JP2018123133A - 組成物及びオリゴヌクレオチドをコンジュゲートする方法 - Google Patents

Abstract

【課題】オリゴヌクレオチド誘導体の組成物及びオリゴヌクレオチドをコンジュゲートする方法の提供。
【解決手段】式（Ａ）の構造を有するオリゴヌクレオチド誘導体及びオリゴヌクレオチド誘導体を製造する方法。

（式中、Ｒ^３は、第１のオリゴヌクレオチドであり、Ｒ^１は、第２のオリゴヌクレオチドなどから選択され、Ｒ^２は、リンカー又は直接結合であり、Ｚ^１は、ＮＲ^４、Ｓ又はＯであり、Ｚ^２は、ＮＲ^４又はＳであり、ここで、Ｒ^４は、Ｈ、アルキルなどから選択される）方法は、アミノ基又はチオール基を含むオリゴヌクレオチド誘導体を合成するステップと、３，４−ジアルコキシシクロブテン−１，２−ジオンとオリゴヌクレオチド誘導体とを反応させるステップを含む。
【選択図】図２

Description

［優先権の主張及び関連特許出願］
本願は、２０１２年５月２１日付で出願された米国仮出願第６１／６４９７６６号（そ
の内容全体が引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の優先権の利益を主
張するものである。

［発明の分野］
本願は概して、オリゴヌクレオチドの試薬、合成及び精製の分野に関する。より具体的
には、本発明は、オリゴヌクレオチド誘導体の組成物及びオリゴヌクレオチドをコンジュ
ゲートする方法に関する。

多くの方法がオリゴヌクレオチドと他の分子とをコンジュゲートするために利用可能で
ある。これらの方法は通常、オリゴヌクレオチドとカップリングする標的対象に対する反
応性部分の結合を含む。反応性部分を有する標的対象は多くの場合、通常は有機合成法に
よって別個に作製され、使用前に精製される。

いずれの場合にも、オリゴヌクレオチドは標的対象上の反応性部分との反応に適切な官
能基により修飾される。オリゴヌクレオチドの修飾は多くの場合、特別なホスホロアミダ
イト及び／又は修飾塩基を作製し、それらをオリゴヌクレオチド配列に対して所望の部位
において組み込むことによって達成される。これらのアミダイト試薬の多くが、これら試
薬をオリゴヌクレオチドにカップリングするための保護基を必要とする官能基を含有する
。これらの保護基は、その後のコンジュゲーション反応を行う前に除去する必要がある。
あるいは、標的対象上の反応性部分はオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションの前に
生成することができる。

現在のカップリング化学の大半は、コンジュゲーションパートナーの少なくとも１つの
加水分解的及び／又は酸化的に不安定な種の使用又は生成を含む。これは、オリゴヌクレ
オチド（又はタンパク質、若しくは任意の有機不溶性／水溶性種）とのコンジュゲーショ
ンに必要な条件下（通常は水溶液中）で問題となる。最近のコンジュゲーション化学は、
反応の際に新たな構造を生み出してもよい。例えば、Piekenらに対して発行された特許文
献１は、生体分子のコンジュゲーションのための付加環化反応を開示している。一例であ
るアルキンとアジドとの間の１，３−双極性付加環化コンジュゲーション（後に非特許文
献１によって「クリック」ケミストリーという一般用語で分類された）は、置換トリアジ
ンをコンジュゲーション生成物の一部として生成するものである。これらの新たな化学的
対象はオリゴヌクレオチド生成物とは無関係の毒性を引き起こす可能性があるため、オリ
ゴヌクレオチドコンジュゲートをヒトに用いる場合に問題となり得る。

米国特許第６，７３７，２３６号

Sharpless et. al., Angew. Chem. Int. Ed. 40:2004(2001)

本発明の一態様は下記式（Ａ）の構造を有するオリゴヌクレオチド誘導体：
（式中、Ｒ^３は第１のオリゴヌクレオチドであり、Ｒ^１はアルキル、シクロアルキル、ア
リール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ポリエチレングリコール、ペプチド、タンパ
ク質、多糖及び第２のオリゴヌクレオチドからなる群から選択され、Ｒ^２はリンカー又は
直接結合であり、Ｚ^１はＮＲ^４、Ｓ又はＯであり、Ｚ^２はＮＲ^４又はＳであり、ここでＲ
^４はＨ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロアリールから選択される）に関
する。

本発明のいくつかの実施の形態では、Ｒ^２が、上記第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩
基上の５’ヒドロキシ基、３’ヒドロキシ基又は環外アミノ基に結合された（Ｃ_１〜Ｃ_１
２）リンカーである。本発明のいくつかの実施の形態では、Ｚ^２がＮＨである。本発明の
いくつかの実施の形態では、Ｒ^１が（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキルであり、Ｚ^１がＯである。

本発明のいくつかの実施の形態では、Ｒ^１が１Ｋ〜４０Ｋポリエチレングリコールであ
り、Ｚ^１がＮＨである。本発明のいくつかの実施の形態では、Ｒ^１が第２のオリゴヌクレ
オチドであり、Ｚ^１がＮＨであり、ここで上記第２のオリゴヌクレオチドが上記第１のオ
リゴヌクレオチドに相補的であり得る。

本発明の別の態様は、オリゴヌクレオチドをコンジュゲートする方法に関する。本発明
の一実施の形態に従う方法は、アミノ基又はチオール基を含むオリゴヌクレオチド誘導体
を合成するステップと、オリゴヌクレオチドスクアレートモノコンジュゲートを生成する
ために、３，４−ジアルコキシシクロブテン−１，２−ジオンをオリゴヌクレオチド誘導
体と反応させるステップとを含む。

本発明のいくつかの実施の形態では、方法は、上記オリゴヌクレオチドスクアレートモ
ノコンジュゲートを、ポリエチレングリコール、ペプチド、タンパク質、多糖又は第２の
オリゴヌクレオチドから選択される標的対象と反応させるステップを更に含む。

本発明のいくつかの実施の形態では、上記オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチド誘
導体の第２の位置に第２のアミノ基又はチオール基を含み、上記方法が環状構造を生じる
オリゴヌクレオチド内架橋を形成するステップを更に含む。

本発明の他の態様及び利点は以下の記載及び添付の特許請求の範囲から明らかである。

スクアリン酸及びスクアリン酸との様々な反応を示す図である。 本発明の一実施形態に従う修飾オリゴヌクレオチドとスクアリン酸ジエステルとの間の反応を示す図である。 本発明の一実施形態に従うオリゴヌクレオチドスクアレートモノ付加物と標的対象（例えばＲ−ＮＨ_２）とのコンジュゲーションを示す図である。 本発明の実施形態に従うオリゴヌクレオチドスクアレートモノ付加物と様々な標的対象とのコンジュゲーションを示す図である。 記載のスクアレートカップリング手順を用いた、一方が５’アミンであり、他方が３’アミンである２つの相補的ＲＮＡ鎖のコンジュゲーションを示す図である。 本発明の実施形態に従うオリゴヌクレオチドスクアレートモノ付加物と様々な第２級アミン標的対象とのコンジュゲーションを示す図である。

