SE520256C2 - Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär - Google Patents
BiomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediärInfo
- Publication number
- SE520256C2 SE520256C2 SE0103558A SE0103558A SE520256C2 SE 520256 C2 SE520256 C2 SE 520256C2 SE 0103558 A SE0103558 A SE 0103558A SE 0103558 A SE0103558 A SE 0103558A SE 520256 C2 SE520256 C2 SE 520256C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- amino
- group
- ethyl
- enyl
- dioxocyclobut
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 20
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 8
- -1 cyanopropyl Chemical group 0.000 claims description 55
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 52
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 25
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 24
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 14
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 14
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 14
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000001488 beta-D-galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 12
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 11
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 11
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 9
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 claims description 8
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 claims description 8
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 claims description 8
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 7
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 claims description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 125000003550 alpha-D-galactosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 5
- WYUFTYLVLQZQNH-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-D-galactoside Natural products CCOC1OC(CO)C(O)C(O)C1O WYUFTYLVLQZQNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 2-amino-2-deoxy-D-galactopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical compound N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 claims description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 claims description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 4
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 claims description 4
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 claims description 4
- AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N L-idopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-HNFCZKTMSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 4
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 4
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 4
- 229960002442 glucosamine Drugs 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 claims description 3
- 150000003797 alkaloid derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 3
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 3
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 claims description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 3
- 150000003463 sulfur Chemical class 0.000 claims description 3
- 229920006026 co-polymeric resin Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- PWEBUXCTKOWPCW-UHFFFAOYSA-N squaric acid Chemical compound OC1=C(O)C(=O)C1=O PWEBUXCTKOWPCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 14
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 26
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 15
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 6
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 6
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 5
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 5
- 238000002000 high resolution fast-atom bombardment mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydroxybenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(O)=CC=C1O WXTMDXOMEHJXQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N Deuterated methanol Chemical compound [2H]OC([2H])([2H])[2H] OKKJLVBELUTLKV-MZCSYVLQSA-N 0.000 description 4
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N decan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCO MWKFXSUHUHTGQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000004705 ethylthio group Chemical group C(C)S* 0.000 description 4
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 4
- CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N octyldodecane Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC CBFCDTFDPHXCNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960004106 citric acid Drugs 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N Aglycone of yadanzioside D Natural products COC(=O)C12OCC34C(CC5C(=CC(O)C(O)C5(C)C3C(O)C1O)C)OC(=O)C(OC(=O)C)C24 TWCMVXMQHSVIOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N Astrantiagenin E-methylester Natural products CC12CCC(O)C(C)(CO)C1CCC1(C)C2CC=C2C3CC(C)(C)CCC3(C(=O)OC)CCC21C PLMKQQMDOMTZGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N alpha-D-mannose Chemical group OC[C@H]1O[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PQMKYFCFSA-N 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 238000009838 combustion analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N homoegonol Natural products C1=C(OC)C(OC)=CC=C1C1=CC2=CC(CCCO)=CC(OC)=C2O1 PFOARMALXZGCHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- IFBHRQDFSNCLOZ-GCHJQGSQSA-N (2r,3s,4s,5s,6r)-2-(hydroxymethyl)-6-(4-nitrophenoxy)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-GCHJQGSQSA-N 0.000 description 1
- YTHLQSXFNUGOPY-HEIBUPTGSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-2-(2-aminoethoxy)-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound NCCO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O YTHLQSXFNUGOPY-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- WYUFTYLVLQZQNH-HEIBUPTGSA-N (2s,3s,4s,5s,6r)-2-ethoxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound CCO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O WYUFTYLVLQZQNH-HEIBUPTGSA-N 0.000 description 1
- 125000005999 2-bromoethyl group Chemical group 0.000 description 1
- ISWFUVBWJNNQSU-UHFFFAOYSA-N 3,4-didecoxycyclobut-3-ene-1,2-dione Chemical compound CCCCCCCCCCOC1=C(OCCCCCCCCCC)C(=O)C1=O ISWFUVBWJNNQSU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGUWZCUCNQXGBU-UHFFFAOYSA-N 3-[(4-methylpiperazin-1-yl)methyl]-5-nitro-1h-indole Chemical compound C1CN(C)CCN1CC1=CNC2=CC=C([N+]([O-])=O)C=C12 VGUWZCUCNQXGBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710186708 Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 235000003911 Arachis Nutrition 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000007866 Chamaemelum nobile Nutrition 0.000 description 1
- YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N Citric acid monohydrate Chemical compound O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O YASYEJJMZJALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800004637 Communis Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101710146024 Horcolin Proteins 0.000 description 1
- 101710189395 Lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710179758 Mannose-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 101710150763 Mannose-specific lectin 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710150745 Mannose-specific lectin 2 Proteins 0.000 description 1
- 244000042664 Matricaria chamomilla Species 0.000 description 1
- 235000007232 Matricaria chamomilla Nutrition 0.000 description 1
- 238000012565 NMR experiment Methods 0.000 description 1
- 108010046016 Peanut Agglutinin Proteins 0.000 description 1
- 235000003846 Ricinus Nutrition 0.000 description 1
- 241000322381 Ricinus <louse> Species 0.000 description 1
- 235000004443 Ricinus communis Nutrition 0.000 description 1
- 240000000528 Ricinus communis Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000000910 agglutinin Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N caesium atom Chemical compound [Cs] TVFDJXOCXUVLDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 229960002303 citric acid monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 108010065799 concanavalin A-horseradish peroxidase conjugate Proteins 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- DEQYTNZJHKPYEZ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;heptane Chemical compound CCOC(C)=O.CCCCCCC DEQYTNZJHKPYEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000003818 flash chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229960005219 gentisic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002952 polymeric resin Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- GSJJCZSHYJNRPN-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-(2-sulfanylethyl)carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCS GSJJCZSHYJNRPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
- C07H15/18—Acyclic radicals, substituted by carbocyclic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
25 30 35 520 256 ¥fÉ¥:§)š§fÉ 2 Kvadratsyradietylester är ett mycket effektivt homobifunktionellt amino-reaktivt kors-kopplingsreagens som har nätt stor spridning för användning i biokon- jugeringar generelltz och speciellt inom glykokonjuge- ringar (biokonjugering av kolhydrater). Glüsenkamp m. fl. lade fram en process för biokonjugering baserad pä kvad- ratsyraestrar (DE434l524 and DEl4990550). Utnyttjandet av kvadratsyraetylestrer introducerades av Tietze3 och Hindsgaul4 och har senare använts av många andra.
Ytterligare publikationer beskriver kvadratsyradiestrar i konjugeringskemillf Det typiska användandet av kvadratsyradietylester involverar en initial reaktion med en aminogrupp pä kolhydrat) kvadratsyramonoamidintermediär (Fig. l). biomolekylen (t.ex. för att ge en biomolekyl- Denna intermediär tilläts därefter reagera med den valda bärarmolekylen eller enheten. Vidare används biomolekyl- kvadratsyramonoamidintermediärerna vanligen i stort molärt överskott relativt bärarmolekylen eller enheten.
Biomolekyler är vanligen isolerade eller syntetiserade i mycket smà mängder och är således mycket värdefulla.
