KR102129148B1

KR102129148B1 - 올리고뉴클레오티드를 접합하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR102129148B1
Application number: KR1020147035692A
Authority: KR
Inventors: 켄네스 더블유 힐; 빅토르 알 모클러
Original assignee: 애질런트 테크놀로지스, 인크.
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2013-04-29
Publication date: 2020-07-01
Also published as: JP2015520766A; CN110156844A; EP2852602B1; EP3747891A3; JP6515222B2; LT2852602T; KR20150013854A; WO2013176844A1; EP2852602A1; JP6351577B2; JP2018123133A; CN104321332A; US9512163B2; EP2852602A4; EP3747891A2; US20150133631A1

Abstract

본 발명은 하기 화학식 A의 올리고뉴클레오티드 유도체, 및 올리고뉴클레오티드 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 제조 방법은 아미노 또는 티올 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유도체를 합성하는 단계; 및 3,4-다이알콕시사이클로부텐-1,2-다이온을 올리고뉴클레오티드 유도체와 반응시켜 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-접합체를 제조하는 단계를 포함한다:
화학식 A

상기 식에서,
R³은 제1 올리고뉴클레오티드이고;
R¹은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 폴리에틸렌 글리콜, 펩티드, 단백질, 다당류 및 제2 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R²는 연결기 또는 직접 결합이고;
Z¹은 NR⁴, S 또는 O이고;
Z²는 NR⁴ 또는 S이고;
R⁴는 H, 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴로부터 선택된다.

Description

올리고뉴클레오티드를 접합하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR CONJUGATING OLIGONUCLEOTIDES}

본 발명은 일반적으로 올리고뉴클레오티드의 시약, 합성 및 정제의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 올리고뉴클레오티드 유도체의 조성물, 및 올리고뉴클레오티드를 접합하는 방법에 관한 것이다.

우선권 주장 및 관련 특허출원

본원은 2012년 5월 21일자 출원된 미국 가출원 제61/649,766호를 우선권 주장하고, 이의 전체 내용은 그대로 본원에 참고로서 혼입된다.

많은 방법이 올리고뉴클레오티드를 다른 분자와 접합하는데 이용가능하다. 이러한 방법은 전형적으로 올리고뉴클레오티드와 커플링되는 표적체 상의 반응성 잔기의 부착을 포함한다. 표적체는 통상적으로 유기 합성 방법에 의해 종종 개별적으로 제조되고, 사용 전에 정제된다.

각각의 경우에, 올리고뉴클레오티드는 표적체 상의 반응성 잔기와의 반응을 위한 적절한 작용기에 의해 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 변형은 종종 특수한 포스포라미디트 및/또는 변형된 염기를 제조하고 이를 목적 지점에서 올리고뉴클레오티드 서열에 혼입시킴으로써 달성된다. 다수의 이러한 아미디트 시약은 올리고뉴클레오티드로의 이러한 시약의 커플링을 위해 보호기를 필요로 하는 작용기를 함유한다. 이러한 보호기는 후속 접합 반응이 일어나기 전에 제거되어야 한다. 다르게는, 표적체 상의 반응성 잔기는 올리고뉴클레오티드로의 접합 전에 생성될 수 있다.

현재의 커플링 화학반응의 대부분은 하나 이상의 접합 파트너의 가수분해적으로 및/또는 산화적으로 불안정한 종의 사용 또는 생성을 포함한다. 이는 올리고뉴클레오티드(또는 단백질, 또는 임의의 유기 불용성/수용성 종)와의 접합에 요구되는 조건(전형적으로 수용액 중) 하에 문제가 된다.

보다 최근의 접합 화학반응은 반응 시 신규한 구조를 생성할 수 있다. 예를 들어, 피켄(Pieken) 등에 허여된 미국특허 제6,737,236호는 생체분자의 접합을 위한 환첨가 반응을 개시한다. 하나의 예로서, 알카인과 아지드 사이의 1,3-양극성 환첨가 접합(이후에 문헌[Sharpless et. al. Angew. Chem. Int. Ed. 40: 2004 (2001)]에 의해 일반적인 용어 "클릭(Click)" 화학반응으로 표지됨)은 접합 생성물의 부분으로서 치환된 트라이아진을 생성한다. 이러한 신규한 화학물질은 올리고뉴클레오티드 접합체가 인간에 사용되는 경우, 신규한 화학물질이 올리고뉴클레오티드 생성물과 관련이 없는 독성을 야기할 수 있으므로 문제가 될 수 있다.

본 발명의 하나의 양상은 하기 화학식 A의 올리고뉴클레오티드 유도체에 관한 것이다:

[화학식 A]

상기 식에서,

R³은 제1 올리고뉴클레오티드이고;

R¹은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 헤테로사이클릴, 헤테로아릴, 폴리에틸렌 글리콜, 펩티드, 단백질, 다당류 및 제2 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되고;

R²는 연결기 또는 직접 결합이고;

Z¹은 NR⁴, S 또는 O이고;

Z²는 NR⁴ 또는 S이고;

R⁴는 H, 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 및 헤테로아릴로부터 선택된다.

본 발명의 일부 양태에서, R²는 제1 올리고뉴클레오티드 상의 핵염기 상의 5' 하이드록시 기, 3' 하이드록시 기 또는 환외 아미노 기에 부착된 (C₁-C₁₂) 연결기이다. 본 발명의 일부 양태에서, Z²는 NH이다. 본 발명의 일부 양태에서, R¹은 (C₁-C₁₂) 알킬이고, Z¹은 O이다.

본 발명의 일부 양태에서, R¹은 1K 내지 40K 폴리에틸렌 글리콜이고, Z¹은 NH이다. 본 발명의 일부 양태에서, R¹은 제2 올리고뉴클레오티드이고, Z¹은 NH이고, 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 올리고뉴클레오티드에 상보적일 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 올리고뉴클레오티드를 접합하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 양태에 따른 방법은 아미노 또는 티올 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유도체를 합성하는 단계; 및 3,4-다이알콕시사이클로부텐-1,2-다이온을 올리고뉴클레오티드 유도체와 반응시켜 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-접합체를 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일부 양태에서, 방법은 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-접합체를 폴리에틸렌 글리콜, 펩티드, 단백질, 다당류 및 제2 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 표적체와 반응시키는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 유도체의 제2 위치에서 제2 아미노 또는 티올 기를 포함하고, 상기 방법은 환형 구조를 생성하는 올리고뉴클레오티드 내 가교결합을 형성하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 양상 및 이점은 하기 명세서 및 첨부된 특허청구범위로부터 명백할 것이다.

도 1은 스쿠아르산, 및 스쿠아르산과의 다양한 반응을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 하나의 양태에 따른 변형된 올리고뉴클레오티드와 스쿠아르산 다이에스터 사이의 반응을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 하나의 양태에 따른 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-부가물과 표적체(예컨대, R-NH₂)의 접합을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 하나의 양태에 따른 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-부가물과 다양한 표적체의 접합을 나타낸다.
도 5는 상기 스쿠아레이트 커플링 과정을 사용하는 2개의 상보적인 RNA 가닥(5' 아민을 갖는 하나 및 3' 아민을 갖는 다른 하나)을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 양태에 따른 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-부가물과 다양한 부차적인 아민 표적체의 접합을 나타낸다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 사용된 화학, 생화학, 유전학 및 분자 생물학의 용어 및 기호는 당해 분야의 표준 논문 및 교과서(예컨대, 문헌[Kornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992)]; 문헌[Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975)]; 문헌[Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999)]; 문헌[Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991)]; 문헌[Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)]; 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)] 등)의 용어 및 기호에 따른다. 그럼에도 불구하고, 특정 용어는 참고의 명확성 및 용이성을 위하여 하기 정의된다.