［定義］
他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明
が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書
中で使用される核酸化学、生化学、遺伝学及び分子生物学の用語及び記号は、当該技術分
野の標準的な論文及び教科書、例えばKornberg and Baker, DNA Replication, Second Ed
ition (W.H. Freeman, New York, 1992)、Lehninger, Biochemistry, Second Edition (W
orth Publishers, New York, 1975)、Strachan and Read, Human Molecular Genetics, S
econd Edition (Wiley-Liss, New York, 1999)、Eckstein, editor, Oligonucleotides a
nd Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991)、Gait
, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 19
84)、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.sup.nd Edition (
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)等に従う。ただし、或る特定の用語を明確にし、
参照しやすいように下記に規定する。

「ヌクレオシド」という用語は本明細書中で使用される場合、修飾された若しくは天然
のデオキシリボヌクレオシド若しくはリボヌクレオシド、又はそれらの任意の化学修飾物
を指す。ヌクレオシドの修飾としては、２’位、３’位及び５’位の糖修飾、５位及び６
位のピリミジン修飾、２位、６位及び８位のプリン修飾、環外アミンにおける修飾、５−
ブロモ−ウラシルの置換等が挙げられるが、これらに限定されない。ヌクレオシドを好適
に保護及び誘導体化して、当該技術分野で既知の方法、例えばヌクレオシドホスホロアミ
ダイトモノマーを用いた固相自動合成、Ｈ−ホスホネートカップリング又はリン酸トリエ
ステルカップリングによるオリゴヌクレオチド合成を可能にすることができる。

「ヌクレオチド」という用語は本明細書中で使用される場合、修飾された又は天然のデ
オキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、１つ又はいくつ
かのリン酸又は置換リン酸が５’位、２’位又は３’位に結合した上記で規定したような
ヌクレオシドである。ヌクレオチドは通常プリン及びピリミジンを含み、これらは、チミ
ジン、シチジン、グアノシン、アデニン及びウリジンを含む。

「オリゴヌクレオチド」という用語は本明細書中で使用される場合、上記で規定したよ
うな複数の連結ヌクレオチド単位から形成されるポリヌクレオチドを指す。ヌクレオチド
単位は各々、リン酸連結基を介して互いに連結したヌクレオシド単位を含む。オリゴヌク
レオチドという用語は、ホスホロチオエート結合等のリン酸結合以外の結合を介して互い
に連結した複数のヌクレオチドも指す。オリゴヌクレオチドは天然のものであっても天然
のものでなくてもよい。好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは１〜１０
００のヌクレオチドを有する。オリゴヌクレオチドは合成物であっても、又は酵素的に作
製されたものであってもよく、いくつかの実施形態では１０ヌクレオチド長〜５０ヌクレ
オチド長である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチドモノマー（すなわちオリゴリ
ボヌクレオチドであり得る）又はデオキシリボヌクレオチドモノマーを含み得る。オリゴ
ヌクレオチドは例えば１０〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、
６１〜７０、７１〜８０、８０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜５
００、又は５００を超えるヌクレオチド長であり得る。

「アルキル」という用語は本明細書中で使用される場合、１個〜２４個の炭素原子（す
なわち（Ｃ_１〜Ｃ_２４）アルキル）、典型的には１個〜１２個の炭素原子（すなわち（Ｃ
_１〜Ｃ_１2）アルキル）、更に典型的には１個〜６個の炭素原子（すなわち（Ｃ_１〜Ｃ_６
）アルキル）の飽和された直鎖、分岐又は環状の炭化水素基、例えば、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、シクロ
ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキシル、３
−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチルを指す。「低
級アルキル」という用語は、１個〜６個の炭素原子のアルキル基を指し、例としては、メ
チル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペ
ンチル、シクロペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シク
ロヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、及び２，３−ジメチルブチ
ルが挙げられる。「シクロアルキル」という用語は、シクロプロピル、シクロブチル、シ
クロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチル等の環状アルキル基
を指す。

「アルキレン」及び「アルキレン鎖」は本明細書中で使用される場合、分子の他の部分
をラジカル基へと連結し、炭素及び水素のみからなり、不飽和を含有せず、１個〜１２個
の炭素原子、好ましくは１個〜８個の炭素を有する直鎖又は分岐二価炭化水素鎖、例えば
メチレン、エチレン、プロピレン、ｎ−ブチレン等を指す。アルキレン鎖は、鎖内の１個
の炭素又は鎖内の任意の２個の炭素を介して分子の他の部分及びラジカル基へと結合し得
る。

さらに、「アルキル」という用語は、１個〜２４個の炭素原子（Ｃ１〜Ｃ２０）を有し
、更に付加的な基、例えば、エーテル結合、チオ結合、アミノ結合、リン酸結合、オキソ
結合、エステル結合及びアミド結合から選択される１つ若しくは複数の結合を有し、且つ
／又は、低級アルキル基、アリール基、アルコキシ基、チオアルキル基、ヒドロキシル基
、アミノ基、スルホニル基、チオ基、メルカプト基、イミノ基、ハロ基、シアノ基、ニト
ロ基、ニトロソ基、アジド基、カルボキシ基、スルフィド基、スルホン基、スルホキシ基
、ホスホリル基、シリル基、シリルオキシ基及びボロニル基を含む１つ若しくは複数の付
加的な基で置換されたアルキル基を表す「修飾アルキル」を含む。

同様に「低級アルキル」という用語は、１個〜８個の炭素原子を有し、更に付加的な基
、例えば、エーテル結合、チオ結合、アミノ結合、リン酸結合、ケト結合、エステル結合
及びアミド結合から選択される１つ若しくは複数の結合を有し、且つ／又は、低級アルキ
ル基、アリール基、アルコキシ基、チオアルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホ
ニル基、チオ基、メルカプト基、イミノ基、ハロ基、シアノ基、ニトロ基、ニトロソ基、
アジド基、カルボキシ基、スルフィド基、スルホン基、スルホキシ基、ホスホリル基、シ
リル基、シリルオキシ基及びボロニル基を含む１つ若しくは複数の基で置換された基を表
す「修飾低級アルキル」を含む。「アルコキシ」という用語は本明細書中で使用される場
合、置換基−Ｏ−Ｒ（ここでＲは上記で規定したようなアルキルである）を指す。「低級
アルコキシ」という用語は、Ｒが低級アルキルであるそのような基を指す。「チオアルキ
ル」という用語は本明細書中で使用される場合、置換基−Ｓ−Ｒ（ここでＲは上記で規定
したようなアルキルである）を指す。

「アリール」という用語は本明細書中で使用される場合、水素及び炭素のみからなり、
６個〜１９個の炭素原子（（Ｃ_６〜Ｃ_１９）アリールとして表される）、好ましくは６個
〜１０個の炭素原子（（Ｃ_６〜Ｃ_１０）アリールとして表される）を含有する、その一部
が縮合していてもよい芳香族単環式又は多環式（multicyclic）の炭化水素環系を指し、
部分的又は完全に飽和していてもよい。アリール基としては、フルオレニル基、フェニル
基及びナフチル基等の基が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において特に
言及されない限りは、「アリール」という用語は、（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビル、−
Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−
ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ
−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−ＣＯ
−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン又はこ
れらの組合せ（ここでＲ’及びＲ’’は独立してＨ又は（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビル
であり、Ｒは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビルである）から選択される１つ又は複数の置
換基によって任意に置換されたアリールラジカルを含むことを意味する。

