SE520256C2

SE520256C2 - Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär

Info

Publication number: SE520256C2
Application number: SE0103558A
Authority: SE
Inventors: Ulf Nilsson; Anders Bergh
Original assignee: Lundonia Biotech Ab
Priority date: 2001-10-25
Filing date: 2001-10-25
Publication date: 2003-06-17
Also published as: SE0103558L; SE0103558D0; EP1438328A1; WO2003035672A1

Abstract

The present invention relates to a biomolecule squaric acid monoamide conjugate of formula (I), as presented in the claims, and to a method for non-polar extraction of a biomolecule squaric acid monoamide conjugate of formula (I), as presented in the claims, obtained after a bioconjugation reaction, wherein said extraction comprises recovering said intermediate by non-polar means.

Description

25 30 35 520 256 ¥fÉ¥:§)š§fÉ 2 Kvadratsyradietylester är ett mycket effektivt homobifunktionellt amino-reaktivt kors-kopplingsreagens som har nätt stor spridning för användning i biokon- jugeringar generelltz och speciellt inom glykokonjuge- ringar (biokonjugering av kolhydrater). Glüsenkamp m. fl. lade fram en process för biokonjugering baserad pä kvad- ratsyraestrar (DE434l524 and DEl4990550). Utnyttjandet av kvadratsyraetylestrer introducerades av Tietze3 och Hindsgaul4 och har senare använts av många andra. 25 30 35 520 256 ¥ fÉ ¥: §) š§fÉ 2 Square acid diethyl ester is a very effective homobifunctional amino-reactive cross-linking reagent that has quite a wide spread for use in bioconjugations in general and especially in glycoconjugations (bioconjugation of carbohydrates) . Glüsenkamp et al. presented a process for bioconjugation based on square acid esters (DE4341524 and DE144990550). The use of square acid ethyl esters was introduced by Tietze3 and Hindsgaul4 and has since been used by many others.

Ytterligare publikationer beskriver kvadratsyradiestrar i konjugeringskemillf Det typiska användandet av kvadratsyradietylester involverar en initial reaktion med en aminogrupp pä kolhydrat) kvadratsyramonoamidintermediär (Fig. l). biomolekylen (t.ex. för att ge en biomolekyl- Denna intermediär tilläts därefter reagera med den valda bärarmolekylen eller enheten. Vidare används biomolekyl- kvadratsyramonoamidintermediärerna vanligen i stort molärt överskott relativt bärarmolekylen eller enheten.Additional publications describe quadratic acid diesters in conjugation chamomile. The typical use of quadratic acid diethyl ester involves an initial reaction with an amino group on carbohydrate (quadratic acid monoamide intermediate) (Fig. 1). biomolecule (eg to give a biomolecule- This intermediate was then allowed to react with the selected carrier molecule or device.

Biomolekyler är vanligen isolerade eller syntetiserade i mycket smà mängder och är således mycket värdefulla.Biomolecules are usually isolated or synthesized in very small amounts and are thus very valuable.

Följaktligen sä är återvinning av oreagerat överskott av biomolekyl-kvadratsyramonoamidintermediär av yttersta Dock, vikt. även om kvadratsyradietylester är ett effektivt aminoreaktivt kors-kopplingsreagens, sä är en stor nackdel att biomolekyl-kvadratsyramonoamidetyl- esterintermediär är komplicerad att återvinna, vilket leder till att återvinning av oreagerad biomolekyl- kvadratsyramonoamidetylestrerintermediär är en tidsödande och komplex procedur. Återvinning/upprening av kolhydrat- kvadratsyramonoamidintermediärer baserat pä C18 fast- fasextraktion har rapporterats4'1? Dock, dessa upp- reningsprotokoll är hänvisade till närvaron av en hydro- fob kemisk markör på kolhydratmolekylen och är således inte generellt applicerbara pà kvadratsyradietylester- biokonjugeringens kemi med oderivatiserade biomolekyler, eftersom varje individuell biomolekyl mäste för- derivatiseras med en hydrofob markör före konjugering, 10 15 20 25 520 256 3 h. ,. vilket är arbetskrävande, tidsödande och kostsamt.Accordingly, recovery of unreacted excess biomolecular square acid monoamide intermediate is of the utmost Dock, weight. Although quadratic acid diethyl ester is an effective amino-reactive cross-linking reagent, a major disadvantage is that biomolecular quadratic acid monoamide ethyl ester intermediates are complicated to recover, leading to the recovery of unreacted biomolecular quadratic acid monoamide ethyl ester intermediates being time consuming. Recovery / purification of carbohydrate-square acid monoamide intermediates based on C18 solid phase extraction has been reported4'1? However, these purification protocols refer to the presence of a hydrophobic chemical marker on the carbohydrate molecule and are thus not generally applicable to the chemistry of quadratic acid diethyl ester bioconjugation with undivatized biomolecules, as each individual biomolecule must be pre-derivatized with 15 20 25 520 256 3 h.,. which is labor intensive, time consuming and costly.

Ytterligare en nackdel är att den hydrofoba markören behälles av produkten, vilket kan påverka användbarheten av produkten i biomedicinska applikationer.Another disadvantage is that the hydrophobic marker is retained by the product, which can affect the usefulness of the product in biomedical applications.

Således finns ett avsevärt behov inom teknikområdet av att rena upp biomolekylkvadratsyramonoamidinter- mediärer och, viktigare, av enkel återvinning av oreage- rade överskott av dyrbara biomolekyl-kvadratsyramonoamid- intermediärer.Thus, there is a significant need in the art for purifying biomolecular square acid monoamide intermediates and, more importantly, for easy recovery of unreacted excess of precious biomolecular square acid monoamide intermediates.

Sammanfattning av uppfinningen.Summary of the invention.

Föreliggande uppfinningen hänför sig enligt en aspekt till en biomolekylkvadratsyramonoamidkopplings- medelintermediär enligt formeln (I): Xššb A44] (1) R1\z N/ Rz Rs i vilken X, Y och Z är, oberoende av varandra, valda ur gruppen bestående av O och S; Rl är vald ur gruppen bestående av en alkyl-, en alkenyl-, en alkynyl- och en arylgrupp innehållande minst 6 kolatomer; R2 är en biomolekyl; R3 är vald ur gruppen bestående av väte, en alkyl-, en alkenyl-, en alkynylgrupp innefattande 6 till 30 kolatomer, och en arylgrupp innefattande 6 till 18 kolatomer.The present invention relates in one aspect to a biomolecular square acid monoamide coupling agent intermediate of the formula (I): X6b A44] (1) R and S; R 1 is selected from the group consisting of an alkyl, an alkenyl, an alkynyl and an aryl group containing at least 6 carbon atoms; R 2 is a biomolecule; R 3 is selected from the group consisting of hydrogen, an alkyl, an alkenyl, an alkynyl group comprising 6 to 30 carbon atoms, and an aryl group comprising 6 to 18 carbon atoms.

Uppfinningen hänför sig enligt en annan aspekt till ett förfarande för opolär extraktion av ett biomolekyl- kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär (I) erhållen efter en biokonjugeringsreaktion 10 15 20 25 Lu CD 520 256 4 u' .- Xqšš Aáçy (I) R1\z N/ Rz Rs i vilken X, Y och Z är, oberoende av varandra, valda ur gruppen bestående av O och S; Rl är vald ur gruppen bestående av en alkyl-, en alkenyl-, en alkynyl- och en arylgrupp innehållande minst 6 kolatomer; R2 är en biomolekyl; R3 är vald ur gruppen bestående av väte, en alkyl-, en alkenyl-, en alkynylgrupp innefattande 6 till 30 kolatomer, och en arylgrupp innefattande 6 till 18 kolatomer; varvid nämnda extraktion innefattar; återvinning av nämnda intermediär med opolära medel.The invention relates in another aspect to a process for non-polar extraction of a biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate (I) obtained after a bioconjugation reaction Lu CD 520 256 4 u '. in which X, Y and Z are, independently, selected from the group consisting of O and S; R 1 is selected from the group consisting of an alkyl, an alkenyl, an alkynyl and an aryl group containing at least 6 carbon atoms; R 2 is a biomolecule; R 3 is selected from the group consisting of hydrogen, an alkyl, an alkenyl, an alkynyl group comprising 6 to 30 carbon atoms, and an aryl group comprising 6 to 18 carbon atoms; wherein said extraction comprises; recovery of said intermediate by non-polar means.

