのオンタ
ーゲット切断パーセンテージを各比に掛けることによって、特異性スコアも算出する。図
８Ｂのエントリー６、１２、１３、２０、２１および３１の陰付きの値は、標的ポリヌク
レオチド配列（ＯＮ１）についての切断収率のわずかな乃至は相当な低減の結果として得
られる。重要なこととして、オフターゲットポリヌクレオシドの一方または両方について
低減がさらに大きく、２．０より大きいオン：オフ切断比が得られた。陰付きの値は、特
異性の少なくとも２倍の改善を得ることができることを示す。この実験で試験した種々の
化学修飾および組合せの中で、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾は、
特に、ガイド配列内の最適な数の位置にそれを組み込んだとき、高いオンターゲット切断
レベルを保持しながら最大の所望されるオフターゲット切断減少効果をもたらした。これ
らの実施例は、本教示の実施形態として役立つ。
［実施例４］
図９Ａに示す例について、オフターゲット切断活性に対するオンターゲット切断活性に
よって判断して特異性の改善を生じさせる修飾位置が分るように、２０ｎｔガイド配列を
横断して単一または三重のＭＰ修飾の「ウォーキング」を行った。表４に列挙するように
、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ４」遺伝子座を標的とする２８個の一連のｓｇＲＮ
Ａ（配列番号４３～７０）を作製し、これらの実験的ｓｇＲＮＡは、最後の（すなわち最
も３’側の）ヌクレオチド間連結を含むｓｇＲＮＡの３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ領域内
の、ヌクレオチド１および最後から２番目のヌクレオチドにもＭＰ修飾を有することに加
えて、ガイド配列内の１つまたは複数の位置に２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「Ｍ
Ｐ」）修飾を含有した。したがって、そのような修飾ｓｇＲＮＡをエキソヌクレアーゼに
よる切断から保護するように、末端ヌクレオチド間連結の修飾を設計した。個々のＲＮＡ
鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全
長鎖純度および質量分析による化学組成に基づいて品質管理承認した。ＣＬＴＡ４標的ポ
リヌクレオチド配列（「オン」）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ
１、オフ２およびオフ３）の切断パーセンテージを数値によっておよび棒グラフ形式で図
９Ａに示す。アッセイした各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号４３～７０）について算出した、
切断された標的ポリヌクレオチドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する
比を用いて、図９Ａの結果から図９Ｂを導き出す。「ラージ」と記録されている比は、オ
フターゲットＤＮＡポリヌクレオチドの切断がそれらの個別のアッセイにおいて検出され
なかったことを示す。上記の図８Ｂについての説明の中で述べたように、特異性スコアは
、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する
。図９Ｂによって示される例では、特異性スコア≧２．０に陰を付けて、陰付きでないス
コアに対する特異性の改善を示す。陰を付けることで、特異性の少なくとも２倍の改善を
もたらしたガイド配列内のＭＰ位置を示す。エントリー１～１８におけるＭＰウォーキン
グの結果は、ウォーキングを行ったＭＰ修飾の配置に特異性に対する効果があることを示
し、アッセイしたオフターゲット部位ごとの特異性スコアの各セットについて、エントリ
ー３～１８と比較してエントリー１および２で分るように、ガイド配列の５’末端付近の
ＭＰ修飾のほうがガイド配列内のその他の位置でのＭＰより大きく特異性を増強すること
を示す傾向が明らかである。この傾向は、図８Ｂにおけるエントリー１２～１３および２
０～２１の陰付きスコアによって示されるように、ＣＬＴＡ１－ｓｇＲＮＡの５’末端に
加えられたＭＰ修飾が特異性を増強した、ＣＬＴＡ１標的配列に標的化されたｇＲＮＡの
ＭＰ修飾について観察された特異性増強傾向と、一致する。あらゆる事例に有効であるわ
けではおそらくないが、特異性を改善するための一般戦略は、ｇＲＮＡ内のガイド配列の
５’末端における連続するホスホジエステルヌクレオチド間連結に１、２、３、４または
５つのＭＰ修飾を組み込むことである。
Figure 2022137068000013
［実施例５］
図１０に示す実施例では、オフターゲット切断活性に対するオンターゲット切断活性に
よって判断して特異性の改善を生じさせる修飾位置が分るように、２０ｎｔガイド配列を
横断して単一または三重のＭＰ修飾の「ウォーキング」を行った。表５に列挙するように
、ヒトＩＬ２ＲＧ遺伝子内の遺伝子座を標的とする３０個の一連のｓｇＲＮＡ（配列番号
７１～８６および１７３～１８６）を作製した。実験的ｓｇＲＮＡは、最後の（すなわち
最も３’側の）ヌクレオチド間連結を含むｓｇＲＮＡの３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ領域
内の、ヌクレオチド１および最後から２番目のヌクレオチドにもＭＰ修飾を有することに
加えて、ガイド配列内の１つまたは複数の位置に２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「
ＭＰ」）修飾を含有した。したがって、ｓｇＲＮＡをエキソヌクレアーゼから保護するよ
うに、末端ヌクレオチド間連結の修飾を設計した。個々のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精
製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析による完全長鎖純度および質量分析
による化学組成に基づいて品質管理承認した。ＩＬ２ＲＧ標的ポリヌクレオチド配列（オ
ン）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ３）の切断パーセンテージを
数値によって図１０に示す。この図は、アッセイした各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号７１～
８６および１７３～１８６）について算出した、切断された標的ポリヌクレオチドの切断
されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比も示す。特異性スコアは、比にそのそ
れぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。特異性スコ
ア≧２．０に陰を付けて、陰付きでないスコアに対する特異性の改善を示し、したがって
、陰を付けることで、特異性の少なくとも２倍の改善をもたらしたガイド配列内のＭＰ位
置を示す。図１０には、特異性の最大の改善をもたらしたガイド配列内の位置を、濃い陰
を付けることによって示す。位置７、１４または１６のＭＰ修飾からの結果をエントリー
６、１３および１５に関してそれぞれ示す。そのような組成物を有するガイドＲＮＡは、
特に、臨床的に重要なＩＬ２ＲＧ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの種々のＣＲＩＳＰＲ－
Ｃａｓへの応用のために、ＭＰ修飾を欠くｇＲＮＡなどの、その他の一般に使用される組
成物と比較して、特異性の性能を増強することができる。図１０によって表される実施例
は、ウォーキングを行うＭＰ修飾位置に起因して特異性増強が生じる位置（１つまたは複
数）を同定するための、ｇＲＮＡのガイド配列部分を横断するＭＰ修飾の本新規「ウォー
キング」方法も示す。特異性増強の大きさを、試験した各位置についてのオンターゲット
対オフターゲット切断比によって評価し、実施者は、そのような値を、ｇＲＮＡの全般的
性能に恩恵をもたらす可能性が高いＭＰ修飾位置（１つまたは複数）を決定する際に、各
設計のために測定されるオンターゲット切断のパーセンテージとともに考慮することがで
きる。ガイド配列を横断する単一ＭＰの漸進的ウォーキングによって、ウォーキングによ
り試験した位置でのＭＰ修飾の１つまたは複数の組合せの結果として生じる特異性の可能
性ある相乗的改善のための配列内の位置を同定することもできる。
Figure 2022137068000014
［実施例６］
図１１Ａに示すようにヒトＨＢＢ遺伝子に標的化されたガイド配列を横断して漸進的な
位置にＭＰ修飾を組み込むことで修飾「ウォーキング」を行って、２０ｎｔガイド配列内
の種々の部位が、オンターゲット部位の実質的切断、およびオフターゲット部位の切断減
少をもたらすことができるかどうかを見た。表６に列挙するようなＨＢＢ遺伝子を標的と
する６５個の一連のｓｇＲＮＡを作製し、この場合の実験的ｓｇＲＮＡは、最後の（すな
わち最も３’側の）ヌクレオチド間連結を含むｓｇＲＮＡの３’末端のｔｒａｃｒＲＮＡ
領域内の、ヌクレオチド１および最後から２番目のヌクレオチドにもＭＰ修飾を有するこ
とに加えて、ガイド配列内の１つまたは複数の内部ヌクレオチド位置に２’－Ｏ－メチル
－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾を含有した。したがって、ｓｇＲＮＡをエキソヌクレ
アーゼによる分解から保護するように、末端ヌクレオチド間連結の修飾を設計した。個々
のＲＮＡ鎖を合成し、ＨＰＬＣ精製した。すべてのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣ分析に
よる完全長鎖純度および質量分析による化学組成に基づいて品質管理承認した。ＨＢＢ標
的ポリヌクレオチド配列（オン）および比較オフターゲットポリヌクレオチド配列（オフ
１）の切断パーセンテージを数値によって図１１Ａに示す。この図は、アッセイした各合
成ｓｇＲＮＡ（配列番号８７～１０３）について算出した、切断された標的ポリヌクレオ
チドの切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比も示す。特異性スコアは、
比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。
特異性スコア≧２．０に陰を付けて、陰付きでないスコアに対する特異性の改善を示し、
したがって、陰を付けることで、特異性の少なくとも２倍の改善をもたらしたガイド配列
内のＭＰ位置を示す。図１１Ａでは、エントリー２、６および８にそれぞれ示されている
ように位置５、９または１１のＭＰ修飾の結果として生じた特異性の最大の改善をもたら
したガイド配列内の位置を、濃い陰を付けることによって示す。そのような組成物を有す
るガイドＲＮＡは、特に、臨床的に重要なＨＢＢ遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの種々の
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓへの応用のために、ＭＰ修飾を欠くｇＲＮＡなどの、その他の一般
に使用される組成物と比較して、特異性を増強することができる。図１１Ａによって表さ
れる実施例はまた、ウォーキングを行うＭＰ修飾位置に起因して特異性増強が生じる位置
（１つまたは複数）を同定するための、ｇＲＮＡのガイド配列部分を横断するＭＰ修飾の
本発明者らの「ウォーキング」方法を例示する。特異性増強の大きさを、試験した各位置
についてのオンターゲット対オフターゲット切断比によって評価し、実施者は、そのよう
な値を、ｇＲＮＡの全般的性能に恩恵をもたらす可能性が高いＭＰ修飾位置（１つまたは
複数）を決定する際に、各設計のために測定されるオンターゲット切断のパーセンテージ
とともに考慮することができる。ガイド配列を横断する単一ＭＰの漸進的ウォーキングに
よって、ウォーキングにより試験した位置でのＭＰ修飾の１つまたは複数の組合せの結果
として生じる特異性の可能性ある相乗的改善のための配列内の位置を同定することもでき
る。
同一の２０ｎｔガイド配列を有するＨＢＢ ｓｇＲＮＡを使用する関連実験では、Ｋ５
６２細胞内のゲノムＨＢＢ標的遺伝子座の編集についての特異性を評価し、このｉｎ ｖ
ｉｖｏでの２０塩基対標的配列は、表１１Ａでｉｎ ｖｉｔｒｏでポリヌクレオチド構築
物において試験したのと同一であった。図１１Ｂは、各合成ｓｇＲＮＡ（配列番号１８７
～１９０）をＣａｓ９ ｍＲＡＮとともに同時トランスフェクトし、標的遺伝子座の切断
、および図１１Ａにおいて評価したのと同一のオフターゲット配列オフ１を含む３つのオ
フターゲット遺伝子座の切断を測定することによって、Ｋ５６２細胞内のヒトＨＢＢゲノ
ムを標的とするｓｇＲＮＡにおける種々の種類の修飾の影響を示す。アッセイした各合成
ｓｇＲＮＡについて、切断された標的ポリヌクレオチド（オン）の切断されたオフターゲ
ットポリヌクレオチド（オフ１）に対する比を算出する。特異性スコアは、比にそのそれ
ぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する。結果は、ガイ
ド配列におけるＰＡＣＥ修飾が、試験した種々の種類の修飾について、特に、主要オフタ
ーゲット活性（オフ１でのもの）に関して、特異性スコアによって評価して、特異性の実
質的改善を生じたことを示す。
Figure 2022137068000015
［実施例７］
ＭＰ修飾に起因するオンターゲット対オフターゲット特異性増強を判定するためのさら
なる実験を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して溶液中で、または２つの型の培養
ヒト細胞において、実施した。２つの細胞型は、Ｋ５６２細胞および誘導多能性幹細胞（
ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知である）であった。個々のウェルの中で、組換え
Ｃａｓタンパク質と予め複合体を形成しているＭＰ修飾されたｇＲＮＡを培養細胞にトラ
ンスフェクトした。ゲノムＨＢＢ標的遺伝子座についての編集の特異性を評価し、この培
養細胞内の２０塩基対標的配列は、図１１Ａおよび１２Ａにおいて評価したポリヌクレオ
チド構築物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイしたのと同一であった。図１２Ａのエン
トリー１～１７（配列番号８７～１０３）は、図１１Ａと同一の結果を示す。図１２Ａの
データは、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけしたものである。エントリー
１８～６４（配列番号１２５～１７１）は、ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１タ
ーゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ
切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイした切
断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置における
さらなるＭＰ修飾の影響を示す。すべてのエントリーについて、アッセイした各合成ｓｇ
ＲＮＡについての切断された標的ポリヌクレオチド（オン）の切断されたオフターゲット
ポリヌクレオチド（オフ１）に対する比を算出した。特異性スコアは、比にそのそれぞれ
のオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出した。エントリー１８～
６４は、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけしたものである。最高スコアを
有するエントリーに陰を付ける。
図１２Ｂは、図１２Ａについてポリヌクレオチド構築物に関してｉｎ ｖｉｔｒｏで試
験したのと同一の２０塩基対配列を有するゲノムＨＢＢ標的の編集結果を示す。図１２Ｂ
について、ゲノムＨＢＢ標的部位は、試験したヒトＫ５６２細胞およびｉＰＳ細胞におい
て内因性である。結果を、２０ｎｔガイド配列に組み込まれたＭＰ修飾の数によってグル
ープ分けする。図１２Ａ中のエントリー１～１７ならびに図１２Ｂ中のエントリー１～１
２および２２～３３は、５’末端の最初のヌクレオチド間連結におけるＭＰ修飾、および
エキソヌクレアーゼ分解から各ｓｇＲＮＡを保護するための各ｓｇＲＮＡの３’末端の最
後のヌクレオチド間連結における別のＭＰに加えて、２０ｎｔガイド配列内の種々の位置
における単一の内部ＭＰについての試験を表す。図１２Ｂのエントリー１～１２および２
２～３３について試験したｓｇＲＮＡは、配列番号８８、９０、９２～９４、９６、９７
、９９、１００、１０３、１７１および１７２であった。図１２Ｂのエントリー１３～１
９および３４～４０について試験したｓｇＲＮＡは、配列番号１２８、１２９、１３３、
１４１、１６０、１６５および１６８であった。これらのグループに、図１２Ａ中のエン
トリー１４ならびに図１２Ｂ中のエントリー７～９および２９～３１に示すものなどの、
内部ＭＰ修飾を欠く対照の結果を含める。結果のその他のグループを、図１２Ａでエント
リー１８～６４ならびに図１２Ｂでエントリー１３～１９および３４～４０について示す
ように、ｓｇＲＮＡの各末端にエキソヌクレアーゼを阻害するための単一のＭＰ修飾を有
することに加えて、２０ｎｔガイド配列内の種々の位置に２つの内部修飾を有するｓｇＲ
ＮＡのために作製した。それらの種々のグループを、これらの図中で太い黒線によって分
ける。これらの図は、図１２Ａ中のエントリー１～２ならびに図１２Ｂ中のエントリー１
～２および２２～２３に示すように、最大の特異性増強をｉｎ ｖｉｔｒｏでもたらす内
部ＭＰ位置が、両方の細胞型における最大の増強をもたらす位置と同一であることを示す
。図１２Ａ中でエントリー３～５ならびに図１２Ｂ中のエントリー３～５および２４～２
６に示すように、より明るい陰を付けることによって、内部ＭＰ修飾に起因する特異性増
強のすぐ下の階層を示す。ＨＢＢ ｓｇＲＮＡにおける内部ＭＰ修飾の位置の結果として
生じる特異性増強の相対順位は、図１２Ａ中のエントリー１～１７ならびに図１２Ｂ中の
エントリー１～１２および２２～３３に示すように、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉ
ｖｏアッセイにわたって顕著に一致する。
１対の内部ＭＰ修飾についての結果を、図１２Ａ中のエントリー１８～６４に関してな
らびに図１２Ｂ中のエントリー１３～１９および３４～４０に関して別々にグループ分け
したところ、特異性スコアによって順位付けしたこれらの設計のｉｎ ｖｉｔｒｏおよび
ｉｎ ｖｉｖｏでの相対性能は、種々のアッセイおよび細胞型にわたって顕著に一致する
。特異性増強を評価するわずかに異なる方法は、図１２Ａおよび１２Ｂ中のＨＢＢ例につ
いてのオン：オフ１である、オンターゲット対オフターゲット比を単に考慮する方法であ
る。この代替測定基準を使用して、グループごとに最高比から最低比へと並べ替えた、測
定された比による図１２Ｂ中のグループの再順位付けを、図１２Ｃに示す。これらの図中
の種々のグループを太い黒線によって分ける。図１２Ｂ中の特異性スコアについての本発
明者らの観察結果に匹敵して、図１２Ｃに提示するオン：オフ１比による特異性のより単
純な評価は、両方の細胞型にわって同様の結果を示す。実施例６および７は、特異性増強
が、ＨＢＢ遺伝子を標的とする２０ｎｔガイド配列におけるＭＰ修飾の位置に依存するこ
とを実証する。
表５中のＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡの一部を使用する実験で、Ｋ５６２細胞におけるゲノ
ムＩＬ２ＲＧ標的遺伝子座についての編集の特異性を評価した。また、表７（下に示す）
のＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡを使用して、Ｋ５６２細胞におけるゲノムＶＥＧＦＡ標的遺伝
子座の編集についての特異性も評価した。
Figure 2022137068000016
このようにして、２０ｎｔガイド配列をｉｎ ｖｉｖｏで試験した。図１４は、Ｋ５６
２細胞におけるＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡおよびＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡの種々のタイプの
修飾の影響を示す。各合成ｓｇＲＮＡをＣａｓ９のｍＲＮＡとともに同時トランスフェク
トし、標的遺伝子座の切断およびオフターゲット遺伝子座オフ２の切断を測定した。アッ
セイした各合成ｓｇＲＮＡについて、切断された標的ポリヌクレオチド（オン）の切断さ
れたオフターゲットポリヌクレオチド（オフ２）に対する比を算出する。特異性スコアは
、比にそのそれぞれのオンターゲット切断パーセンテージを掛けることによって算出する
。
図１４における結果は、ＩＬ２ＲＧおよびＶＥＧＦＡを標的とする合成ｇＲＮＡのガイ
ド配列における修飾が、試験した種々の種類の修飾について、特に、オフターゲット活性
（オフ２でのもの）に関して、特異性スコアによって評価して、特異性の実質的改善をも
たらしたことを示す。エントリー１とは対照的に、エントリー２は、５’および３’末端
ヌクレオチド間連結が修飾される、ＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡの両末端におけるＭＰ修飾の
結果として生じる有意な特異性増強を示す。エントリー１および２とは対照的に、エント
リー３および４は、ＩＬ２ＲＧガイド配列内の内部位置に、すなわち、それぞれ位置５ま
たは１１にＭＰ修飾を有するＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡについて、強い印象を与える特異性
増強を示す。さらに、位置５のＭＰ修飾は、図１４中のエントリー１～４の中で最も大き
い特異性増強をもたらした。
エントリー５とは対照的に、エントリー６～１０は、ＶＥＧＦＡガイド配列内の内部位
置に、すなわち、それぞれ位置５、７、９、１０または１１にＭＰ修飾を有するＶＥＧＦ
Ａ－ｓｇＲＮＡについて、有意な特異性増強を示す。エントリー５～１０にわたって増強
を比較したとき、エントリー６について、２０ｎｔガイド配列の位置５におけるＭＰ修飾
がＶＥＧＦＡに対する特異性の最大の増強をもたらしたことは、注目に値する。
異なるＤＮＡ配列を標的とするｇＲＮＡ内のガイド配列を横断してＭＰウォーキングを
行い、実施例４～７において提示したようにｉｎ ｖｉｔｒｏでオンターゲットおよびオ
フターゲットポリヌクレオチドの切断をアッセイすることによって、特異性増強をもたら
す種々のガイド配列内のＭＰ修飾位置の複合マップを図１３に示す。詳細には、図１３は
、図９Ａ、９Ｂ、１０および１１Ａからのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断の結果の比較を示す。図
１３は、いくつかの重要な傾向を示す。第１に、図１３中のすべてのその他のエントリー
とは対照的に、エントリー１２に示すように、それらの２０ｎｔガイド配列内の位置１５
にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡは、Ｃａｓ９媒介性切断活性の実質的喪失を被った。これは
、位置１５が、Ｃａｓ９媒介性切断に対するＭＰ修飾に対して特に不耐性であったことを
示唆する。第２に、陰付き特異性スコアによって示すように、エントリー１～２を通して
特異性増強傾向がある。この傾向は、種々の２０ｎｔガイド配列の５’末端へのまたはそ
の付近へのＭＰ修飾の組込みが、ｇＲＮＡの標的特異性を増強するための一般に有用な設
計戦略であり得ることを示唆する。このアプローチの有用性の別の例は、ｉｎ ｖｉｔｒ
ｏでＣＬＴＡ１遺伝子座を標的とするｇＲＮＡの５’末端におけるＭＰ修飾に関して図８
Ａおよび８Ｂに提示する結果について、上記実施例３で論じた。この一般アプローチの有
用性のさらなる例は、図１１Ｂに示すように、トランスフェクトＫ５６２細胞におけるＨ
ＢＢ遺伝子を標的とするｇＲＮＡの５’末端でのＭＳＰ修飾に関して、上記実施例６で論
じた。ＭＰ修飾の特異性効果に関する第３の例は、別様に標的化された２０ｎｔガイド配
列内の位置６のＭＰ修飾の結果として得られる特異性スコアが、上述の位置１５について
の異常効果を無視すれば、ＭＰウォーキングあたりの最低スコアになる、図１３のエント
リー３で明らかである。ＣＬＴＡ４オフ３、ＩＬ２ＲＧオフ３およびＨＢＢオフ１を含む
一連のＭＰウォーキング各々について、位置６のＭＰ修飾に起因する特異性増強の最低点
は、特に顕著であり、これは、同一ガイド配列内の隣接位置、すなわち、位置４、５また
は７（エントリー１、２または４を通して陰付きスコアとしてそれぞれ示す）のＭＰ修飾
の結果として得られる特異性スコアとは対照的である。
実施例３～７は、ｇＲＮＡ内の多くの配列位置での修飾がオンターゲットポリヌクレオ
チドの標的特異的切断を妨げなかったので、ガイド配列内の特定の位置に修飾を含有する
ｇＲＮＡが、活性Ｃａｓタンパク質、およびｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体によって
許容されることを実証する。実施例３～７は、本ｇＲＮＡ、複合体および方法が、少なく
とも１．２、あるいは少なくとも１．５、あるいは少なくとも２、あるいは少なくとも２
．５、あるいは少なくとも３、あるいは少なくとも３．５、あるいは少なくとも４、ある
いは少なくとも４．５、あるいは少なくとも５のオンターゲット対オフターゲット比を達
成することができること、および／または前記比が、１０、１２、１５もしくは２０以下
であることも実証する。多くの場合、２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修
飾は、特異性増強のために所望どおりの高いオンターゲット切断レベルを保持しながらオ
フターゲット切断レベルを低下させることによって、比にプラスの効果をもたらした。
これらの実験の結果として、ガイド配列全体にわたって特定の部位における結合エネル
ギーを減少させる複数の修飾の組込みは、公知および未知のオフターゲット切断事象を減
少させることになると予測される。
上述の実施例３～７において使用したＤＮＡ構築物の完全配列を表８に示す。標的ポリ
ヌクレオチドまたはオフターゲット配列をＰＡＭ配列とともに太字で示し、ＰＡＭ配列に
は下線も付ける。
Figure 2022137068000017
Figure 2022137068000018
Figure 2022137068000019
Figure 2022137068000020
Figure 2022137068000021
Figure 2022137068000022
Figure 2022137068000023
Figure 2022137068000024
Figure 2022137068000025
Figure 2022137068000026
Figure 2022137068000027
［実施例８］
この実施例は、本開示による合成ｇＲＮＡを使用してＣａｓ９切断によって刺激される
相同性指向修復（ＨＤＲ）を実証する。両方の染色体（Ｃｈｒ１１）対上に正常ＨＢＢ遺
伝子を有するＫ５６２細胞を用意した。鎌状赤血球症（ＳＣＤ）突然変異を有するＨＤＲ
用のＤＮＡドナー鋳型も用意した。実験は、ヘテロ接合細胞株を作出するためにＳＣＤ突
然変異を付加またはノックインするようにＫ５６２細胞内のＨＢＢ遺伝子を編集しようす
るものであった。そのような細胞株は、ＳＣＤ疾患のモデル化に有用であるだろう。
化学修飾を有するまたは有しないｓｇＲＮＡを使用した。より詳細には、非修飾ｇＲＮ
Ａ（Ｕｎｍｏｄｉｆ）、５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（１ｘＭＰ）、
位置５ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（５ＭＰ＿１ｘＭＰ）、