Följaktligen sä är återvinning av oreagerat överskott av biomolekyl-kvadratsyramonoamidintermediär av yttersta Dock, vikt. även om kvadratsyradietylester är ett effektivt aminoreaktivt kors-kopplingsreagens, sä är en stor nackdel att biomolekyl-kvadratsyramonoamidetyl- esterintermediär är komplicerad att återvinna, vilket leder till att återvinning av oreagerad biomolekyl- kvadratsyramonoamidetylestrerintermediär är en tidsödande och komplex procedur. Återvinning/upprening av kolhydrat- kvadratsyramonoamidintermediärer baserat pä C18 fast- fasextraktion har rapporterats4'1? Dock, dessa upp- reningsprotokoll är hänvisade till närvaron av en hydro- fob kemisk markör på kolhydratmolekylen och är således inte generellt applicerbara pà kvadratsyradietylester- biokonjugeringens kemi med oderivatiserade biomolekyler, eftersom varje individuell biomolekyl mäste för- derivatiseras med en hydrofob markör före konjugering, 10 15 20 25 520 256 3 h. ,. vilket är arbetskrävande, tidsödande och kostsamt.
Ytterligare en nackdel är att den hydrofoba markören behälles av produkten, vilket kan påverka användbarheten av produkten i biomedicinska applikationer.
Således finns ett avsevärt behov inom teknikområdet av att rena upp biomolekylkvadratsyramonoamidinter- mediärer och, viktigare, av enkel återvinning av oreage- rade överskott av dyrbara biomolekyl-kvadratsyramonoamid- intermediärer.
Sammanfattning av uppfinningen.
Föreliggande uppfinningen hänför sig enligt en aspekt till en biomolekylkvadratsyramonoamidkopplings- medelintermediär enligt formeln (I): Xššb A44] (1) R1\z N/ Rz Rs i vilken X, Y och Z är, oberoende av varandra, valda ur gruppen bestående av O och S; Rl är vald ur gruppen bestående av en alkyl-, en alkenyl-, en alkynyl- och en arylgrupp innehållande minst 6 kolatomer; R2 är en biomolekyl; R3 är vald ur gruppen bestående av väte, en alkyl-, en alkenyl-, en alkynylgrupp innefattande 6 till 30 kolatomer, och en arylgrupp innefattande 6 till 18 kolatomer.
Uppfinningen hänför sig enligt en annan aspekt till ett förfarande för opolär extraktion av ett biomolekyl- kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär (I) erhållen efter en biokonjugeringsreaktion 10 15 20 25 Lu CD 520 256 4 u' .- Xqšš Aáçy (I) R1\z N/ Rz Rs i vilken X, Y och Z är, oberoende av varandra, valda ur gruppen bestående av O och S; Rl är vald ur gruppen bestående av en alkyl-, en alkenyl-, en alkynyl- och en arylgrupp innehållande minst 6 kolatomer; R2 är en biomolekyl; R3 är vald ur gruppen bestående av väte, en alkyl-, en alkenyl-, en alkynylgrupp innefattande 6 till 30 kolatomer, och en arylgrupp innefattande 6 till 18 kolatomer; varvid nämnda extraktion innefattar; återvinning av nämnda intermediär med opolära medel.
Kortfattad beskrivning av bilderna.
Fig. l. Schematisk procedur för konjugering av en biomolekyl till en bàrarmolekyl/bärarmatris medelst kvadratsyraestrar som homobifunktionella aminreaktiva kors-kopplingsreagens.
Fig. 2. Procedur för konjugering av 2-aminoetyl a-D- mannosid till kvadratsyra didecyl ester, till att ge 2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyl d-D- mannopyranosid (1).
Fig. 3. 1-9.
Fig. 4.
Sackarid-kvadratsyramonoamidintermediärer MALDI~TOF MS av BSA före (a) och efter (b) konjugeringsreaktion med 1 visande framgångsrik konju- gering av i snitt 5 a-D-mannopyranosid enheter per BSA molekyl.
Fig. 5. Schematisk procedur för återvinning av biomolekylintermediärer enligt formel (I) efter biokonju- gering till en aminofunktionaliserad mikrotiterplatta. 10 15 20 25 30 35 520 256 5 Fig. 6. Detektion av inbindning av växtlektiner till sackaridbärande mikrotiterplattor framställda med sackarid-kvadratsyramonoamidintermediärer.
Fig. 7. Inhibition av inbindning av växtlektiner till sackaridbärande mikrotiterplattor framställda med sackarid~kvadratsyramonoamidintermediärer a) 1, b) 4 och c) 6.
Detaljerad beskrivning av föredragna utföringsformer.
I en av uppfinningens utföringsformer väljes nämnda biomolekyl enligt formeln (I) ur gruppen bestående av en kolhydrat, ett protein, en peptid, en nukleosid, en nukleotid, en steroid, en lipid, en alkaloid, en sekundär metabolit, en sackarid, en sackaridsubstituterad alkyl- grupp och en sackaridsubstituterad svavelinnehållande alkylgrupp.
I en annan av uppfinningens utföringsformer våljes nämnda sackarid ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukosamin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, iduronsyra, en disackaride, en oligosackarid bestående av minst två av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav.
I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer innehåller nämnda Rl i formel (I) från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis innehåller nämnda R1 från 10 till 20 kolatomer.
I en annan av uppfinningens utföringsformer år nämnda X i formel (I) O, är nämnda Y i formel (I) O, är nämnda Z i formel (I) O och är nämnda R1 i formel (I) en decylgrupp.
I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer är nämnda biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagens- intermediär vald ur gruppen bestående av 2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino)etyl a~D~mannopyranosid (l), (ß-D-galaktopyranosyl)-(1-94)-ß-D-glukopyranosid (2), 2- (a-D- 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyl [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-I-enyl)amino]etyl galaktopyranosyl)-(I-»4)-(ß-D- galaktopyranosyl)-(l-+4)-ß- (3), D-glukopyranosid 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- « v s v = , 10 15 20 25 30 35 520 256 6 enyl)amino]etyl (2-acetamido-2-deoxy-ß-D-galakto- pyranosyl)-(l-+3)-(a-D~galaktopyranosyl)~(l-+4)-(ß-D- 2-[(2- (5-acet- galaktopyranosyl)-(1-#4)-B-D-glukopyranosid (4), decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl amido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2~ulopyrano- sylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-ß-D- (5), (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D- glukopyranosid 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- enyl)amino]etyl galakto-non-2-ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galakto- pyranosyl)-(l-+4)-[(a-L-fukopyranosyl)-(l~+3)]-2-acet- amido-2-deoxy-ß-D-glukopyranosid (6), 2-{2-[(2~decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyltio}etyl a-D-manno- pyranosid (7), 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioXocyklobut-l- enyl)amino]etyltio}etyl ß-D-glukopyranosid (8), or 2-{2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyltio}etyl (a-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-B-D-galaktopyranosid (9).
I en av uppfinningens utföringsformer omfattar förfarandet vidare, före nämnda återvinning, att uppsamla en reaktionslösning efter nämnda biokonjugeringsreaktion och bringa nämnda reaktionslösning, eventuellt efter en ändring, koncentrering utspädning och/eller tillsats av lösningsmedel, i kontakt med opolära medel.
I en annan av uppfinningens utföringsformer är nämnda opolära medel valt ur gruppen bestående av en opolär fast fas och en opolär lösning.