Kortfattad beskrivning av bilderna.Brief description of the pictures.

Fig. l. Schematisk procedur för konjugering av en biomolekyl till en bàrarmolekyl/bärarmatris medelst kvadratsyraestrar som homobifunktionella aminreaktiva kors-kopplingsreagens.Fig. 1. Schematic procedure for conjugating a biomolecule to a carrier molecule / carrier matrix by quadratic acid esters as homobifunctional amine-reactive cross-linking reagents.

Fig. 2. Procedur för konjugering av 2-aminoetyl a-D- mannosid till kvadratsyra didecyl ester, till att ge 2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyl d-D- mannopyranosid (1).Fig. 2. Procedure for conjugating 2-aminoethyl α-D-mannoside to quadratic acid didecyl ester, to give 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl d-D-mannopyranoside (1).

Fig. 3. 1-9.Fig. 3. 1-9.

Fig. 4.Fig. 4.

Sackarid-kvadratsyramonoamidintermediärer MALDI~TOF MS av BSA före (a) och efter (b) konjugeringsreaktion med 1 visande framgångsrik konju- gering av i snitt 5 a-D-mannopyranosid enheter per BSA molekyl.Saccharide-square acid monoamide intermediates MALDI-TOF MS of BSA before (a) and after (b) conjugation reaction with 1 showing successful conjugation of an average of 5 α-D-mannopyranoside units per BSA molecule.

Fig. 5. Schematisk procedur för återvinning av biomolekylintermediärer enligt formel (I) efter biokonju- gering till en aminofunktionaliserad mikrotiterplatta. 10 15 20 25 30 35 520 256 5 Fig. 6. Detektion av inbindning av växtlektiner till sackaridbärande mikrotiterplattor framställda med sackarid-kvadratsyramonoamidintermediärer.Fig. 5. Schematic procedure for recycling biomolecular intermediates of formula (I) after bioconjugation to an amino-functionalized microtiter plate. Fig. 6. Detection of binding of plant lectins to saccharide-bearing microtiter plates prepared with saccharide-square acid monoamide intermediates.

Fig. 7. Inhibition av inbindning av växtlektiner till sackaridbärande mikrotiterplattor framställda med sackarid~kvadratsyramonoamidintermediärer a) 1, b) 4 och c) 6.Fig. 7. Inhibition of binding of plant lectins to saccharide-bearing microtiter plates prepared with saccharide-square acid monoamide intermediates a) 1, b) 4 and c) 6.

Detaljerad beskrivning av föredragna utföringsformer.Detailed description of preferred embodiments.

I en av uppfinningens utföringsformer väljes nämnda biomolekyl enligt formeln (I) ur gruppen bestående av en kolhydrat, ett protein, en peptid, en nukleosid, en nukleotid, en steroid, en lipid, en alkaloid, en sekundär metabolit, en sackarid, en sackaridsubstituterad alkyl- grupp och en sackaridsubstituterad svavelinnehållande alkylgrupp.In one embodiment of the invention, said biomolecule of formula (I) is selected from the group consisting of a carbohydrate, a protein, a peptide, a nucleoside, a nucleotide, a steroid, a lipid, an alkaloid, a secondary metabolite, a saccharide, a saccharide substituted alkyl group and a saccharide-substituted sulfur-containing alkyl group.

I en annan av uppfinningens utföringsformer våljes nämnda sackarid ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukosamin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, iduronsyra, en disackaride, en oligosackarid bestående av minst två av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav.In another embodiment of the invention, said saccharide is selected from the group consisting of glucose, mannose, galactose, glucosamine, galactosamine, fucose, fructose, xylose, neuramic acid, glucuronic acid, iduronic acid, a disaccharide, an oligosaccharide consisting of at least two of the above and monosaccharides. derivatives thereof.

I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer innehåller nämnda Rl i formel (I) från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis innehåller nämnda R1 från 10 till 20 kolatomer.In a further embodiment of the invention, said R 1 in formula (I) contains from 6 to 30 carbon atoms, preferably said R 1 contains from 10 to 20 carbon atoms.

I en annan av uppfinningens utföringsformer år nämnda X i formel (I) O, är nämnda Y i formel (I) O, är nämnda Z i formel (I) O och är nämnda R1 i formel (I) en decylgrupp.In another embodiment of the invention, said X in formula (I) is O, said Y in formula (I) is O, said Z in formula (I) is O and said R 1 in formula (I) is a decyl group.

I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer är nämnda biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagens- intermediär vald ur gruppen bestående av 2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino)etyl a~D~mannopyranosid (l), (ß-D-galaktopyranosyl)-(1-94)-ß-D-glukopyranosid (2), 2- (a-D- 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyl [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-I-enyl)amino]etyl galaktopyranosyl)-(I-»4)-(ß-D- galaktopyranosyl)-(l-+4)-ß- (3), D-glukopyranosid 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- « v s v = , 10 15 20 25 30 35 520 256 6 enyl)amino]etyl (2-acetamido-2-deoxy-ß-D-galakto- pyranosyl)-(l-+3)-(a-D~galaktopyranosyl)~(l-+4)-(ß-D- 2-[(2- (5-acet- galaktopyranosyl)-(1-#4)-B-D-glukopyranosid (4), decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl amido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2~ulopyrano- sylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-ß-D- (5), (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D- glukopyranosid 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- enyl)amino]etyl galakto-non-2-ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galakto- pyranosyl)-(l-+4)-[(a-L-fukopyranosyl)-(l~+3)]-2-acet- amido-2-deoxy-ß-D-glukopyranosid (6), 2-{2-[(2~decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyltio}etyl a-D-manno- pyranosid (7), 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioXocyklobut-l- enyl)amino]etyltio}etyl ß-D-glukopyranosid (8), or 2-{2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l-enyl)amino]etyltio}etyl (a-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-B-D-galaktopyranosid (9).In a further embodiment of the invention, said biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate is selected from the group consisting of 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino) ethyl α-D-mannopyranoside (1), (β-D -galactopyranosyl) - (1-94) -β-D-glucopyranoside (2), 2- (αD-2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl [(2-decyloxy) -3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl galactopyranosyl) - (1-4) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β- (3), D-glucopyranoside 2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-yl) enyl) amino] ethyl] ethyl (2-acetamido-2-deoxy-β-D-galactopyranosyl) - (1- + 3) - (αD-galactopyranosyl) ~ (1- + 4) - (β-D-2 - [(2- (5-acet-galactopyranosyl) - (1- # 4) -BD-glucopyranoside ( 4), decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl amido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-non-2-ulopyrano-silicone acid) - (2- + 3) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D- (5), (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-αD-glucopyranoside 2 - [(2-decyloxy-3) , 4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl galactonon-2-ulopyr anosylonic acid) - (2- + 3) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - [(αL-fucopyranosyl) - (1- ~ 3)] - 2-acetamido-2- deoxy-β-D-glucopyranoside (6), 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl α-D-mannopyranoside (7), 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl β-D-glucopyranoside (8), or 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1) -enyl) amino] ethylthio} ethyl (α-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -BD-galactopyranoside (9).

I en av uppfinningens utföringsformer omfattar förfarandet vidare, före nämnda återvinning, att uppsamla en reaktionslösning efter nämnda biokonjugeringsreaktion och bringa nämnda reaktionslösning, eventuellt efter en ändring, koncentrering utspädning och/eller tillsats av lösningsmedel, i kontakt med opolära medel.In one embodiment of the invention, the method further comprises, prior to said recovery, collecting a reaction solution after said bioconjugation reaction and contacting said reaction solution, optionally after a change, concentration of dilution and / or addition of solvents, with non-polar agents.

I en annan av uppfinningens utföringsformer är nämnda opolära medel valt ur gruppen bestående av en opolär fast fas och en opolär lösning.In another embodiment of the invention, said non-polar means is selected from the group consisting of a non-polar solid phase and a non-polar solution.