位置１１ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（１１ＭＰ＿１ｘＭＰ
）、ならびにｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の代わりにバッファーで処理したｍｏｃｋトラ
ンスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ）の、２０ｎｔ合成ガイドＲＮＡを用いて実験を実行した。
ＨＢＢ標的部位でのＨＤＲのための修復鋳型として役立てるためのｓｓＤＮＡオリゴとと
もに、Ｋ５６２細胞に（エレクトロポレーションによって）トランスフェクトするために
、各ｓｇＲＮＡを別々に予めＣａｓ９タンパク質との複合体にした。各グループに関して
、ドナーＤＮＡ鋳型を用いて（図１５におけるドナー＋）、およびドナーＤＮＡ鋳型を用
いずに（図１５におけるドナー－）、実験を実行した。標的部位をｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９
複合体によって切断して、二本鎖切断を形成した。ドナーＤＮＡ鋳型の配列が、切断され
たＤＮＡ標的配列の修復を方向づけるためにトランスフェクト細胞内の内因性ＤＮＡ修復
酵素より使用されるように、ＨＤＲプロセスによって、切断を修復した。
修復鋳型として役立てるためにＫ５６２細胞にトランスフェクトした一本鎖ドナーＤＮ
Ａ鋳型の配列は、
ＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＡＴＴＧＣＴＴＡＣＡＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＡＣＡ
ＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＣＡＣＴＡＧＣＡＡＣＣＴＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＧＴＧ
ＣＡＣＣＴＧＡＣＴＣＣＴｇｔａＧＡＧＡＡＧＴＣＴＧＣＧＧＴＴＡＣＴＧＣＣＣＴＧＴ
ＧＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＴＧＡＧＧＣＣ（配
列番後２００）
であった。
このオリゴヌクレオチドは、１５８ヌクレオチド長であり、小文字の「ｇｔａ」は、Ｈ
ＤＲによってノックインされることになるＳＣＤ突然変異のためのコドンである。トラン
スフェクト細胞を培養し、その後、トランスフェクションの４８時間後に回収した。ゲノ
ムＤＮＡを単離し、ＨＢＢ遺伝子座およびその主オフターゲット遺伝子座を、両方とも、
ディープシークエンシングのためにＰＣＲによって増幅して、（ｉ）Ｃａｓ９誘導インデ
ル（図１５におけるオンターゲットインデルおよびオフターゲットインデル）の形成と、
（ｉｉ）部分的ＨＤＲ（部分的オンターゲットＨＤＲ）と、（ｉｉｉ）ＳＤＣコドンを組
込む完全ＨＤＲ（オンターゲットＨＤＲおよびオフターゲットＨＤＲ）とを含む編集結果
を定量した。３種類すべての編集をオンターゲット部位（図１５における遺伝子座オン）
で測定し、３種類のうちの２種類の編集が、Ｃｈｒ９上のゲノム内の主オフターゲット部
位（図１５における遺伝子座オフ）で検出された。
図１５は、ヒトＫ５６２細胞におけるＨＢＢ遺伝子の相同性指向修復（ＨＤＲ）のこれ
らの実験からの結果を要約するものである。「遺伝子座オン」について報告する結果は（
左から右へ）、オンターゲットＨＤＲ％、部分的オンターゲットＨＤＲ％、およびオンタ
ーゲットインデル％である。「遺伝子座オフ」について報告する結果は（左から右へ）、
オフターゲットＨＤＲ％およびオフターゲットインデル％である。
この実験は、２０ｎｔガイド配列内の位置５および位置１１における特異性を増強する
ための化学修飾、特にＭＰ修飾が、オフターゲットインデルの形成をかなり大幅に低減さ
せたばかりでなく、オフターゲットＨＤＲ活性も有意に低減させたことを実証する。この
実験では、オフターゲット部位はまた、ＨＤＲ編集を受けるために十分なｓｓＤＮＡ修復
鋳型との配列類似性も有したことに、注目された。
［実施例９］
この実験では、合成ガイドＲＮＡによるオフターゲット活性を２つの異なる、しかし補
完的な方法で評価した。実施例７および図１２Ｂに関して上で説明したのと同一のｉｎ
ｖｉｖｏアッセイを使用してＨＢＢ標的部位およびオフターゲット部位に結合し、それを
切断するために、いくつかの化学合成したガイドＲＮＡを使用した。したがって、第１の
評価のために、ヒトＫ５６２細胞からのゲノムＤＮＡ内の実施者指定ポリヌクレオチド配
列または遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、第２の評価のために、前記ゲノムＤＮＡの断
片内の約１，０００のポリヌクレオチド配列または遺伝子座（実施者によって指定された
もの）のライブラリーを、市販の遺伝子座濃縮キットを使用することによって濃縮した。
より詳細には、第１の評価では、ゲノムＤＮＡに対してＰＣＲを行って、ＨＢＢ内の２０
ｂｐ標的配列に関して３個以下のミスマッチを有し、かつ標的配列と比較して位置２１～
２３にＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列（このようなＰＡＭ配列は、Ｃａｓ
９認識に必要である）のどちらかも含む、ヒトゲノム内の配列を構成する１６のオフター
ゲット部位を増幅した。第２の評価では、標的部位およびオフターゲット部位を捕捉する
ためにビオチン化オリゴヌクレオチドベイト（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓからのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ）をＫ５
６２細胞からのゲノムＤＮＡに対して使用することによって、オフターゲット活性を評価
した。ＨＢＢ内の２０ｂｐ標的配列に関して５個以下のミスマッチを有し、かつ位置２１
～２３にＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列のどちらかも有する、ヒトゲノム
内の配列（合計おおよそ９６０配列）を選択的に捕捉するように、ベイトを設計した。オ
ンターゲット配列およびオフターゲット配列は、次のとおりであった。
Figure 2022137068000028
両方の評価に、非修飾ｇＲＮＡ（Ｕｎｍｏｄｉｆ）、５’および３’末端にＭＰ修飾を
有するｇＲＮＡ（１ｘＭＰ）、位置５ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇ
ＲＮＡ（５ＭＰ＿１ｘＭＰ）、ならびにｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の代わりにバッファ
ーで処理したｍｏｃｋトランスフェクト細胞（Ｍｏｃｋ）の、２０ｎｔ合成ガイドＲＮＡ
を使用した。第１の評価は、位置１１ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇ
ＲＮＡ（１１ＭＰ＿１ｘＭＰ）も含んだ。
前記実施例で使用したのと同じ手順を使用して、ヒトＫ５６２細胞にｇＲＮＡおよびＣ
ａｓ９をトランスフェクトした。より詳細には、ヒトＫ５６２細胞をＡＴＣＣから入手し
、１０％ウシ成長血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）を補充したＰＲＭＩ１６４０培
地で培養した。Ｌｏｎｚａ ４Ｄヌクレオフェクター（９６ウェルシャトルデバイス、プ
ログラムＦＦ－１２０）を製造業者の使用説明書に従って使用して、Ｋ５６２細胞（継代
数３～９以内）へのヌクレオフェクションを行った。ヌクレオフェクション条件は、Ｌｏ
ｎｚａ ＳＦ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅキット（Ｖ４ＳＣ－２９６０）を、２０μＬの培地中
の細胞２００，０００個、１２５ピコモルの化学修飾されたｓｇＲＮＡ、および５０ピコ
モルの組換えＣａｓ９タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）を使用するものであ
った。細胞を３７℃で、周囲酸素および５％二酸化炭素で培養した。培養した細胞を、ト
ランスフェクションの４８時間後に回収した。
第２の評価のために、標的濃縮ベイトを含むライブラリーを、ＨＢＢ標的部位にほぼ中
心があるゲノムＤＮＡの１Ｋｂｐセグメントを捕捉するために重複する配列カバー範囲（
「タイリング」とも称される）を有するように（ＡｇｉｌｅｎｔからのＳｕｒｅＳｅｌｅ
ｃｔ濃縮プラットフォームを使用して）設計した。このライブラリーは、ヒトゲノム内の
９６０の個別のオフセット部位に中心がある１Ｋｂｐセグメントを捕捉するための、同様
にタイリングされたベイトも含んだ。９６０のオフターゲット部位は、ＨＢＢにおけるＣ
ＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９標的化のための２０ｂｐ標的配列に関して５個以下のミスマッチを
有し、かつＣａｓ９認識および結合などを可能にするために必要となるような２０ｂｐオ
フターゲット配列に隣接するＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列のいずれかも
有する、ヒトゲノム内のすべての配列を構成すると考えられる。ゲノムＤＮＡを処理ごと
の三つ組みサンプルごとに単離し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＨｉＳｅｑ
プロトコールに従って各単離物を処理した。
両方の評価のために、増幅または捕捉されたＤＮＡを、ペアードエンド２ｘ１５０ｂｐ
シークエンシングリードのためのＩｌｌｕｍｉｎａ試薬を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈ
ｉＳｅｑ ４０００シークエンサーでシークエンシングした。オンまたはオフターゲット
配列ごとにＣａｓ９切断部位のいずれかの側の少なくとも３０ｂｐまでにオンまたはオフ
ターゲット部位を重複しないリードを破棄することによって、ＨｉＳｅｑ生データを再処
理した。ヒトゲノムへのリードのマッピングは、デフォルトパラメータに設定したＢＷＡ
－ＭＥＭ（ｂｗａ－０．７．１０）ソフトウェアを使用して実施した。一貫性のないペア
ードエンドマッピング、低品質のマッピング、または二次マッピングを生じさせるリード
を分析から破棄した。インデルを有する場合、またはＣａｓ９切断についてマッピングさ
れた切断部位の１０ｂｐ以内に配列の挿入または欠失（すなわち、インデル）を有するか
どうかによらずに、各々の保持されたマッピングリードのスコアを生成した。オンまたは
オフターゲット部位ごとのマッピングされたリードを、インデルを有したか否かに従って
ビニング処理し、ビンごとのリードの集計を使用して、オンターゲット部位でおよび同様
に９６０のオフターゲット部位の各々で形成された％インデルを算出した。それらの％イ
ンデル結果を使用して、オン：オフ標的切断比および特異性スコアを算出した（データは
省略）。
図１６は、修飾または非修飾ｓｇＲＮＡについてＨＢＢオンターゲット部位および１６
の同様のオフターゲット部位でのインデルの形成を測定した、第１の評価からの結果を要
約するものである。ＰＣＲアンプリコンのディープシークエンシングによって、処理ごと
に単離されたゲノムＤＮＡを使用して１７部位（前記オンターゲット部位と１６のオフタ
ーゲット部位）について配列リードを生成した。修飾または非修飾ｓｇＲＮＡのすべてが
、オンターゲット部位での高いインデルパーセンテージをもたらした。オフ１部位では、
非修飾ｇＲＮＡおよび１ｘＭＰのｇＲＮＡもまた高いインデルパーセンテージを生じたが
、対照的に、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡおよび１１ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡは、はる
かに低いインデルパーセンテージをもたらした。オフ５部位では、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇ
ＲＮＡおよび１１ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡは、非修飾ｇＲＮＡおよび１ｘＭＰのｇＲＮ
Ａよりはるかに低いインデルパーセンテージを生じた。他のオフ部位では、ｇＲＮＡのす
べてが、非常に低いインデルパーセンテージを生じた。この評価は、特異性を増強するた
めの化学修飾、特に、２０ｎｔガイド配列内の位置５および位置１１におけるＭＰ修飾が
、ＨＢＢ内の２０ｂｐオンターゲット配列に関して３個以下のミスマッチを有し、かつ位
置２１～２３にＮＧＧ－ＰＡＭ配列またはＮＡＧ－ＰＡＭ配列のどちらかも有する、ヒト
ゲノム内の配列において、オフターゲットインデルの形成をかなり大幅に低減させたこと
を示す。
図１７は、両方の評価からの増幅されたＤＮＡ遺伝子座（ＰＣＲ）または捕捉されたＤ
ＮＡ遺伝子座（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）のディープシークエンシング分析からの結果を要
約するものである。図１７は、非修飾ｇＲＮＡ（ＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＰＣＲ）およ
びＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））、５’および３’末端にＭＰ修飾
を有するｇＲＮＡ（ＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＳｕｒｅＳｅ
ｌｅｃｔ））、位置５ならびに５’および３’末端にＭＰ修飾を有するｇＲＮＡ（ＨＢＢ
＿５ｘＭＰ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿５ｘＭＰ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））、ならびにｓ
ｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の代わりにバッファーで処理されたｍｏｃｋトランスフェクト
細胞（Ｍｏｃｋ（ＰＣＲ）およびＭｏｃｋ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））の、２０ｎｔ合成
ガイドＲＮＡでの実験からの、ＨＢＢ標的部位（ＨＢＢオン）および３つのオフターゲッ
ト部位（オフ１、オフ５およびオフ９）で測定されたインデル形成パーセンテージを示す
。検出されたインデルのパーセンテージは、２つの評価間で一致し、ＰＣＲによって増幅
された個別のＤＮＡ遺伝子座の分析において見られたのと同様のインデルパーセンテージ
がＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ濃縮による捕捉ＤＮＡの分析で見られた。修飾または非修飾ｓｇ
ＲＮＡのすべてが、ＨＢＢオンターゲット部位での高いインデルパーセンテージをもたら
した。オフ１部位では、ＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉｆ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿ｕｎｍｏｄｉ
ｆ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）実験とＨＢＢ＿１ｘＭＰ（ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿１ｘＭＰ
（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）実験の両方が、高いインデルパーセンテージを示した。対照的
に、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡおよび１１ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡは、ＰＣＲおよび
ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ評価によって、はるかに低いインデルパーセンテージを示した。オ
フ５部位では、５ＭＰ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡ（すなわち、ＨＢＢ＿５ｘＭＰのｇＲＮＡ（
ＰＣＲ）およびＨＢＢ＿５ｘＭＰのｇＲＮＡ（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ））を使用する両方
の評価が、非修飾ｇＲＮＡおよびＨＢＢ＿１ｘＭＰのｇＲＮＡよりはるかに低いインデル
パーセンテージを生じた。オフ９部位では、試験したｇＲＮＡのすべてが、非常に低いイ
ンデルパーセンテージを有した。ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ濃縮によって評価した残りの９５
７のオフターゲット遺伝子座のうち、３２のみが、０．１％の検出限界より高いレベルで
インデルを生じ（結果は示されていない）、これらの中で最高のインデル％は、０．５％
未満であった。したがって、特異性を増強する化学修飾、特に、２０ｎｔガイド配列内の
位置５でのＭＰ修飾は、オフターゲットインデルの形成をかなり大幅に低減させた。この
ような特異性増強は、ＰＣＲによって増幅されたゲノム遺伝子座、またはＳｕｒｅＳｅｌ
ｅｃｔなどの標的化ライブラリー濃縮キットを使用することにより濃縮されたゲノム遺伝
子座によって実証することができる。
［例示的実施形態］
本明細書において開示される対象に従って提供される例示的実施形態として、これらに
限定されないが、特許請求の範囲および以下の実施形態を含む。
Ａ１．（ａ）（ｉ）標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｉｉ）ステム配列
を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）ステム配列と部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒａｃ
ｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
ガイド配列が、少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、合成ガイドＲＮＡがｇＲＮＡ
機能性を有する、合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハ
イブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオ
チド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハ
イブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイ
ブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ａ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ５．ガイドＲＮＡの５’末端または３’末端または両末端に少なくとも１つの安定性
増強修飾をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ６．ガイド配列が、ロッキング領域、サンプリング領域、およびシード領域を含み、
少なくとも１つの特異性増強修飾が、サンプリング領域に、および／またはシード領域に
存在する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、シード領域内に、および／またはサンプリ
ング領域内に、および／またはロッキング領域内に存在する、実施形態Ａ６の合成ガイド
ＲＮＡ。
Ａ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド間連結修飾を含む、前記実施
形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、化学修飾された核酸塩基を含む、前記実施
形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、少なくとも１つのヌクレオチド糖部分内
に位置する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１１．少なくとも１つの特異性増強修飾が、３’－ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結
、３’－ホスホノ酢酸メチルエステルヌクレオチド間連結、３’－メチルホスホネートヌ
クレオチド間連結、３’－チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結、３’－メチルチオホス
ホネートヌクレオチド間連結、３’－ボラノホスホネートヌクレオチド間連結、またはそ
れらの組合せを含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１２．Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾を含む、前記実施形態のいずれ
か１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、
（ａ）２’－デオキシリボース；２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル
；２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル；２’－Ｏ－フェニル、２’－チオフ
ェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’
－アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル
、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－
Ｏ－プロピルアミノもしくは２’－Ｏ－置換フェニルを有するリボースなどの糖；または
それらの組合せ；
（ｂ）ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピ
オン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネートもしくはボラノホスホネート、ま
たはそれらの組み合わせ；あるいは
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ
を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１４．２’－Ｏ－メチル修飾をさらに含む、実施形態Ａ８、Ａ９、Ａ１１またはＡ１
３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、構造不定の核酸（「ＵＮＡ」）、アンロ
ックド核酸（「ＵＬＮＡ」）、脱塩基ヌクレオチド、または－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２）ｍ
－ＰＯ４Ｙ－を含むアルキレンスペーサー、または（－ＰＯ４Ｙ－（ＣＲ３ ２ＣＲ３ ２Ｏ
）ｎ－ＰＯ３Ｙ－）を含むエチレングリコールスペーサーであり、ｍは、２、３または４
であり、ｎが、１、２または３であり、各Ｒ３が、Ｈ、アルキルおよび置換アルキルから
なる群から独立に選択され、各Ｙが、Ｈまたは負の電荷である、前記実施形態のいずれか
１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、核酸塩基修飾を含まない、実施形態Ａ１
～Ａ９、Ａ１１～Ａ１３、またはＡ１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、
６－チオＧ、２－アミノプリン、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７－デアザ－８
－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５－メチルＣ、
５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラシル、５，６
－デヒドロウラシル、５－エチニルシトシン、５－アミノアリルＵ、５－アミノアリルＣ
、脱塩基ヌクレオチド、ＵＮＡ塩基、イソＣ、イソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ
、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、およびそれらの組合せからなる群から
選択される核酸塩基である、実施形態Ａ１～Ａ１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、５－ニトロインドール、ネブラリン、イ
ノシン、ジアミノプリン、脱塩基性連結、および脱塩基性フルオロフォア連結、例えば３
－Ｏ－イル－２－（４－ブチルアミドフルオレセイン）プロピル－１－Ｏ－イル－ホスホ
ジエステルからなる群から選択される、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である、
前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ１９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、合成ガイドＲＮＡおよび標的ポリヌクレ
オチドによって形成される第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）を、特異性増
強修飾を有しない二本鎖のＴｍと比較して低下させる修飾を含む、前記実施形態のいずれ
か１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｔｍを修飾あたり約０．５℃、あるいは
修飾あたり約０．５～１．０℃、あるいは修飾あたり約１．０～２．０℃、あるいは修飾
あたり２～８℃低下させる、実施形態Ａ１９の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２１．ガイド配列が、２０ヌクレオチドを含み、任意選択的に５’－オーバーハング
配列を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０と、
ヌクレオチド１での、あるいはヌクレオチド１および２での、あるいはヌクレオチド１、
２および３での、あるいはヌクレオチド１、２、３および４での、あるいはヌクレオチド
１、２、３、４および５での少なくとも１つの特異性増強修飾とを含むか、またはそれら
からなる、実施形態Ａ２１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎ
からなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の整数であり、少
なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオ
チド５－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１０－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレ
オチド１３－Ｎ～２０－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－
Ｎ～１９－Ｎ内、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ～１４－Ｎもしくは１６－Ｎ～１８－Ｎ