본원에 사용된 용어 "뉴클레오시드"는 변형되거나 천연 발생된 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오시드 또는 이들의 임의의 화학적 변형을 지칭한다. 뉴클레오시드의 변형은 비제한적으로, 2'-, 3'- 및 5'-위치 당 변형, 5- 및 6-위치 피리미딘 변형, 2-, 6- 및 8-위치 푸린 변형, 환외 아민에서의 변형, 5-브로모-우라실의 치환 등을 포함한다. 뉴클레오시드는 적절히 보호되거나 유도체화되어 당해 분야에 공지된 방법, 예컨대 뉴클레오시드 포스포라미디트 단량체, H-포스폰에이트 커플링 또는 포스페이트 트라이에스터 커플링을 사용하는 고체 상 자동화된 합성에 의한 올리고뉴클레오티드 합성을 가능하게 한다.

본원에 사용된 용어 "뉴클레오티드"는 변형되거나 천연 발생되는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 5'-, 2'- 또는 3'-위치에 부착된 하나 또는 다수의 포스페이트 또는 치환된 포스페이트를 갖는 상기 정의된 뉴클레오시드이다. 뉴클레오티드는 전형적으로 푸린 및 피리미딘을 포함하고, 이들은 티미딘, 시티딘, 구아노신, 아데닌 및 우리딘을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 상기한 바와 같은 다수의 연결된 뉴클레오티드 단위로부터 형성된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 단위는 각각 포스페이트 연결기를 통해 함께 연결된 뉴클레오시드 단위를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 포스페이트 연결기 외의 연결기, 예컨대 포스포로티오에이트 연결기를 통해 함께 연결된 다수의 뉴클레오티드를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 천연 발생되거나, 비-천연 발생될 수 있다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 1 내지 1,000개의 뉴클레오티드를 갖는다. 올리고뉴클레오티드는 합성될 수 있거나, 효소적으로 만들어 질 수 있고, 일부 양태에서, 길이가 10 내지 50개 뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 단량체(즉, 올리고리보뉴클레오티드일 수 있음) 또는 데옥시리보뉴클레오티드 단량체를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어, 길이가 10 내지 20개, 21 내지 30개, 31 내지 40개, 41 내지 50개, 51 내지 60개, 61 내지 70개, 71 내지 80개, 80 내지 100개, 100 내지 150개, 150 내지 200개, 200 내지 500개, 또는 500개 초과의 뉴클레오티드일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "알킬"은 탄소수 1 내지 24(즉, (C₁-C₂₄) 알킬), 전형적으로 1 내지 12(즉, (C₁-C₁₂) 알킬), 더욱 전형적으로 탄소수 1 내지 6(즉, (C₁-C₆) 알킬)의 포화 직쇄, 분지형 또는 환형 탄화수소, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-다이메틸부틸 및 2,3-다이메틸부틸을 지칭한다. 용어 "저급 알킬"은 탄소수 1 내지 6의 알킬 기를 의미하고, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 3-메틸펜틸, 2,2-다이메틸부틸 및 2,3-다이메틸부틸을 포함한다. 용어 "사이클로알킬"은 환형 알킬 기, 예컨대 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸 및 사이클로옥틸을 지칭한다.

본원에 사용된 "알킬렌" 및 "알킬렌 쇄"는 분자의 나머지를 라디칼 기에 연결하고, 탄소 및 수소만으로 이루어지고, 불포화를 함유하지 않고, 탄소수 1 내지 12, 바람직하게는 탄소수 1 내지 8의 직쇄 또는 분지형 2가 탄화수소 쇄, 예컨대, 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, n-부틸렌 등을 지칭한다. 알킬렌 쇄는 쇄 내의 하나의 탄소 또는 쇄 내의 임의의 2개의 탄소를 통해 분자의 나머지 및 라디칼 기에 부착될 수 있다.

또한, 용어 "알킬"은 "변형된 알킬"을 포함하고, 이는 탄소수 1 내지 24(C₁-C₂₄)이고, 에터-, 티오-, 아미노-, 포스포-, 옥소-, 에스터- 및 아미도-로부터 선택되는 하나 이상의 연결기와 같은 부가적인 기를 추가로 갖고/거나, 저급 알킬, 아릴, 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 아미노, 설폰일, 티오, 머캡토, 이미노, 할로, 시아노, 니트로, 니트로소, 아지드, 카복시, 설파이드, 설폰, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시 및 보론일을 비롯한 하나 이상의 부가적인 기로 치환되는 알킬 기를 지칭한다.