I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer är nämnda biomolekyl vald ur gruppen bestående av en kolhyd- en peptid, en nukleosid, en nukleotid, rat, ett protein, en steroid, en lipid, en alkaloid, en sekundär metabolit, en sackarid, en sackaridsubstituterad alkylgrupp och en sackaridsubstituterad svavelinnehàllande alkylgrupp.In a further embodiment of the invention, said biomolecule is selected from the group consisting of a carbohydrate, a peptide, a nucleoside, a nucleotide, rat, a protein, a steroid, a lipid, an alkaloid, a secondary metabolite, a saccharide, a saccharide-substituted alkyl group. and a saccharide-substituted sulfur-containing alkyl group.

Vilken annan biomolekyl känd för en fackman inom teknik- området kan självklart användas som alternativ till de ovan nämnda.Any other biomolecule known to a person skilled in the art can of course be used as an alternative to those mentioned above.

I ytterligare en annan av uppfinningens utförings- former är nämnda sackarid vald ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukosamin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, 10 15 20 25 30 35 » 1 \ . . I 520 256 7 iduronsyra, en disakarid, en oligosackarid bestående av minst tvä av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav. Vilken annan sackarid känd för en fackman inom teknikomrädet kan självklart användas som alternativ till de ovan nämnda sackariderna.In yet another embodiment of the invention, said saccharide is selected from the group consisting of glucose, mannose, galactose, glucosamine, galactosamine, fucose, fructose, xylose, neuramic acid, glucuronic acid,. . In 520 256 7 iduronic acid, a disaccharide, an oligosaccharide consisting of at least two of the above-mentioned monosaccharides and derivatives thereof. Any other saccharide known to a person skilled in the art can of course be used as an alternative to the above-mentioned saccharides.

I en annan av uppfinningens utföringsformer inne- fattar biomolekyl-intermediären enligt ovan nämnda formel (I) en sackarid i formen av en glykosid med en aminofunk- tionaliserad aglykon eller en aminofunktionaliserad och svavelinnehàllande aglykon, i vilken sackariden är vald ur gruppen bestående av glukos, mannos, galaktos, glukos- amin, galaktosamin, fukos, fruktos, xylos, neuraminsyra, glukoronsyra, iduronsyra, en disackaride, en oligo- sackarid bestående av minst tvà av de ovan nämnda monosackariderna och derivat därav. Vilken annan sackarid känd för en fackman inom teknikomrädet kan självklart användas som alternativ till de ovan nämnda sackariderna.In another embodiment of the invention, the biomolecular intermediate of the above formula (I) comprises a saccharide in the form of a glycoside with an amino-functionalized aglycone or an amino-functionalized and sulfur-containing aglycone, in which the saccharide is selected from the group consisting of glucose, mannose, galactose, glucosamine, galactosamine, fucose, fructose, xylose, neuramic acid, glucuronic acid, iduronic acid, a disaccharide, an oligosaccharide consisting of at least two of the abovementioned monosaccharides and derivatives thereof. Any other saccharide known to a person skilled in the art can of course be used as an alternative to the above-mentioned saccharides.

I ytterligare en annan av uppfinningens utförings- former innefattar nämnda R? i biomolekylkvadratsyra- monoamidkopplingsreagensintermediären enligt formel (I) från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis fràn 10 till 20 kolatomer. Det är mycket praktiskt att Rl kan väljas oberoende av strukturen pä biomolekylen.In yet another embodiment of the invention, said R in the biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate of formula (I) from 6 to 30 carbon atoms, preferably from 10 to 20 carbon atoms. It is very practical that R1 can be selected independently of the structure of the biomolecule.

I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer är den opolära fasta fasen, vilken intermediären bringas i kontakt med enligt förfarandet enligt uppfinningen, vald ur gruppen bestående av alkylerad silika (t.ex. C2, C4, C6, C8, C18, (t.ex. fenyl), cyklohexyl, cyanopropyl), arylerad silika resin-baserade fast-fasextraktions- sorbenter (t.ex. polystyren, co-polymer resiner) och extraktionsorbenter av blandad fast-fas.In a further embodiment of the invention, the non-polar solid phase, which the intermediate is contacted with according to the process of the invention, is selected from the group consisting of alkylated silica (eg C2, C4, C6, C8, C18, (e.g. phenyl), cyclohexyl, cyanopropyl), arylated silica resin-based solid phase extraction sorbents (eg polystyrene, copolymer resins) and mixed solid phase extraction sorbents.

I en utföringsform, hänför sig uppfinningen till en enkel, manuell eller automatiserad, upprening och ätervinning av oreagerat överskott av biomolekyl- kvadratsyramonoamidkopplingsreagens enligt formel (I) efter biokonjugering till en bärarmolekyl, enhet eller matris. 10 15 20 25 30 35 520 256 8 I ytterligare en utföringsform hänför sig förelig- gande uppfinning till upptäckten att biomolekylkvadrat- syramonoamidkopplingsreagensintermediårer enligt formel (I) kan enkelt extraheras in i en hydrofob lösning eller fast fas, exemplifierad av, men inte begränsad till, alkylerad silika (t.ex. C2, C4, C6, C8, C18, cyklohexyl, cyanopropyl etc.), arylerad silika (t.ex. fenyl etc ), resin-baserade fast~fas extraktionssorbenter (t.ex. polystyren, co-polymer resiner etc.) och extraktions- sorbenter av blandad fast~fas (d.v.s. sorbenter bestående av en blandning av 2 eller fler av ovan nämnda sorbenter). Biomolekylkvadratsyramonoamidkopplings- reagensintermediären enligt formel (I) kan således återvinnas ur komplexa reaktionsblandningar efter en biokonjugeringsreaktion till aminogrupp-innehållande bärarmolekyler eller matriser, exemplifierad av, men inte begränsad till, proteiner, peptider, fluorescensmarkörer, fasta polymer kulor, mikrotiter plattor, provrör, glasytor och kromatografimatriser så som silika, dextran, stärkelse, cellulosa, agarose etc. Extraktionen av biomolekylkvadratsyramonoamidkopplingsreagensinter- mediärer enligt formel (I) in i hydrofob lösning eller fast fas möjliggöres av de hydrofoba egenskaperna hos R1.In one embodiment, the invention relates to a simple, manual or automated, purification and recovery of unreacted excess biomolecular square acid monoamide coupling reagent of formula (I) after bioconjugation to a carrier molecule, moiety or matrix. In a further embodiment, the present invention relates to the discovery that biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediates of formula (I) can be easily extracted into a hydrophobic solution or solid phase, exemplified by, but not limited to, alkylated silica (eg C2, C4, C6, C8, C18, cyclohexyl, cyanopropyl etc.), arylated silica (eg phenyl etc), resin-based solid phase extraction sorbents (eg polystyrene, co polymer resins, etc.) and mixed solid phase extraction sorbents (ie sorbents consisting of a mixture of 2 or more of the abovementioned sorbents). Thus, the biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate of formula (I) can be recovered from complex reaction mixtures following a bioconjugation reaction to amino group-containing carrier molecules or matrices, exemplified by, but not limited to, proteins, peptides, fluorescence markers, solid glass beads, chromatography matrices such as silica, dextran, starch, cellulose, agarose, etc. The extraction of biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediates of formula (I) into hydrophobic solution or solid phase is made possible by the hydrophobic properties of R1.

Enkelheten hos extraktionsproceduren gör den lämplig för automatisering.The simplicity of the extraction procedure makes it suitable for automation.

I ytterligare en av uppfinningens utföringsformer, i biomolekyl-kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär enligt formel (I), nämnda X är O, nämnda Y är O, nämnda Z är O och nämnda Rl är en decyl grupp.In a further embodiment of the invention, in biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate of formula (I), said X is 0, said Y is 0, said Z is 0 and said R1 is a decyl group.