内にある、実施形態Ａ２１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０－Ｎ
からなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間）の正または負の整
数であり、前記ガイド配列が、ヌクレオチド１１－Ｎ、１２－Ｎ、１３－Ｎ、１４－Ｎ、
１６－Ｎ、１７－Ｎ、１８－Ｎ、１９－Ｎまたは２０－Ｎに位置する、あるいはヌクレオ
チド１３－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、１７－Ｎ、１８－Ｎ、１９－Ｎまたは２０－Ｎに位
置する、あるいはヌクレオチド１３－Ｎ、１４－Ｎ、１６－Ｎ、１７－Ｎ、または１８－
Ｎに位置する１つの特異性増強修飾を含む、実施形態Ａ２１の合成ガイドＲＮＡ。
Ａ２５．ガイドＲＮＡの５’末端のヌクレオチド１から始まる少なくとも１つの安定性
増強修飾、および３’末端の５つの末端ヌクレオチド内の少なくとも１つの安定性増強修
飾をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｂ１．前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質を含む
ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体であって、標的ポリヌクレオチドを切断することがで
きるか、それにニックを入れるもしくは結合することができるか、または切断活性、ニッ
キング活性および／もしくは結合活性を有するｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体。
Ｃ１．標的ポリヌクレオチドを切断するか、それにニックを入れるまたは結合するため
の方法であって、
前記標的ポリヌクレオチドを実施形態Ｂ１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触
させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断するか、それにニックを入れるまたは結合するステッ
プと
を含む方法。
Ｃ２．少なくとも１つの特異性増強修飾を含む合成ガイドＲＮＡが、非修飾ｇＲＮＡと
比較してオフターゲットポリヌクレオチドの切断、ニッキングまたは結合を減少させる、
実施形態Ｃ１の方法。
Ｃ３．少なくとも１つのオフターゲットポリヌクレオチドが、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパ
ク質により切断され、ニックを入れられ、または結合を受け；切断された、ニックを入れ
られた、または結合を受けた標的ポリヌクレオチドの、切断された、ニックを入れられた
、または結合を受けたオフターゲットポリヌクレオチドに対する比が、少なくとも１．２
、あるいは少なくとも１．５、あるいは少なくとも２、あるいは少なくとも２．５、ある
いは少なくとも３、あるいは少なくとも３．５、あるいは少なくとも４、あるいは少なく
とも４．５、あるいは少なくとも５または少なくとも１０、１２、１５もしくは２０であ
る、実施形態Ｃ２の方法。
Ｄ１．合成ガイドＲＮＡを調製する方法であって、
ゲノム内の、それぞれのヌクレオチド配列を含む少なくとも１つの標的ポリヌクレオチ
ドを、選択するステップと；
ゲノム内の、それぞれのヌクレオチド配列を含むオフターゲットポリヌクレオチドを、
同定するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドの配列を前記オフターゲットポリヌクレオチドの配列とアラ
インして、両方の鎖の１つまたは複数の同一部分を同定するステップと；
合成ガイドＲＮＡを設計するステップと（設計される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、
（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、同定された同一部分のうちの１つと相補的なその配列の部分
内に特異性増強修飾を含む）
を含む方法。
Ｄ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハ
イブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオ
チド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間のハ
イブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハイ
ブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｄ１の方法。
Ｄ５．設計されたガイドＲＮＡを合成するステップをさらに含む、前記実施形態のいず
れか１つの方法。
Ｄ６．オフターゲットポリヌクレオチドが、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．
ｎｅｔ／Ｃａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ；ｈｔｔｐｓ：／／ｃｍ．ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ．ｅｄ
ｕ／Ｏｆｆ－Ｓｐｏｔｔｅｒ；もしくはｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕで
見付けられるものなどの、オフターゲット部位を予測するためのアルゴリズム；またはＴ
ｓａｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１８７－９７
；Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ ５２０，１８６－９１；および／も
しくはＦｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３，１
７９－８６において開示されているような、実際の事例でオフターゲット部位の活性化を
同定および定量するためのその他の技術によって、同定される、前記実施形態のいずれか
１つの方法。
Ｄ７．標的ポリヌクレオチドとオフターゲットポリヌクレオチド間の少なくとも１つの
識別ヌクレオチド位置であって、前記標的ポリヌクレオチドとオフターゲットポリヌクレ
オチドとが異なるヌクレオチド基を有する少なくとも１つの識別ヌクレオチド位置を同定
するステップと、
前記標的ポリヌクレオチド内の前記少なくとも１つの識別位置におけるヌクレオチドと
マッチするヌクレオチドを合成ガイドＲＮＡに含めるステップと
をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｄ８．特異性増強修飾が、合成ガイドＲＮＡのガイド配列と標的ポリヌクレオチドとに
よって形成される第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（「Ｔｍ」）を、特異性増強修
飾を有しない二本鎖のＴｍと比較して低下させる、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｄ９．特異性増強修飾が、第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、修飾あたり約０．５
℃、あるいは修飾あたり約０．５～１℃、あるいは修飾あたり約１～２℃、あるいは修飾
あたり約２～８℃低下させる、実施形態Ｄ８の方法。
Ｄ１０．特異性増強修飾が、第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを、例えば、該Ｔｍを
約１℃～約１３℃、あるいは約１℃～約６℃低下させることによって、少なくとも約１℃
、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、および
／または約６℃以下、あるいは約８℃以下、あるいは約１０℃以下、あるいは約１３℃以
下、低下させる、実施形態Ｄ８の方法。
Ｄ１１．特異性増強修飾が、合成ガイドＲＮＡのガイド配列と少なくとも１つオフター
ゲットポリヌクレオチドとによって形成された第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍを低下
させる、実施形態Ｄ８の方法。
Ｄ１２．第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍが、第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＴｍよ
り高く、例えば、少なくとも少なくとも約０．５℃高く、あるいは少なくとも約１℃高い
、実施形態Ｄ８の方法。
Ｅ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための
方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意および／または設計するステップと（用意および／または設計
される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、
（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、特異性増強修飾を含む）；
前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチドとのＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔ
ｍ）を算出するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と、前記Ｔｍの１０
℃以内、あるいは前記Ｔｍの５℃以内、あるいはほぼ前記Ｔｍである温度で接触させるス
テップと；
接触させることによって、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れ
るまたは結合するステップと
を含む方法。
Ｆ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための
方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意および／または設計するステップと（用意および／または設計
される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、
（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、少なくとも１つの特異性増強修飾を含む）；
前記修飾または修飾の組合せを、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチドとのＤＮ
Ａ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）が２５℃から４９℃の間になるように、選択するス
テップと；
Ｃａｓタンパク質と設計された合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質
複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と、前記Ｔｍの１２
℃以内、あるいは前記Ｔｍの８℃以内、あるいは前記Ｔｍの５℃以内、あるいはほぼ前記
Ｔｍである温度で接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは前記標的ポリヌク
レオチドに結合するステップと
を含む方法。
Ｇ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための
方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを、用意および／または設計するステップと（用意および／または設
計される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、
（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、少なくとも１つの特異性増強修飾を含む）；
前記修飾もしくは修飾の組合せを、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチドとのＤ
ＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の融解温度（Ｔｍ）が、非修飾ｇＲＮＡ／標的二本鎖のＴｍより少な
くとも０．５℃～１℃低く、もしくは少なくとも１～３℃低く、もしくは少なくとも１～
１２℃低くなるように選択する、またはそのような修飾もしくは修飾の組合せを前記ガイ
ド配列に含めるステップと；
Ｃａｓタンパク質と設計された合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質
複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と、前記Ｔｍの１２
℃以内、あるいは前記Ｔｍの８℃以内、あるいは前記Ｔｍの５℃以内、あるいはほぼ前記
Ｔｍである温度で接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップ
と
を含む方法。
ＥＦＧ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間
のハイブリダイゼーションを弱化する、前記実施形態Ｅ１、Ｆ１またはＧ１のいずれか１
つの方法。
ＥＦＧ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌク
レオチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｅ１、Ｆ１またはＧ１のいず
れか１つの方法。
ＥＦＧ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間
のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間の
ハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｅ１、Ｆ１またはＧ１のいずれか１つの合
成ガイドＲＮＡ。
Ｈ１．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行わ
れる、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ２．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、前記
実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ３．細胞が、標的ポリヌクレオチドをｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ
る前に多細胞供給源から単離される、実施形態Ｈ２の方法。
Ｈ４．供給源が、植物、動物、多細胞原生生物または真菌である、実施形態Ｈ３の方法
。
Ｈ５．細胞、またはそれに由来する細胞が、標的ポリヌクレオチドをｇＲＮＡ：Ｃａｓ
タンパク質複合体と接触させた後、供給源に戻される、実施形態Ｈ２～Ｈ４のいずれか１
つの方法。
Ｈ６．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｖｏで行われ
る、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ７．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ８．切断するまたはニックを入れるステップが、遺伝子編集をもたらす、前記実施形
態のいずれか１つの方法。
Ｈ９．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、遺伝子発現の変更をもた
らす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１０．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、標的遺伝子の機能的ノ
ックアウトをもたらす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１１．切断された標的ポリヌクレオチドを、外因性または内因性鋳型ポリヌクレオチ
ドを用いる相同性指向修復によって修復するステップをさらに含む、前記実施形態のいず
れか１つの方法。
Ｈ１２．外因性または内因性鋳型ポリヌクレオチドが、切断部位のいずれかの側の配列
と実質的な配列同一性を有する少なくとも１つの配列を含む、実施形態Ｈ１１の方法。
Ｈ１３．切断された標的ポリヌクレオチドを非相同末端結合によって修復するステップ
をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１４．修復ステップが、標的ポリヌクレオチドの１つまたは複数のヌクレオチドの挿
入、欠失または置換をもたらす、前記実施形態のいずれか１つの方法。
Ｈ１５．挿入、欠失または置換が、標的ポリヌクレオチドを含む遺伝子から発現される
タンパク質における１つまたは複数のアミノ酸変化をもたらす、実施形態Ｈ１４の方法。
Ｉ１．前記実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡを２種以上含む合成ガイドＲＮＡ分
子のセットまたはライブラリー。
Ｊ１．前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡおよび１種または複数のそのほ
かの成分を含むキット。
Ｋ１．前記実施形態のいずれかの合成ガイドＲＮＡを２種以上含むＲＮＡ分子のアレイ
。
Ｌ１．ｃｒＲＮＡセグメントとｔｒａｃｒＲＮＡセグメントの両方を含む単一ＲＮＡ鎖
を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラ
リー、キットまたはアレイ。
Ｌ２．２つのＲＮＡ鎖を含み、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメン
トが、異なるＲＮＡ鎖中にある、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法
、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ３．合成ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントが、ループＬを介して連結されている、前記実施形態のいずれ
か１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ４．ループＬが、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドを含
む、実施形態Ｌ３の合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたは
アレイ。
Ｌ５．ループＬが、ＧＮＲＡのヌクレオチド配列を含み、Ｎが、Ａ、Ｃ、ＧまたはＵを
表し、Ｒが、ＡまたはＧを表す、実施形態Ｌ３またはＬ４の合成ガイドＲＮＡ、方法、セ
ットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ６．ループＬが、ＧＡＡＡのヌクレオチド配列を含む、実施形態Ｌ３～Ｌ５のいずれ
か１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ７．ループＬが、１つまたは複数の修飾されたヌクレオチドを含む、実施形態Ｌ３～
Ｌ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまた
はアレイ。
Ｌ８．ループＬが、蛍光色素を含む、実施形態Ｌ３～Ｌ７のいずれか１つの合成ガイド
ＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ９．１つまたは複数の同位体標識を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイド
ＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１０．１つまたは複数の蛍光標識を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイド
ＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１１．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢
酸（２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ）ヌクレオチドを含む、前記実施形態のいずれか
１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１２．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２－チオＵを含む、前記実施形態のい
ずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ
。
Ｌ１３．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの６－チオＧを含む、前記実施形態のい
ずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ
。
Ｌ１４．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２－チオＣを含む、前記実施形態のい
ずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットまたはアレイ
。
Ｌ１５．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－デオキシ－２’－フルオロアラ
ビノフラノシル修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セ
ットまたはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１６．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－デオキシ－２’－フルオロリボ
フラノシル修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セット
またはライブラリー、キットまたはアレイ。
Ｌ１７．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－フェニルリボースを含む、
前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キ
ットまたはアレイ。
Ｌ１８．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－チオフェニルリボースを含む、
前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キ
ットまたはアレイ。
Ｌ１９．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｓ－チオフェニルリボースを含
む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー
、キットまたはアレイ。
Ｌ２０．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－メチルリボースを含む、前記実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットま
たはアレイ。
Ｌ２１．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－エチルリボースを含む、前記実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットま
たはアレイ。
Ｌ２２．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－プロピルリボースを含む、前記
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キット
またはアレイ。
Ｌ２３．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－アリルリボースを含む、前記実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、キットま
たはアレイ。
Ｌ２４．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－アリルフェニルリボースを含む
、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー、
キットまたはアレイ。
Ｌ２５．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－メチルヒドロキシリボースを含
む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー
、キットまたはアレイ。
Ｌ２６．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－メチルオキシメチルリボースを
含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリ
ー、キットまたはアレイ。
Ｌ２７．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－カルバミン酸リボースを含
む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー
、キットまたはアレイ。
Ｌ２８．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－エチルアミノリボースを含
む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー
、キットまたはアレイ。
Ｌ２９．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－アリルアミノリボースを含
む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー
、キットまたはアレイ。
Ｌ３０．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－プロピルアミノリボースを
含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリ
ー、キットまたはアレイ。
Ｌ３１．合成ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの２’－Ｏ－置換フェニルリボースを含
む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライブラリー
、キットまたはアレイ。
Ｌ３２．合成ガイドＲＮＡのガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレ
オチド１～２０－Ｎからなり、Ｎが、－１０から１０の間（任意選択的に１０から６の間
）の整数であり、ヌクレオチド６－Ｎ～１４－Ｎの領域が、特異性増強修飾（複数でもよ
い）を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法、セットまたはライ