유사하게, 용어 "저급 알킬"은 "변형된 저급 알킬"을 포함하고, 이는 탄소수 1 내지 8이고, 에터-, 티오-, 아미노-, 포스포-, 케토-, 에스터- 및 아미도-로부터 선택되는 하나 이상의 연결기와 같은 부가적인 기를 추가로 갖고/거나, 저급 알킬, 아릴, 알콕시, 티오알킬, 하이드록실, 아미노, 설폰일, 티오, 머캡토, 이미노, 할로, 시아노, 니트로, 니트로소, 아지드, 카복시, 설파이드, 설폰, 설폭시, 포스포릴, 실릴, 실릴옥시 및 보론일을 비롯한 하나 이상의 부가적인 기로 치환되는 기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "알콕시"는 R이 상기 정의된 알킬인 치환기 -O-R을 지칭한다. 용어 "저급 알콕시"는 R이 저급 알킬인 알콕시 기를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "티오알킬"은 R이 상기 정의된 알킬인 치환기 -S-R을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "아릴"은 탄소수 6 내지 19((C₆-C₁₉) 아릴), 바람직하게는 탄소수 6 내지 10((C₆-C₁₀) 아릴)의 탄소 및 수소만으로 이루어진 방향족 단환형 또는 다환형(이들 중 일부는 함께 융합될 수 있음) 탄화수소 고리 시스템을 지칭하고, 상기 고리 시스템은 부분적으로 또는 완전히 포화될 수 있다. 아릴 기는, 비제한적으로 플루오렌일, 페닐 및 나프틸과 같은 기를 포함한다. 명세서에 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "아릴"은 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌, -O-R", -O-CO-R", -CO-O-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R", -R-O-R", -R-O-CO-R", -R-CO-O-R", -R-NR'-R", -R-NR'-CO-R", -R-CO-NR'-R", -R-CO-R", -CN, 할로겐 및 이들의 조합(이때, R' 및 R"는 독립적으로 H 또는 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌이고, R은 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌임)으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 아릴 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"을 탄소 원자 및 질소, 산소 및 황으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 헤테로원자로 이루어진 5- 내지 18-원 단환형- 또는 이환형- 또는 융합된 다환형-고리 시스템을 지칭한다. 바람직하게는 헤테로아릴은 5- 내지 12-원 또는 5- 내지 9-원 고리 시스템이다. 본 발명의 목적을 위하여, 헤테로아릴 라디칼은 단환형, 이환형, 삼환형 또는 사환형 고리 시스템일 수 있고, 이는 융합되거나 가교된 고리 시스템을 포함할 수 있고, 헤테로아릴 라디칼 내의 질소, 탄소 또는 황 원자는 선택적으로 산화될 수 있고; 질소 원자는 선택적으로 4차화될 수 있다. 예는, 비제한적으로, 아제핀일, 아크리딘일, 벤즈이미다졸릴, 벤즈티아졸릴, 벤즈인돌릴, 벤조티아다이아졸릴, 벤조나프토푸란일, 벤족사졸릴, 벤조다이옥솔릴, 벤조다이옥신일, 벤조피란일, 벤조피라노닐, 벤조푸란일, 벤조푸라노닐, 벤조티엔일(벤조티오페닐), 벤조트라이아졸릴, 벤조[4,6]이미다조[1,2-a]피리딘일, 카바졸릴, 신놀린일, 다이벤조푸란일, 푸란일, 푸라노닐, 이소티아졸릴, 이미다졸릴, 인돌릴, 인다졸릴, 이소인돌릴, 인돌린일, 이소인돌린일, 인돌리진일, 이속사졸릴, 나프티리딘일, 옥사다이아졸릴, 2-옥소아제핀일, 옥사졸릴, 옥시란일, 펜아진일, 페노티아진일, 페녹사진일, 프탈라진일, 프테리딘일, 푸린일, 피롤릴, 피라졸릴, 피리딘일, 피라진일, 피리미딘일, 피리다진일, 퀴나졸린일, 퀴녹살린일, 퀴놀린일, 퀴누클리딘일, 이소퀴놀린일, 티아졸릴, 티아다이아졸릴, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 트라이아진일 및 티오페닐을 포함한다. 명세서에 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "헤테로아릴"은 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌, -O-R", -O-CO-R", -CO-O-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R", -R-O-R", -R-O-CO-R", -R-CO-O-R", -R-NR'-R", -R-NR'-CO-R", -R-CO-NR'-R", -R-CO-R", -CN, 할로겐 및 이들의 조합(이때, R' 및 R"는 독립적으로 H 또는 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌이고, R은 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌임)으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 상기 정의된 헤테로아릴 라디칼을 포함하는 것을 의미한다.

용어 "헤테로아릴"은 또한 헤테로방향족 고리가 하나 이상의 아릴, 지환족 또는 헤테로사이클릴 고리에 융합되고, 부착 라디칼 또는 지점이 헤테로방향족 고리 상인 기를 지칭한다. 비제한적인 예는 비제한적으로 1-, 2-, 3-, 5-, 6-, 7-, 또는 8-인돌리진일, 1-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-이소인돌릴, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-인돌릴, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-인다졸릴, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-푸린일, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8- 또는 9-퀴놀리진일, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-퀴놀린일, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-이소퀴놀린일, 1-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-프탈라진일, 2-, 3-, 4-, 5- 또는 6-나프티리딘일, 2-, 3-, 5-, 6-, 7- 또는 8-퀴나졸린일, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-신놀린일, 2-, 4-, 6- 또는 7-프테리딘일, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-4aH 카바졸릴, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-카바졸릴, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-카볼린일, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-페난트리딘일, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-아크리딘일, 1-, 2-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-페리미딘일, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 8-, 9- 또는 10-페나트롤린일, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8- 또는 9-페나진일, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-페노티아진일, 1-, 2-, 3-, 4-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-페녹사진일, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- 또는 10-벤즈이소퀴놀린일, 2-, 3-, 4- 또는 티에노[2,3-b]푸란일, 2-, 3-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10- 또는 11-7H-피라지노-[2,3-c]카바졸릴, 2-, 3-, 5-, 6- 또는 7-2H-푸로[3,2-b]-피란일, 2-, 3-, 4-, 5-, 7- 또는 8-5H-피리도[2,3-d]-o-옥사진일, 1-, 3- 또는 5-lH-피라졸로[4,3-d]옥사졸릴, 2-, 4- 또는 5-4H-이미다조[4,5-d]티아졸릴, 3-, 5- 또는 8-피라지노[2,3-d]피리다진일, 2-, 3-, 5- 또는 6-이미다조[2,l-b]티아졸릴, 1-, 3-, 6-, 7-, 8- 또는 9-푸로[3,4-c]신놀린일, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 8-, 9-, 10- 또는 11-4H-피리도[2,3-c]카바졸릴, 2-, 3-, 6- 또는 7-이미다조[1,2-b][1,2,4]트라이아진일, 7-벤조[b]티엔일, 2-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤즈옥사졸릴, 2-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤즈이미다졸릴, 2-, 4-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤조티아졸릴, 1-, 2-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- 또는 9-벤즈옥사핀일, 2-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-벤즈옥사진일, 1-, 2-, 3-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10- 또는 11-lH-피롤로[1,2-b][2]벤즈아자핀일을 포함한다. 전형적인 융합된 헤테로아릴 기는, 비제한적으로 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-퀴놀린일, 1-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- 또는 8-이소퀴놀린일, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-인돌릴, 2-, 3-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤조[b]티엔일, 2-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤즈옥사졸릴, 2-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤즈이미다졸릴, 2-, 4-, 5-, 6- 또는 7-벤조티아졸릴을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알킬"은 탄소수 3 내지 15, 바람직하게는 탄소수 3 내지 12((C₃-C₁₂) 사이클로알킬)의, 탄소 및 수소 원자만으로 이루어지고 포화되거나 불포화되고 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착되는 안정한 비-방향족 단환형 또는 이환형 탄화수소 라디칼, 예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 데칼린일 등을 지칭한다. 명세서에 구체적으로 달리 언급되지 않는 한, 용어 "사이클로알킬"은 -O-R", -O-CO-R", -CO-O-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R", -CN, 할로겐 및 이들의 조합(이때, R' 및 R"는 독립적으로 H 또는 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌임)으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 사이클로알킬 라디칼을 포함함을 의미한다.

본원에 사용된 용어 "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클"은, 예컨대 하나 이상의 탄소-함유 고리 내에 하나 이상의 헤테로원자를 갖는, 4- 내지 7-원 단환형, 7- 내지 12-원 이환형 또는 10- 내지 15-원 삼환형 고리 시스템인 선택적으로 치환되거나 포화되거나 부분적으로 불포화된 비-방향족 환형 기를 지칭한다. 헤테로원자를 함유하는 헤테로환형 기의 각각의 고리는 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자로부터 선택된 1, 2, 3 또는 4개의 헤테로원자를 가질 수 있고, 이때 질소 및 황 헤테로원자는 또한 선택적으로 산화될 수 있다. 헤테로환형 기는 헤테로원자 또는 탄소 원자에 부착될 수 있다. 본원에 기술된 헤테로환형 고리는 생성된 화합물이 안정하다면 탄소 또는 질소 원자 상에서 치환될 수 있다. 구체적으로 언급되는 경우, 헤테로사이클 내의 질소는 선택적으로 4차화될 수 있다. 헤테로사이클 내의 S 및 O 원자의 총 수가 1을 초과하는 경우, 이러한 헤테로원자는 서로 인접하지 않는 것이 바람직하다. 이환형 및 삼환형 헤테로사이클릴 기는 융합되거나 스피로 고리 또는 고리 기일 수 있다. 바람직하게는, 헤테로사이클릴은 4- 내지 12-원 고리 시스템이다. 또한, 바람직하게는 헤테로사이클릴은 4- 내지 9-원 고리 시스템이다.