「ヘテロアリール」という用語は本明細書中で使用される場合、炭素原子と窒素、酸素
及び硫黄からなる群から選択される１個〜５個のヘテロ原子とからなる５員〜１８員の単
環式又は二環式又は縮合多環式の環系を指す。ヘテロアリールは５員〜１２員又は５員〜
９員の環系であるのが好ましい。本発明の目的上、ヘテロアリールラジカルは、縮合又は
架橋環系を含み得る、単環式、二環式、三環式又は四環式の環系とすることができ、ヘテ
ロアリールラジカルにおける窒素原子、炭素原子又は硫黄原子は任意に酸化されていても
よく、窒素原子は任意に四級化されていてもよい。例としては、アゼピニル、アクリジニ
ル、ベンゾイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンズインドリル、ベンゾチアジアゾリル
、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニ
ル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチ
エニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，
２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジベンゾフラニル、フラニル、フラ
ノニル、イソチアゾリル、イミダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、
インドリニル、イソインドリニル、インドリジニル、イソオキサゾル、ナフチリジニル、
オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、フェナジニル
、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロ
リル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニ
ル、キノキサリニル、キノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニル、チアゾリル、チア
ジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル及びチオフェニルが挙げられる
が、これらに限定されない。本明細書において特に言及されない限りは、「ヘテロアリー
ル」という用語は、（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビル、−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’
’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’
−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−
Ｏ−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−Ｒ’’、−Ｒ−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−ＮＲ’
−Ｒ’’、−Ｒ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン又はこれらの組合せ（ここでＲ’及び
Ｒ’’は独立してＨ又は（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビルであり、Ｒは（Ｃ_１〜Ｃ_１２）
ヒドロカルビルである）から選択される１つ又は複数の置換基によって任意に置換された
上記で規定したようなヘテロアリールラジカルを含むことを意味する。

「ヘテロアリール」という用語は、芳香族複素環が１つ又は複数のアリール環、脂環式
環又はヘテロシクリル環と縮合し、ラジカル又は結合点が芳香族複素環上にある基も指す
。非制限的な例としては、１−、２−、３−、５−、６−、７−又は８−インドリジニル
、１−、３−、４−、５−、６−又は７−イソインドリル、２−、３−、４−、５−、６
−又は７−インドリル、２−、３−、４−、５−、６−又は７−インダゾリル、２−、４
−、５−、６−、７−又は８−プリニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−又
は９−キノリジニル、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−キノリニル、１−、
３−、４−、５−、６−、７−又は８−イソキノリニル、１−、４−、５−、６−、７−
又は８−フタラジニル、２−、３−、４−、５−又は６−ナフチリジニル、２−、３−、
５−、６−、７−又は８−キナゾリニル、３−、４−、５−、６−、７−又は８−シンノ
リニル、２−、４−、６−又は７−プテリジニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−
、７−又は８−４ａＨカルバゾリル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８
−カルバゾリル、１−、３−、４−、５−、６−、７−、８−又は９−カルボリニル、１
−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−又は１０−フェナントリジニル、１−、
２−、３−、４−、５−、６−、７−、８−又は９−アクリジニル、１−、２−、４−、
５−、６−、７−、８−又は９−ペリミジニル、２−、３−、４−、５−、６−、８−、
９−又は１０−フェナトロリニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−又は９−
フェナジニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−又は１０−フェノチア
ジニル、１−、２−、３−、４−、６−、７−、８−、９−又は１０−フェノキサジニル
、２−、３−、４−、５−、６−又は１−、３−、４−、５−、６−、７−、８−、９−
又は１０−ベンズイソキノリニル、２−、３−、４−又はチエノ［２，３−ｂ］フラニル
、２−、３−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−又は１１−７Ｈ−ピラジノ［２，
３−ｃ］カルバゾリル、２−、３−、５−、６−又は７−２Ｈ−フロ［３，２−ｂ］−ピ
ラニル、２−、３−、４−、５−、７−又は８−５Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］−ｏ−オキ
サジニル、１−、３−又は５−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｄ］−オキサゾリル、２−、４
−又は５−４Ｈ−イミダゾ［４，５−ｄ］チアゾリル、３−、５−又は８−ピラジノ［２
，３−ｄ］ピリダジニル、２−、３−、５−又は６−イミダゾ［２，１−ｂ］チアゾリル
、１−、３−、６−、７−、８−又は９−フロ［３，４−ｃ］シンノリニル、１−、２−
、３−、４−、５−、６−、８−、９−、１０−又は１１−４Ｈ−ピリド［２，３−ｃ］
カルバゾリル、２−、３−、６−又は７−イミダゾ［１，２−ｂ］［１，２，４］トリア
ジニル、７−ベンゾ［ｂ］チエニル、２−、４−、５−、６−又は７−ベンゾオキサゾリ
ル、２−、４−、５−、６−又は７−ベンゾイミダゾリル、２−、４−、４−、５−、６
−又は７−ベンゾチアゾリル、１−、２−、４−、５−、６−、７−、８−又は９−ベン
ズオキサピニル、２−、４−、５−、６−、７−又は８−ベンズオキサジニル、１−、２
−、３−、５−、６−、７−、８−、９−、１０−又は１１−１Ｈ−ピロロ［１，２−ｂ
］［２］ベンズアザピニルが挙げられるが、これらに限定されない。典型的な縮合ヘテロ
アリール基としては、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−キノリニル、１−、
３−、４−、５−、６−、７−又は８−イソキノリニル、２−、３−、４−、５−、６−
又は７−インドリル、２−、３−、４−、５−、６−又は７−ベンゾ［ｂ］チエニル、２
−、４−、５−、６−又は７−ベンゾオキサゾリル、２−、４−、５−、６−又は７−ベ
ンゾイミダゾリル、２−、４−、５−、６−又は７−ベンゾチアゾリルが挙げられるが、
これらに限定されない。

「シクロアルキル」という用語は本明細書中で使用される場合、炭素原子及び水素原子
のみからなり、３個〜１５個の炭素原子を有し、好ましくは３個〜１２個の炭素原子を有
し（（Ｃ_３〜Ｃ_１２）シクロアルキル）、飽和又は不飽和であり、分子の他の部分に単結
合で結合している、安定な非芳香族の単環式又は二環式炭化水素ラジカル、例えば、シク
ロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びデカリニル等を指す。
本明細書において特に言及されない限りは、「シクロアルキル」という用語は、−Ｏ−Ｒ
’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−
Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はこれらの組
合せ（ここでＲ’及びＲ’’は独立してＨ又は（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビルである）
から選択される１つ又は複数の置換基によって任意に置換されたシクロアルキルラジカル
を含むことを意味する。