I en annan av uppfinningens utföringsformer är biomolekyl-kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediår enligt formel (I) vald ur, men inte begränsad till, gruppen bestående av2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-l- enyl)amino]etyl d-D-mannopyranosid (1), 2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (ß-D-galaktopyrano- syl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid (2), 2-[(2-decyloxy-3,4- dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (a-D-galaktopyranosyl)- (1-+4)-(B-D- galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid 10 15 20 25 30 35 520 256 9 (3), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (2-acetamido-2-deoxy-B-D-galaktopyranosyl)-(l-+3)-(a-D- galaktopyranosyl)-(1-+4)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)~ß- D-glukopyranosid (4), 2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut- 1-enyl)amino]etyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D- galakto~non-2-ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galakto- pyranosyl)-(1-+4)-ß-D-glukopyranosid (5), 2-[(2-decyloxy- 3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5-acetamido-3,5- dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2-ulopyranosylonsyra)- (2~+3)-(B-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-{(a-L-fukopyranosyl)- (1-+3)]-2-acetamido-2-deoxy-ß-D-glukopyranosid (6), 2-{2- [(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyltio}etyl a-D-mannopyranosid (7), 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklo- but-1-enyl)amino]etyltio}etyl ß-D-glukopyranosid (8), or 2-{2-[(2-decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl- tio}etyl (a-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D-galaktopyrano- sid (9).In another embodiment of the invention, biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediates of formula (I) are selected from, but not limited to, the group consisting of 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl dD-mannopyranoside ( 1), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-glucopyranoside (2), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (α-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - (BD-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D -glucopyranoside 10 15 20 25 30 35 520 256 9 (3), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (2-acetamido-2-deoxy-BD-galactopyranosyl) - (1- + 3) - (α-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-glucopyranoside (4), 2 - [(2- decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-αD-galacto-non-2-ulopyranosylonic acid) - (2- + 3) - (ß -D-galacto-pyranosyl) - (1- + 4) -β-D-glucopyranoside (5), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (5-acetamido- 3,5-dideoxy-D-glycero-αD-galac to-non-2-ulopyranosylonic acid) - (2 ~ + 3) - (BD-galactopyranosyl) - (1- + 4) - {(αL-fucopyranosyl) - (1- + 3)] - 2-acetamido-2- deoxy-β-D-glucopyranoside (6), 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl αD-mannopyranoside (7), 2- {2- [ (2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl β-D-glucopyranoside (8), or 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1) -enyl) amino] ethylthio} ethyl (α-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-galactopyranoside (9).

I föreliggande uppfinning är termen ”alkylgrupp” menad att innehålla från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer. Nämnda alkyl- grupp kan vara linjär eller grenad. Nämnda alkylgrupp kan också bilda en ring innehållande från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer.In the present invention, the term "alkyl group" is intended to contain from 6 to 30 carbon atoms, preferably from 10 to 20 carbon atoms. Said alkyl group may be linear or branched. Said alkyl group may also form a ring containing from 6 to 30 carbon atoms, preferably from 10 to 20 carbon atoms.

I föreliggande uppfinning är termen ”alkenylgrupp” menad att innehålla från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer. Nämnda alkenylgrupp innehåller minst en dubbelbindning.In the present invention, the term "alkenyl group" is intended to contain from 6 to 30 carbon atoms, preferably from 10 to 20 carbon atoms. Said alkenyl group contains at least one double bond.

I föreliggande uppfinning är termen ”alkynylgrupp” menad att innehålla från 6 till 30 kolatomer, företrädesvis från 10 till 20 kolatomer. Nämnda alkynylgrupp innehåller minst en trippelbindning.In the present invention, the term "alkynyl group" is intended to contain from 6 to 30 carbon atoms, preferably from 10 to 20 carbon atoms. Said alkynyl group contains at least one triple bond.

I föreliggande uppfinning är termen ”arylgrupp” menad att innehålla från 6 till 18 kolatomer.In the present invention, the term "aryl group" is intended to contain from 6 to 18 carbon atoms.

De ovan nämnda grupperna kan naturligtvis substitueras med vilken annan känd substituent känd inom området organisk kemi. Grupperna kan också substitueras med två eller flera substituenter. 10 15 20 25 30 35 1:., 142.' ", *' *' W - r^ f | - ' . ' . I* f = . i i; ' : ; 1 10 I ytterligare en utföringsform hänför sig uppfin- ningen till àtervinnande av en biomolekyl-kvadratsyra- monoamidkopplingsreagensintermediär enligt ovan nämnda formel efter konjugering till en naturlig eller konstgjord bärarmolekyl eller enhet, till exempel, men inte begränsad till, en polymerkula, en mikrotiterbrunn, ett protein, en fluorescensmarkör, en affinitetsmatris.The above groups may, of course, be substituted with any other known substituent known in the art of organic chemistry. The groups may also be substituted with two or more substituents. 10 15 20 25 30 35 1:., 142. ' In a further embodiment, the invention relates to the recovery of a biomolecule-square acid monoamide coupling reagent intermediate according to the above-mentioned embodiment. formula after conjugation to a natural or artificial carrier molecule or entity, for example, but not limited to, a polymer bead, a microtiter well, a protein, a fluorescence marker, an affinity matrix.

I ytterligare en annan utföringsform hänför sig föreliggande uppfinning till ätervinnande av en biomolekyl-kvadratsyramonoamidkopplingsreagensintermediär enligt ovan nämnda formel efter konjugering till en aminofunktionaliserad naturlig eller konstgjord bärar- molekyl eller enhet, till exempel, men inte begränsad till, en polymerkula, en mikrotiter brunn, ett protein, en fluorescensmarkör, en affinitetsmatris.In yet another embodiment, the present invention relates to the recovery of a biomolecular-square acid monoamide coupling reagent intermediate of the above formula after conjugation to an amino-functionalized natural or artificial carrier molecule or moiety, for example, but not limited to, a polymer bead, a microtiter well, a protein, a fluorescence marker, an affinity matrix.

Föreliggande uppfinning har sitt ursprung i upptäckten att nyttjande av kvadratsyraestrar av hydro- foba alkoholer i biokonjgeringskemi resulterar i kvadrat- syraestermonoamider som bär en hydrofobisk markör som frisläppes under biokonjugeringsreaktionen (se fig. l), d.v.s. markören är spårlös (hydrofoba markör kan inter- ferera med biomolekylens biologiska aktivitet), varvid sàledes nödvändigheten av att märka varje enskild bio- molekyl undvikes eftersom den hydrofoba markören är närvarande i kvadratsyraesterreagenset_ Överskottet av oreagerad kvadratsyraestermonoamid efter biokonjugerings- reaktion kan enkelt återvinnas medelst förfarandet enligt uppfinningen och kan återanvändas i vidare biokonjuge- ringsreaktioner.The present invention originates from the discovery that the use of quadratic acid esters of hydrophobic alcohols in bioconjugation chemistry results in quadric acid ester monoamides bearing a hydrophobic marker released during the bioconjugation reaction (see Fig. 1), i.e. the marker is trace-free (hydrophobic marker may interfere with the biological activity of the biomolecule), thus avoiding the need to label each individual biomolecule because the hydrophobic marker is present in the quadratic acid ester reagent. invention and can be reused in further bioconjugation reactions.

Metodologi/Experimentellt Generella metoder NMR experiment togs med antingen en Bruker ARX 300 MHz, en Bruker DRX 400 MHz eller en Varian Unity 400 MHz spectrometer vid rumstemperatur. IH NMR tilldelningar erhölls ur COSY experiment. Optiska aktiviteter mättes med en Perkin-Elmer 241 polarimeter. Högupplösta FAB masspektra togs med ett JEOL SX-120 instrument. MALDI-TOF MS togs med ett Bruker Biflex III instrument (använt i 10 15 20 25 30 35 520 256 11 postiv mod) med gentisinsyra (2,5-dihydroxybensosyra) som matris. Lektin-peroxidas konjugat köptes fràn Sigma- Aldrich Aldrich (L6397) för l, Arachis L7759) för 2, Toxin RCA12O (L2758) (L539l) för 3 , (weat germ agglutinin, L3892) för 5 och 6).Methodology / Experimental General methods NMR experiments were taken with either a Bruker ARX 300 MHz, a Bruker DRX 400 MHz or a Varian Unity 400 MHz spectrometer at room temperature. 1 H NMR assignments were obtained from COSY experiments. Optical activities were measured with a Perkin-Elmer 241 polarimeter. High-resolution FAB mass spectra were taken with a JEOL SX-120 instrument. MALDI-TOF MS was taken with a Bruker Biflex III instrument (used in positive mode) with gentisic acid (2,5-dihydroxybenzoic acid) as matrix. Lectin-peroxidase conjugate was purchased from Sigma-Aldrich Aldrich (L6397) for 1, Arachis L7759) for 2, Toxin RCA12O (L2758) (L5391) for 3, (weat germ agglutinin, L3892) for 5 and 6).