예시적인 단환형 헤테로환형 기는 옥세탄일, 티아탄일, 아제티딘일, 다이하이드로푸란일, 테트라하이드로푸란일, 다이하이드로티오페닐, 테트라하이드로티오페닐, 피롤리딘일, 다이하이드로피라졸릴, 테트라하이드로피라졸릴, 다이하이드로피리딘일, 테트라하이드로피리딘일, 다이하이드로티오피란일, 테트라하이드로티오피란일, 피란일, 다이하이드로피란일, 테트라하이드로피란일, 티오피란일, 다이하이드로티오피란일, 테트라하이드로티오피란일, 프테리딘일, 피페라진일, 모폴린일, 아제핀일, 다이하이드로아제핀일, 테트라하이드로아제핀일, 2-옥소피페라진일, 2-옥소피페리딘일, 2-옥소피롤로딘일, 2-옥소아제핀일, 옥세판일, 티에판일, 다이하이드로티에핀일, 테트라하이드로티에핀일, 다이하이드로옥세핀일, 테트라하이드로옥세핀일, 1,4-다이옥산일, 1,4-옥사티안일, 모폴린일, 옥사졸릴, 옥사졸리딘일, 이속사졸린일, A-프테리돈일, 이속사졸린일, 이속사졸릴, 1,4-아자티안일, 1,4-옥사티에판일, 1,4-옥사아제판일, 1,4-다이티에판일, 1,4-티에아제판일, 1,4-다이아제판일, 트로판일, 3,4-다이하이드로-2H-피란일, 5,6-다이하이드로-2H-피란일, 티아졸리딘일, 티아모폴린일, 티아모폴린일 설폭사이드, 티아모폴린일 설폰, 1,3-다이옥솔란 및 테트라하이드로-1,1-다이옥소티엔일, 1,1,4-트라이옥소-1,2,5-티아다이아졸리딘-2-일, 피라졸린일 등을 포함한다.

예시적인 이환형 헤테로환형 기는, 비제한적으로, 다이하이드로인돌릴, 퀴누크티딘일, 테트라하이드로퀴놀린일, 데카하이드로퀴놀린일, 2-옥사-6-아자스피로[3,3]헵탄-6-일, 테트라하이드로이소퀴놀린일, 데카하이드로이소퀴놀린일, 다이하이드로이소인돌릴, 인돌린일, 노보란일, 아다만탄일 등을 포함한다.

명세서에 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 용어 "헤테로사이클릴"은 -O-R", -O-CO-R", -CO-O-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R", -CN, 할로겐 및 이들의 조합(이때, R' 및 R"는 독립적으로 H 또는 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌임)으로부터 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된, 상기 정의된 헤테로사이클릴 라디칼을 포함하는 것으로 의도된다.

본원에 사용된 용어 "직접 결합"은 "직접 결합"에 의해 연결된 2개의 독립체가 서로 직접 연결됨을 의미한다. 직접 결합은, 예를 들어 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "DNA" 또는 "데옥시리보핵산"은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "RNA" 또는 "리보핵산"은 하나 이상의 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "연결기"는 분자 내의 2개의 잔기를 가교한다. "연결기"는 치환기로 선택적으로 치환된 하이드로카빌 쇄(예컨대, (C₁-C₁₂) 알킬렌, (C₂-C₁₂) 알켄일렌)일 수 있거나, 연결기는, -(CHR')_a-W_b-(CHR')_c-V_d-(CHR')_e-(이때, W 및 V는 독립적으로 -0-, -S- 또는 -NR-이고; R'는 H 또는 (C₁-C₆) 알킬이고; a, b, c, d 및 e는 독립적으로 0 내지 10, 바람직하게는 0 내지 6, 바람직하게는 0 내지 3의 정수이고, a, b, c, d 및 e의 합계는 바람직하게는 2 내지 6의 정수임)로 표시되는 바와 같이, 다른 원자와 함께 배치되는 하이드로카빌 쇄일 수 있다. 선택적인 치환기는 -O-R", -O-CO-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R", -CN, 할로겐 또는 이들의 조합(이때, R' 및 R"는 독립적으로 H 또는 (C₁-C₆) 하이드로카빌임)일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은 화학식 R-(0-CH₂-CH₂)_n-0-R'(이때, R 및 R'는 독립적으로 H 또는 알킬임)의 폴리에터 화합물을 지칭한다. "폴리에틸렌 글리콜 유도체"는 화학식 R-(0-CH₂-CH₂)_n-X-R'(이때, R 및 R'는 독립적으로 H 또는 알킬이고, X는 O 또는 NH임)의 폴리에터 화합물을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 연결된 다수의 아미노산을 함유하는 분자를 지칭한다. 폴리펩티드는 천연 단백질로부터 생성되거나 화학적으로 합성될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드를 함유하는 분자를 지칭한다. 단백질은 종종 천연 유래일 수 있지만, 천연 단백질로부터 변형된 것을 포함할 수 있다.

용어 "다당류" 또는 "폴리탄수화물(polycarbohydrate)"은 글리코시드 결합에 의해 연결된 다수의 당 잔기를 갖는 탄수화물 분자를 지칭한다.

"선택적인" 또는 "선택적으로"는 이어서 기술되는 상황이 발생할 수 있거나 발생할 수 없음을 의미하고, 이에 따라 기술내용은 상황이 발생하는 경우 및 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, 어구 "선택적으로 치환된"은 비-수소 치환기가 존재할 수 있거나 존재할 수 없음을 의미하고, 이에 따라 기술내용은 비-수소 치환기가 존재하는 구조 및 비-수소 치환기가 존재하지 않는 구조를 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 양태는 올리고뉴클레오티드와 다른 분자 또는 표적체를 접합하기 위한 방법에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA 또는 키메라 DNA/RNA를 포함한다. 표적체는 임의의 목적 표적, 예컨대 다른 올리고뉴클레오티드, 단백질/펩티드, 탄수화물 또는 지지체(가용성 중합체 또는 고체 지지체, 예컨대 수지, 유리 비드, 자기 비드, 매트릭스 표면 등을 포함할 수 있음)일 수 있다.

본 발명의 양태는 스쿠아르산 및 이의 유도체가 온화한 조건 하에 아미노 기와 용이하게 커플링될 수 있다는 사실에 기초한다. 이러한 접합 방법은 올리고뉴클레오티드 접합체를 생성하기 위한 간단한 수계 방법을 제공한다. 이러한 반응으로부터의 생성물은 안정하고, 용이하게 단리되고 저장될 수 있다. 또한, 스쿠아르산 유도체는 약제의 변형에 사용될 수 있고, 비-독성인 것으로 밝혀졌다.