「ヘテロシクリル」又は「複素環」という用語は本明細書中で使用される場合、少なく
とも１個の炭素原子を含有する環内に少なくとも１個のヘテロ原子を有する任意に置換さ
れた、飽和した又は部分的に不飽和の非芳香族環状基、例えば４員〜７員の単環式、７員
〜１２員の二環式又は１０員〜１５員の三環式環系を指す。ヘテロ原子を含有する複素環
基の各環は窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択される１個、２個、３個又は４個の
ヘテロ原子を含有し、窒素及び硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよい。複素環基
はヘテロ原子又は炭素原子で結合し得る。本明細書に記載の複素環は、得られる化合物が
安定であれば炭素原子又は窒素原子で置換されていてもよい。具体的に述べると、複素環
中の窒素が任意に四級化されていてもよい。複素環中のＳ原子及びＯ原子の総数が１を超
える場合、これらのヘテロ原子が互いに隣接していないのが好ましい。二環式及び三環式
ヘテロシクリル基は縮合環又はスピロ環又は環基であってもよい。ヘテロシクリルは４員
〜１２員の環系であるのが好ましい。ヘテロシクリルは４員〜９員の環系であるのも好ま
しい。

単環式の複素環基の例としては、オキセタニル、チアタニル、アゼチジニル、ジヒドロ
フラニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオフェニル、
ピロリジニル、ジヒドロピラゾリル、テトラヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、テ
トラヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピラニル、
ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、チオピラニル、ジヒドロチオピラニル、テト
ラヒドロチオピラニル、プテリジニル、ピペラジニル、モルホリニル、アゼピニル、ジヒ
ドロアゼピニル、テトラヒドロアゼピニル、２−オキソピペラジニル、２−オキソピペリ
ジニル、２−オキソピロロジニル、２−オキソアゼピニル、オキセパニル、チエパニル、
ジヒドロチエピニル、テトラヒドロチアピニル、ジヒドロオキセピニル、テトラヒドロオ
キセピニル、１，４−ジオキサニル、１，４−オキサチアニル、モルホリニル、オキサゾ
リル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリニル、Ａ−プテリドニル、イソオキサゾリニル
、イソオキサゾリル、１，４−アザチアニル、１，４−オキサチエパニル、１，４−オキ
サアゼパニル、１，４−ジチエパニル、１，４−チエアキセパニル（thieaxepanyl）、１
，４−ジアゼパニル、トロパニル、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラニル、５，６−ジヒド
ロ−２Ｈ−ピラニル、チアゾリジニル、チアモルホリニル、チアモルホリニルスルホキシ
ド、チアモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソラン及びテトラヒドロ−１，１−ジオ
キソチエニル、１，１，４−トリオキソ−１，２，５−チアジアゾリジン−２−イル、ピ
ラゾリニル等が挙げられる。

二環式の複素環黄の例としては、ジヒドロインドリル、キヌクチジニル、テトラヒドロ
キノリニル、デカヒドロキノリニル、２−オキサ−６−アザスピロ［３，３］ヘプタン−
６−イル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロイソキノリニル、ジヒドロイソイン
ドリル、インドリニル、ノルボラニル、アダマンタニル等が挙げられるが、これらに限定
されない。

本明細書において特に言及されない限りは、「ヘテロシクリル」という用語は、−Ｏ−
Ｒ’’、−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｏ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ
−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン、又はこれらの
組合せ（ここでＲ’及びＲ’’は独立してＨ又は（Ｃ_１〜Ｃ_１２）ヒドロカルビルである
）から選択される１つ又は複数の置換基によって任意に置換された、上記で規定したよう
なヘテロシクリルラジカルを含むことを意味する。

「直接結合」という用語は本明細書中で使用される場合、「直接結合」によって連結し
た２つの対象が互いに直接結び付いていることを意味する。直接結合は例えば単結合又は
二重結合であり得る。

「ＤＮＡ」又は「デオキシリボ核酸」という用語は本明細書中で使用される場合、少な
くとも１つのデオキシリボヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオ
チドを指す。

「ＲＮＡ」又は「リボ核酸」という用語は本明細書中で使用される場合、少なくとも１
つのリボヌクレオチド残基を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを指す。

本明細書中で使用される場合、「リンカー」は分子内の２つの部分を架橋する。「リン
カー」は置換基で任意に置換されたヒドロカルビル鎖（例えば、（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキ
レン、（Ｃ_２〜Ｃ_１２）アルケニレン）であってもよく、又はリンカーは−（ＣＨＲ’）
_ａ−Ｗ_ｂ−（ＣＨＲ’）_ｃ−Ｖ_ｄ−（ＣＨＲ’）_ｅ−（式中、Ｗ及びＶは独立して−Ｏ−
、−Ｓ−又は−ＮＲ’−であり、Ｒ’はＨ又は（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキルであり、ａ、ｂ、
ｃ、ｄ及びｅは独立して０〜１０、好ましくは０〜６又は好ましくは０〜３の整数であり
、ａ、ｂ、ｃ、ｄ及びｅの総和が好ましくは２〜６の整数である）で表される他の原子が
組み入れられたヒドロカルビル鎖であってもよい。任意の置換基は−Ｏ−Ｒ’’、−Ｏ−
ＣＯ−Ｒ’’、−ＮＲ’−Ｒ’’、−ＮＲ’−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＯ−ＮＲ’−Ｒ’’、
−ＣＯ−Ｒ’’、−ＣＮ、ハロゲン又はそれらの組合せであり、Ｒ’及びＲ’’は独立し
てＨ又は（Ｃ_１〜Ｃ_６）ヒドロカルビルである。

「ポリエチレングリコール」という用語は本明細書中で使用される場合、式Ｒ−（Ｏ−
ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−Ｏ−Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は独立してＨ又はアルキルである）を
有するポリエーテル化合物を指す。「ポリエチレングリコール誘導体」は、式Ｒ−（Ｏ−
ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−Ｘ−Ｒ’（式中、Ｒ及びＲ’は独立してＨ又はアルキルであり、Ｘ
はＯ又はＮＨである）を有するポリエーテル化合物を指す。

「ポリペプチド」という用語は本明細書中で使用される場合、ペプチド結合によって連
結した複数のアミノ酸を含有する分子を指す。ポリペプチドは天然タンパク質から生成し
ても又は化学的に合成してもよい。

「タンパク質」という用語は本明細書中で使用される場合、１つ又は複数のポリペプチ
ドを含有する分子を指す。タンパク質は天然起源であることが多いが、天然タンパク質か
ら修飾されたものを含み得る。

「多糖」又は「ポリ炭水化物（polycarbohydrate）」という用語は本明細書中で使用さ
れる場合、グリコシド結合によって連結した複数の糖部分を有する炭水化物分子を指す。

「任意の」又は「任意で」とは、その後に記載される状況が起こっても又は起こらなく
てもよく、その記載がその状況が起こる例及び起こらない例を含むことを意味する。例え
ば、「任意に置換された」という表現は、非水素置換基が存在していても又は存在してい
なくてもよく、その記載が非水素置換基が存在する構造及び非水素置換基が存在しない構
造を含むことを意味する。