PBS buffert: 24 g NaCl, 0.6 g KCl, 3.46 g NaH2PO4*H2O och 0.6 g KH2PO4 i 1000 mL H20. pH justerades till 7.2.PBS buffer: 24 g NaCl, 0.6 g KCl, 3.46 g NaH 2 PO 4 * H 2 O and 0.6 g KH 2 PO 4 in 1000 mL H 2 O. The pH was adjusted to 7.2.

Tween20/PBS lösning: 0.10 mL Tween20 i 200 mL PBS buffert.Tween20 / PBS solution: 0.10 mL Tween20 in 200 mL PBS buffer.

(Concavalin A Ricinus för 2 och 4, och Triticum hypogaea (peanut agglutinin, communis (Castorbean) Bandeira simplicifolia vulgaris Lektin lösningar: lmg av lektin i 1 mL Tween20/PBS lösning filtrerades genom ett 0.22 pm filter. Den resulterande lösningen späddes därefter mellan 25-50 gánger i Tween20/PBS.Concavalin A Ricinus for 2 and 4, and Triticum hypogaea (peanut agglutinin, communis (Castorbean) Bandeira simplicifolia vulgaris Lectin solutions: lmg of lectin in 1 mL Tween20 / PBS solution was filtered through a 0.22 μm filter. The resulting solution was then diluted between -50 times in Tween20 / PBS.

Cova buffert: 117 g NaCl, 10 g MgSO4*7H2O och 0.50 mL Tween20 i 1000 mL PBS buffert.Cova buffer: 117 g NaCl, 10 g MgSO 4 * 7H 2 O and 0.50 mL Tween20 in 1000 mL PBS buffer.

Citronsyra buffert: 7.98 g citronsyramonohydrat och 9.46 g Na2HPO4 i 1000 mL H20. pH justerades till 5.0. o-Fenylendiamin substrat lösning: Till 6.0 mg o-fenylen- diamin i 10 mL citronsyra buffert tillsattes 5 uL H2O2.Citric acid buffer: 7.98 g citric acid monohydrate and 9.46 g Na 2 HPO 4 in 1000 mL H 2 O. The pH was adjusted to 5.0. o-Phenylenediamine substrate solution: To 6.0 mg of o-phenylenediamine in 10 mL of citric acid buffer was added 5 μL of H 2 O 2.

Lösningen användes omedelbart.The solution was used immediately.

NaHCO3 buffert: 20 g NaHCO3 i 1000 mL H20. pH justerades till 9.00. 4-Nitrofenyl d-D-mannopyranosid köptes fràn Sigma- Aldrich. Aminofunktionaliserad Covalink mikrotiter (Roskilde, Danmark). Mikrotiter platt absorbanser lästes pà en InterMed ImmunoReader NJ-2000. plattor var fràn Nalge Nunc International Isolute C-18 pluggar var frän International Sorbent Technology.NaHCO 3 buffer: 20 g NaHCO 3 in 1000 mL H 2 O. The pH was adjusted to 9.00. 4-Nitrophenyl d-D-mannopyranoside was purchased from Sigma-Aldrich. Amino-functionalized Covalink microtiter (Roskilde, Denmark). Microtiter flat absorbances were read on an InterMed ImmunoReader NJ-2000. plates were from Nalge Nunc International Isolute C-18 plugs were from International Sorbent Technology.

Syntes av kvadratsyradidecylester (3,4-Didecyloxy- cyklobut-3-en-1,2-dion) Kvadratsyra (3,4-hydroxy-cyklobut-3-en-1,2-dion, 9.13 mmol) (7.6 mL, 39.85 mmol) àterloppskokades i toluen (7.5 mL) 1.042 g, och dekanol i en Dean-Stark fälla under 12 timmar. Toluen indunstades och den återstående dekanolen destillerades under högvakuum. Återstoden renades med flash kromatografi (heptan etyl acetat 2:1) 10 15 20 25 30 35 q 3.., 520 256 ;¿¿¿¿ 12 vilket gav 2 (2.645 g, 73%), som en klar vätska som långsamt stelnade, sm.p. 34°C. lH-NMR (400 MHz, CDCl3): Ö 4.68 (tr, 2 H, J 6.7 H2, OC§2CH2), l.8l (dt, 2 H, J 6.7 Hz, OCH2C§2CH2), 1.43-1.28 (m, 14 H, CH2(C§2)7CH3), 0.89 (t, 3H, J 6.6 HZ, CH2C§3). l3C-NMR (400 MHZ, CDCl3): Ö 189.8, 184.71, 32.3, 30.3, 29.9, 30.0, 29.9, 29.7, 29.6, 25.7, 23.1, 14.5. HR FAB-MS beräknad för C24H43O4 (M+H): 395.3161; funnen: 395 3170.Synthesis of quadratic acid didecyl ester (3,4-Didecyloxy-cyclobut-3-en-1,2-dione) Square acid (3,4-hydroxy-cyclobut-3-en-1,2-dione, 9.13 mmol) (7.6 mL, 39.85 mmol) was refluxed in toluene (7.5 mL) at 1,042 g, and decanol in a Dean-Stark trap for 12 hours. Toluene was evaporated and the remaining decanol was distilled under high vacuum. The residue was purified by flash chromatography (heptane ethyl acetate 2: 1) q 3 .., 520 256; ¿¿¿¿12 to give 2 (2,645 g, 73%) as a clear liquid which slowly solidified , m.p. 34 ° C. 1 H-NMR (400 MHz, CDCl 3): δ 4.68 (tr, 2H, J 6.7 H2, OC§2CH2), 1.8l (dt, 2H, J 6.7 Hz, OCH2C§2CH2), 1.43-1.28 (m , 14 H, CH2 (C§2) 7CH3), 0.89 (t, 3H, J 6.6 HZ, CH2C§3). 13 C-NMR (400 MHz, CDCl 3): δ 189.8, 184.71, 32.3, 30.3, 29.9, 30.0, 29.9, 29.7, 29.6, 25.7, 23.1, 14.5. HR FAB-MS calcd for C 24 H 43 O 4 (M + H): 395.3161; found: 395 3170.