도 1은 알콜과 반응하여 스쿠아르산 다이에스터를 제공할 수 있는 스쿠아르산(즉, 사이클로부텐 3,4-다이온)의 구조를 나타낸다. 에스터화는 카복실산의 통상적인 에스터화에서와 마찬가지로 산 촉매의 존재 하에 용이하게 발생할 수 있다. 스쿠아르산 에스터는, 예컨대 친핵체로서 아민에 의해 용이하게 발생하여 상응하는 모노아미드 또는 다이아미드를 제공할 수 있다. 이러한 특성은 특성을 변화시키기 위한 생물학적 분자의 변형을 비롯한 많은 적용 분야에 사용될 수 있다.

에스터 외에, 친핵체(예컨대, 아미노 기 또는 티올 기)와 반응하는데 또한 사용될 수 있는 스쿠아르산 유도체는 스쿠아르산 할라이드, 스쿠아르산 에스터 할라이드 및 스쿠아르산 이미다졸을 포함한다. 이러한 모든 스쿠아르산 유도체가 본 발명의 양태에 사용될 수 있고, 이러한 모든 시약이 아미노 또는 티올 작용기를 갖는 올리고뉴클레오티드와 반응할 수 있다. 본 발명의 양태는 바람직하게는 시약으로서 스쿠아르산 다이에스터를 사용한다.

스쿠아르산 유도체의 사용이 소분자와의 접합 및 단백질 또는 탄수화물로의 소분자의 접합을 위해 기술되었다. 20K 다당류와 같은 대분자를 단백질로 커플링시키는 것이 또한 사용되었다. 또한, 글루센캄프(Glusenkamp) 등에 허여된 미국특허 제6,602,692호는 스쿠아르산 유도체에 의해 변형된 고체 지지체로 접합시키기 위한 스쿠아르산 유도체의 사용을 개시한다. 미국특허 제6,602,692호의 개시내용은 이의 전체내용이 참고로서 혼입된다.

본 발명의 양태는 임의의 상기 스쿠아르산 유도체를 사용할 수 있다. 바람직한 본 발명의 양태는 스쿠아르산 에스터(일반적으로 스쿠아레이트로 지칭됨)를 사용한다. 스쿠아르산 에스터는 2개의 에스터 기(-OR 기)가 동일하거나 상이할 수 있는 다이에스터이다.

다양한 분자를 접합하기 위한 스쿠아레이트의 사용이 공지되어 있지만, DNA 또는 RNA에 대한 접합을 위해 이러한 기술을 사용하는 어떠한 적용도 보고된 바 없다. 상당한 노력이 진단/연구 시약 또는 잠재적인 치료제로서 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 적용하는데 수행되었다. 약제로서 올리고뉴클레오티드의 잠재적인 적용의 예는 단백질의 발현을 예방하거나 다양한 세포 기능을 차단하기 위한 특정 코딩 영역에 결합할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 또한, SELEX 기술(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)(문헌[Tuerk and Gold, Science, 249:505 (1990)])의 개발은 거의 모든 생물학적 관심 표적에 결합할 올리고뉴클레오티드를 동정하는 것을 가능하게 한다.

약제로서 올리고뉴클레오티드의 잠재적인 사용은 이들의 치료 활성 및 안정성을 증가시키기 위한 다양한 화학적 변형의 추가 개발을 야기하였다. 이러한 변형은 올리고뉴클레오티드의 세포 침투 또는 뉴클레아제에 대한 이들의 내성을 증가시킬 수 있다. 또한, 이러한 변형은 표적으로의 올리고뉴클레오티드의 결합을 강화시킬 수 있거나, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선할 수 있다. 따라서, 다양한 적용을 위해 올리고뉴클레오티드를 용이하게 변형시킬 수 있는 방법이 바람직하다.

본 발명의 양태는 매우 온화한 조건 하에 올리고뉴클레오티드를 변형시키기 위한 방법을 제공하고, 이러한 방법은 올리고뉴클레오티드 약제의 변형에 적용하기에 적합하다. 본 발명의 양태에 따라서, 올리고뉴클레오티드 유도체(스쿠아르산 유도체와의 커플링을 위한 반응성 작용기를 함유함)는 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 스쿠아르산 유도체와의 커플링을 위한 반응성 작용기(예컨대, 아미노 기)와 합성될 수 있다. 반응성 작용기는, 예를 들어, 아미노 기 또는 티올 기일 수 있다.

올리고뉴클레오티드에 작용기를 부착하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다(검토를 위해, 문헌[Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1 :165-187 (1990)] 참고). 일단 화학적 반응성 작용기가 올리고뉴클레오티드(예컨대, 5'- 및/또는 3'-말단에서)에 부착되면, 이러한 반응성 작용기는 다양한 접합체와 커플링되기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 1차 지방족 아미노 기는 올리고뉴클레오티드의 합성의 최종 단계에서 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 혼입될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 연결하기 위한 시약은 시판 중이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 연결하기 위한 상이한 길이의 -(CH₂)_n- 결합기를 갖는 다양한 연결기가 이용가능하다. 하나의 예는 글렌 리서치 코포레이션(Glen Research Corp., 미국 버지니아주 스털링 소재)에서 시판 중인 5'-아미노-모디파이어 C6(5'-Amino-Modifier C6)이다. 올리고뉴클레오티드의 3' 말단을 위한 아미노 모디파이어가 또한 포스포라미디트로서 또는 합성 고체 지지체에 미리 부착되어 용이하게 이용가능하다.

반응성 작용기를 제공하기 위한 올리고뉴클레오티드를 변형시키기 위하여 사용된 시약은 포스포라미디트의 형태일 수 있고, 이는 고체 지지체에 부착되어 있으면서 전장 올리고뉴클레오티드의 유리 5'-하이드록실 기에 커플링될 수 있다. 이러한 커플링은 또한 다른 뉴클레오티드 단량체를 부착할 것이다(예컨대, 문헌[Theison et al, Tetrahedron Lett., 33:5033-5036 (1992)] 참고).

본 발명의 일부 양태에 따라서, 반응성 기(예컨대, 아미노 또는 티올 기)는 변형된 뉴클레오티드에 의해 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 이러한 경우에, 반응성 기가 5' 또는 3' 말단에 부착될 필요는 없다. 대신에, 이러한 변형된 뉴클레오티드 유사체를 반응성 기를 내부 위치에 혼입하는데 사용할 수 있다. 이러한 변형된 뉴클레오티드의 일부 예가 하기 제시된다:

상기 예에서, R¹은 H 또는 OH이다. 화학식 I은 천연 뉴클레오시드 또는 데옥시뉴클레오시드(R¹은 H 또는 OH임)를 나타내고, 화학식 II 내지 IV(이때, n은 0 초과의 정수임)는 당 고리 상에 반응성 아미노 기 변형을 갖는 다양한 유사체를 나타낸다. 이러한 아미노 기는 상기 유사체의 올리고뉴클레오티드로의 혼입 중에 보호될 것이다. 이러한 시약 중 일부는 시판 중이거나, 당해 분야에 공지된 과정에 따라 제조될 수 있다.