本発明の実施形態は、オリゴヌクレオチドを他の分子又は標的対象とコンジュゲートす
る方法に関する。オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ又はキメラＤＮＡ／ＲＮＡを含み
得る。標的対象は任意の所望の標的、例えば他のオリゴヌクレオチド、タンパク質／ペプ
チド、炭水化物又は支持体（可溶性ポリマー又は固体支持体、例えば樹脂、ガラスビーズ
、電磁ビーズ、マトリックス表面等を含み得る）。

本発明の実施形態は、スクアリン酸及びその誘導体を穏和な条件下で容易にアミノ基と
カップリングすることができるということに基づく。これらのコンジュゲーションプロセ
スは、オリゴヌクレオチドコンジュゲートを生成する簡単な水性の（aqueous based）方
法をもたらす。これらの反応による生成物は安定であり、容易に単離及び貯蔵することが
できる。加えて、スクアリン酸誘導体は医薬品の修飾に用いられており、非毒性であるこ
とが見出されている。

図１は、アルコールと反応してスクアリン酸ジエステルを生じ得るスクアリン酸（すな
わちシクロブテン−３，４−ジオン）の構造を示す。このエステル化は、通常のカルボン
酸のエステル化と同様に酸触媒の存在下で容易に起こり得る。スクアリン酸エステルの求
核置換は例えばアミンを求核試薬として用いて容易に行うことができ、対応するモノアミ
ド又はジアミドが得られる。これらの特性を、特性を変化させるための生体分子の修飾を
含む多くの用途に用いることができる。

エステルに加えて、同様に求核試薬（例えばアミノ基又はチオール基）との反応に用い
ることができる他のスクアリン酸誘導体としては、スクアリン酸ハロゲン化物、スクアリ
ン酸エステルハロゲン化物及びスクアリン酸イミダゾールが挙げられる。これら全てのス
クアリン酸誘導体を本発明の実施形態とともに用いることができ、これら全ての試薬をア
ミノ官能基又はチオール官能基を有するオリゴヌクレオチドと反応させることができる。
本発明の実施形態は好ましくはスクアリン酸ジエステルを試薬として用いるものである。

スクアリン酸誘導体の使用は、小分子とのコンジュゲーション及び小分子とタンパク質
又は炭水化物とのコンジュゲーションについて記載されている。スクアリン酸誘導体は、
２０Ｋ多糖等の巨大分子とタンパク質とのカップリングにも用いられている。加えて、Gl
usenkampらに対して発行された米国特許第６，６０２，６９２号は、ペプチドとスクアリ
ン酸誘導体で修飾された固体支持体とをコンジュゲートするためのスクアリン酸誘導体の
使用を開示している。米国特許第６，６０２，６９２号の開示は、その全体が引用するこ
とにより本明細書の一部をなすものとする。

本発明の実施形態に上記のスクアリン酸誘導体のいずれを用いてもよい。好ましい本発
明の実施形態では、一般にスクアレートと称され得るスクアリン酸エステルが使用される
。このスクアリン酸エステルは、２つのエステル基（−ＯＲ基）が同じであっても又は異
なっていてもよいジエステルである。

様々な分子をコンジュゲートするためのスクアレートの使用は既知であるが、ＤＮＡ又
はＲＮＡへのコンジュゲーションにこの技術を用いた用途は報告されていない。多大な労
力が、診断／研究用試薬又は有力な治療薬としてのオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレ
オチド類似体の用途に向けられている。医薬品としてのオリゴヌクレオチドの潜在用途の
例としては、或る特定のコード領域に結合して、タンパク質の発現を阻止するか又は様々
な細胞機能を遮断することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを挙げることができ
る。さらに、ＳＥＬＥＸ（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichmen
t）法（Tuerk and Gold, Science, 249:505 (1990)）の開発は、ほとんどの生物学的に興
味深い標的に結合するオリゴヌクレオチドの同定を可能にするものである。

医薬品としてのオリゴヌクレオチドの潜在的使用は、治療活性及び安定性の増大を目的
とする様々な化学的修飾の更なる開発をもたらしている。かかる修飾は、オリゴヌクレオ
チドの細胞透過又はそのヌクレアーゼに対する耐性を増大させることができる。加えて、
これらの修飾はオリゴヌクレオチドとその標的との結合を強化するか、又はオリゴヌクレ
オチドの薬物動態特性を改善することができる。したがって、オリゴヌクレオチドを様々
な用途に対して容易に修飾することができる方法が望ましい。

本発明の実施形態は、オリゴヌクレオチドを非常に穏和な条件下で修飾する方法を提供
し、この方法はオリゴヌクレオチド医薬品の修飾における用途に好適である。本発明の実
施形態に従うと、オリゴヌクレオチド誘導体（スクアリン酸誘導体とのカップリングのた
めの反応性官能基を含有する）を任意の好適な方法で調製することができる。例えば、ス
クアリン酸誘導体とのカップリングのための反応性官能基（例えばアミノ基）を有するオ
リゴヌクレオチドを合成することができる。例えば、反応性官能基はアミノ基又はチオー
ル基であり得る。

官能基をオリゴヌクレオチドに結合させる様々な方法が既知である（概説としては、Go
odchild, Bioconjugate Chemistry, 1:165-187 (1990)を参照されたい）。化学的に反応
性の官能基をオリゴヌクレオチドに（例えば５’末端及び／又は３’末端に）結合させた
後、これらの反応性官能基を様々なコンジュゲートとのカップリングに用いることができ
る。例えば、第１級脂肪族アミノ基をオリゴヌクレオチド合成の最終段階でオリゴヌクレ
オチドの５’末端に組み込むことができる。オリゴヌクレオチドの５’末端への連結のた
めの試薬は市販されている。例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端への連結のための種
々の長さの−（ＣＨ_２）_ｎ−コネクタを有する様々なリンカーが利用可能である。一例は
、Glen Research Corp.（Sterling，Va.）から入手可能な５’−Ａｍｉｎｏ−Ｍｏｄｉｆ
ｉｅｒ Ｃ６である。オリゴヌクレオチドの３’末端に対するアミノ修飾剤も、ホスホロ
アミダイトとして又は既に合成固体支持体に結合したものとして容易に入手可能である。

オリゴヌクレオチドの修飾に用いられ、反応性官能基をもたらす試薬は、完全長オリゴ
ヌクレオチドの遊離５’ヒドロキシル基にカップリングすることができ、固体支持体に結
合したホスホロアミダイトの形態であってもよい。このカップリングは別のヌクレオチド
モノマーへの結合と同様である（例えば、Theison et al., Tetrahedron Lett., 33:5033
-5036 (1992)を参照されたい）。

本発明のいくつかの実施形態に従うと、反応基（例えばアミノ基又はチオール基）を、
修飾ヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチドに結合させることができる。この場合、反
応基を５’末端又は３’末端に結合させる必要はない。代わりに、これらの修飾ヌクレオ
チド類似体を用いて反応基を内部の位置に組み込むことができる。かかる修飾ヌクレオチ
ドのいくつかの例を下記に示す。

上記の例において、Ｒ_１はＨ又はＯＨである。式（Ｉ）は天然ヌクレオシド又はデオキ
シヌクレオシド（ＲはＨ又はＯＨである）を表し、式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）（ｎは０を超
える整数である）は反応性アミノ基修飾を糖環に有する様々な類似体を表す。これらのア
ミノ基はこれらの類似体をオリゴヌクレオチドに組み込む際に保護される。これらの試薬
のいくつかは市販されているか、又は当該技術分野で既知の手順に従って調製することが
できる。