I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer är nämnda biomolekyl vald ur gruppen bestående av en kolhyd- en peptid, en nukleosid, en nukleotid, rat, ett protein, en steroid, en lipid, en alkaloid, en sekundär metabolit, en sackarid, en sackaridsubstituterad alkylgrupp och en sackaridsubstituterad svavelinnehàllande alkylgrupp.
Vilken annan biomolekyl känd för en fackman inom teknik- området kan självklart användas som alternativ till de ovan nämnda.
I ytterligare en annan av uppfinningens utförings- former är nämnda sackarid vald ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukosamin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, 10 15 20 25 30 35 » 1 \ . . I 520 256 7 iduronsyra, en disakarid, en oligosackarid bestående av minst tvä av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav. Vilken annan sackarid känd för en fackman inom teknikomrädet kan självklart användas som alternativ till de ovan nämnda sackariderna.
I en annan av uppfinningens utföringsformer inne- fattar biomolekyl-intermediären enligt ovan nämnda formel (I) en sackarid i formen av en glykosid med en aminofunk- tionaliserad aglykon eller en aminofunktionaliserad och svavelinnehàllande aglykon, i vilken sackariden är vald ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukos- amin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, iduronsyra, en disackaride, en oligo- sackarid bestående av minst tvà av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav. Vilken annan sackarid känd för en fackman inom teknikomrädet kan självklart användas som alternativ till de ovan nämnda sackariderna.
I ytterligare en annan av uppfinningens utförings- former innefattar nämnda R? i biomolekylkvadratsyra- monoamidkopplingsreagensintermediären enligt formel (I) från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis fràn 10 till 20 kolatomer. Det är mycket praktiskt att Rl kan väljas oberoende av strukturen pä biomolekylen.
I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer är den opolära fasta fasen, vilken intermediären bringas i kontakt med enligt förfarandet enligt uppfinningen, vald ur gruppen bestående av alkylerad silika (t.ex. C2, C4, C6, C8, C18, (t.ex. fenyl), cyklohexyl, cyanopropyl), arylerad silika resin-baserade fast-fasextraktions- sorbenter (t.ex. polystyren, co-polymer resiner) och extraktionsorbenter av blandad fast-fas.
I en utföringsform, hänför sig uppfinningen till en enkel, manuell eller automatiserad, upprening och ätervinning av oreagerat överskott av biomolekyl- kvadratsyramonoamidkopplingsreagens enligt formel (I) efter biokonjugering till en bärarmolekyl, enhet eller matris. 10 15 20 25 30 35 520 256 8 I ytterligare en utföringsform hänför sig förelig- gande uppfinning till upptäckten att biomolekylkvadrat- syramonoamidkopplingsreagensintermediårer enligt formel (I) kan enkelt extraheras in i en hydrofob lösning eller fast fas, exemplifierad av, men inte begränsad till, alkylerad silika (t.ex. C2, C4, C6, C8, C18, cyklohexyl, cyanopropyl etc.), arylerad silika (t.ex. fenyl etc ), resin-baserade fast~fas extraktionssorbenter (t.ex. polystyren, co-polymer resiner etc.) och extraktions- sorbenter av blandad fast~fas (d.v.s. sorbenter bestående av en blandning av 2 eller fler av ovan nämnda sorbenter). Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplings- reagensintermediären enligt formel (I) kan således återvinnas ur komplexa reaktionsblandningar efter en biokonjugeringsreaktion till aminogrupp-innehållande bärarmolekyler eller matriser, exemplifierad av, men inte begränsad till, proteiner, peptider, fluorescensmarkörer, fasta polymer kulor, mikrotiter plattor, provrör, glasytor och kromatografimatriser så som silika, dextran, stärkelse, cellulosa, agarose etc. Extraktionen av biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensinter- mediärer enligt formel (I) in i hydrofob lösning eller fast fas möjliggöres av de hydrofoba egenskaperna hos R1.
Enkelheten hos extraktionsproceduren gör den lämplig för automatisering.
I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer, i biomolekyl-kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär enligt formel (I), nämnda X är O, nämnda Y är O, nämnda Z är O och nämnda Rl är en decyl grupp.
I en annan av uppfinningens utföringsformer är biomolekyl-kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediår enligt formel (I) vald ur, men inte begränsad till, gruppen bestående av2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- enyl)amino]etyl d-D-mannopyranosid (1), 2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (ß-D-galaktopyrano- syl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid (2), 2-[(2-decyloxy-3,4- dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (a-D-galaktopyranosyl)- (1-+4)-(B-D- galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid 10 15 20 25 30 35 520 256 9 (3), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (2-acetamido-2-deoxy-B-D-galaktopyranosyl)-(l-+3)-(a-D- galaktopyranosyl)-(1-+4)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)~ß- D-glukopyranosid (4), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut- 1-enyl)amino]etyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D- galakto~non-2-ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galakto- pyranosyl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid (5), 2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5-acetamido-3,5- dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2-ulopyranosylonsyra)- (2~+3)-(B-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-{(a-L-fukopyranosyl)- (1-+3)]-2-acetamido-2-deoxy-ß-D-glukopyranosid (6), 2-{2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyltio}etyl a-D-mannopyranosid (7), 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklo- but-1-enyl)amino]etyltio}etyl ß-D-glukopyranosid (8), or 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl- tio}etyl (a-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D-galaktopyrano- sid (9).
I föreliggande uppfinning är termen ”alkylgrupp” menad att innehålla från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer. Nämnda alkyl- grupp kan vara linjär eller grenad. Nämnda alkylgrupp kan också bilda en ring innehållande från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer.
I föreliggande uppfinning är termen ”alkenylgrupp” menad att innehålla från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer. Nämnda alkenylgrupp innehåller minst en dubbelbindning.
I föreliggande uppfinning är termen ”alkynylgrupp” menad att innehålla från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer. Nämnda alkynylgrupp innehåller minst en trippelbindning.
I föreliggande uppfinning är termen ”arylgrupp” menad att innehålla från 6 till 18 kolatomer.
De ovan nämnda grupperna kan naturligtvis substitueras med vilken annan känd substituent känd inom området organisk kemi. Grupperna kan också substitueras med två eller flera substituenter. 10 15 20 25 30 35 1:., 142.' ", *' *' W - r^ f | - ' . ' . I* f = . i i; ' : ; 1 10 I ytterligare en utföringsform hänför sig uppfin- ningen till àtervinnande av en biomolekyl-kvadratsyra- monoamidkopplingsreagensintermediär enligt ovan nämnda formel efter konjugering till en naturlig eller konstgjord bärarmolekyl eller enhet, till exempel, men inte begränsad till, en polymerkula, en mikrotiterbrunn, ett protein, en fluorescensmarkör, en affinitetsmatris.
I ytterligare en annan utföringsform hänför sig föreliggande uppfinning till ätervinnande av en biomolekyl-kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär enligt ovan nämnda formel efter konjugering till en aminofunktionaliserad naturlig eller konstgjord bärar- molekyl eller enhet, till exempel, men inte begränsad till, en polymerkula, en mikrotiter brunn, ett protein, en fluorescensmarkör, en affinitetsmatris.