Typisk procedur för syntes av kvadratsyradecylester- glykosider 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl a-D- mannopyranosid (1). Till en lösning av 2-aminoetyl a-D- mannopyranosid 3” (468 mg, 1.88 mmol) i DMF (lOmL) (250 mg, 0.63 tillsattes kvadratsyra didecyl ester mmol) och Et3N (60 HL, 0.43 mmol). Efter 24 h koncentrerades lösningen och àterstoden flash kromatograferades (S102, CH2Cl2:MeOH 85:15), (165 mg, 83%) vitt fast material; [a]D23 +lO° (c 0.1, H20). lH-NMR (400 vilket gav 1 som ett MHz, cD3oD>= 6 4.78 (d, 1 H, J 1.6 Hz, H-1), 4.70 (dt, 2H, J 14.2, 7.6 Hz, ocH2cH2cH2), 3.89-3.57 (m, 8H), 3.51 (dd, 1H, J 2.7, 3.8 Hz, H~5), 1.83 (dt, 2H, J 5.6, 6.3 Hz, ocH2cH2cH2), 1.46-1.31 (m, 14H, (cH2)7cH3), 0.90 (t, 3H, J 6.7 Hz, CH3). l3c-NHR (400 MHz, cD3oD)= 5 184.0, 188.8, 184.0, 177.4, 177.1, 174.2, 100.7, 100.5, 73 9, 73.8, 71.5, 67.5, 66.7, 66.5, 61.9, 44.4, 44.0, 32.1, 30.1 29.7, 29.7, 29.5, 29.3, 25.5, 25.4, 22.8, 13.5. HR FA8-Ms beräknad för c22H38No9 460.2552. funnen: Pà liknande sätt framställdes: 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (ß-D- galaktopyranosyl)-(1-è4)-ß-D-glukopyranosid (2). [ü]D23 +14° (C 0.1, HHM. IH-NMR (400 MHz, cD3oD)= ö 4.59 (q, 2H, J 5.0 Hz, ocH2(cHg8>, 4.26 (d, 1H, J 7.4 Hz, H-1), 4.24 (d, 1 H, J 7.6 Hz, H-1'), 3.27 (ad, 1H, J 4.6, 8.2 Hz, H- 2), 1.72 (dc, 2 H J 6.7, 7.5 Hz, ocHHHg(CHﬁ7 >, 1.35- 1.21 (m, 14H, (cHg,cH3>, 0.80 (6, 3H, J 6.7 Hz, CHB). ”C- NMR (400MHz, cngon). 6 104.1, 103.2, 79.6, 76.1, 75.6, 75.4, 73.9, 73.8, 71.6, 69.3, 68.8, 32.0, 30.1, 29.62, 10 15 20 25 30 35 . | - . . » 520 256 §j.¿Jjj.f-._H,= 13 29.60, 29.4, 29.3, 25.4, 22.7, 13.4. HR FAB~MS beräknad för C2$h7NOMNa (M+Na): 644.2895; funnen 644.2894. 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (a~D- galaktopyranosyl)-(1-+4)-(B-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß- D-glukopyranosid (3). [a]D23 + 29° (C 0.1, H20). lH-NMR (400 MHZ, CD3OD): Ö 4.86 (d, 1H, J 3.6 HZ, H-1"), 4.59 (q, 2H, J 5.4 HZ, OCë2CH2), 4.32 (d, 1H, J 7.2 HZ, H-1'), 4.25 (d, 1H, J 7.8 Hz, H-1), 4.16 (t, 1H, J 6.0 Hz, H- 5"), 3.17 (dd, 1H, J 4.6, 6.2 Hz, H-2), 1.72 (dt, 2H, J 3.0, 6.6 Hz, ocH2cH2), 1.36-1.17 (m, 14H, (cH2)7CH3>, 0.60 (t, 3H, J 6.7 HZ, CE3). l3C~NMR (400 MHZ, CD3OD): Ö 189.2, 188.9, 184.8 183.8, 177.5, 177.2, 173.7, 173.3, 105.9, 104.4, 104.0, 103.2, 101.7, 80.0, 78.8, 78.6, 76.3, 75.5, 75.4, 75.1, 74.2, 73.8, 73.7, 72.3, 72.2, 71.9, 71.7, 70.3, 70.1 69.6, 69.4, 69.2, 68.8, 61.7, 61.6, 60.9, 60.5, 44.7, 44.4, 32.0, 31.9, 30.1, 29.62, 29.61, 29.4, 29.3, 25.4, 22.71, 22.68, 13.4. HR FAB-MS beräknad för C34H57NO19Na (M+Na): 806.3423; 806.3434. 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (2- funnen: acetamido-2-deoxy-ß-D-galaktopyranosyl)-(1-#3)-(a-D- galaktopyranosy1)-(1-+4)-(B-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)-ß- D-glukopyranosid (4). IH-NMR 400 MHz (CD3OD) Ö 4.89 (d, 1H, J'3.8 HZ, H-1"), 4.69 (q, 2H, J 5.3 HZ, OCg2CH2CH2>, 4.62 (d, 1 H, J 8.4 HZ, H-1"'), 4.41 (d, 1 H, J 7.5 HZ, virtuella kopplingar, H-1'), 4.29 (d, 1H, J 7.3 Hz, H-1), 4.27 (br t, 1H, J 6.2 HZ, H-5"), 4.16 (br d, 16H, J 1.8 HZ, H-4"), 3.42 (br dt, 1H, J 3.3, 9.5 HZ, H-5), 2.01 (S, 3 H, Ac), 1.72 (q, 2H, J 7.2 Hz, ocH2cH2cH2), 1.42- l.27 (m, 14H, (C§2)7CH3), 0.90 (t, 3H, J 7.1 HZ, CH2Cë3); HR beräknad för C42H70N2O24Na 1009.4216. 2-[(2-Decyloxy~3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5- (M+Na): l009.4216, funnen: acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2- ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)- ß-D-glukopyranosid (5). lH-NMR 300 MHz (CD3OD) Ö 4.68 (br q, 2H, J 6.7 HZ, OCE2CH2CH2), 4.43 (d, 1H, J 7.8 HZ, H- 1'), 4.35 (d, 1H, J 7.8 HZ, H-1), 4.10 (dd, 1H, J 3.1, 9.7 HZ, H-3'), 3.27 (t, 1H, J 8.1 HZ, H-2), 2.86 (dd, 1H, 10 15 20 25 30 35 520 256 14 J 3.9, 12.3 Hz, H-3"e), 2.01 (S, 7.2 Hz, ocH¿3§cH2), 1.72 (t, 1 47-1 28 (m, 14H, cH2cg3). 3H, Ae), 1H, J 11.3 Hz, H-3"a), (cg2)7cH3), 0.90 (c, 3H, J 6.9 Hz, 2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1-enyl)amino]etyl (5- acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-a-D-galakto-non-2- ulopyranosylonsyra)-(2-+3)-(ß-D-galaktopyranosyl)-(l-+4)- [(a-L-fukopyranosyl)-(1-+3)]-2-acetamido~2-deoxy-ß-D- glukopyranosid (6). lH~NMR 300 MHz (CD3OD) Ö 5.02 (d, 1H, J 3.5 Hz, H-1'>, 4.80 (br q, 1H, J 6.6 Hz, H-5'>, 4.68 (br q, 2H, J 6.7 Hz, ocgﬁﬁhcﬂz), 4.50 (d, 1H, J 7.8 Hz, H-1"), 4.46 (d, 1H, J 8.2 Hz, H~1), 4.03 (dd, 1H, J 3.1, 9.7 Hz, H-3"), 2.87 (dd, 1H, J 3.9, 12.3 Hz, H~3"'e), 2.01 (s, 3H, Ae), 1.94 (28, 3H, Ae), 1.81 (q, 2H, J 6.8 Hz, ocH4gycH2), 1.72 (n, 1H, J 11.8 Hz, H-3"'a>, 1.47- 1.28 (m, 14H, (cg2)7cH3), 1.16 (d, 3H, J 6.6 Hz, H-6'), 0.90 (t, 3H, J 6.9 Hz, cH2cg3).Typical procedure for the synthesis of quadric acid decyl ester glycosides 2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl α-D-mannopyranoside (1). To a solution of 2-aminoethyl α-D-mannopyranoside 3 ”(468 mg, 1.88 mmol) in DMF (10 mL) (250 mg, 0.63 was added quadratic acid didecyl ester mmol) and Et 3 N (60 HL, 0.43 mmol). After 24 h, the solution was concentrated and the residue flash was chromatographed (S10 2, CH 2 Cl 2: MeOH 85:15), (165 mg, 83%) white solid; [α] D 23 + 10 ° (c 0.1, H 2 O). 1 H-NMR (400 giving 1 as a MHz, cD 3 OD> = δ 4.78 (d, 1H, J 1.6 Hz, H-1), 4.70 (dt, 2H, J 14.2, 7.6 Hz, ocH 2 cH 2 cH 2), 3.89-3.57 (m, 8H), 3.51 (dd, 1H, J 2.7, 3.8 Hz, H ~ 5), 1.83 (dt, 2H, J 5.6, 6.3 Hz, ocH2cH2cH2), 1.46-1.31 (m, 14H, (cH2) 7cH3 ), 0.90 (t, 3H, J 6.7 Hz, CH3). 13 C-NHR (400 MHz, cD3oD) = δ 184.0, 188.8, 184.0, 177.4, 177.1, 174.2, 100.7, 100.5, 73 9, 73.8, 71.5, 67.5 , 66.7, 66.5, 61.9, 44.4, 44.0, 32.1, 30.1 29.7, 29.7, 29.5, 29.3, 25.5, 25.4, 22.8, 13.5 HR FA8-Ms calculated for c22H38No9 460.2552. Found: Similarly prepared: 2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (β-D-galactopyranosyl) - (1- (4) -β-D-glucopyranoside (2). [Α] D 23 + 14 ° (C 0.1 1 H-NMR (400 MHz, cD 30 D) = δ 4.59 (q, 2H, J 5.0 Hz, ocH 2 (cHg8>, 4.26 (d, 1H, J 7.4 Hz, H-1), 4.24 (d, 1H , J 7.6 Hz, H-1 '), 3.27 (ad, 1H, J 4.6, 8.2 Hz, H-2), 1.72 (dc, 2 HJ 6.7, 7.5 Hz, ocHHHg (CH ﬁ7>, 1.35- 1.21 (m, 14 H, (cHg, cH 3>, 0.80 (6, 3H, J 6.7 Hz, CHB). ”C , 75.6, 75.4, 73.9, 73.8, 71.6, 69.3, 68.8, 32.0, 30.1, 29.62, 10 15 20 25 30 35. | -. . »520 256 §j.¿Jjj.f -._ H, = 13 29.60, 29.4, 29.3, 25.4, 22.7, 13.4. HR FAB-MS calcd for C 21 H 17 NOMNa (M + Na): 644.2895; found 644.2894. 2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (α-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - (BD-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β - D-glucopyranoside (3). [α] D 23 + 29 ° (C 0.1, H 2 O). 1 H-NMR (400 MHz, CD 3 OD): δ 4.86 (d, 1H, J 3.6 Hz, H-1 "), 4.59 (q, 2H, J 5.4 Hz, OC 2 CH 2), 4.32 (d, 1H, J 7.2 Hz, H-1 '), 4.25 (d, 1H, J 7.8 Hz, H-1), 4.16 (t, 1H, J 6.0 Hz, H-5 "), 3.17 (dd, 1H, J 4.6, 6.2 Hz, H -2), 1.72 (dt, 2H, J 3.0, 6.6 Hz, ocH2cH2), 1.36-1.17 (m, 14H, (cH2) 7CH3>, 0.60 (t, 3H, J 6.7 HZ, CE3). 400 MHz, CD3OD): Ö 189.2, 188.9, 184.8 183.8, 177.5, 177.2, 173.7, 173.3, 105.9, 104.4, 104.0, 103.2, 101.7, 80.0, 78.8, 78.6, 76.3, 75.5, 75.4, 75.1, 74.2, 73.8, 73.7, 72.3, 72.2, 71.9, 71.7, 70.3, 70.1 69.6, 69.4, 69.2, 68.8, 61.7, 61.6, 60.9, 60.5, 44.7, 44.4, 32.0, 31.9, 30.1, 29.62, 29.61, 29.4, 29.3, 25.4, 22.71 , 22.68, 13.4 HR FAB-MS calculated for C 34 H 57 NO 19 Na (M + Na): 806.3423; 806.3434. 2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl 2-deoxy-β-D-galactopyranosyl) - (1- # 3) - (α-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - (BD-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-glucopyranoside ( 4) 1 H-NMR 400 MHz (CD 3 OD) δ 4.89 (d, 1H, J '3.8 HZ, H-1 "), 4.69 (q, 2H, J 5.3 HZ, OCg2C H2CH2>, 4.62 (d, 1H, J 8.4 Hz, H-1 "'), 4.41 (d, 1H, J 7.5 Hz, virtual connections, H-1'), 4.29 (d, 1H, J 7.3 Hz , H-1), 4.27 (br t, 1H, J 6.2 HZ, H-5 "), 4.16 (br d, 16H, J 1.8 HZ, H-4"), 3.42 (br dt, 1H, J 3.3, 9.5 Hz, H-5), 2.01 (S, 3H, Ac), 1.72 (q, 2H, J 7.2 Hz, ocH2cH2cH2), 1.42- l.27 (m, 14H, (C§2) 7CH3), 0.90 (t, 3H, J 7.1 Hz, CH 2 Cl 3); HR calculated for C 42 H 70 N 2 O 24 Na 1009.4216. 2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (5- (M + Na): 1009.4216, found: acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-αD- galactonon-2-ulopyranosylonic acid) - (2- + 3) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - β-D-glucopyranoside (5). 1 H-NMR 300 MHz (CD 3 OD) δ 4.68 (br q, 2H, J 6.7 Hz, OCE2CH2CH2), 4.43 (d, 1H, J 7.8 HZ, H-1 '), 4.35 (d, 1H, J 7.8 HZ, H -1), 4.10 (dd, 1H, J 3.1, 9.7 Hz, H-3 '), 3.27 (t, 1H, J 8.1 HZ, H-2), 2.86 (dd, 1H, 10 15 20 25 30 35 520 256 14 J 3.9, 12.3 Hz, H-3 "e), 2.01 (S, 7.2 Hz, ocH¿3§cH2), 1.72 (t, 1 47-1 28 (m, 14H, cH2cg3). 3H, Ae) , 1H, J 11.3 Hz, H-3 "a), (cg2) 7cH3), 0.90 (c, 3H, J 6.9 Hz, 2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-α-D-galacto-non-2-ulopyranosylonic acid) - (2- + 3) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) - [ (αL-fucopyranosyl) - (1- + 3)] - 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (6) 1 H-NMR 300 MHz (CD 3 OD) δ 5.02 (d, 1H, J 3.5 Hz, H-1 '>, 4.80 (br q, 1H, J 6.6 Hz, H-5'>, 4.68 (br q, 2H, J 6.7 Hz, ocg ﬁﬁ hc ﬂ z), 4.50 (d, 1H, J 7.8 Hz, H-1 "), 4.46 (d, 1H, J 8.2 Hz, H ~ 1), 4.03 (dd, 1H, J 3.1, 9.7 Hz, H-3"), 2.87 (dd, 1H, J 3.9, 12.3 Hz, H ~ 3 "'e), 2.01 (s, 3H, Ae), 1.94 (28, 3H, Ae), 1.81 (q, 2H, J 6.8 Hz, ocH4gycH2), 1.72 (n, 1H, J 11.8 Hz, H-3 "'a>, 1.47- 1. 28 (m, 14H, (cg2) 7cH3), 1.16 (d, 3H, J 6.6 Hz, H-6 '), 0.90 (t, 3H, J 6.9 Hz, cH2cg3).