他の修飾ヌクレオチド類似体は、下記に示すようにプリン環又はピリミジン環に修飾を
有し得る。

上記の式（Ｖ）〜式（Ｘ）（ｎは０を超える整数である）は、反応性アミノ基を含有す
るヌクレオチド類似体の例を示す。これらの類似体を用いて、これらのアミノ基を保護し
た後にオリゴヌクレオチドに組み込むことができる。これらの試薬のいくつかは市販され
ているか、又は当該技術分野で既知の手順に従って調製することができる。

オリゴヌクレオチドを反応性官能基（例えば、アミノ基又はチオール基）で誘導体化し
た後、スクアリン酸誘導体とのカップリングに用いることができる。以下の例に本発明の
いくつかの実施形態を示す。

本発明のいくつかの実施形態に従うと、オリゴヌクレオチドスクアレートモノコンジュ
ゲートを用いて、オリゴヌクレオチドを他の標的対象、例えばペプチド、タンパク質、オ
リゴ糖、固体表面、ポリマー材料、ナノ粒子、ヒドロゲル及び小分子に結合させることが
できる。

本発明のいくつかの実施形態に従うと、これらのモノコンジュゲートを用いて、特定の
目的に選択され得る他の手段（handles）とカップリングすることができる。かかる用途
の一例は、ジエン部分（例えばフラン）をオリゴヌクレオチドスクアレートモノ付加物に
結合させて、同日付けで出願された同時係属出願に開示されているジエノフィル連結分子
（例えばＮ−エチルマレイミド）とのディールスアルダー反応に供することである。

本明細書に記載の例ではアミノ基を用いてスクアレートにコンジュゲートするが、他の
求核基（例えばチオール）を用いてもよいことに留意されたい。

限定量の２つ以上のアミン（例えばジアミン、トリアミンからポリアミンまで）を含有
する種でのオリゴヌクレオチドモノスクアレートの処理は、多量体オリゴヌクレオチド構
造を作製する手段をもたらす。

このコンジュゲーションの別の用途は、２つのアミノ標識オリゴヌクレオチドをカップ
リングして、環状（cyclical）又はヘアピン型のオリゴヌクレオチド構造を形成すること
であり得る。オリゴヌクレオチドは、一方の鎖に３’アミノ標識及び他方に５’アミノ標
識を有する相補的配列であってもよい。これはヘアピン様二量体を形成する。

本発明の利点は以下の１つ又は複数を含み得る。本発明の実施形態は、オリゴヌクレオ
チドを様々な標的対象にコンジュゲートする容易かつ効率的な方法を提供する。スクアレ
ートとの反応は水溶液中において高収率で行うことができ、生成物を（例えば、限外濾過
又はサイズ排除クロマトグラフィによって）容易に精製することができる。モノスクアレ
ート付加物は安定であり、後に使用するために精製及び貯蔵することができる。

ＤＮＡ／ＲＮＡとのモノコンジュゲートの安定性は、オリゴヌクレオチドモノスクアレ
ート種の配列と相補的でない第２のアミノ標識オリゴヌクレオチドとのカップリングを許
容し得る。２つの非相補的オリゴヌクレオチドのカップリングは、非酵素的に行うのが非
常に困難である。本発明の方法はこれらの分子へのアクセスをもたらす。スクアリン酸誘
導体は小さく、免疫原性応答を引き起こすことがなく、この官能基を医薬品に組み込んだ
場合に生じる有害反応は僅かである。

＜オリゴヌクレオチドスクアレートモノコンジュゲートの合成＞
アミノリンカーが結合したオリゴヌクレオチドを、当該技術分野で既知の任意の方法（
上記の論考を参照されたい）を用いて合成する。図２に示す例では、ＴＦＡ保護アミンＣ
６リンカーホスホロアミダイト（すなわち、ＣＦ_３−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ_２）_６−Ｏ−Ｐ
（（Ｏ−ＣＨ（ＣＨ_３）_２）_２（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−ＣＮ）が用いられ、これは適切な
合成条件を用いてオリゴヌクレオチドの５’−ＯＨ末端を固体支持体にカップリングする
ものである。このカップリングは、ヌクレオチドモノマーのカップリングと同様の条件下
で行うことができ、オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合させたままで行うことができ
る。通常通りの合成及び脱保護（ＲＮＡについては標準的なアンモニア及びＴＥＡ−３Ｈ
Ｆ）の後、混合物をＮａＣｌに対して限外濾過して、全てのアンモニア及びアンモニウム
塩を除去することができる。最後に、残余分を水で洗浄して過剰な塩を全て除去する。次
いで、オリゴヌクレオチド溶液を濃縮してもよい。濃縮物を凍結乾燥してもよく、又はそ
のまま使用してもよい。

アミノ標識オリゴヌクレオチドを利用可能とした後、スクアリン酸誘導体にカップリン
グすることができる。例えば、３００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７〜８）５００μＬ中
およそ１０ｍｇのアミノ標識オリゴヌクレオチドの溶液を調製した。図２に示すように、
これに過剰なスクアリン酸ジメチルエステル（ジメトキシシクロブテン−１，２−ジオン
；オリゴヌクレオチド１ｍｇにつきおよそ０．７５ｍｇ）を添加した。過剰なスクアリン
酸エステルを用いることで、一置換スクアレート誘導体の形成を促し、二置換スクアレー
ト誘導体の形成を抑制する。

コンジュゲーション中にｐＨが低下する傾向があるため、反応混合物を２５℃に保ち、
溶液のｐＨを第二リン酸塩で調整して反応ｐＨを７〜７．８に維持した。約４時間後、反
応溶液を濾過し、３Ｋ限外濾過（ＵＦ）スピンカートリッジ内において水で洗浄して、残
存する小分子（例えば、過剰なスクアリン酸エステル及び塩）を除去した。ＵＦ残余分を
凍結乾燥し、ＬＣＭＳによって分析すると、所望の生成物、すなわちオリゴヌクレオチド
スクアレートモノ付加物の形成が確認された。かかる付加物は非常に安定である。例えば
、これらの一置換スクアレートは、ｐＨ７の水溶液中で少なくとも２日間及び凍結乾燥固
体として４℃で１年を超えて安定であることが見出される。

あるいは、反応溶液を濾過し、水で洗浄した後、次の反応に緩衝剤として用いられ得る
ホウ酸塩緩衝剤で洗浄し、次のコンジュゲーション工程（例えば、下記に示す標的対象と
のコンジュゲーション）に直接使用することができる。

上記のカップリング反応は非常に効率的である。反応を複数回行うと、コンジュゲーシ
ョン後に残存する出発アミノ標識オリゴヌクレオチドの量から判断されるように、これら
の反応が９０％〜９９％完了するまで進行することが見出される。反応はＬＣＭＳ分析に
よって容易にモニタリングすることができる。