Föreliggande uppfinning har sitt ursprung i upptäckten att nyttjande av kvadratsyraestrar av hydro- foba alkoholer i biokonjgeringskemi resulterar i kvadrat- syraestermonoamider som bär en hydrofobisk markör som frisläppes under biokonjugeringsreaktionen (se fig. l), d.v.s. markören är spårlös (hydrofoba markör kan inter- ferera med biomolekylens biologiska aktivitet), varvid sàledes nödvändigheten av att märka varje enskild bio- molekyl undvikes eftersom den hydrofoba markören är närvarande i kvadratsyraesterreagenset_ Överskottet av oreagerad kvadratsyraestermonoamid efter biokonjugerings- reaktion kan enkelt återvinnas medelst förfarandet enligt uppfinningen och kan återanvändas i vidare biokonjuge- ringsreaktioner.
Metodologi/Experimentellt Generella metoder NMR experiment togs med antingen en Bruker ARX 300 MHz, en Bruker DRX 400 MHz eller en Varian Unity 400 MHz spectrometer vid rumstemperatur. IH NMR tilldelningar erhölls ur COSY experiment. Optiska aktiviteter mättes med en Perkin-Elmer 241 polarimeter. Högupplösta FAB masspektra togs med ett JEOL SX-120 instrument. MALDI-TOF MS togs med ett Bruker Biflex III instrument (använt i 10 15 20 25 30 35 520 256 11 postiv mod) med gentisinsyra (2,5-dihydroxybensosyra) som matris. Lektin-peroxidas konjugat köptes fràn Sigma- Aldrich Aldrich (L6397) för l, Arachis L7759) för 2, Toxin RCA12O (L2758) (L539l) för 3 , (weat germ agglutinin, L3892) för 5 och 6).
PBS buffert: 24 g NaCl, 0.6 g KCl, 3.46 g NaH2PO4*H2O och 0.6 g KH2PO4 i 1000 mL H20. pH justerades till 7.2.
Tween20/PBS lösning: 0.10 mL Tween20 i 200 mL PBS buffert.
(Concavalin A Ricinus för 2 och 4, och Triticum hypogaea (peanut agglutinin, communis (Castorbean) Bandeira simplicifolia vulgaris Lektin lösningar: lmg av lektin i 1 mL Tween20/PBS lösning filtrerades genom ett 0.22 pm filter. Den resulterande lösningen späddes därefter mellan 25-50 gánger i Tween20/PBS.
Cova buffert: 117 g NaCl, 10 g MgSO4*7H2O och 0.50 mL Tween20 i 1000 mL PBS buffert.
Citronsyra buffert: 7.98 g citronsyramonohydrat och 9.46 g Na2HPO4 i 1000 mL H20. pH justerades till 5.0. o-Fenylendiamin substrat lösning: Till 6.0 mg o-fenylen- diamin i 10 mL citronsyra buffert tillsattes 5 uL H2O2.
Lösningen användes omedelbart.
NaHCO3 buffert: 20 g NaHCO3 i 1000 mL H20. pH justerades till 9.00. 4-Nitrofenyl d-D-mannopyranosid köptes fràn Sigma- Aldrich. Aminofunktionaliserad Covalink mikrotiter (Roskilde, Danmark). Mikrotiter platt absorbanser lästes pà en InterMed ImmunoReader NJ-2000. plattor var fràn Nalge Nunc International Isolute C-18 pluggar var frän International Sorbent Technology.
Syntes av kvadratsyradidecylester (3,4-Didecyloxy- cyklobut-3-en-1,2-dion) Kvadratsyra (3,4-hydroxy-cyklobut-3-en-1,2-dion, 9.13 mmol) (7.6 mL, 39.85 mmol) àterloppskokades i toluen (7.5 mL) 1.042 g, och dekanol i en Dean-Stark fälla under 12 timmar. Toluen indunstades och den återstående dekanolen destillerades under högvakuum. Återstoden renades med flash kromatografi (heptan etyl acetat 2:1) 10 15 20 25 30 35 q 3.., 520 256 ;¿¿¿¿ 12 vilket gav 2 (2.645 g, 73%), som en klar vätska som långsamt stelnade, sm.p. 34°C. lH-NMR (400 MHz, CDCl3): Ö 4.68 (tr, 2 H, J 6.7 H2, OC§2CH2), l.8l (dt, 2 H, J 6.7 Hz, OCH2C§2CH2), 1.43-1.28 (m, 14 H, CH2(C§2)7CH3), 0.89 (t, 3H, J 6.6 HZ, CH2C§3). l3C-NMR (400 MHZ, CDCl3): Ö 189.8, 184.71, 32.3, 30.3, 29.9, 30.0, 29.9, 29.7, 29.6, 25.7, 23.1, 14.5. HR FAB-MS beräknad för C24H43O4 (M+H): 395.3161; funnen: 395 3170.
Typisk procedur för syntes av kvadratsyradecylester- glykosider 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl a-D- mannopyranosid (1). Till en lösning av 2-aminoetyl a-D- mannopyranosid 3” (468 mg, 1.88 mmol) i DMF (lOmL) (250 mg, 0.63 tillsattes kvadratsyra didecyl ester mmol) och Et3N (60 HL, 0.43 mmol). Efter 24 h koncentrerades lösningen och àterstoden flash kromatograferades (S102, CH2Cl2:MeOH 85:15), (165 mg, 83%) vitt fast material; [a]D23 +lO° (c 0.1, H20). lH-NMR (400 vilket gav 1 som ett MHz, cD3oD>= 6 4.78 (d, 1 H, J 1.6 Hz, H-1), 4.70 (dt, 2H, J 14.2, 7.6 Hz, ocH2cH2cH2), 3.89-3.57 (m, 8H), 3.51 (dd, 1H, J 2.7, 3.8 Hz, H~5), 1.83 (dt, 2H, J 5.6, 6.3 Hz, ocH2cH2cH2), 1.46-1.31 (m, 14H, (cH2)7cH3), 0.90 (t, 3H, J 6.7 Hz, CH3). l3c-NHR (400 MHz, cD3oD)= 5 184.0, 188.8, 184.0, 177.4, 177.1, 174.2, 100.7, 100.5, 73 9, 73.8, 71.5, 67.5, 66.7, 66.5, 61.9, 44.4, 44.0, 32.1, 30.1 29.7, 29.7, 29.5, 29.3, 25.5, 25.4, 22.8, 13.5. HR FA8-Ms beräknad för c22H38No9 460.2552. funnen: Pà liknande sätt framställdes: 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (ß-D- galaktopyranosyl)-(1-è4)-ß-D-glukopyranosid (2). [ü]D23 +14° (C 0.1, HHM. IH-NMR (400 MHz, cD3oD)= ö 4.59 (q, 2H, J 5.0 Hz, ocH2(cHg8>, 4.26 (d, 1H, J 7.4 Hz, H-1), 4.24 (d, 1 H, J 7.6 Hz, H-1'), 3.27 (ad, 1H, J 4.6, 8.2 Hz, H- 2), 1.72 (dc, 2 H J 6.7, 7.5 Hz, ocHHHg(CHfi7 >, 1.35- 1.21 (m, 14H, (cHg,cH3>, 0.80 (6, 3H, J 6.7 Hz, CHB). ”C- NMR (400MHz, cngon). 6 104.1, 103.2, 79.6, 76.1, 75.6, 75.4, 73.9, 73.8, 71.6, 69.3, 68.8, 32.0, 30.1, 29.62, 10 15 20 25 30 35 . | - . . » 520 256 §j.