Typisk procedur för syntes av svavelinnehàllande kvadratsyradecylesterglykosider 2-{2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1- enyl)amino]etyltio}etyl Q-D-mannopyranosid (7). Till en lösning av 2-bromoetyl d-D-mannopyranosid 10” (180 mg, 0.395 mmol) i DMF (5 mL) under N2 tillsattes cesium (140 mg, 0.430 mmol) (75 pL, om över natt. Reaktionsblandningen spàddes med vatten (10 (2X3O mL). karbonat och 2-(t-butoxykarbonyl- amino)etanetiol 0.430 mmol) och lösningen rördes mL) och extraherades med CH2Cl2 (MQSOU flash kromatograferades Den organiska och koncentrerades. Återstoden (S102, för att ge 2-[2-(t-butoxykarbonylamino)etyltio]etyl (191 mg, 87%) som en klar sirap. Genom en lösning av en del av 0.096 mmol) i MeOH (25 mL) bubblades vid 0°C i 15 min. Lösningen rördes om över natt fasen torkades heptanzetyl acetat 1:2) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl a-D-mannopyranosid återstoden (53 mg, Hcl (9) vid rumstemperatur. Lösningsmedlet evaporerades och (10mL), Et3N (27 pL, 0.192 mmol) (133 mg, 0.336 mmol) återstoden löstes i DMF och kvadratsyradidecylester tillsattes, och lösningen rördes om i 48 timmar vid 1.82 (q, 2H, J 10 15 20 25 30 35 520 256 15 rumstemperatur. Lösningsmedlet evaporerades och återstoden flash kromatograferades (S102, CH2Cl2:MeOH 85:15) (43 mg, 87%) substans; [a]D20 +10° (C 1.0, H20). 1H NMR (400 MHz, CD3OD): Ö 4.79 (br S, lH, H-1), 4.76 (t, 1H, J 6.4 HZ, OCEﬂ1hCH2), 4.73 (t, lH, J 6.4 Hz, OC§2CH2CH2), 2.79 (m, för att ge 7 som en kletigt fast 46, cH2scH2), 1.81 (dc, 2H, J 6.4, 7.2 Hz, ocH2cg2(cH2>ﬁ, 1.50-1 24 (m, 14H, (cg2)7cH3), 0.89 (6, 3H, J 8.4 Hz, CH3). ”c«NMR (400MHz, cD3oD)= 6 173.7, 100.5, 73.7, 71.5, 71.0, 67.4, 67.3, 67.2, 61.8, 48.6, 48.3, 48.1, 47.9, 47.7, 47.5, 47.3, 44.2, 43.6, 33.1, 32.8, 32.0, 31.3, 31.0, 30.3, 29.5, 29.4, 29.2, 25.4, 25.3, 22.6, 13.4. HR FAB-MS beräknad för C24H41NO9SNa (M+Na): 542.2400; funnen: 542.2413.Typical procedure for the synthesis of sulfur-containing square acid decyl ester glycosides 2- {2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl Q-D-mannopyranoside (7). To a solution of 2-bromoethyl dD-mannopyranoside 10 ”(180 mg, 0.395 mmol) in DMF (5 mL) under N 2 was added cesium (140 mg, 0.430 mmol) (75 μL, overnight). The reaction mixture was diluted with water (10 Carbonate and 2- (t-butoxycarbonylamino) ethanethiol 0.430 mmol) and the solution was stirred (mL) and extracted with CH 2 Cl 2 (MQSOU flash was chromatographed on the organic and concentrated. (t-butoxycarbonylamino) ethylthio] ethyl (191 mg, 87%) as a clear syrup. Through a solution of a portion of 0.096 mmol) in MeOH (25 mL) was bubbled at 0 ° C for 15 minutes. phase, heptanzetyl acetate was dried 1: 2) 2,3,4,6-tetra-O-acetyl αD-mannopyranoside residue (53 mg, HCl (9) at room temperature The solvent was evaporated and (10 mL), Et 3 N (27 μL, 0.192 mmol ) (133 mg, 0.336 mmol) the residue was dissolved in DMF and quadratic acid didecyl ester was added, and the solution was stirred for 48 hours at 1.82 (q, 2H, J 5 15 20 25 30 5 520 256 The residue was evaporated and the residue was flash chromatographed (S10 2, CH 2 Cl 2: MeOH 85:15) (43 mg, 87%) substance; [α] D 20 + 10 ° (C 1.0, H 2 O). 1 H NMR (400 MHz, CD 3 OD): δ 4.79 (br S, 1H, H-1), 4.76 (t, 1H, J 6.4 Hz, OCE ﬂ1 hCH2), 4.73 (t, 1H, J 6.4 Hz, OC§2CH2CH2), 2.79 (m, to give 7 as a sticky solid 46, cH2scH2), 1.81 (dc, 2H, J 6.4, 7.2 Hz, ocH2cg2 (cH2> ﬁ, 1.50-1 24 (m, 14H, (cg2) 7cH3), 0.89 (6, 3H, J 8.4 Hz, CH 3). 47.7, 47.5, 47.3, 44.2, 43.6, 33.1, 32.8, 32.0, 31.3, 31.0, 30.3, 29.5, 29.4, 29.2, 25.4, 25.3, 22.6, 13.4 HR FAB-MS calculated for C24H41NO9SNa (M + Na): 542.2400 ; found: 542.2413.