다른 변형된 뉴클레오티드 유사체는 하기 제시된 바와 같이, 푸린 또는 피리미딘 고리 상에 변형을 가질 수 있다:

상기 화학식 V 내지 X(이때, n은 0 초과의 정수임)은 반응성 아미노 기를 함유하는 뉴클레오티드 유사체의 예를 나타낸다. 이러한 유사체는 상기 아미노 기를 보호한 후 올리고뉴클레오티드에 혼입하는데 사용될 수 있다. 상기 시약의 일부는 시판 중이거나 당해 분야에 공지된 과정에 따라 제조될 수 있다.

일단 올리고뉴클레오티드가 반응성 작용기(예컨대, 아미노 또는 티올 기)에 의해 유도체화되는 경우, 이들은 스쿠아르산 유도체와 커플링되도록 사용될 수 있다. 하기 예는 본 발명의 일부 양태를 설명한다.

본 발명의 일부 양태에 따라서, 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-접합체는 올리고뉴클레오티드를 다른 표적체, 예컨대 펩티드, 단백질, 올리고당, 고체 표면, 중합체 물질, 나노입자, 하이드로젤 및 소분자에 부착하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 양태에 따라서, 상기 모노-접합체는 특정 목적을 위해 선택될 수 있는 다른 핸들과 커플링되도록 사용될 수 있다. 이러한 적용의 하나의 에는, 동일자로 출원된 공-계류 출원에 개시된, 친다이엔체-연결된 분자(예컨대, N-에틸 말레이미드)와의 딜스 알더(Diels Alder) 반응에 참여하도록, 다이엔 잔기(예컨대, 푸란)를 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노 부가물에 부착하는 것이다.

본원에 기술된 예가 스쿠아레이트와 접합하기 위하여 아미노 기를 사용하지만, 다른 친핵성 기(예컨대, 티올)가 또한 사용될 수 있음에 유의하여야 한다.

하나보다 많은 아민을 함유하는 종(예컨대, 다이아민, 트라이아민, 폴리아민)의 제한된 양에 의한 올리고뉴클레오티드 모노 스쿠아레이트의 처리는 다량체성 올리고뉴클레오티드 구조를 만들기 위한 수단을 제공할 것이다.

이러한 접합의 다른 적용은 환형 또는 헤어핀형 올리고뉴클레오티드 구조를 형성하기 위하여 2개의 아미노 표지된 올리고뉴클레오티드를 함께 커플링하는 것일 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 하나의 가닥 상의 3' 아미노 표지 및 다른 가닥 상의 5' 아미노 표지를 갖는 상보적 서열일 수 있다. 이는 헤어핀형 이량체를 형성할 것이다.

본 발명의 이점은 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 본 발명의 양태는 올리고뉴클레오티드를 다양한 표적체에 접합하기 위한 용이하고 효율적인 방법을 제공한다. 스쿠아레이트와의 반응은 고수율로 수용액 중에서 수행될 수 있고, 생성물은 (예컨대, 한외여과 또는 크기 배제 크로마토그래피에 의해) 용이하게 정제될 수 있다. 모노-스쿠아레이트 부가물은 안정하고, 추후 사용을 위해 정제되고 저장될 수 있다.

DNA/RNA와의 모노-접합체의 안정성은 올리고뉴클레오티드-모노 스쿠아레이트 종의 서열에 상보적이지 않은 제2 아미노 표지된 올리고뉴클레오티드의 커플링을 가능하게 할 수 있다. 2개의 비-상보적인 올리고뉴클레오티드는 비-효소적으로 거동하기가 매우 어렵다. 본 발명의 방법은 이러한 분자에 대한 접근법을 제공할 것이다. 스쿠아르산 유도체는 작고, 불리한 면역원성 반응을 야기하지 않을 것이고, 이는 약제에 작용기를 혼입하는 경우에 보다 적은 불리한 반응을 유발할 것이다.

실시예

올리고뉴클레오티드- 스쿠아레이트 모노-접합체의 합성

당해 분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 부착된 아미노 연결기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 합성한다(상기 논의 참고). 도 2에 제시된 예는 적적한 합성 조건을 사용하여 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오티드의 5'-OH 말단에 커플링되는 TFA-보호된 아민 C6 연결기 포스포라미디트(즉, CF₃-CO-NH-(CH₂)₆-0-P((0-CH(CH₃)₂)₂(0-CH₂-CH₂-CN))를 사용한다. 이러한 커플링은 뉴클레오티드 단량체의 커플링과 유사한 조건 하에 수행될 수 있고, 올리고뉴클레오티드가 고체 지지체에 계속 부착되어 있으면서 수행될 수 있다. 통상적인 합성 및 탈보호(RNA에 대한 TEA 3HF 및 표준 암모니아) 후, 혼합물을 NaCl에 대해 한외여과하여 모든 암모니아 및 암모늄 염을 제거할 수 있다. 최종적으로, 농축물을 물로 세척하여 모든 과량의 염을 제거한다. 이어서, 올리고뉴클레오티드 용액을 농축할 수 있다. 농축물은 동결건조되거나 그대로 사용될 수 있다.

일단 아미노-표지된 올리고뉴클레오티드기 이용가능하면, 이는 스쿠아르산 유도체에 커플링될 수 있다. 예를 들어, 500 ㎕의 300 mM 나트륨 포스페이트 중 아미노-표지된 올리고뉴클레오티드(약 10 mg)의 용액(pH 7 내지 8)을 제조하였다. 스쿠아르산의 다이메틸 에스터 과량(다이메톡시 사이클로부텐 1,2-다이온; 올리고뉴클레오티드의 각각의 mg에 대해 약 0.75 mg)을 도 2에 도시된 바와 같이 첨가하였다. 과량의 스쿠아르산 에스터를 사용하여 모노-치환된 스쿠아레이트 유도체의 형성을 촉진하고, 이-치환된 스쿠아레이트 유도체의 형성을 억제한다.

반응 혼합물을 25℃에서 유지하고, pH가 접합 중에 강하하는 경향이 있으므로, 용액의 pH를 이염기성 포스페이트로 조정하여 7 내지 7.8의 반응 pH를 유지한다. 약 4시간 후, 반응 용액을 여과하고, 3K 한외여과(UF) 스핀 카트리지에서 물로 세척하여 잔류하는 소분자(예컨대, 과량의 스쿠아르산 에스터 및 염)를 제거하였다. UF 농축물을 동결건조하고, LCMS로 분석하여 목적 생성물(즉, 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노 부가물)의 형성을 확인한다. 이러한 부가물은 매우 안정하다. 예를 들어, 이러한 모노 치환된 스쿠아레이트는 pH 7의 수용액 중에서 2일 이상 동안, 및 동결건조된 고체로서 4℃에서 1년 초과 동안 안정한 것으로 밝혀졌다.

다르게는, 반응 용액을 여과하고, 물로 세척하고, 이어서 보레이트 완충제로 세척할 수 있고, 이는 후속 반응을 위한 완충제로서 사용될 수 있고, 후속 접합 단계(예컨대, 하기 제시된 표적체로의 접합)에 직접 사용될 수 있다.

상기 커플링 반응은 매우 효율적이다. 반응을 여러번 수행하였고, 이러한 반응은, 접합 후 잔류하는 출발 아미노-표지된 올리고뉴클레오티드의 양에 의해 판단되는 바와 같이, 90 내지 99% 완료까지 진행된 것으로 밝혀졌다. 반응을 LCMS 분석에 의해 용이하게 모니터링할 수 있다.