¿Jjj.f-._H,= 13 29.60, 29.4, 29.3, 25.4, 22.7, 13.4. HR FAB~MS beräknad för C2$h7NOMNa (M+Na): 644.2895; funnen 644.2894. 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (a~D- galaktopyranosyl)-(1-+4)-(B-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß- D-glukopyranosid (3). [a]D23 + 29° (C 0.1, H20). lH-NMR (400 MHZ, CD3OD): Ö 4.86 (d, 1H, J 3.6 HZ, H-1"), 4.59 (q, 2H, J 5.4 HZ, OCë2CH2), 4.32 (d, 1H, J 7.2 HZ, H-1'), 4.25 (d, 1H, J 7.8 Hz, H-1), 4.16 (t, 1H, J 6.0 Hz, H- 5"), 3.17 (dd, 1H, J 4.6, 6.2 Hz, H-2), 1.72 (dt, 2H, J 3.0, 6.6 Hz, ocH2cH2), 1.36-1.17 (m, 14H, (cH2)7CH3>, 0.60 (t, 3H, J 6.7 HZ, CE3). l3C~NMR (400 MHZ, CD3OD): Ö 189.2, 188.9, 184.8 183.8, 177.5, 177.2, 173.7, 173.3, 105.9, 104.4, 104.0, 103.2, 101.7, 80.0, 78.8, 78.6, 76.3, 75.5, 75.4, 75.1, 74.2, 73.8, 73.7, 72.3, 72.2, 71.9, 71.7, 70.3, 70.1 69.6, 69.4, 69.2, 68.8, 61.7, 61.6, 60.9, 60.5, 44.7, 44.4, 32.0, 31.9, 30.1, 29.62, 29.61, 29.4, 29.3, 25.4, 22.71, 22.68, 13.4. HR FAB-MS beräknad för C34H57NO19Na (M+Na): 806.3423; 806.3434. 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (2- funnen: acetamido-2-deoxy-ß-D-galaktopyranosyl)-(1-#3)-(a-D- galaktopyranosy1)-(1-+4)-(B-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-ß- D-glukopyranosid (4). IH-NMR 400 MHz (CD3OD) Ö 4.89 (d, 1H, J'3.8 HZ, H-1"), 4.69 (q, 2H, J 5.3 HZ, OCg2CH2CH2>, 4.62 (d, 1 H, J 8.4 HZ, H-1"'), 4.41 (d, 1 H, J 7.5 HZ, virtuella kopplingar, H-1'), 4.29 (d, 1H, J 7.3 Hz, H-1), 4.27 (br t, 1H, J 6.2 HZ, H-5"), 4.16 (br d, 16H, J 1.8 HZ, H-4"), 3.42 (br dt, 1H, J 3.3, 9.5 HZ, H-5), 2.01 (S, 3 H, Ac), 1.72 (q, 2H, J 7.2 Hz, ocH2cH2cH2), 1.42- l.27 (m, 14H, (C§2)7CH3), 0.90 (t, 3H, J 7.1 HZ, CH2Cë3); HR beräknad för C42H70N2O24Na 1009.4216. 2-[(2-Decyloxy~3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5- (M+Na): l009.4216, funnen: acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2- ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)- ß-D-glukopyranosid (5). lH-NMR 300 MHz (CD3OD) Ö 4.68 (br q, 2H, J 6.7 HZ, OCE2CH2CH2), 4.43 (d, 1H, J 7.8 HZ, H- 1'), 4.35 (d, 1H, J 7.8 HZ, H-1), 4.10 (dd, 1H, J 3.1, 9.7 HZ, H-3'), 3.27 (t, 1H, J 8.1 HZ, H-2), 2.86 (dd, 1H, 10 15 20 25 30 35 520 256 14 J 3.9, 12.3 Hz, H-3"e), 2.01 (S, 7.2 Hz, ocH¿3§cH2), 1.72 (t, 1 47-1 28 (m, 14H, cH2cg3). 3H, Ae), 1H, J 11.3 Hz, H-3"a), (cg2)7cH3), 0.90 (c, 3H, J 6.9 Hz, 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5- acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2- ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)- [(a-L-fukopyranosyl)-(1-+3)]-2-acetamido~2-deoxy-ß-D- glukopyranosid (6). lH~NMR 300 MHz (CD3OD) Ö 5.02 (d, 1H, J 3.5 Hz, H-1'>, 4.80 (br q, 1H, J 6.6 Hz, H-5'>, 4.68 (br q, 2H, J 6.7 Hz, ocgfifihcflz), 4.50 (d, 1H, J 7.8 Hz, H-1"), 4.46 (d, 1H, J 8.2 Hz, H~1), 4.03 (dd, 1H, J 3.1, 9.7 Hz, H-3"), 2.87 (dd, 1H, J 3.9, 12.3 Hz, H~3"'e), 2.01 (s, 3H, Ae), 1.94 (28, 3H, Ae), 1.81 (q, 2H, J 6.8 Hz, ocH4gycH2), 1.72 (n, 1H, J 11.8 Hz, H-3"'a>, 1.47- 1.28 (m, 14H, (cg2)7cH3), 1.16 (d, 3H, J 6.6 Hz, H-6'), 0.90 (t, 3H, J 6.9 Hz, cH2cg3).
Typisk procedur för syntes av svavelinnehàllande kvadratsyradecylesterglykosider 2-{2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1- enyl)amino]etyltio}etyl Q-D-mannopyranosid (7). Till en lösning av 2-bromoetyl d-D-mannopyranosid 10” (180 mg, 0.395 mmol) i DMF (5 mL) under N2 tillsattes cesium (140 mg, 0.430 mmol) (75 pL, om över natt. Reaktionsblandningen spàddes med vatten (10 (2X3O mL). karbonat och 2-(t-butoxykarbonyl- amino)etanetiol 0.430 mmol) och lösningen rördes mL) och extraherades med CH2Cl2 (MQSOU flash kromatograferades Den organiska och koncentrerades. Återstoden (S102, för att ge 2-[2-(t-butoxykarbonylamino)etyltio]etyl (191 mg, 87%) som en klar sirap. Genom en lösning av en del av 0.096 mmol) i MeOH (25 mL) bubblades vid 0°C i 15 min. Lösningen rördes om över natt fasen torkades heptanzetyl acetat 1:2) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl a-D-mannopyranosid återstoden (53 mg, Hcl (9) vid rumstemperatur. Lösningsmedlet evaporerades och (10mL), Et3N (27 pL, 0.192 mmol) (133 mg, 0.336 mmol) återstoden löstes i DMF och kvadratsyradidecylester tillsattes, och lösningen rördes om i 48 timmar vid 1.82 (q, 2H, J 10 15 20 25 30 35 520 256 15 rumstemperatur. Lösningsmedlet evaporerades och återstoden flash kromatograferades (S102, CH2Cl2:MeOH 85:15) (43 mg, 87%) substans; [a]D20 +10° (C 1.0, H20). 1H NMR (400 MHz, CD3OD): Ö 4.79 (br S, lH, H-1), 4.76 (t, 1H, J 6.4 HZ, OCEfl1hCH2), 4.73 (t, lH, J 6.4 Hz, OC§2CH2CH2), 2.79 (m, för att ge 7 som en kletigt fast 46, cH2scH2), 1.81 (dc, 2H, J 6.4, 7.2 Hz, ocH2cg2(cH2>fi, 1.50-1 24 (m, 14H, (cg2)7cH3), 0.89 (6, 3H, J 8.4 Hz, CH3). ”c«NMR (400MHz, cD3oD)= 6 173.7, 100.5, 73.7, 71.5, 71.0, 67.4, 67.3, 67.2, 61.8, 48.6, 48.3, 48.1, 47.9, 47.7, 47.5, 47.3, 44.2, 43.6, 33.1, 32.8, 32.0, 31.3, 31.0, 30.3, 29.5, 29.4, 29.2, 25.4, 25.3, 22.6, 13.4. HR FAB-MS beräknad för C24H41NO9SNa (M+Na): 542.2400; funnen: 542.2413.