＜オリゴヌクレオチドスクアレートモノコンジュゲートと標的対象との反応＞
図３に示すように、凍結乾燥したスクアレートモノコンジュゲートを２５ｍＭホウ酸ナ
トリウム緩衝剤（ｐＨ＝９．２）中に取り、少量のＤＭＳＯに溶解した過剰な（例えば１
０倍〜４０倍の）アミノ基（例えばＮＨ_２−Ｒ）を含有する標的対象で処理した。２５ｍ
Ｍホウ酸塩緩衝剤で事前限外濾過したモノコンジュゲート（上記を参照されたい）を、凍
結乾燥及び再溶解することなく直接アミン／ＤＭＳＯ混合物で処理することができる。

この特定の例において、標的対象は５−メチルフルフリルアミン（すなわち、Ｒ＝５−
メチル−フルフリル）である。反応を室温で２時間行った。反応混合物を再度濃縮し、３
Ｋ ＵＦスピンカートリッジ内で洗浄して、過剰なアミン及び塩を除去した。残余分を凍
結乾燥し、固体の一部をＬＣＭＳによって分析すると、所望のコンジュゲートが出発モノ
コンジュゲートベースでおよそ９５％の収率で形成されたことが示された。

これらのプロトコルに基づき、様々な標的対象をオリゴヌクレオチドとコンジュゲート
した。これらのコンジュゲーションのいくつかの例を図４に示す。ＰＥＧ−オリゴヌクレ
オチドコンジュゲートの調製は既知であり、例えば、Goodchild et al., Bioconjugate C
hem., 1:165 (1990)及びZalipsky et al., Bioconjugate Chem., 6:150 (1995)を参照さ
れたい。ＰＥＧコンジュゲートを用いて、オリゴヌクレオチドのインビボ安定性を改善し
、且つ／又はオリゴヌクレオチドの免疫原性を低減することができる。

＜２つの相補的オリゴヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド二本鎖の形成＞
５’ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）スペーサリンカーと、それに続く標準的な６
炭素アミノリンカーを含有するＲＮＡ２０マー（20 mer：二十量体）を、標準オリゴヌク
レオチド固相合成法を用いて作製した。ＨＥＧ及びＣ６アミノリンカー（どちらも市販さ
れている）を、標準オリゴヌクレオチド合成／脱保護プロトコルを用いてホスホロアミダ
イトとして付加した。上記の実施例１を参照されたい。粗ＲＮＡを陰イオン交換クロマト
グラフィによって精製し、２Ｋ Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ膜で限外濾過した後、凍結乾燥した
。凍結乾燥物質のＬＣＭＳ分析から期待分子量の修飾オリゴヌクレオチドが示された。こ
の凍結乾燥したアミノ修飾ＲＮＡ（１５０ｍｇ）を３．０ｍＬのリン酸ナトリウムに取り
、ｐＨ範囲が７〜８の溶液を得た。この溶液に３００μＬのＤＭＳＯに溶解したジメトキ
シスクアレート１００ｍｇを添加した。１時間後のＬＣＭＳ分析から、図５に示すように
、アミノ標識ＲＮＡが完全に所望のモノスクアレートへと変換されたことが示された。

上記段落［００７１］で述べたものと相補的な配列（この場合は３’アミノリンカーが
結合する）を、上記段落で用いられるものと同じ標準合成プロトコルを用いて作製した。
図５を参照されたい。５’アミノ標識ＲＮＡの調製に用いたものと同じ手順を用いて修飾
ＲＮＡを脱保護し、精製し、限外濾過し、凍結乾燥した。凍結乾燥した５’アミノＲＮＡ
（１０ｍｇ）を４００μＬの水に溶解した。１１ｍｇ（およそ１．２倍過剰）の凍結乾燥
した３’アミノＲＮＡ相補鎖を別の４００μＬの水に溶解した。これら２つの溶液を合わ
せ、５０℃〜６０℃におよそ５分間加温し、溶液を３０分間かけて室温に冷却した。次い
で、この溶液に１５０ｍＭホウ酸ナトリウム３００μＬを添加し、溶液のｐＨをおよそ９
とした（ｐＨ紙による）。この混合物を室温で３時間静置した。この反応のサンプルのＬ
ＣＭＳ分析から、加水分解モノＲＮＡスクアレートが観察されることなく二量体が正確に
形成されたことが示された。

＜２つのオリゴヌクレオチドのコンジュゲート＞
加えて、スクアレートとオリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）とのモノコン
ジュゲートの安定性は、モノコンジュゲート中間体を単離し、第２のアミノ標識オリゴヌ
クレオチドがオリゴヌクレオチドスクアレートモノ付加物の配列と相補的でなくとも、そ
れらを第２のオリゴヌクレオチドとのカップリングに使用することを可能にする。２つの
非相補的オリゴヌクレオチドのカップリング（特に一方のオリゴヌクレオチドがＤＮＡで
あり、他方がＲＮＡである場合）は、非酵素的に行うのが非常に困難である。本発明の方
法はこれらの分子へのアクセスをもたらす。

＜環状オリゴヌクレオチドの形成＞
上で述べたように、スクアレートとオリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）と
のモノコンジュゲートの安定性は、モノコンジュゲート中間体を単離し、それらをその後
の第２のオリゴヌクレオチドとのカップリングに使用することを可能にする。この特性を
利用し、これらのモノコンジュゲートを使用することで、オリゴヌクレオチドの他の末端
に存在する第２のアミノ基（コンジュゲーションの第一段階の間に一時的に保護してもよ
い）とコンジュゲートし、環状オリゴヌクレオチドを形成することができる。

［第２級アミンとのコンジュゲーション］
＜ペプチドとのオリゴヌクレオチドモノスクアレートコンジュゲーション＞
およそ１μＭのモノメトキシスクアレート標識ＲＮＡ２０マーの１００ｍＭホウ酸ナト
リウム緩衝溶液（ｐＨ＝９．２）１００μＬに、１００ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝溶液（
ｐＨ＝９．２）１００μＬに溶解した過剰なトリペプチドＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを添加
した。この混合物を２５℃に１．５時間置いた。反応混合物のＬＣＭＳ分析から、ペプチ
ドコンジュゲートがおよそ８５％の収率で生成したことが示された。図６も参照されたい
。

＜脂質とのオリゴヌクレオチドモノスクアレートコンジュゲーション＞
およそ１μＭのモノメトキシスクアレート標識ＲＮＡ２０マーの１００ｍＭホウ酸ナト
リウム緩衝溶液（ｐＨ＝９．２）７５μＬに、イソプロパノール７５μＬに溶解した小過
剰なスフィンゴシンを添加した。この混合物を２５℃に３０分間置いた。反応混合物のＬ
ＣＭＳ分析から、脂質コンジュゲートがおよそ６０％の収率で生成したことが示された。
図６も参照されたい。

＜イソプロピルアミンとのオリゴヌクレオチドモノスクアレートコンジュゲーション＞
およそ１μＭのモノメトキシスクアレート標識ＲＮＡ２０マーの１００ｍＭホウ酸ナト
リウム緩衝溶液（ｐＨ＝９．２）１５０μＬに、ＤＭＳＤ２０μＬに溶解した過剰なイソ
プロピルアミンを添加した。２５℃で４時間後の反応混合物のＬＣＭＳ分析から、イソプ
ロピルアミン誘導体が９５％を超える収率で生成したことが示された。図６にも示される
。