ブラリー、キットまたはアレイ。
Ｍ１．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合する
ための方法であって、
標的ポリヌクレオチド内のＨＢＢ遺伝子座における標的配列を選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ＨＢＢポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド
配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎは－１０から１０の間の
整数であり、前記ガイド配列は、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１
－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増
強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
を形成するステップと；
前記標的ＨＢＢポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させ
るステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップ
と
を含む方法。
Ｍ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｍ
１の方法。
Ｍ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｍ１
またはＭ２のいずれか１つの方法。
Ｍ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｍ１
～Ｍ３のいずれか１つの方法。
Ｍ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｍ
１～Ｍ４のいずれか１つの方法。
Ｍ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｍ１
～Ｍ５のいずれか１つの方法。
Ｍ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｍ１
～Ｍ６のいずれか１つの方法。
Ｍ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（
ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’
－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、または
それらの組合せでの修飾を含む、実施形態Ｍ１～Ｍ７のいずれか１つの方法。
Ｍ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’
修飾；ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾；およびそれらの組合せから選択さ
れる、実施形態Ｍ１～Ｍ７のいずれか１つの方法。
Ｍ１０．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択され
る、実施形態Ｍ９の方法。
Ｍ１１．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行
われる、実施形態Ｍ１～Ｍ１０のいずれか１つの方法。
Ｍ１２．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、実
施形態Ｍ１～Ｍ１０のいずれか１つの方法。
Ｍ１３．ガイド配列が、その５’末端、３’末端または両方に修飾、任意選択的に、２
’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ
酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキ
シ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）
、２’－フルオロ－３’－ホスホノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ
酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、またはそれらの
組合せから選択される１つまたは複数の安全性増強性修飾をさらに含む、実施形態Ｍ１～
Ｍ１２のいずれか１つの方法。
Ｍ１４．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態Ｍ１～Ｍ１３
のいずれか１つの方法。
Ｍ１５．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｍ１～Ｍ１４のいず
れか１つの方法。
Ｍ１６．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１
５のいずれか１つの方法。
Ｍ１７．標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｍ１
～Ｍ１５のいずれか１つの方法。
Ｍ１８．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｍ１～Ｍ１
５のいずれか１つの方法。
Ｍ１９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記方法の特異性を増大させる、実施形
態Ｍ１～Ｍ１８のいずれか１つの方法。
Ｎ１．（ａ）（ｉ）標的ＨＢＢポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガ
イド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが－１０から１０の間の整数で
あり、前記ガイド配列が、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、
１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾
を含み、
前記合成ガイドＲＮＡがｇＲＮＡ機能性を有する、合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｎ
１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｎ１
またはＮ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｎ１
～Ｎ３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｎ
１～Ｎ４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｎ１
～Ｎ５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｎ１
～Ｎ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（
ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’
－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、または
それらの組合せを含む、実施形態Ｎ１～Ｎ７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’
修飾；ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾；およびそれらの組合せから選択さ
れる、実施形態Ｎ１～Ｎ８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１０．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択され
る、実施形態Ｎ９の合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１１．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ＨＢＢポリヌクレオチ
ド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｎ１～Ｎ１０のいずれか１つの合成
ガイドＲＮＡ。
Ｎ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレ
オチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｎ１～Ｎ１０のいずれか１つの
合成ガイドＲＮＡ。
Ｎ１３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ＨＢＢポリヌクレオチ
ド間のハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド
間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｎ１～Ｎ１０のいずれか１つの合成ガ
イドＲＮＡ。
Ｎ１４．合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｎ１～Ｎ１３のいずれか１つの合成ガ
イドＲＮＡ。
Ｎ１５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０から
なる、実施形態Ｎ１～Ｎ１４のいずれか１つの方法。
Ｏ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための
方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（
ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが－１０から１０の間の
整数であり、前記ガイド配列は、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１
－Ｎ、１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増
強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステ
ップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップ
と
を含む方法。
Ｏ２．標的ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレ
オチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドからなる群か
ら選択される、実施形態Ｏ１の方法。
Ｏ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｏ
１またはＯ２の方法。
Ｏ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｏ１
～Ｏ３のいずれか１つの方法。
Ｏ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｏ１
～Ｏ４のいずれか１つの方法。
Ｏ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｏ
１～Ｏ５のいずれか１つの方法。
Ｏ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｏ１
～Ｏ６のいずれか１つの方法。
Ｏ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｏ１
～Ｏ７のいずれか１つの方法。
Ｏ９．少なくとも１つの特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（
ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’
－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、または
それらの組合せでの修飾を含む、実施形態Ｏ１～Ｏ８のいずれか１つの方法。
Ｏ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２
’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｏ１～Ｏ
８のいずれか１つの方法。
Ｏ１１．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択され
る、実施形態Ｏ１０の方法。
Ｏ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記方法の特異性を増大させる、実施形
態Ｏ１～Ｏ１１のいずれか１つの方法。
Ｏ１３．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行
われる、実施形態Ｏ１～Ｏ１２の方法。
Ｏ１４．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、実
施形態Ｏ１～Ｏ１２の方法。
Ｏ１５．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態Ｏ１～Ｏ１４
のいずれか１つの方法。
Ｏ１６．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｏ１～Ｏ１５のいず
れか１つの方法。
Ｏ１７．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｏ１～Ｏ１
６のいずれか１つの方法。
Ｏ１８．標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｏ１
～Ｏ１６のいずれか１つの方法。
Ｏ１９．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｏ１～Ｏ１
６のいずれか１つの方法。
Ｏ２０．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０から
なる、実施形態Ｏ１～Ｏ１９のいずれか１つの方法。
Ｐ１．（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配
列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが－１０から１０の間の整数で
あり、前記ガイド配列が、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１－Ｎ、
１４－Ｎおよび１６－Ｎから選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾
を含み、
前記合成ガイドＲＮＡがｇＲＮＡ機能性を有する、合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ２．標的ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレ
オチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリヌクレオチドからなる群か
ら選択される、実施形態Ｐ１の合成ガイド。
Ｐ３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１１－Ｎにある、実施形態Ｐ
１またはＰ２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド５－Ｎにある、実施形態Ｐ１
～Ｐ３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド７－Ｎにある、実施形態Ｐ１
～Ｐ４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド１０－Ｎにある、実施形態Ｐ
１～Ｐ５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ７．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド９－Ｎにある、実施形態Ｐ１
～Ｐ６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ８．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ヌクレオチド４－Ｎにある、実施形態Ｐ１
～Ｐ７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ９．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ
－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（
ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを
含む、実施形態Ｐ１～Ｐ８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２
’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｐ１～Ｐ
９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１１．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択され
る、実施形態Ｐ１０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間の
ハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｐ１～Ｐ１１のいずれか１つの合成ガイド
ＲＮＡ。
Ｐ１３．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレ
オチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｐ１～Ｐ１２のいずれか１つの
合成ガイドＲＮＡ。
Ｐ１４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間の
ハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハ
イブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｐ１～Ｐ１３のいずれか１つの合成ガイドＲ
ＮＡ。
Ｐ１５．合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｐ１～Ｐ１４のいずれか１つの合成ガ
イドＲＮＡ。
Ｐ１６．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０から
なる、実施形態Ｐ１～Ｐ１５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｑ１．標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するための
方法であって、
ゲノム内の標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
合成ガイドＲＮＡを用意するステップと（用意される前記合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（
ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、少なくとも２つの連続する特異性増強修飾を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドをｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップ
と；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合するステップ
と
を含み、
前記少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチド
間のハイブリダイゼーションを弱化する、方法。
Ｑ２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１および２に修
飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２および３
に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３およ
び４に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３、４
、および５に修飾を含む、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ６．ガイド配列が、連続する特異性増強修飾を５’末端に含む、実施形態Ｑ１の方法
。
Ｑ７．連続する特異性増強修飾が、ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、
２、３または４で始まる、実施形態Ｑ１の方法。
Ｑ８．標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢポリヌクレオチド、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチ
ド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポリ
ヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態Ｑ１～Ｑ７のいずれか１つの方法。
Ｑ９．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ
－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（
ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを
含む、実施形態Ｑ１～Ｑ８のいずれか１つの方法。
Ｑ１０．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２
’修飾、およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｑ１～Ｑ
８のいずれか１つの方法。
Ｑ１１．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択され
る、実施形態Ｑ１０の方法。
Ｑ１２．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行
われる、実施形態Ｑ１～Ｑ１１のいずれか１つの方法。
Ｑ１３．切断する、ニックを入れるまたは結合するステップが、細胞内で行われる、実
施形態Ｑ１～Ｑ１１のいずれか１つの方法。
Ｑ１４．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１
３のいずれか１つの方法。
Ｑ１５．標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｑ１
～Ｑ１３のいずれか１つの方法。
Ｑ１６．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｑ１～Ｑ１
３のいずれか１つの方法。
Ｑ１７．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｑ１～Ｑ１６のいず
れか１つの方法。
Ｑ１８．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０を含
むか、またはそれからなる、実施形態Ｑ１～Ａ１７のいずれか１つの方法。
Ｒ１．（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配
列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列が、少なくとも２つの連続する特異性増強修飾を含む、合成ガイ
ドＲＮＡであって、
ｇＲＮＡ機能を有し；
前記少なくとも１つの特異性増強修飾が、前記ガイド配列と前記標的ポリヌクレオチド
間のハイブリダイゼーションを弱化する、合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１および２に特
異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２および３
に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３およ
び４に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、２、３、４
および５に特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ６．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えられる連続する特異性増強修飾
をその５’末端に含む、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ７．連続する特異性増強修飾が、ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１、
２、３または４で始まる、実施形態Ｒ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ８．ガイド配列が、３つの連続する特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイ
ドＲＮＡ。
Ｒ９．ガイド配列が、４つの連続する特異性増強修飾を含む、実施形態Ｒ１の合成ガイ
ドＲＮＡ。
Ｒ１０．標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢポリヌクレオチド、ＶＥＧＦＡポリヌクレオ
チド、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド、およびＣＬＴＡ４ポ
リヌクレオチドからなる群から選択される、実施形態Ｒ１～Ｒ９のいずれか１つの合成ガ
イドＲＮＡ。
Ｒ１１．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－
Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸
（ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せ
を含む、実施形態Ｒ１～Ｒ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１２．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２
’修飾；ホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾；およびそれらの組合せから選択
される、実施形態Ｒ１～Ｒ１０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１３．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択され
る、実施形態Ｒ１２の合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間の
ハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｒ１～Ｒ１３のいずれか１つの合成ガイド
ＲＮＡ。
Ｒ１５．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレ
オチド間のハイブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｒ１～Ｒ１３のいずれか１つの
合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１６．少なくとも１つの特異性増強修飾が、ガイド配列と標的ポリヌクレオチド間の
ハイブリダイゼーションを強化し、ガイド配列とオフターゲットポリヌクレオチド間のハ
イブリダイゼーションを弱化する、実施形態Ｒ１～Ｒ１３のいずれか１つの合成ガイドＲ
ＮＡ。
Ｒ１７．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｒ１～Ｒ１６のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡ。
Ｒ１８．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～２０を含
むか、またはそれからなる、実施形態Ｒ１～Ｒ１７のいずれか１つの方法。
Ｓ１．合成ガイドＲＮＡを選択する方法であって、
少なくとも第１の合成ガイドＲＮＡおよび第２の合成ガイドＲＮＡを用意するステップ
と（用意される前記合成ガイドＲＮＡの各々は、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、（
ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、
前記ガイド配列の各々は、該ガイド配列の５’末端から数えて２０－Ｎヌクレオチド
（Ｎは、－１０から１０の間の整数である）からなり、
前記第１の合成ガイドＲＮＡは、前記ガイド配列内の第１の位置に特異性増強修飾を
含み、前記第２の合成ガイドＲＮＡは、前記ガイド配列内の第２の位置に特異性増強修飾
を含む）；
Ｃａｓタンパク質と前記第１の合成ガイドＲＮＡとを含む第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタン
パク質複合体を形成し、前記標的ポリヌクレオチドを前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパ
ク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるま
たは結合するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記第２の合成ガイドＲＮＡとを含む第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタン
パク質複合体を形成し、前記標的ポリヌクレオチドを前記第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパ
ク質複合体と接触させ、前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるま
たは結合するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを切断する、それにニックを入れるまたは結合する点での、
前記第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体および前記第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパ
ク質複合体の特異性を判定するステップと；
第１のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体および第２のｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複
合体のどちらが前記標的ポリヌクレオチドに対してより大きい特異性を有するかを同定す
るステップと
を含む方法。
Ｓ２．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ
－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（
ＤＰ）、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せを
含む、実施形態Ｓ１の方法。
Ｓ３．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）または２’
－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）を含む、実施形態Ｓ２の方法。
Ｓ４．少なくとも１つの特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’
修飾；およびホスホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｓ１の方法
。
Ｓ５．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される
、実施形態Ｓ４の方法。
Ｓ６．第１および第２の合成ガイドＲＮＡが、異なるヌクレオチドに特異性増強修飾を
含む、実施形態Ｓ１～Ｓ５のいずれか１つの方法。
Ｓ７．特異性が、オンおよび／もしくはオフターゲット切断、結合もしくはニッキング
パーセンテージ、オン：オフ比、特異性スコア、またはそれらの組合せから選択される、
実施形態Ｓ１～Ｓ６のいずれか１つの方法。
Ｓ８．ガイド配列部分内の異なるヌクレオチド部分に特異性増強修飾を含む第１～第２
０の合成ガイドＲＮＡを用意するステップと；前記合成ガイドＲＮＡの各々を使用してｇ
ＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；前記標的ポリヌクレオチドを前
記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと；前記標的ポリヌクレオチ
ドを切断し、それにニックを入れまたは結合し、各合成ガイドＲＮＡの特異性を測定する
ステップと；最大の特異性増強をもたらす１つまたは複数の修飾された部分を同定するス
テップとを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ７のいずれか１つの方法。
Ｓ９．ガイド配列が、５’末端および３’末端に、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ
酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－Ｏ－メチ
ル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）
、２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－フルオロ－３’－ホスホ
ノ酢酸（ＦＰ）、２’－フルオロ－３’－チオホスホノ酢酸（ＦＳＰ）、２’－フルオロ
－３’－ホスホロチオエート（ＦＳ）、またはそれらの組合せでの修飾をさらに含む、実
施形態Ｓ１～Ｓ８のいずれか１つの方法。
Ｓ１０．標的ＨＢＢポリヌクレオチドを切断するステップを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ９
のいずれか１つの方法。
Ｓ１１ 標的ＨＢＢポリヌクレオチドにニックを入れるステップを含む、実施形態Ｓ１
～Ｓ９のいずれか１つの方法。
Ｓ１２．標的ＨＢＢポリヌクレオチドに結合するステップを含む、実施形態Ｓ１～Ｓ９
のいずれか１つの方法。
Ｓ１３．第１および第２のガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｓ
１～Ｓ１２のいずれか１つの方法。
Ｔ１．合成ガイドＲＮＡを選択するためのキットであって、
少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡ
（該少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡは、
（ａ）（ｉ）標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるガイド配列、
（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔ
ｒａｃｒＲＮＡセグメントと
を含み、前記ガイド配列は、前記ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド２０－Ｎ
（ここでのＮは、－１０から１０の間の整数である）からなり、前記ガイド配列内のヌク
レオチドに少なくとも１つの特異性増強修飾を含み、および
該少なくとも２つの合成ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの異なる特異性増強修飾を有
する点、または前記ガイド配列内の少なくとも１つの異なる位置に特異性増強修飾を有す
る点で、互いに異なる）；および
Ｃａｓタンパク質、または前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を含むキット。
Ｔ２．少なくとも２０の合成ガイドＲＮＡを含む、実施形態Ｔ１のキット。
Ｔ３．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である、実施形態Ｔ１またはＴ２
のキット。
Ｔ４．特異性増強修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ
－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（
ＤＰ）、または２’－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）を含む、実施形態Ｔ
１～Ｔ３のいずれか１つのガイドＲＮＡ。
Ｔ５．特異性増強修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーを付与する２’修飾、およびホス
ホノ酢酸またはチオホスホノ酢酸連結修飾を含む、実施形態Ｔ１～Ｔ３のいずれか１つの
キット。
Ｔ６．２’修飾が、２’－Ｆおよび２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）から選択される
、実施形態Ｔ５のキット。
Ｔ７．ガイドＲＮＡが、合成単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｔ１～Ｔ６のいずれか
１つのキット。
Ｕ１．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、１より大きい、
好ましくは少なくとも１．１、より好ましくは少なくとも１．５、よりいっそう好ましく
は少なくとも２、よりいっそう好ましくは少なくとも５、よりいっそう好ましくは少なく
とも１０、または最適には少なくとも２０の特異性スコアを有する、前記実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ２．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、約２～約６０、
または好ましくは約１０～約６０の特異性スコアを有する、前記実施形態のいずれか１つ
の合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ３．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、少なくとも３０
％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７０％、または最適には少
なくとも９０％のオンターゲット切断を有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイ
ドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ４．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、約２５％～９９
．９％、または好ましくは約５０％～約９９．９％のオンターゲット切断を有する、前記
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ５．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、１より大きい、
好ましくは少なくとも１．１：１、より好ましくは少なくとも１．５：１、よりいっそう
好ましくは少なくとも３：１、よりいっそう好ましくは少なくとも１０：１、よりいっそ
う好ましくは少なくとも２０：１、または最適には少なくとも４０：１のオン：オフ比を
有する、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｕ６．ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、特異性増強修飾を含み、約１．５：１～
約９９．９：１、または好ましくは約１０：１～約９９．９：１のオン：オフ比を有する
、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ１．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１９からな
り、位置３、４、６、８、９および１０から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも
１つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキ
ット。
Ｗ２．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１８からな
り、位置２、３、５、７、８および９から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１
つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキッ
ト。
Ｗ３．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１７からな
り、位置１、２、４、６、７および８から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１
つの化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキッ
ト。
Ｗ４．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１６からな
り、位置１、３、５、６および７から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの
化学修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ５．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１５からな
り、位置２、４、５および６から選択されるヌクレオチドの１つに少なくとも１つの化学
修飾を含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
Ｗ６．ガイド配列が、該ガイド配列の５’末端から数えてヌクレオチド１～１４からな
り、位置１、３、４および５から選択されるヌクレオチドに少なくとも１つの化学修飾を
含む、前記実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ、方法またはキット。
下記の例示的実施形態において、「Ｘ実施形態」とは、番号がＸで始まるすべての実施
形態を意味する。同様に、下記の例示的実施形態において、「Ｘｎ実施形態」とは、番号
がＸｎで始まるすべての実施形態を意味する。例として、「Ｘ９実施形態」は、いずれの
請求項に記載される場合も、「Ｘ９」、および存在する場合には「Ｘ９ａ」から「Ｘ９ｚ
」までを意味する。
Ｘ．（ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブ
リダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメント
と、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間の整数
であり、
前記ガイド配列が、少なくとも１つの修飾を含む、合成ガイドＲＮＡ。
Ｘ１．（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダ
イズすることができる、ガイド配列と、
（ｉｉ）ステム配列と
を含む合成ｃｒＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間の整数
であり、
前記ガイド配列が、少なくとも１つの修飾を含む、合成ｃｒＲＮＡ。
Ｘ１ａ．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１－Ｎでの修飾を含む、実施
形態ＸまたはＸ１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１ｂ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置２－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１ｃ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置３－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置４－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施
形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置５－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置６－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置７－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施
形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置８－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ５．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置９－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実施
形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ６．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１０－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１１－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ実
施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１２－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｂ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１３－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｃ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１４－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｄ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｅ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１６－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｆ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１７－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｇ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１８－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｈ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１９－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ７ｉ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置２０－Ｎでの修飾を含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ８．少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、任意選択的
にホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成
ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ８ａ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連
結、任意選択的にホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施形態のい
ずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ８ｂ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノプロピオン酸ヌクレオチド間連結を含
む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、任
意選択的にチオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ａ．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノプロピオン酸ヌクレオチド間連結
を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｂ．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド
間連結、任意選択的にチオホスホノ酢酸エステルヌクレオチド間連結を含む、前記Ｘ実施
形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｃ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む
、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｄ．前記少なくとも１つの修飾が、キラルホスホロチオエートヌクレオチド間連結
を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｅ．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホロジチオエートヌクレオチド間連結を含
む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｆ．前記少なくとも１つの修飾が、ボラノホスホネートヌクレオチド間連結を含む
、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｇ．前記少なくとも１つの修飾が、Ｃ１－４アルキルホスホネートヌクレオチド間
連結を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｈ．前記少なくとも１つの修飾が、メチルホスホネートヌクレオチド間連結を含む
、Ｘ９ｇ実施形態の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ９ｉ．前記少なくとも１つの修飾が、メチルチオホスホネートヌクレオチド間連結を
含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０．前記少なくとも１つの修飾が、修飾された糖を含む、前記Ｘ実施形態のいずれ
か１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ａ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシリボース（２’－デオキシ）
である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｂ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－ＮＨ２である、実施形態Ｘ１０の合成
ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｃ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－アラビノフラノシル（２’－アラビノ
）である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｄ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフ
ラノシル（２’－Ｆ－アラビノ）である、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒ
ＲＮＡ。
Ｘ１０ｅ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－ＬＮＡである、実施形態Ｘ１０の合成
ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｆ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－ＵＬＮＡである、実施形態Ｘ１０の合
成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｇ．前記少なくとも１つの修飾が、４’－チオリボシルである、実施形態Ｘ１０
の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｈ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキルである、実施形
態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｉ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｃ１－３アルキル－Ｏ－Ｃ１－３
アルキルである、実施形態Ｘ１０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｊ．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－フェニル、２’－チオフェニル、