Pä liknande sätt framställdes: 2-{2-L(2-necyloxy-3,4-di6x66yk16but-1- eny1)amino]ety1tio}etyl ß-D-glukopyranosid (8). [u]D23 -7° (C 0.7, MGOH). lH-NMR 400 MHZ (CD3OD) Ö 4.71 (dt, 2H, J 6.4, 15.8 H2, OCE2CH2CH2), 4.31 (d, lH, LT 7.7 Hz, virtuella kopplingar, H-1), 1.82 (m, 2H, OCH2C§2CH2), 1.47-1.29 (m, 14H, (cg2),cH3), 0.90 (t, 3H, J 6.77 Hz, (cH2)8cg3>; 130-NMR 400MHz (cD3oD) 6 189.1, 188.7, 183.9, 183.8, 177.3, 177.1, 173.9, 103.5, 77.1, 74.1, 73.9, 73.8, 70.6, 69.8, 69.7, 61.8, 44.3, 43.8, 33.0, 32.8, 32.1, 31.9, 31.3, 31.0, 30.1, 29.6, 29.5, 29.3, 25.5, 25.4, 22.7, 13.5; HR FAB-M8 beräknad för c24H41No9sNa (M+Na): 542.2400; funnen: 542.2389. 2-{2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1- enyl)amino]etyltio}etyl (a-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D- galaktopyranosid (9). [a]D23 +34° (C 1.0, H20). lH-NMR 400 MHZ (CDCl3:CD3OD:IbO) Ö 4.77 (Ö, lH, J 2.9 HZ, H-1'), 4.48 (m, 2H, OCëfl¶hCH2), 4.12 (d, 1H, J 7.5 HZ, H-1), 4.03 (t, lH, J 5.5 H2, H-5'), 3.30 (dd, lH, J 7.5, 9.2 H2, H-2), 1.58 (m, 2H, OCH2C§2CH2), 1.24-1.03 (m, 14H, (Cë2)7CH3), 0.66 (t, 3H, J 6.7 H2, (CH2)gC§3); l3C-NMR 400MHZ (CDCl3:CD3OD:D2O) Ö 188.7, 182.7, 176.9, 172.5, 103.1, 100.6, 77.6, 74.1, 73.6, 73.5, 72.7, 71.0, 70.9, 69.3, 69.1, 68.9, 68.7, 60.9, 59.3, 43.7, 43.0, 32.3, 31.3, 10 15 20 25 30 35 520 256 §j;;:fu¿_; 16 31.0, 24.7, (M+Na): 30.4, 29.5, 22.1, 13.3; 704.2828; Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester- (1-9) till BSA Bovin serum albumin (BSA, mg, 5.44 pmol) löstes i NaHCO3 buffert 29.0, 28.9, 28.7, 28.63, 28.58, 24.8, HR FAB-MS beräknad fÖr C3OH51NO14SNa funnen: 704.2916. glykosider 62 mg, 0.93 pmol) och 1 (2.5 (2.5 mL) och rördes om vi rumstemperatur i 24 timmar. Lösningen dialyserades därefter mot 5x25 mL och frystorkades vilket gav d-D-mannopyranosidneoglykoproteinet som ett vitt pulver. Den genomsnittliga graden av inkorporering bestämdes med MALDI-TOF MS och centrum av den enkelt laddade protein toppen (Fig. 4).
Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester~ glykosider (1-9) till Sepharose EAH 4B Den svavelinnehàllande kvadratsyradecylestern 7 (5.0 mg) sattes till en suspension av sedimenterad Sepharose EAH 0.05 mL) i NaHCO3 buffert (1.5 mL). Sepharosen filtrerades efter 24 timmar på en 4B (Pharmacia Amersham, glasfiltertratt och tvättades noggrant med vatten.
Svavelatomen 7 möjliggjorde differentiell svavel förbrànningsanalysis: små prov av Sepharosen togs före och efter konjugering med 7, frystorkades, och utsattes för svavel förbrånningsanalysis. Ökningen av svavelinnehåll efter konjugering motsvarade ett a-D- mannopyranosid innehåll på 3.1 pmol/mL sedimenterad Sepharose.
Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester- glykosider (8-9) till aminofunktionaliserade polymerkulor (500 4% suspension i Portland, USA) (2 mL), centrifugerades, varefter supernatanten En suspension av aminofunktionaliserade polymerkulor pL, IDC amino polystyren latex 3.0 pm, vatten, Interfacial Dynamics Corporation, suspenderades ytterligare i NaHCO3 buffert blandades, kastades. Denna tvàttprocedur upprepades 5 gånger. Till polymerkulorna i NaHCO3 buffert (2 mL) tillsattes 8 (7,6 mg, 15 pM). Suspensionen rördes försiktigt om i 15 timmar, varefter den tvättades med vatten som ovan. Ren 10 15 20 25 30 35 520 256 17 oreagerad 8 àtervanns sà som beskrivet för mikrotiter~ plattor nedan.
Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester- (1-9) Kvadratsyradecylesterglykosiderlösning (150 pL/well, 0.02 mM i NaHCO3 buffert), glykosider till mikrotiterplattor sattes till en aminofunk- tionaliserad mikrotiterplatta (CovaLink, NUNC A/S, Rosklide, tvättades tre gånger med Cova buffert Danmark). Efter 24 timmar tömdes plattorna och (1+l+10 min), följt av noggrann tvätt med vatten. Till plattorna sattes en lösning av 20% ättiksyra anhydrid i vatten. Efter 2 timmar tvättades plattorna noga med vatten.
Typisk procedur för återvinning av kvadratsyradecylester- glykosider (3, 5, och 6) 5) efter konjugeringsreaktion (Fig.
Följande pà ett protokol för konjugering av kvadratsyra- decylesterglykosider till mikrotiter plattor som beskrivet ovan, togs reaktionsblandningarna ur brunnarna, slogs samman och tilläts passera genom en Isolute C-18 kolonn. Kolonnen tvättades med 2x5 mL H20 och eluerades därefter med 80% MeOH för att ge rena återvunna oreagerade kvadratsyra decyl ester glykosider 3, 5, och 6: I Kvadratsyradecylesterglykosiden 3 (8.2 mg 3 àtervunnet efter konjugeringsreaktion i 96 brunnar med totalt 11.3 mg 3, 1 mM, 150pL/well), 0 Kvadratsyradecylesterglykosiden 3 (O.93 mg 3 återvunnet efter konjugeringsreaktion i 96 brunnar med totalt 1.50 mg 3, 0.2 mM, 100pL/well), (1.2O mg 5 àtervunnet efter konjugeringsreaktion i 3840 brunnar med totalt 3.51 mg 5, 0.01 mM, l00pL/well), (1.20 mg 6 àtervunnet efter konjugeringsreaktion i 3840 brunnar med totalt 4.22 mg 6, 0.01 mM, 100pL/well).