添加順序を逆転して、アミノ／チオ標識オリゴヌクレオチドを既に誘導体化したモノス
クアレートに添加してもよいことに留意されたい。アミン／チオ小分子又はペプチド、タ
ンパク質のモノスクアレート等を初めに作製し、次いでアミノ／チオ標識オリゴヌクレオ
チドで処理して、スクアレートオリゴヌクレオチドコンジュゲートを形成することができ
る。

本明細書及び添付の特許請求の範囲において、文脈上明白に他の指示がない限り、数量
を特定していない単数形（the singular forms "a," "an," and "the")は複数の指示対象
を含む。

他に規定のない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者
によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同
等の任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験に用いてもよいが、好ましい方法及び材
料は本明細書に記載している。本明細書に挙げた方法は、開示した特定の順序に加えて論
理的に可能な任意の順序で行うことができる。

本発明を限定数の実施形態に関して記載したが、本開示の利益を得る当業者は、本明細
書に開示の本発明の範囲を逸脱しない他の実施形態を考案することができることを理解す
るであろう。したがって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定される
ものとする。

［援用記載］
特許、特許出願、特許公報、定期刊行物、書籍、論文、ウェブコンテンツ等の他の文献
の参照及び引用を本開示において行った。かかる文献は全て、その全体があらゆる目的の
ために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。引用することにより本明細
書の一部をなすと述べられているが、本明細書に明示的に記載される既存の定義、言説又
は他の開示事項と抵触する任意の事項又はその一部は、引用事項と本開示の事項との間に
抵触が生じない限りにおいてのみ引用される。抵触の場合には、本開示を好ましい開示と
して支持することによって抵触が解決される。

［均等物］
本明細書に開示の代表的な例は本発明の説明を助けることを意図し、本発明の範囲を限
定することを意図するものでも、そのように解すべきものでもない。実際に、本明細書に
提示及び記載されるものに加えて、本発明及びその多くの更なる実施形態の様々な変更が
、先の実施例並びに本明細書に引用される科学文献及び特許文献の参照を含む本明細書の
全内容から当業者に明らかとなるであろう。先の実施例は、その様々な実施形態及びその
均等物において本発明の実施に適用することができる重要な追加情報、例示及び指針を含
む。

Claims (22)

1. 下記式（Ａ）の構造を有するオリゴヌクレオチド誘導体：
   （式中、Ｒ^３は、第１のオリゴヌクレオチドであり、Ｒ^１は、アルキル、シクロアルキル
   、アリール、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ポリエチレングリコール、ペプチド、タ
   ンパク質、多糖及び第２のオリゴヌクレオチドからなる群から選択され、Ｒ^２は、リンカ
   ー又は直接結合であり、Ｚ^１は、ＮＲ^４、Ｓ又はＯであり、Ｚ^２は、ＮＲ^４又はＳであり
   、ここで、Ｒ^４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロアリールから選
   択される）。
2. Ｒ^２が、前記第１のオリゴヌクレオチドの核酸塩基上の５’ヒドロキシ基、３’ヒドロ
   キシ基又は環外アミノ基に結合した（Ｃ_１〜Ｃ_１２）リンカーである、請求項１に記載の
   オリゴヌクレオチド誘導体。
3. Ｚ^２がＮＨである、請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
4. Ｒ^１が（Ｃ_１〜Ｃ_１２）アルキルであり、Ｚ^１がＯである、請求項１〜３のいずれか一
   項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
5. Ｒ^１が１Ｋ〜８０Ｋポリエチレングリコールであり、Ｚ^１がＮＨである、請求項１〜３
   のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
6. Ｒ^１が第２のオリゴヌクレオチドであり、Ｚ^１がＮＨである、請求項１〜３のいずれか
   一項に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
7. 前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドに相補的である、請求
   項６に記載のオリゴヌクレオチド誘導体。
8. オリゴヌクレオチドスクアレート誘導体を製造する方法であって、
   ａ． アミノ基又はチオール基を含むオリゴヌクレオチド誘導体を合成するステップと
   、
   ｂ． オリゴヌクレオチドスクアレートモノコンジュゲートを生成するために、３，４
   −ジアルコキシシクロブテン−１，２−ジオンと前記オリゴヌクレオチド誘導体とを反応
   させるステップと、
   を含む、方法。
9. 前記オリゴヌクレオチド誘導体が、前記アミノ基又はチオール基を含むリンカーを含む
   、請求項８に記載の方法。
10. 前記オリゴヌクレオチドスクアレートモノコンジュゲートを、ポリエチレングリコール
    、ペプチド、タンパク質、多糖及び第２のオリゴヌクレオチドから選択される標的対象と
    反応させるステップを更に含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記オリゴヌクレオチドモノスクアレートを、アレイ表面、ヒドロゲル、ナノ粒子、可
    溶性ポリマー及び不溶性ポリマーから選択されるアミン／チオ標識表面と反応させるステ
    ップを更に含む、請求項８に記載の方法。
12. 前記オリゴヌクレオチド誘導体が該オリゴヌクレオチド誘導体の第２の位置に第２のア
    ミノ基又はチオール基を含み、環状構造を生じるオリゴヌクレオチド内架橋を形成するス
    テップを更に含む、請求項８に記載の方法。
13. スクアレートを介したオリゴヌクレオチドの多数の結合を有する材料を提供するために
    、前記オリゴヌクレオチドモノスクアレートを多アミン／チオ含有種と組み合わせる、請
    求項８に記載の方法。
14. 下記式（Ａ）の構造を有する化合物：
    （式中、Ｒ^３は、第１のオリゴヌクレオチドであり、Ｒ^１は、ポリエチレングリコール、
    ペプチド、タンパク質、多糖及び第２のオリゴヌクレオチドからなる群から選択され、Ｒ
    ^２は、リンカー又は直接結合であり、Ｚ^１は、ＮＲ^４、Ｓ又はＯであり、Ｚ^２は、ＮＲ^４
    又はＳであり、ここで、Ｒ^４は、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロシクリル又はヘテロア
    リールから選択される）。
15. Ｒ^１がポリエチレングリコールである、請求項１４に記載の化合物。
16. Ｒ^１がペプチドである、請求項１４に記載の化合物。
17. Ｒ^１が第２のオリゴヌクレオチドである、請求項１４に記載の化合物。
18. 前記第２のオリゴヌクレオチドが前記第１のオリゴヌクレオチドに相補的である、請求
    項１７に記載の化合物。
19. Ｚ^１及びＺ^２が各々ＮＨである、請求項１４に記載の化合物。
20. Ｚ^１がＯであり、Ｚ^２がＮＨである、請求項１４に記載の化合物。
21. Ｒ^１が２０ｋ〜４０ｋポリエチレングリコールであり、Ｚ^１がＮＨである、請求項１５
    に記載の化合物。
22. 前記第２のオリゴヌクレオチドが約２〜約２００のヌクレオチドを含み、Ｚ^１がＮＨで
    ある、請求項１７に記載の化合物。