２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’－アリル
、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル、２’－
Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－Ｏ－プロ
ピルアミノ、および２’－Ｏ－置換フェニルから選択される、実施形態Ｘ１０の合成ガイ
ドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１０ｋ．前記少なくとも１つの修飾が、Ｃ３’－エンド糖パッカーコンホメーション
を付与する２’修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃ
ｒＲＮＡ。
Ｘ１１．前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、および２’－Ｏ－（２
－メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｘ１０ｋの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲ
ＮＡ。
Ｘ１１ａ．前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチルである、実施形態Ｘ１１の合成ガイドＲ
ＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１１ｂ．前記２’修飾が、２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル（２’－
フルオロ）である、実施形態Ｘ１１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１１ｃ．前記２’修飾が、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）である、実施形態Ｘ１
１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１２．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ
）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１３．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（
ＭＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１４．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（Ｄ
Ｐ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１５．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸
（ＤＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ
。
Ｘ１６．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置４－Ｎ～２０－Ｎのいずれか
１つの位置にホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾
を含み、前記修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎにはない、実施形態ＸまたはＸ１の合成
ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１６ａ．前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間連結修飾を含み、位置１５－
Ｎが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－
チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）を含まない、実施形態ＸまたはＸ１の合成ガイドＲＮＡまた
はｃｒＲＮＡ。
Ｘ１７．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置４－Ｎでのホスホノカルボン酸ま
たはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ
１６～Ｘ１６ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１８．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置５－Ｎでのホスホノカルボン酸ま
たはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ
１６～Ｘ１７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ１９．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置６－Ｎでのホスホノカルボン
酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およ
びＸ１６～Ｘ１８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２０．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置７－Ｎでのホスホノカルボン酸ま
たはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ
１６～Ｘ１９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２１．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置８－Ｎでのホスホノカルボン酸ま
たはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ
１６～Ｘ２０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２２．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置９－Ｎでのホスホノカルボン酸ま
たはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ
１６～Ｘ２１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２３．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１０－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２４．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１１－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２５．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１２－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２４のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２６．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１３－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２５のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２７．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１４－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２７ａ．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎでのホスホノカルボン
酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およ
びＸ１６ａ～Ｘ２６のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２８．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１６－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２７のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ２９．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１７－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３０．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１８－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ２９のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３１．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置１９－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ３０のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３２．少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置２０－Ｎでのホスホノカルボン酸
またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を含む、実施形態Ｘ、Ｘ１および
Ｘ１６～Ｘ３１のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３３．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結を含む
、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒ
ＲＮＡ。
Ｘ３４．前記少なくとも１つの修飾が、チオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結を
含む、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３２のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたは
ｃｒＲＮＡ。
Ｘ３５．前記ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結が、ホスホノ酢酸連結（Ｐ）であ
る、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃ
ｒＲＮＡ。
Ｘ３６．前記ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結が、チオホスホノ酢酸連結（ＳＰ
）である、実施形態Ｘ、Ｘ１およびＸ１６～Ｘ３３のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡま
たはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３７．前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾
をさらに含む、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３８．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ
－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオ
チド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－
３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）お
よび２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから
独立に選択される、実施形態Ｘ３７の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３８ａ．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－
デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸
（ＤＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、実施形態Ｘ３７の合成ガイド
ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ３９．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢポリヌクレオチド内に位置する、実施形
態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４０．前記標的ポリヌクレオチドが、ＩＬ２ＲＧポリヌクレオチド内に位置する、実
施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４１．前記標的ポリヌクレオチドが、ＶＥＧＦＡポリヌクレオチド内に位置する、実
施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４２．前記標的ポリヌクレオチドが、ＣＬＴＡ１ポリヌクレオチド内に位置する、実
施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４３．前記標的ポリヌクレオチドが、ＣＬＴＡ４ポリヌクレオチド内に位置する、実
施形態Ｘ～Ｘ３８ａのいずれか１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４４．標的ポリヌクレオチドが、ＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡを含む、実施
形態Ｘ３９の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４５．標的ポリヌクレオチドが、ＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡを含む、実施
形態Ｘ４０の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４６．標的ポリヌクレオチドが、ＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、実施
形態Ｘ４１の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４７．標的ポリヌクレオチドが、ＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣＣＴＣＡＡＧＣを含む、実施
形態Ｘ４２の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８．標的ポリヌクレオチドが、ＧＡＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡを含む、実施
形態Ｘ４３の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ａ．少なくとも１つの修飾が、修飾された塩基を含む、前記Ｘ実施形態のいずれ
か１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｂ．修飾された塩基が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２
－アミノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニ
ン、７－デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニ
ン、５－メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチ
ルウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラ
シル、５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５
－アミノアリルＵ、５－アミノアリルＣ、脱塩基ヌクレオチド、ＵＮＡ塩基、イソＣ、イ
ソＧ、５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）
、およびそれらの組合せから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃ
ｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｃ．修飾された塩基が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵおよび６－チオＵ
から選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｄ．修飾された塩基が、２－アミノＡおよび２－アミノプリンから選択される、
実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｅ．修飾された塩基が、シュードウラシルおよびヒポキサンチンから選択される
、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｆ．修飾された塩基が、イノシンである、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡ
またはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｇ．修飾された塩基が、７－デアザグアニン、７－デアザ－８－アザグアニン、
７－デアザアデニン、および７－デアザ－８－アザアデニンから選択される、実施形態Ｘ
４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｈ．修飾された塩基が、５－メチル－シトシン、５－メチル－ウラシルおよび５
－メチル－ピリミジンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒ
ＲＮＡ。
Ｘ４８ｉ．修飾された塩基が、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチル
ウラシル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシ
ル、５－エチニルシトシンおよび５－エチニルウラシルから選択される、実施形態Ｘ４８
ａの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｊ．修飾された塩基が、５－アリルウラシル、５－アリルシトシン、５－アミノ
アリルウラシルおよび５－アミノアリルシトシンから選択される、実施形態Ｘ４８ａの合
成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｋ．修飾された塩基が、脱塩基ヌクレオチドである、実施形態Ｘ４８ａの合成ガ
イドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｌ．修飾された塩基が、イソＣおよびイソＧから選択される、実施形態Ｘ４８ａ
の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４８ｍ．修飾された塩基が、ＵＮＡ塩基である、実施形態Ｘ４８ａの合成ガイドＲＮ
ＡまたはｃｒＲＮＡ。
Ｘ４９．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強するための方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
前記Ｘ実施形態のいずれか１つの少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ
を用意するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓ
タンパク質複合体を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドと前記ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとのハイブリダイゼー
ション、およびＣＲＩＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記標的ポリヌクレ
オチドを前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと
を含む方法。
Ｘ４９ａ．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強するための方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
前記Ｘ実施形態のいずれか１つの少なくとも１つの合成ｃｒＲＮＡを用意するステップ
と；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ｃｒＲＮＡとを含むｃｒＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを前記ｃｒＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるス
テップと
を含む方法。
Ｘ４９ｂ．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を分析するための方法であって、
（１）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドと（２）オフターゲット配列を含む１つま
たは複数のオフターゲットポリヌクレオチドとを含むサンプルを用意するステップと；
前記標的配列のための前記Ｘ実施形態のいずれか１つの少なくとも１つの合成ガイドＲ
ＮＡまたはｃｒＲＮＡを用意するステップと；
タンパク質としてまたは前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして用
意されるＣａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：
Ｃａｓタンパク質複合体を形成するステップと；
前記ｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーショ
ン、およびＣＲＩＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記サンプルと前記ｇＲ
ＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体とを接触させるステップと；
前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイトと、１つまた
は複数のオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイト
とを含む、オリゴヌクレオチドベイトのライブラリーを添加して、前記標的ポリヌクレオ
チドおよび前記１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドを捕捉するステップと
；
前記捕捉された標的ポリヌクレオチドおよび前記捕捉されたオフターゲットポリヌクレ
オチドを単離および分析して、前記ＣＲＩＳＰＲ機能に起因する変化を同定し、前記標的
ポリヌクレオチドおよび前記オフターゲットポリヌクレオチドにおける相対変化を判定し
、それによって前記ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を評価するステップと
を含む方法。
Ｘ４９ｃ．前記サンプルが、標的配列を各々が含む２つ以上の標的ポリヌクレオチドを
含む、実施形態Ｘ４９ｂの方法。
Ｘ４９ｄ．前記ガイドＲＮＡが、任意の前記Ｘ実施形態の合成ｃｒＲＮＡであり、前記
ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体が、ｃｒＲＮＡ：Ｃｐｆ１複合体である、実施形態Ｘ
４９ｂの方法。
Ｘ５０．接触させるステップが、細胞内で実施される、実施形態Ｘ４９の方法。
Ｘ５１．細胞が、初代細胞である、実施形態Ｘ５０に記載の方法。
Ｘ５２．Ｃａｓタンパク質が、タンパク質として、または該Ｃａｓタンパク質を発現す
るポリヌクレオチドとして用意される、実施形態Ｘ４９～５１のいずれか１つの方法。
Ｘ５２ａ．Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９である、実施形態Ｘ４９～５２のいずれか１
つの方法。
Ｘ５２ｂ．Ｃａｓタンパク質が、Ｃｐｆ１である、実施形態Ｘ４９～５２のいずれか１
つの方法。
Ｘ５３．ポリヌクレオチドが、ｍＲＮＡである、実施形態Ｘ５２の方法。
Ｘ５４．前記形成するステップが、細胞外で実施される、前記Ｘ実施形態のいずれか１
つの方法。
Ｘ５５．ＣＲＩＳＰＲ機能が、遺伝子編集である、前記実施Ｘ形態のいずれか１つの方
法。
Ｘ５５ａ．ＣＲＩＳＰＲ機能が、遺伝子編集であり、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオ
チドを相同性指向修復のためのドナー鋳型として用意するステップをさらに含む、前記Ｘ
実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ５６．ＣＲＩＳＰＲ機能が、ＣＲＩＳＰＲａである、前記Ｘ実施形態のいずれか１つ
の方法。
Ｘ５７．ＣＲＩＳＰＲ機能が、ＣＲＩＳＰＲｉである、前記Ｘ実施形態のいずれか１つ
の方法。
Ｘ５７ａ．捕捉されたポリヌクレオチドを分析するステップを含み、分析するステップ
が、シークエンシングによって実施される、実施形態Ｘ５５～Ｘ５７のいずれか１つの方
法。
Ｘ５７ｂ．遺伝子発現レベルを測定することによって、任意選択的にｑＲＴ－ＰＣＲに
よって、前記ＣＲＩＳＰＲ機能を分析するステップをさらに含む、実施形態Ｘ５６または
Ｘ５７の方法。
Ｘ５７ｃ．遺伝子発現レベルの前記測定が、マイクロアレイを用いて実施される、実施
形態Ｘ５７ｂの方法。
Ｘ５８．ＣＲＩＳＰＲ機能が、遺伝子発現の調節である、前記実施Ｘ形態のいずれか１
つの方法。
Ｘ５９．Ｎが０であり、ガイド配列が、２０ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５
８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６０．Ｎが１であり、ガイド配列が、１９ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５