Exempel pà nyttjande av neoglykokonjugater erhållna med 0 kvadratsyradecylesterglykosiden 5 0 kvadratsyradecylesterglykosiden 6 den aktuella tekniken: 10 15 20 25 520 256 šgïïf 18 A) Detektion av växtlektin inbindning till mikrotiter plattor konjugerade med kvadratsyradecylesterglykosider (1-9) (Fig. 6) Till mikrotiterplattan framställd med 1, såsom beskrivet ovan, tillsattes en concanavalin A-pepparotsperoxidas- konjugatlösning (100 pL/well) och plattan inkuberades vid rumstemperatur i 45 minuter. Plattan tvättades därefter tre gànger med Cova buffert (1+l+l0min) följt av en gäng med citronsyra buffert. (lO0pL/brunn) o-Fenylendiamin lösning tillsattes som substrat och den optiska densiteten avlästes vid 490 nm.
B) Kompetitiv inhibition av växtlektininbindning till mikrotiterplattor konjugerade med kvadratsyradecylester- (1-9) (Fig. 7) Till mikrotiterplattan glykosider (framställd med 1 säsom beskrivet wspm (36 mM i TWEEN20/PBS) (50 pL) En volym av 25 pL fràn första raden fördes därefter over ovan) tillsattes en lösning av 4-nitrofenyl a~D- mannopyranosid till första raden.
Tween2O /PBS tillsattes till resterande brunnar. till andra raden och blandades. Denna procedur repeterades nedåt i raderna till sista raden, varifrån 25 pL kastades. Detta resulterade i en utspädningsfaktor pà tre för varje rad. Concavalin A-pepparotsperoxidaskon- jugat tillsattes därefter och bindningen detekterades som OVëlfl . 10 15 20 25 30 35 520 256 19 Referenser 1) Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Academic 1996.
Press Inc.: San Diego, 2) Glüsenkamp, K.-H.; Drosdziok, W.; Eberle, G.; Jähde, E.; Rajewsky, M. F. Z. Naturforsch. C: Biosci. 1991, 46, 498-501. 3) Tietze, L. P.; Schroter, C.; Gabius, 8.; Brinck, U.; Goerlach-Graw, A.; Gabius, H.-J. Bioconjugate Chem. 1991, 2, 148-153. 4) Kamath, V. P.; Diedrich, P.; Hindsgaul, O. Glycoconj.
J. 1996, l3, 315-319. 5) Tietze, L. F., Arlt, M.; Beller, M.; Glüsenkamp, K.- H.; Jähde, E.; Rajewsky, M. F. Chem. Ber. 1991, 124, 1215-1221. 6) Hällgren, C., Hindsgaul, O. J. Carbohydr. Chem. 1994, 14, 453-456.
F.-I.; 2003-2010. 7) Auzanneau, 1996, 4, Pinto, B. M. Bioorg. Med. Chem. 8) Pozsgay, V.; Dubois, E. P.; 1997, 62, 2832-2846. 9) Zhang, J.; Pannell, L. J. Org. Chem.
Yergey, A.; Kowalak, J.; Kovác, P.
Carbohydrate Res. 1998, 313, 15-20. 10) Blixt, 0.; Norberg, T. Carbohydr. Res. 1999, 319, 80- 91. 11) Zhang, J.; Kovác, P. Bioorg. med. Chem. Lett. 1999, 9, 487-490. 12) Zhang, J.; Kovác, P. Carbohydrate Res. 1999, 321, 157-167. 13) Kitov, P. 1.; Sadowska, J. M.; Mulvey, G.; Armstrong, G. D.; Ling, H.; Pannu, N. S.; Read, R. J.; Bundle, D. R.
Nature 2000, 403, 669-672. 14) Fan, E.; Zhang, Z.; Minke, W. E.; Hou, Z.; Verlinde, C. L. M. J.; H01, W. G. J. Jfl Am. Chem. SOC. 2000, 122, 2663-2664. 15) Chernyak, A.; Karavanov, A.; Ogawa, Y.; Kovác, P.
Carbohydr. Res. 2001, 330, 479-486. 16) Kitov, P. I.; Bundle, D. R. J. Chem. Soc., Perkin Trans. l 2001, 838-853. 520 256 20 17) Lindhorst, T. K.; Kötter, S.; Krallmann-Wenzel, U.; Ehlers, S. J. Chem. Soc , Perkin Trans.l 2001, 823-831. 18) Dahmën, J.; Frejd, T.; Grönberg, G.; Lave, T.; Magnusson, G.; Noori, G. Carbohydr. Res. 1983, 116, 303- 307.
Claims (14)
1. Förfarande för opolär extraktion av en biomolekyl- kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär enligt formeln (I) erhållen efter en biokonjugeringsreaktion: Xššš Åáçy (D i vilken X, Y och Z är, oberoende av varandra, valda ur gruppen bestående av O och S; Rl är vald ur gruppen bestående av en alkyl-, en alkenyl-, en alkynyl- och en arylgrupp innehållande av minst 6 kolatomer; R2 är en biomolekyl; R3 är vald ur gruppen bestående av väte, en alkyl-, en alkenyl-, en alkynylgrupp innehållande från 6 till 30 kolatomer, och en arylgrupp innehållande från 6 till 18 kolatomer; varvid nämnda extraktion innefattar: återvinning av nämnda intermediär med opolära medel.
2. Förfarande enligt krav 1, vari förfarandet vidare innefattar, före nämnda återvinning, att uppsamla en reaktionslösning efter nämnda biokonjugeringsreaktion och bringa nämnda reaktionslösning, eventuellt efter en ändring, koncentrering, utspädning och/eller tillsats av lösningsmedel, i kontakt med opolära medel.
3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, vari nämnda opolära medel väljes ur gruppen bestående av en opolär fast fas och en hydrofob lösning.
4. Förfarande enligt vilket som helst av krav l-3, vari nämnda biomolekyl väljes ur gruppen bestående av kolhydrat, ett protein, en peptid, en nukleosid, en nukleotid, en steroid, en lipid, en alkaloid, en sekundär metabolit, en sackarid, en sackaridsubstituterad alkylgrupp och en sackaridsubstituterad svavelinnehållande alkylgrupp. 520 256 22
5. Förfarande enligt krav 4, vari nämnda kolhydrat väljes ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukosamin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, iduronsyra, en disackarid, en oligosackarid bestående av minst tvà av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav.
6. Förfarande enligt vilket som helst av krav 1-5, vari nämnda R1 innehåller frän 6 till 30 kolatomer.
7. Förfarande enligt krav 6, vari nämnda R1 innehåller frán 10 till 20 kolatomer.
8. Förfarande enligt krav 3, vari nämnda opolära fasta fas väljes ur gruppen bestående av alkylerad silika (företrädesvis C2, C4, C6, C8, C18, cyklohexyl, cyanopropyl), arylerad silika (företrädesvis fenyl), resin-baserade fast- fasextraktionssorbenter (företrädesvis polystyren, co-polymer resiner) och extraktionsorbenter av blandad fast~fas.