올리고뉴클레오티드- 스쿠아레이트 모노-접합체와 표적체의 반응

도 3에 제시된 바와 같이, 동결건조된 스쿠아레이트 모노-접합체를 25 mM 나트륨 보레이트 완충제(pH 9.2)에 용해시키고, 소량의 DMSO에 용해된 아미노 기(예컨대, NH₂-R)를 함유하는 과량(예컨대, 10 내지 40배)의 표적체로 처리하였다. 25 mM 보레이트 완충제에 사전-한외여과된 모노-접합체(상기 참고)를 동결건조 및 재용해 없이 아민/DMSO 혼합물로 직접 처리할 수 있다.

이러한 구체적인 예에서, 표적체는 5-메틸 푸르푸릴 아민(즉, R = 5-메틸-푸르푸릴)이다. 반응을 실온에서 2시간 동안 수행하였다. 반응 혼합물을 다시 농축하고, 3K UF 스핀 카트리지로 세척하여 과량의 아민 및 염을 제거하였다. 농축물을 동결건조하고, 고체 부분을 LCMS로 분석하고, 이는 출발 모노-접합체를 기준으로 약 95% 수율로 형성된 목적 접합체를 나타냈다.

이러한 프로토콜을 기준으로, 다양한 표적체를 올리고뉴클레오티드와 접합하였다. 이러한 접합의 일부 예를 도 4에 제시한다. PEG-올리고뉴클레오티드 접합체의 제법은 공지되어 있다(예컨대, 문헌[Goodchild et al, Bioconjugate Chem., 1:165 (1990)]; 및 문헌[Zalipsky et al, Bioconjugate Chem., 6:150 (1995)] 참고). PEG 접합체를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성을 개선하고/하거나 올리고뉴클레오티드의 면역원성을 감소시킬 수 있다.

2개의 상보적인 올리고뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드 듀플렉스의 형성

5' 헥사에틸렌 글리콜(HEG) 스페이서 연결기 및 이어서 표준 6개 탄소 아미노 연결기를 함유하는 RNA 20 mer을 표준 올리고뉴클레오티드 고체 상 합성 기술을 사용하여 만들었다. HEG 및 C6 아미노 연결기(둘다 시판 중임)를 표준 올리고뉴클레오티드 합성/탈보호 프로토콜을 사용하여 포스포라미디트로서 첨가하였다(상기 실시예 1 참고). 조질 RNA를 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하고, 2K 하이드로사르트(Hydrosart) 막 상에서 한외여과하고, 이어서 동결건조하였다. 동결건조된 물질의 LCMS 분석은 예측된 분자량의 변형된 올리고뉴클레오티드를 제공하였다. 150 mg의 이러한 동결건조된 아미노 변형된 RNA를 pH 7 내지 8의 용액을 제공하는 3.0 mL의 나트륨 포스페이트에 용해시켰다. 300 ㎕ DMSO에 용해된 100 mg의 다이메톡시 스쿠아레이트를 상기 용액에 첨가하였다. 1시간 후의 LCMS 분석은, 도 5에 제시된 바와 같이, 아미노 표지된 RNA가 목적 모노 스쿠아레이트로 완전히 전환되었음을 나타냈다.

상기 두 문단 위에 언급된 것에 대한 상보적인 서열은, 이러한 경우에 부착된 3' 아미노 연결기를 갖는, 사용된 동일한 표준 합성 프로토콜을 사용하여 만들어졌다(도 5 참고). 변형된 RNA를 5' 아미노 표지된 RNA의 제법에 사용된 바와 동일한 과정을 사용하여 탈보호하고, 정제하고, 한외여과하고, 동결건조시켰다. 10 mg의 동결건조된 5' 아미노 RNA를 400 ㎕의 물에 용해시켰다. 11 mg(약 1.2배 과량)의 동결건조된 3' 아미노 RNA 컴플리멘트(compliment)를 개별적인 400 ㎕의 물에 용해시켰다. 2개의 용액을 합하고, 약 5분 동안 50 내지 60℃까지 가온하고, 용액을 30분에 걸쳐 실온까지 냉각하였다. 이어서, 용액의 pH를 약 9(pH 종이에 의해)로 만드는 300 ㎕의 150 mM 나트륨 보레이트를 상기 용액에 첨가하였다. 이러한 혼합물을 실온에서 3시간 동안 방치하였다. 이러한 반응의 샘플의 LCMS 분석은 이량체가 깨끗하게 형성되었고, 어떠한 가수분해된 모노 RNA 스쿠아레이트도 관찰되지 않았음을 나타냈다.

2개의 올리고뉴클레오티드의 접합체

또한, 스쿠아레이트와 올리고뉴클레오티드(예컨대, DNA 또는 RNA)의 모노-접합체의 안정성은, 심지어 제2 아미노-표지된 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노 부가물의 서열과 상보적이지 않은 경우에도 모노-접합체 중간체를 단리하고, 이를 사용하여 제2 올리고뉴클레오티드와 커플링하는 것을 가능하게 한다. 2개의 비-상보적인 올리고뉴클레오티드(특히, 하나의 올리고뉴클레오티드가 DNA이고 다른 하나가 RNA인 경우)의 커플링은 비-효소적으로 수행하기에 매우 어렵다. 본 발명의 방법은 이러한 분자로의 접근법을 제공할 것이다.

환형 올리고뉴클레오티드의 형성

상기한 바와 같이, 스쿠아레이트와 올리고뉴클레오티드(예컨대, DNA 또는 RNA)의 모노-접합체의 안정성은 모노-접합체 중간체를 단리하고, 이를 이후에 제2 올리고뉴클레오티드와 커플링시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 특성의 이점을 취할 수 있고, 이러한 모노-접합체를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 다른 말단에 존재하는 제2 아미노 기(접합의 제1 단계 중에 일시적으로 보호될 수 있음)와 접합하여 환형 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있다.

2차 아민과의 접합

펩티드와의 올리고뉴클레오티드 모노 스쿠아레이트 접합

모노 메톡시 스쿠아레이트 표지된 RNA 20 mer(약 1 μΜ)의 100 ㎕의 100 mM 나트륨 보레이트 완충된 용액(pH 9.2)에 용해된 과량의 트라이펩티드(Leu-Gly-Gly)를 첨가하였다. 이러한 혼합물을 25℃에서 1.5시간 동안 방치하였다. 반응 혼합물의 LCMS 분석은 펩티드 접합체가 약 85% 수율로 생성되었음을 나타냈다(또한, 도 6 참고).

지질과의 올리고뉴클레오티드 모노 스쿠아레이트 접합

모노 메톡시 스쿠아레이트 표지된 RNA 20 mer(약 1 μΜ)의 75 ㎕의 100 mM 나트륨 보레이트 완충된 용액(pH = 9.2)에 75 ㎕의 이소프로판올에 용해된 조금 과량의 스핀고신을 첨가하였다. 이러한 혼합물을 25℃에서 30분 동안 방치하였다. 반응 혼합물의 LCMS 분석은 지질 접합체가 약 60% 수율로 생성되었음을 나타냈다(또한, 도 6 참고).