８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６１．Ｎが２であり、ガイド配列が、１８ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５
８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６２．Ｎが３であり、ガイド配列が、１７ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５
８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６３．Ｎが４であり、ガイド配列が、１６ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５
８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６４．Ｎが５であり、ガイド配列が、１５ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ５
８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６５．Ｎが－１であり、ガイド配列が、２１ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ
５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６６．Ｎが－２であり、ガイド配列が、２２ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ
５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６７．Ｎが－３であり、ガイド配列が、２３ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ
５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６８．Ｎが－４であり、ガイド配列が、２４ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ
５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ６９．Ｎが－５であり、ガイド配列が、２５ヌクレオチドからなる、実施形態Ｘ～Ｘ
５８のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７０．ガイド配列内の１０以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のい
ずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７１．ガイド配列内の９以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７２．ガイド配列内の８以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７３．ガイド配列内の７以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７４．ガイド配列内の６以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７５．ガイド配列内の５以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７６．ガイド配列内の４以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７７．ガイド配列内の３以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７８．ガイド配列内の２以下のヌクレオチドが、修飾を含む、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ７９．ガイド配列の最初の４つのヌクレオチドが、すべて修飾されている場合、それ
らが同一の方法で修飾されていない、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡ
もしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８０．ガイド配列の最初の５つのヌクレオチドが、すべて修飾されている／される場
合、それらが同一の方法で修飾されていない／されない、前記Ｘ実施形態のいずれか１つ
の合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８１．ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの
合成ガイドＲＮＡまたは方法。
Ｘ８２．ガイドＲＮＡが、修飾を有しない対応するガイドＲＮＡより、標的ポリヌクレ
オチオに対する高い特異性、または高いｇＲＮＡ機能性を有する、前記Ｘ実施形態のいず
れか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８３．少なくとも２つの異なる合成ガイドＲＮＡが、２つの異なる標的ポリヌクレオ
チドのために用意される、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの方法。
Ｘ８４．２つの異なる標的ポリヌクレオチドが、同じ遺伝子内に位置する、実施形態Ｘ
８３の方法。
Ｘ８５．Ｎが、－１０から６の間であり、ガイド配列が、１４～３０ヌクレオチドから
なる、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法
。
Ｘ８６．Ｎが、－５から６の間であり、ガイド配列が、１４～２５ヌクレオチドからな
る、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８７．Ｎが、－４から３の間であり、ガイド配列が、１７～２４ヌクレオチドからな
る、前記Ｘ実施形態のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ８８．前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）
を含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまた
は方法。
Ｘ８９．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸
（ＤＳＰ）を含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒ
ＲＮＡまたは方法。
Ｘ９０．２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）を含む少なくとも１つの修飾を
、５’末端、３’末端または両末端に含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１つの合成ガ
イドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｘ９１．２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）を含む少なくとも１
つの修飾を、５’末端、３’末端または両末端に含む、前記Ｘ実施形態方法のいずれか１
つの合成ガイドＲＮＡもしくはｃｒＲＮＡまたは方法。
Ｙ１．（ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイ
ブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメン
トと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間、任意
選択的に１０～６の間の整数であり、
前記ガイド配列が、前記ガイド配列の位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ
、１１－Ｎ、１４－Ｎ、もしくは１６－Ｎ、またはそれらの組合せに位置する、少なくと
も１つの修飾をさらに含む、合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ２．単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ３．前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）；チオホ
スホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）；およびＣ３’－エンド糖パッカーコンホメーシ
ョンを付与する２’修飾；またはそれらの組合せから選択される、実施形態Ｙ１の合成ガ
イドＲＮＡ。
Ｙ４．前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、および２’－Ｏ－（２－
メトキシエチル）から選択される、実施形態Ｙ３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ５．前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）
および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）から選択される、実施形態
Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ６．前記少なくとも１つの修飾が、ガイド配列の位置５－Ｎもしくは１１－Ｎ、また
はそれらの組合せに位置する、実施形態Ｙ５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ７．前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾を
さらに含む、実施形態Ｙ１の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ８．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－
メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチ
ド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３
’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）およ
び２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独
立に選択される、実施形態Ｙ７の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ９．５’末端、３’末端または両末端に、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエ
ートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ
酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ
）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チ
オホスホノ酢酸（ＭＳＰ）またはそれらの組合せから独立に選択される少なくとも１つの
修飾をさらに含む、実施形態Ｙ５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１０．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、またはＶＥ
ＧＦＡ遺伝子内に位置する、実施形態Ｙ５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１１．標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子のＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡ
Ａ、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡ、またはＶＥＧＦＡ遺伝子
のＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、実施形態Ｙ１０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１２．前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡであり、前記ガイドＲＮＡの５’末端
、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホ
スホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、
チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオ
エート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチ
ル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから独立に選択される、
実施形態Ｙ１０の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１３．（ａ）（ｉ）ＰＡＭ配列に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハ
イブリダイズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメ
ントと、
（ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
ａｃｒＲＮＡセグメントと
を含む合成ガイドＲＮＡであって、
前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間、任意
選択的に１０～６の間の整数であり、
前記ガイド配列が、前記ガイド配列の位置４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に少なく
とも１つのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結修飾を
さらに含み、前記修飾が、ガイド配列の位置１５－Ｎにはない、合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１４．前記ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結が、ホスホノ酢酸連結（Ｐ）およ
びチオホスホノ酢酸連結（ＳＰ）から選択される、実施形態Ｙ１３の合成ガイドＲＮＡ．
Ｙ１５．前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾
をさらに含む、実施形態Ｙ１３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１６．単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｙ１３の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１７．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ
－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオ
チド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－
３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）お
よび２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから
独立に選択される、実施形態Ｙ１５の合成ガイドＲＮＡ。
Ｙ１８．ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズ
することができるガイド配列を含む合成ｃｒＲＮＡであって、前記ガイド配列が、２０－
Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から１０の間、任意選択的に１０～６の間の整数
であり、前記ガイド配列が、前記ガイド配列の位置４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に
少なくとも１つのホスホノカルボン酸またはチオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結
修飾をさらに含み、前記修飾が、前記ガイド配列の位置１５－Ｎにはない、合成ｃｒＲＮ
Ａ。
Ｙ１９．前記ｃｒＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に少なくとも１つの修飾を
さらに含む、実施形態Ｙ１８の合成ｃｒＲＮＡ。
Ｙ２０．ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強する方法であって、
標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
実施形態Ｙ１３の少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡを用意するステップと；
Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
を形成するステップと；
前記標的ポリヌクレオチドを、前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるス
テップと
を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質として、または前記Ｃａｓタンパク質をコードす
るポリヌクレオチドとして用意される、方法。
Ｙ２１．前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡである、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２２．前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に
少なくとも１つの修飾をさらに含む、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２３．５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ
－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレオ
チド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－
３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）お
よび２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、またはそれらの組合せから
独立に選択される、実施形態Ｙ２２の方法。
Ｙ２４．前記ガイドＲＮＡが、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結およびチオホスホノ酢
酸ヌクレオチド間連結またはそれらの組合せから選択される少なくとも１つの修飾を含む
、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２５．前記ガイドＲＮＡが、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）および
２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）から選択される少なくとも１つの
修飾を含む、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２６．前記ポリヌクレオチド標的の前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体との前記
接触が、細胞内で実施される、実施形態Ｙ２０の方法。
Ｙ２７．前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、実施形態Ｙ２６の方法
。
Ｙ２８．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、またはＶＥ
ＧＦＡ遺伝子内に位置する、実施形態Ｙ２７の方法。
Ｙ２９．前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子のＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧ
ＴＡＡ、ＩＬ２ＲＧ遺伝子のＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡ、またはＶＥＧＦＡ遺
伝子のＧＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、実施形態Ｙ２８の方法。
Ｙ３０．前記形成が、細胞外で実施される、実施形態Ｙ２０の方法。
例示的または好ましい実施形態の前述の記載は、特許請求の範囲によって規定されるよ
うな本発明の制限としてではなく、例示ととられなければならない。容易に理解されるで
あろうが、特許請求の範囲において示されるような本発明から逸脱することなく、上記で
示される特徴の多数の変更および組合せが利用され得る。このような変更は、本発明の範
囲からの逸脱と見なされず、すべてのこのような変更は、以下の特許請求の範囲内に含ま
れるものとする。本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照により全文が本
明細書の一部をなすものとする。
例示的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系の説明図である。単一ガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質によって複合体が形成され、その複合体が標的ポリヌクレオチドを認識し、結合する。Ｃａｓヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ＰＡＭ配列を認識する（ここで、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧの３ヌクレオチドの配列であり、ここで、Ｎは、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴであるが、ＮＡＧなどのその他のＰＡＭ配列も存在するとわかっている）。ｓｇＲＮＡは、ガイド配列、ｃｒＲＮＡ配列またはセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列またはセグメントを含む。ｓｇＲＮＡのガイド配列は、ＰＡＭ配列のすぐ上流のＤＮＡ標的とハイブリダイズする。 ｃｒＲＮＡセグメント２０３およびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント２０５を含む、例示的なガイドＲＮＡ２０１を示す図である。 ｃｒＲＮＡセグメント２０９およびｔｒａｃｒＲＮＡセグメント２１１を含み、前記ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがループ２１３を介して連結される、例示的な単一ガイドＲＮＡ２０７を示す図である。 ガイドＲＮＡに含めることができる種々の化学修飾の一部についての構造を示す図である。もちろん、図３は、限定を意図したものではなく、本明細書において記載される多くのその他の修飾を使用することができる。 オリゴヌクレオチド二本鎖が加熱によって別個の鎖に分離するにつれて紫外線（ＵＶ）吸光度がどのように上昇するのかを示すグラフである。シグモイド曲線は、別個の鎖への二本鎖の解離を表し、シグモイド曲線の中点が、二本鎖のＴｍである。この曲線は、生理的塩濃度での２０ヌクレオチドＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度が、およそ５０℃であることを示す。 ｃｒＲＮＡセグメントおよびｔｒａｃｒＲＮＡセグメントがハイブリダイズされた二本鎖を形成している、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）または２ピースのデュアルガイドＲＮＡ（「ｄｇＲＮＡ」）を示す図であって、ガイドＲＮＡの伸長領域、ロッキング領域、サンプリング領域、シード領域（通常、１０ｍｅｒ）、デュアルガイドステムまたは単一ガイドステム－ループ、およびｔｒａｃｒＲＮＡ領域を示す図である。 ガイド配列と相補的ＤＮＡ配列とのシード部分間でのシード二本鎖の最初の形成後、ヌクレオチドの結合が、どうのようにして、サンプリング領域およびロッキング領域を通じて逐次的に進行して、融解温度を有するＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成するかを示す図である。 シード領域のヌクレオチドにおける化学修飾が、高い協同性レベルを維持しながら個々の塩基対の結合エネルギーを減少させ、それによって、サンプリング領域を伸長し、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖の融解温度を低下させることができることを示す図である。図５Ｃは、サンプリング領域における化学修飾も示す。 ２０ヌクレオチドのガイド配列を有し、該ガイド配列内の種々の位置に組み込まれた種々の種類の化学修飾によって修飾されている例示的ｃｒＲＮＡポリヌクレオチドを示す図である。 修飾されていないｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す図である。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 別個のガイド配列内のヌクレオチド６～９に異なる種類の修飾を含む化学修飾されたｃｒＲＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖についての融解曲線を示す。 ｘ軸上の負または正の整数によってそれぞれ示される、ガイド配列の漸増的な５’末端切除または５’ 末端伸長後の相補的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされた（ｃｒＲＮＡ内の）ガイド配列の２０塩基対の二本鎖の融解温度の変化を示すグラフである。 ＣＬＴＡ１オンターゲット、ＣＬＴＡ１オフ１ターゲットおよびＣＬＴＡ１オフ３ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断ならびに「オフ１」および「オフ３」と呼ばれる２種の異なるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ１」配列に標的化されたｇＲＮＡの化学修飾の影響を示す図である。 図８Ａの切断結果を、アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比を算出したことに由来する図である。アッセイされたガイドＲＮＡごとに、それぞれのオンターゲット切断パーセンテージを各比に掛けることによって、「特異性スコア」も算出されている。