9. Förfarande enligt vilket som helst av krav 1-8, vari nämnda X är O.
10. Förfarande enligt krav 9, vari nämnda Y är O.
11. Förfarande enligt krav 10, vari nämnda Z är O.
12. Förfarande enligt krav 11, vari nämnda Rl är en decylgrupp.
13. Förfarande enligt vilket som helst av krav 1-12, vari nämnda biomolekylkvadratsyramonoamidkopplings- reagensintermediär väljes ur gruppen bestående av 2-[(2- decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl a-D- mannopyranosid (1), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioXocyklobut-l- enyl)amino]etyl (ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D- glukopyranosid (2), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1- enyl)amino]etyl (d-D-galaktopyranosyl)-(1-è4)-(ß-D- galaktopyranosyl)-(1-94)-ß-D-glukopyranosid (3), 2-[(2- decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (2-acetamido-2- deoxy-B-D-galaktopyranosyl)-(1-à3)-(d-D-galaktopyranosyl)- (1-+4)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid (4), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5- acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-d-D-galakto-non-2- ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D- glukopyranosid (5), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1- 520 256 23 enyl)amino]etyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D- galakto-non-2-ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D- galaktopyranosyl)-(l-+4)-[(a-L-fukopyranosyl)-(l-+3)]-2- acetamido-2-deoXy-ß-D-glukopyranosid (6), 2-{2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyltio}etyl a-D-mannopyranosid (7), 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- enyl)amino]etyltio}etyl ß-D-glukopyranosid (8), or 2-{2-[(2- decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyltio}etyl (a-D- galaktopyranosyl)-(1-94)-B-D-galaktopyranosid (9).
14. Förfarande som definierats i vilket som helst av krav 2-13 för àtervinning av nämnda biomolekylkvadrat- syramonoamidkopplingsreagensintermediär enligt formel (I) efter en biokonjugeringsreaktion och àteranvàndande av nämnda intermediär i ytterligare biokonjugeringsreaktioner_
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0103558A SE520256C2 (sv) | 2001-10-25 | 2001-10-25 | Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär |
| PCT/SE2002/001892 WO2003035672A1 (en) | 2001-10-25 | 2002-10-25 | Novel method for recovery of squaric acid mono esters in bioconjugation chemistry |
| EP02802077A EP1438328A1 (en) | 2001-10-25 | 2002-10-25 | Novel method for recovery of squaric acid mono esters in bioconjugation chemistry |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE0103558A SE520256C2 (sv) | 2001-10-25 | 2001-10-25 | Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SE0103558D0 SE0103558D0 (sv) | 2001-10-25 |
| SE0103558L SE0103558L (sv) | 2003-04-26 |
| SE520256C2 true SE520256C2 (sv) | 2003-06-17 |
Family
ID=20285769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SE0103558A SE520256C2 (sv) | 2001-10-25 | 2001-10-25 | Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1438328A1 (sv) |
| SE (1) | SE520256C2 (sv) |
| WO (1) | WO2003035672A1 (sv) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003084982A2 (en) * | 2001-11-14 | 2003-10-16 | Luminex Corporation | Functionalized compositions for improved immobilization |
| JP5464578B2 (ja) * | 2009-07-31 | 2014-04-09 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Ｓｓｅａ系新規糖鎖化合物 |
| EP2852602B1 (en) * | 2012-05-21 | 2020-08-12 | Agilent Technologies, Inc. | Method for conjugating oligonucleotides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4523980A (en) * | 1984-08-31 | 1985-06-18 | The Halcon Sd Group, Inc. | Process for the recovery of high purity squaric acid |
| DE69933310T2 (de) * | 1998-10-16 | 2007-05-10 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Lagerstabile zusammensetzung enthaltend quadratsäure-aktivierten träger, der für die immobilisierung von amingruppen enthaltenden substanzen benutzt werden kann |
-
2001
- 2001-10-25 SE SE0103558A patent/SE520256C2/sv unknown
-
2002
- 2002-10-25 WO PCT/SE2002/001892 patent/WO2003035672A1/en not_active Ceased
- 2002-10-25 EP EP02802077A patent/EP1438328A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2003035672A1 (en) | 2003-05-01 |
| SE0103558L (sv) | 2003-04-26 |
| SE0103558D0 (sv) | 2001-10-25 |
| EP1438328A1 (en) | 2004-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Christiansen et al. | Microvillus membrane vesicles from pig small intestine purity and lipid composition | |
| Leteux et al. | Biotinyl-L-3-(2-naphthyl)-alanine hydrazide derivatives of N-glycans: versatile solid-phase probes for carbohydrate-recognition studies | |
| Dondoni et al. | Glycoside-clustering round calixarenes toward the development of multivalent carbohydrate ligands. Synthesis and conformational analysis of calix [4] arene O-and C-glycoconjugates | |
| CN101120254B (zh) | 固相寡糖标记:用于操作固定化糖的技术 | |
| JPH10267931A (ja) | 糖と標的物との相互作用の測定方法 | |
| US20030119051A1 (en) | Saccharide library | |
| Maki et al. | Semisynthesis of complex-type biantennary oligosaccharides containing lactosamine repeating units from a biantennary oligosaccharide isolated from a natural source | |
| SE520256C2 (sv) | Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär | |
| Dong et al. | Dimerization of conserved ascaroside building blocks generates species-specific male attractants in Caenorhabditis nematodes | |
| CA3078913C (en) | Novel amphiphilic compound having dendronic hydrophobic group and application thereof | |
| KR102166783B1 (ko) | 새로운 트레할로스 중심을 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용 | |
| KR20200118634A (ko) | 새로운 실로-이노시톨 중심을 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용 | |
| Nagao et al. | Structural study of the asparagine-linked oligosaccharides of lipophorin in locusts | |
| Johnson et al. | Synthesis of novel, fluorescently tagged analogs of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors | |
| JPWO2004104163A1 (ja) | α−選択的グリコシル化反応方法 | |
| JPS63246382A (ja) | ビオチニル試薬及びそれを用いるビオチニル化法 | |
| JP4102263B2 (ja) | 保護された水酸基を有する化合物、その製造法およびその用途 | |
| CN108997447A (zh) | 含有二硫键的化合物及其用途和制备方法 | |
| KR102007317B1 (ko) | 벤젠 고리에서 파생된 양친매성 화합물 및 이의 활용 | |
| Takatani et al. | Facile synthesis of oligosaccharide probes for the analysis of protein–carbohydrate interactions | |
| KR100460177B1 (ko) | 탄수화물칩 제작방법 | |
| Zhang et al. | Study of carbohydrate–carbohydrate interactions: total synthesis of 6d-deoxy Lewisx pentaosyl glycosphingolipid | |
| US8791251B2 (en) | Non-ionic acid-labile surfactants and methods of use | |
| KR20180037907A (ko) | 텐덤 네오펜틸 글리콜 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 | |
| Riley et al. | 2-O-(2-aminoethyl)-myo-inositol 1, 4, 5-trisphosphate as a novel ligand for conjugation: physicochemical properties and synthesis of a new Ins (1, 4, 5) P3 affinity matrix |