이소프로필 아민과의 올리고뉴클레오티드 모노 스쿠아레이트 접합

모노 메톡시 스쿠아레이트 표지된 RNA 20 mer(약 1 μΜ)의 150 ㎕의 lOO mM 나트륨 보레이트 완충된 용액(pH 9.2)에 20 ㎕의 DMSO에 용해된 과량의 이소프로필 아민을 첨가하였다. 25℃에서 4시간 후, 반응 혼합물의 LCMS 분석은 이소프로필 아민 유도체가 95% 수율로 형성되었음을 나타냈다(또한, 도 6에 도시됨).

아미노/티오 표지된 올리고뉴클레오티드가 이미 유도체화된 모노 스쿠아레이트에 첨가되어, 첨가의 순서가 역전될 수 있음에 유의한다. 소분자 아민/티오, 또는 펩티드, 단백질 등의 모노 스쿠아레이트가 먼저 생성되고, 이어서 아미노/티오 표지된 올리고뉴클레오티드로 처리되어 스쿠아레이트 올리고뉴클레오티드 접합체를 형성할 수 있다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 문맥 상 명백히 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당해 분야의 숙련자에게 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 현재 기술되어 있다. 본원에 인용된 방법은 구체적으로 개시된 순서 이외에 논리적으로 가능한 임의의 순서로 수행될 수 있다.

본 발명이 제한된 수의 양태에 관해 기술되었지만, 본 개시내용의 이익을 갖는 당해 분야의 숙련자는 다른 양태가 본원에 개시된 본 발명의 범주를 벗어남이 없이 고안될 수 있음을 인정할 것이다. 따라서, 본 발명의 범주는 단지 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한되어야 한다.

참고에 의한 혼입

다른 문헌, 예컨대 특허, 특허출원, 특허공개, 잡지, 책, 논문, 웹 내용물에 대한 참고 및 인용이 본원에서 수행되었다. 이러한 모든 문헌은 이에 의해 모든 목적을 위하여 이의 전체내용이 참고로서 본원에 혼입된다. 본원에 참고로서 혼입되도록 지칭되지만 본원에 명백히 제시된 정의, 언급 또는 다른 개시내용 자료와 상충되는 임의의 자료 또는 이의 부분은 혼입된 자료와 본 개시내용의 자료 사이에 어떠한 상충도 발생하지 않는 정도까지만 혼입된다. 상충이 발생하는 경우, 상충은 바람직한 개시내용으로서 본 개시내용을 우선함으로써 해결되어야 한다.

균등론

본원에 개시된 대표적인 실시예는 본 발명의 설명을 도울 의도이고, 본 발명의 범주를 제한할 의도가 아니며 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 실제로, 본원에 제시되거나 기술된 바 이외에, 본 발명의 다양한 변형 및 이의 많은 추가 양태가 본원에 인용된 과학 및 특허 문헌에 따르고 이를 참고하는 실시예를 비롯한 본원의 전체 내용으로부터 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 상기 실시예는 본 발명의 실시에 이의 다양한 양태 및 등가물로 변경될 수 있는 중요한 부가적인 정보, 예시 및 안내를 함유한다.

Claims

하기 화학식 A의 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드 유도체:
화학식 A

상기 식에서,
R³은 제1 올리고뉴클레오티드이고;
R¹은 제2 올리고뉴클레오티드이고, 제1 올리고뉴클레오티드 및 제2 올리고뉴클레오티드 중 적어도 하나는 RNA이고;
R²는 연결기 또는 직접 결합이고;
Z¹은 NR⁴, S 또는 O이고;
Z²는 NR⁴ 또는 S이고;
R⁴는 H, 알킬, 아릴, 헤테로사이클릴 또는 헤테로아릴로부터 선택되며,
상기 연결기는 (C₁-C₁₂) 하이드로카빌 쇄로서, -O-R", -O-CO-R", -NR'-R", -NR'-CO-R", -CO-NR'-R", -CO-R", -CN- 또는 할로겐에서 선택되는 하나 이상의 치환기로 치환되고, 상기 R' 및 R"은 독립적으로 H 또는 (C₁-C₆) 하이드로카빌이거나,
또는 상기 연결기는 -(CHR"')_a-W_b-(CHR"')_c-V_d-(CHR"')_e-로 표시되는 하이드로카빌 쇄로서, 상기 W 및 V는 독립적으로 -0-, -S- 또는 -NR"'-이고, 상기 R"'는 H 또는 (C₁-C₆) 알킬이며, 상기 a, b, c, d 및 e는 독립적으로 0 내지 10의 정수이다.
제1항에 있어서,
R²가 제1 올리고뉴클레오티드의 핵염기 상의 5' 하이드록시 기, 3' 하이드록시 기 또는 환외 아미노 기에 부착된 (C₁-C₁₂) 연결기인 올리고뉴클레오티드 유도체.
제1항 또는 제2항에 있어서,
Z²가 NH인 올리고뉴클레오티드 유도체.
삭제
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서,
Z¹이 NH인 올리고뉴클레오티드 유도체.
제6항에 있어서,
제2 올리고뉴클레오티드가 제1 올리고뉴클레오티드와 상보적인 올리고뉴클레오티드 유도체.
(a) 아미노 또는 티올 기를 포함하는 올리고뉴클레오티드 유도체를 합성하는 단계; 및
(b) 3,4-다이알콕시사이클로부텐-1,2-다이온을 올리고뉴클레오티드 유도체와 반응시켜 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-접합체를 제조하는 단계
를 포함하는, 제1항의 올리고뉴클레오티드 유도체인 올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 유도체의 제조 방법.
제8항에 있어서,
올리고뉴클레오티드 유도체가 아미노 또는 티올 기를 포함하는 연결기를 포함하는 제조 방법.
제8항에 있어서,
올리고뉴클레오티드-스쿠아레이트 모노-접합체를 폴리에틸렌 글리콜, 펩티드, 단백질, 다당류 및 제2 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 표적체와 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제8항에 있어서,
올리고뉴클레오티드-모노-스쿠아레이트를 어레이 표면, 하이드로젤, 나노입자, 가용성 중합체 및 불용성 중합체로부터 선택되는 아민/티오 표지된 표면과 반응시키는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제8항에 있어서,
올리고뉴클레오티드 유도체가 올리고뉴클레오티드 유도체의 제2 위치에서 제2 아미노 또는 티올 기를 포함하는 제조 방법으로서, 환형 구조를 생성하는 올리고뉴클레오티드 내 가교결합을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 제조 방법.
제8항에 있어서,
올리고뉴클레오티드 모노 스쿠아레이트가 멀티-아민/티오 함유 종과 조합되어 스쿠아레이트를 통한 올리고뉴클레오티드의 다중 부착을 갖는 물질을 제공하는 제조 방법.
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제1항에 있어서,
Z¹ 및 Z²가 각각 NH인 올리고뉴클레오티드 유도체.
제1항에 있어서,
Z¹이 O이고, Z²가 NH인 올리고뉴클레오티드 유도체.
삭제
제1항에 있어서,
제2 올리고뉴클레오티드가 2 내지 200개의 뉴클레오티드를 포함하고, Z¹이 NH인 올리고뉴클레오티드 유도체.