陰付きの比および特異性スコアは、図８Ｂに示されている他のものより大きい値であることが注目に値する。 「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断ならびに「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」と呼ばれる３種の異なるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断（それぞれ、ＣＬＴＡ４オンターゲット、ＣＬＴＡ４オフ１ターゲット、ＣＬＴＡ４オフ２ターゲットおよびＣＬＴＡ４オフ３ターゲットを表す）に関する、ヒトＣＬＴＡ遺伝子内の「ＣＬＴＡ４」配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置での２’－Ｏ－メチル－３’－ＰＡＣＥ（「ＭＰ」）修飾の影響を示す図である。 図９Ａの切断結果を、アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比を算出したことに由来する図である。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、１．５以上のスコアに陰が付けられている。オフターゲットポリヌクレオチドごとに３つの最高スコアが、より濃い陰を付けることによって示されている。 ＩＬ２ＲＧオンターゲットおよびＩＬ２ＲＧオフ３ターゲットをそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ３」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＩＬ２ＲＧ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、２．０より大きいスコアに陰が付けられている。より濃い陰を付けることによって３つの最高スコアが示されている。 ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異的スコアは、図８Ｂについて説明したように算出され、２．０より大きいスコアに陰が付けられている。より濃い陰を付けることによって３つの最高スコアが示されている。 合成ｓｇＲＮＡおよびＣａｓ９発現プラスミドがトランスフェクトされたヒトＫ５６２細胞における、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡの種々の種類の修飾の影響であって、この図で「オン」と呼ばれる標的ゲノム遺伝子座の切断に関する影響を、「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」と呼ばれる３種の異なるオフターゲットゲノム遺伝子座の同時切断に関する影響を示す図であり、前記「オン」、「オフ１」、「オフ２」および「オフ３」は、内因性ＨＢＢオンターゲット、ＨＢＢオフ１ターゲット、ＨＢＢオフ２ターゲットおよびＨＢＢオフ３ターゲット部位をそれぞれ表す。「Ｕｎｍｏｄｉｆ」は、化学修飾されていないｓｇＲＮＡを示す。「３ｘＭ」は、２’－Ｏ－メチル（「Ｍ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡ鎖の最初の３つおよび最後の３つのヌクレオチドに、すなわち、それぞれ５’および３’末端に組み込まれたことを示す。同様に、「３ｘＭＳ」は、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（「ＭＳ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端に同様に組み込まれたことを示し、それに対して「３ｘＭＳＰ」は、２’－Ｏ－メチル－３’－チオＰＡＣＥ（「ＭＳＰ」）ヌクレオチドが、ｓｇＲＮＡの５’および３’末端に同様に組み込まれたことを示す。すべてのｓｇＲＮＡを、トランスフェクトされた細胞における示されている遺伝子座の編集についてアッセイした。 図１１Ａに示されている同一のエントリー１～１７に関する結果を、該エントリーを特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけして、示す図である。エントリー１８～６４は、ＨＢＢオンターゲットおよびＨＢＢオフ１ターゲットをそれぞれ表す、「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットポリヌクレオチドの別途アッセイされた切断に関する、ヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのさらなるＭＰ修飾の影響を示す。「１ｘＭＰ」は、５’末端と３’末端両方の末端ヌクレオチドが、ＭＰで修飾されていることを示す。アッセイされた各合成ｓｇＲＮＡについての、切断されたオフターゲットポリヌクレオチドに対する切断された標的ポリヌクレオチドの比が算出されている。特異性スコアは、図８Ｂについて説明したように算出されている。最高スコアに陰が付けられている。 内因性ＨＢＢオンターゲットゲノム遺伝子座およびＨＢＢオフ１ターゲット部位をそれぞれ表す、この図で「オン」と呼ばれる標的ポリヌクレオチドの切断および「オフ１」と呼ばれるオフターゲットゲノム遺伝子座の同時切断に関する、トランスフェクト細胞におけるヒトＨＢＢ遺伝子内の配列に標的化されたｇＲＮＡ内の種々の位置でのＭＰ修飾の影響を示す図である。合成ｓｇＲＮＡと組換えＣａｓ９タンパク質の複合体がトランスフェクトされた培養細胞において、どちらかまたは両方の部位で生じた切断のパーセンテージは、精製されたゲノムＤＮＡの別々のサンプルにおけるオンターゲットおよびオフターゲット遺伝子座をＰＣＲ増幅し、続いて、プールされたアンプリコンを次世代シークエンシングし、評価中のオンターゲットまたはオフターゲット切断部位付近にインデルが存在するか、存在しないかに従って配列リードをバイオインフォマティクスにより分割することによって、トランスフェクションの４８時間後に決定されている。トランスフェクトされた細胞の各サンプルにおいて生じたインデルは、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体ではなく、バッファーで処理されたｍｏｃｋトランスフェクト細胞の対照サンプルに対して正規化されている。標的部位インデルを示す配列リード数の、別途トランスフェクトされた各ｓｇＲＮＡについてのオフターゲット部位インデルを示すリード数に対する比が、算出されている。特異性スコアは、図８Ｂについて説明したように算出されている。「１ｘＭＰ」は、５’末端と３’末端両方の末端ヌクレオチドが、ＭＰで修飾されていることを示す。エントリー１～２１は、Ｋ５６２細胞にトランスフェクトし、該細胞を培養することによって得られた結果を示し、それに対してエントリー２２～４２は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣとしても公知である）にトランスフェクトし、該細胞を培養することによって得られた結果を示す。エントリー１～１２は、特異性スコアに従って最高から最低へと順位づけされている。同様に、エントリー１３～１９、エントリー２２～３３、およびエントリー３４～４０は、特異性スコアによってグループごとに順位づけされている。２．０より大きい特異性スコアに陰が付けられている。 グループごとに最高比から最低比へと並べ替えられた、測定された比による図１２Ｂにおける結果の代替構成を示す図である。 図９Ａ、９Ｂ、１０および１１Ａに提示されている結果の比較を示す図である。図１３は、化学修飾されたガイドＲＮＡについての、Ｃａｓ系において標的ポリヌクレオチドを切断するために使用されたときの標的特異性に関する研究からの、いくつかの傾向を示す図である。これらの傾向によって裏付けられる概念は、オフターゲットポリヌクレオチドもＣａｓ系に存在するとき特に有用である。 Ｋ５６２細胞におけるＩＬ２ＲＧ－ｓｇＲＮＡおよびＶＥＧＦＡ－ｓｇＲＮＡの種々のタイプの修飾の影響を示す図である。 ヒトＫ５６２細胞におけるＨＢＢ遺伝子の相同性指向修復（ＨＤＲ）の結果を示す図である。 修飾または非修飾ｓｇＲＮＡについてＨＢＢオンターゲット部位およびオフターゲット部位でのインデルの形成を測定した結果を示す図である。 増幅されたＤＮＡ遺伝子座（ＰＣＲ）または捕捉されたＤＮＡ遺伝子座（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ）のディープシークエンシング分析結果を示す図である。

Claims (36)

  1. （ａ）（ｉ）ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダ
    イズすることができるガイド配列、（ｉｉ）ステム配列を含むｃｒＲＮＡセグメントと、
    （ｂ）前記ステム配列に部分的または完全に相補的であるヌクレオチド配列を含むｔｒ
    ａｃｒＲＮＡセグメントと
    を含む合成ガイドＲＮＡであって、
    前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレオチドからなり、Ｎが、－１０から６の間の整数で
    あり、
    前記ガイド配列が、前記ガイド配列の４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に位置する少
    なくとも１つの修飾を含む、合成ガイドＲＮＡ。
  2. 単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１に記載の合成ガイドＲＮＡ。
  3. ＰＡＭ部位に隣接する標的配列を含む標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズすること
    ができるガイド配列を含む合成ｃｒＲＮＡであって、前記ガイド配列が、２０－Ｎヌクレ
    オチドからなり、Ｎが、－１０から６の間の整数であり、前記ガイド配列が、前記ガイド
    配列の４－Ｎ～２０－Ｎのいずれかの位置に位置する少なくとも１つの修飾を含む、合成
    ｃｒＲＮＡ。
  4. 前記少なくとも１つの修飾が、位置４－Ｎ、５－Ｎ、７－Ｎ、９－Ｎ、１０－Ｎ、１１
    －Ｎ、１４－Ｎまたは１６－Ｎに位置する、請求項１～３のいずれか１項に記載の合成ガ
    イドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  5. 前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイド配列の位置５－Ｎもしくは１１－Ｎ、または
    それらの組合せに位置する、請求項１～４のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまた
    はｃｒＲＮＡ。
  6. 前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間連結修飾であり、位置１５－Ｎが、２’
    －Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）または２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホ
    ノ酢酸（ＭＳＰ）を含まない、請求項１～５のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡま
    たはｃｒＲＮＡ。
  7. 前記少なくとも１つの修飾が、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結、キラルホスホ
    ロチオエートヌクレオチド間連結、ホスホロジチオエートヌクレオチド間連結、ボラノホ
    スホネートヌクレオチド間連結、Ｃ１－４アルキルホスホネートヌクレオチド間連結、ホ
    スホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、ホスホノカルボン酸エステルヌクレオチド間連結
    、チオホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、およびチオホスホノカルボン酸エステル
    ヌクレオチド間連結から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の合成ガイドＲ
    ＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  8. 前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノカルボン酸ヌクレオチド間連結、チオホスホノ
    カルボン酸ヌクレオチド間連結、修飾された塩基、およびＣ３’－エンド糖パッカー構成
    を付与する２’修飾、またはそれらの組合せから選択される、請求項１～７のいずれか１
    項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  9. 前記少なくとも１つの修飾が、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）またはチオホス
    ホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の合成
    ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  10. 前記２’修飾が、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、および２’－Ｏ－（２－メトキ
    シエチル）から選択される、請求項８に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  11. 前記少なくとも１つの修飾が、２’－デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－
    Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ
    酢酸（ＭＰ）および２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）から選択され
    る、請求項１～１０のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  12. 前記ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡの５’末端、３’末端または両末端に１つまたは複
    数の修飾をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたは
    ｃｒＲＮＡ。
  13. ５’末端、３’末端または両末端での前記少なくとも１つまたは複数の修飾が、２’－
    Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）、ホスホノ酢酸ヌクレ
    オチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ）、２’－Ｏ－メチル
    －３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホノ酢酸（ＭＰ）
    、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－デオキシ－３’－ホス
    ホノ酢酸（ＤＰ）、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸（ＤＳＰ）またはそれ
    らの組合せから独立に選択される、請求項１２に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮ
    Ａ。
  14. 前記少なくとも１つの修飾が、修飾された塩基を含む、請求項１～１３のいずれか１項
    に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  15. 前記修飾された塩基が、２－チオＵ、２－チオＣ、４－チオＵ、６－チオＧ、２－アミ
    ノＡ、２－アミノプリン、シュードウラシル、ヒポキサンチン、７－デアザグアニン、７
    －デアザ－８－アザグアニン、７－デアザアデニン、７－デアザ－８－アザアデニン、５
    －メチルＣ、５－メチルＵ、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ヒドロキシメチルウラ
    シル、５，６－デヒドロウラシル、５－プロピニルシトシン、５－プロピニルウラシル、
    ５－エチニルシトシン、５－エチニルウラシル、５－アリルＵ、５－アリルＣ、５－アミ
    ノアリルＵ、５－アミノアリルＣ、脱塩基ヌクレオチド、ＵＮＡ塩基、イソＣ、イソＧ、
    ５－メチル－ピリミジン、ｘ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、ｙ（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、およ
    びそれらの組合せから選択される、請求項１４に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮ
    Ａ。
  16. 前記少なくとも１つの修飾が、２－チオＵおよび２－アミノＡから選択される、請求項
    １５に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  17. 前記少なくとも１つの修飾が、修飾された糖を含む、請求項１～１６のいずれか１項に
    記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  18. 前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－Ｃ１－４アルキル、２’－Ｏ－Ｃ１－３アル
    キル－Ｏ－Ｃ１－３アルキル、２’－デオキシ、２’－Ｆ、２’－ＮＨ２、２’－アラビ
    ノ、２’－Ｆ－アラビノ、２’－ＬＮＡ、２’－ＵＬＮＡおよび４’－チオリボシルから
    選択される、請求項１７に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  19. 前記少なくとも１つの修飾が、
    （ａ）２’－デオキシリボース、２’－デオキシ－２’－フルオロアラビノフラノシル
    、２’－デオキシ－２’－フルオロリボフラノシル、２’－Ｏ－フェニル、２’－チオフ
    ェニル、２’－Ｓ－チオフェニル、２’－メチル、２’－エチル、２’－プロピル、２’
    －アリル、２’－アリルフェニル、２’－メチルヒドロキシ、２’－メチルオキシメチル
    、２’－Ｏ－カルバミン酸、２’－Ｏ－エチルアミノ、２’－Ｏ－アリルアミノ、２’－
    Ｏ－プロピルアミノもしくは２’－Ｏ－置換フェニル；
    （ｂ）ホスホノ酢酸、チオホスホノ酢酸、ホスホノプロピオン酸、チオホスホノプロピ
    オン酸、メチルホスホネート、メチルチオホスホネート、もしくはボラノホスホネート；
    または
    （ｃ）（ａ）と（ｂ）の組合せ
    を含む、請求項１７に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  20. 前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子、ＩＬ２ＲＧ遺伝子、またはＶＥＧＦＡ遺
    伝子内に位置する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒ
    ＲＮＡ。
  21. 前記標的ポリヌクレオチドが、ＨＢＢ遺伝子のＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＴＡＡ、
    ＩＬ２ＲＧ遺伝子のＴＡＡＴＧＡＴＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡ、またはＶＥＧＦＡ遺伝子のＧ
    ＡＧＴＧＡＧＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の合成
    ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  22. 前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり、５’末端、３’末端ま
    たは両末端に、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、ホスホロチオエートヌクレオチド間連結（Ｓ）
    、ホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（Ｐ）、チオホスホノ酢酸ヌクレオチド間連結（ＳＰ
    ）、２’－Ｏ－メチル－３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、２’－Ｏ－メチル－３’－
    ホスホノ酢酸（ＭＰ）、２’－Ｏ－メチル－３’－チオホスホノ酢酸（ＭＳＰ）、２’－
    デオキシ－３’－ホスホノ酢酸（ＤＰ）、２’－Ｏ－デオキシ－３’－チオホスホノ酢酸
    （ＤＳＰ）およびそれらの組合せから独立に選択される１つまたは複数の修飾を含む、請
    求項２０または２１に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ。
  23. ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を増強する方法であって、
    標的ポリヌクレオチドを選択するステップと；
    請求項１～２２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡを用意する
    ステップと；
    Ｃａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体
    を形成するステップと；
    前記ｇＲＮＡの前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、およびＣＲＩ
    ＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記標的ポリヌクレオチドを前記ｇＲＮＡ
    ：Ｃａｓタンパク質複合体と接触させるステップと
    を含み、
    前記Ｃａｓタンパク質が、タンパク質として、または前記Ｃａｓタンパク質をコードす
    るポリヌクレオチドとして用意される、方法。
  24. 前記ポリヌクレオチオチド標的の前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質複合体との前記接触
    が、細胞内で実施され、前記複合体の前記形成が、細胞外または内で実施される、請求項
    ２３に記載の方法。
  25. 前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項２３または２４に記載の
    方法。
  26. 前記形成が、細胞外で実施される、請求項２３～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＣＲＩＳＰＲ機能が、ゲノム編集であり、少なくとも一本鎖または二本鎖ポリＤＮ
    Ａポリヌクレオチドを相同性指向修復のためのドナー鋳型として用意することをさらに含
    む、請求項２３～２６のいずれか１項に記載の方法。
  28. 請求項１～２７のいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なる合成ｃｒＲＮＡを含む
    、ガイドＲＮＡのセットまたはライブラリー。
  29. 請求項１～２８のいずれか１項に記載の少なくとも２つの異なる合成ｃｒＲＮＡを含む
    、ｃｒＲＮＡのセットまたはライブラリー。
  30. 請求項１～２９のいずれか１項に記載の合成ガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡを含むキッ
    ト。
  31. 請求項１～３０のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成ガイドＲＮＡまたはｃｒ
    ＲＮＡを含むマイクロアレイ。
  32. ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を分析するための方法で方法であって、
    （１）標的配列を含む標的ポリヌクレオチドと（２）オフターゲット配列を含む１つま
    たは複数のオフターゲットポリヌクレオチドとを含むサンプルを用意するステップと；
    前記標的配列のための請求項１～３１のいずれか１項に記載の少なくとも１つの合成ガ
    イドＲＮＡを用意するステップと；
    タンパク質としてまたは前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドとして用
    意されるＣａｓタンパク質と前記合成ガイドＲＮＡとを含むｇＲＮＡ：Ｃａｓタンパク質
    複合体を形成するステップと；
    前記ｇＲＮＡの前記標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション、およびＣＲＩ
    ＳＰＲ機能の遂行をもたらすための条件下で、前記サンプルと前記ｇＲＮＡ：Ｃａｓタン
    パク質複合体とを接触させるステップと；
    前記標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイトと、１つまた
    は複数のオフターゲットポリヌクレオチドとハイブリダイズするように設計されたベイト
    とを含む、オリゴヌクレオチドベイトのライブラリーを添加して、前記標的ポリヌクレオ
    チドおよび前記１つまたは複数のオフターゲットポリヌクレオチドを捕捉するステップと
    ；
    前記捕捉された標的ポリヌクレオチドおよび前記捕捉されたオフターゲットポリヌクレ
    オチドを単離および分析して、前記ＣＲＩＳＰＲ機能に起因する変化を同定し、前記標的
    ポリヌクレオチドおよび前記オフターゲットポリヌクレオチドにおける相対変化を判定し
    、それによって前記ＣＲＩＳＰＲ機能の特異性を評価するステップと
    を含む方法。
  33. 前記捕捉された標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドが、シー
    クエンシングによって分析される、請求項３２に記載の方法。
  34. オリゴヌクレオチドベイトの前記ライブラリーが、溶液中で供給され、前記ベイトの前
    記標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーシ
    ョンが、溶液中で行われる、請求項３２または３３に記載の方法。
  35. オリゴヌクレオチドベイトの前記ライブラリーが、固相支持体上に供給され、前記ベイ
    トの前記標的ポリヌクレオチドおよびオフターゲットポリヌクレオチドとのハイブリダイ
    ゼーションが、固相支持体上で行われる、請求項３２または３３に記載の方法。
  36. 前記オリゴヌクレオチドベイトが、前記標的配列または前記オフターゲット配列とでは
    なく、前記標的ポリヌクレオチド内の前記標的配列の１キロベース（ｋｂ）以内の配列、
    または前記オフターゲットポリヌクレオチドの１ｋｂ以内の配列とハイブリダイズするこ
    とができるベイトを含む、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
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