Pä liknande sätt framställdes: 2-{2-L(2-necyloxy-3,4-di6x66yk16but-1- eny1)amino]ety1tio}etyl ß-D-glukopyranosid (8). [u]D23 -7° (C 0.7, MGOH). lH-NMR 400 MHZ (CD3OD) Ö 4.71 (dt, 2H, J 6.4, 15.8 H2, OCE2CH2CH2), 4.31 (d, lH, LT 7.7 Hz, virtuella kopplingar, H-1), 1.82 (m, 2H, OCH2C§2CH2), 1.47-1.29 (m, 14H, (cg2),cH3), 0.90 (t, 3H, J 6.77 Hz, (cH2)8cg3>; 130-NMR 400MHz (cD3oD) 6 189.1, 188.7, 183.9, 183.8, 177.3, 177.1, 173.9, 103.5, 77.1, 74.1, 73.9, 73.8, 70.6, 69.8, 69.7, 61.8, 44.3, 43.8, 33.0, 32.8, 32.1, 31.9, 31.3, 31.0, 30.1, 29.6, 29.5, 29.3, 25.5, 25.4, 22.7, 13.5; HR FAB-M8 beräknad för c24H41No9sNa (M+Na): 542.2400; funnen: 542.2389. 2-{2-[(2-Decyloxy-3,4-dioxocyklobut-1- enyl)amino]etyltio}etyl (a-D-galaktopyranosyl)-(1-+4)-ß-D- galaktopyranosid (9). [a]D23 +34° (C 1.0, H20). lH-NMR 400 MHZ (CDCl3:CD3OD:IbO) Ö 4.77 (Ö, lH, J 2.9 HZ, H-1'), 4.48 (m, 2H, OCëﬂ¶hCH2), 4.12 (d, 1H, J 7.5 HZ, H-1), 4.03 (t, lH, J 5.5 H2, H-5'), 3.30 (dd, lH, J 7.5, 9.2 H2, H-2), 1.58 (m, 2H, OCH2C§2CH2), 1.24-1.03 (m, 14H, (Cë2)7CH3), 0.66 (t, 3H, J 6.7 H2, (CH2)gC§3); l3C-NMR 400MHZ (CDCl3:CD3OD:D2O) Ö 188.7, 182.7, 176.9, 172.5, 103.1, 100.6, 77.6, 74.1, 73.6, 73.5, 72.7, 71.0, 70.9, 69.3, 69.1, 68.9, 68.7, 60.9, 59.3, 43.7, 43.0, 32.3, 31.3, 10 15 20 25 30 35 520 256 §j;;:fu¿_; 16 31.0, 24.7, (M+Na): 30.4, 29.5, 22.1, 13.3; 704.2828; Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester- (1-9) till BSA Bovin serum albumin (BSA, mg, 5.44 pmol) löstes i NaHCO3 buffert 29.0, 28.9, 28.7, 28.63, 28.58, 24.8, HR FAB-MS beräknad fÖr C3OH51NO14SNa funnen: 704.2916. glykosider 62 mg, 0.93 pmol) och 1 (2.5 (2.5 mL) och rördes om vi rumstemperatur i 24 timmar. Lösningen dialyserades därefter mot 5x25 mL och frystorkades vilket gav d-D-mannopyranosidneoglykoproteinet som ett vitt pulver. Den genomsnittliga graden av inkorporering bestämdes med MALDI-TOF MS och centrum av den enkelt laddade protein toppen (Fig. 4).In a similar manner there was prepared: 2- {2-L (2-necyloxy-3,4-di6xy66ky16but-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl β-D-glucopyranoside (8). [α] D 23 -7 ° (C 0.7, MGOH). 1 H-NMR 400 MHz (CD 3 OD) δ 4.71 (dt, 2H, J 6.4, 15.8 H2, OCE2CH2CH2), 4.31 (d, 1H, LT 7.7 Hz, virtual links, H-1), 1.82 (m, 2H, OCH2C§ 2CH2), 1.47-1.29 (m, 14H, (cg2), cH3), 0.90 (t, 3H, J 6.77 Hz, (cH2) 8cg3>; 130-NMR 400MHz (cD3oD) δ 189.1, 188.7, 183.9, 183.8, 177.3, 177.1, 173.9, 103.5, 77.1, 74.1, 73.9, 73.8, 70.6, 69.8, 69.7, 61.8, 44.3, 43.8, 33.0, 32.8, 32.1, 31.9, 31.3, 31.0, 30.1, 29.6, 29.5, 29.3, 25.5, 25.4, 22.7, 13.5; HR FAB-M8 calcd for C 24 H 41 NO 9 5 Na (M + Na): 542.2400; Found: 542.2389. 2- {2 - [(2-Decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl (αD-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-galactopyranoside (9). [α] D 23 + 34 ° (C 1.0, H 2 O) 1 H-NMR 400 MHz (CDCl 3: CD 3 OD: IbO) δ 4.77 (Ö, 1H, J 2.9 HZ, H-1 '), 4.48 (m, 2H, OCë ﬂ¶ hCH2), 4.12 (d, 1H, J 7.5 HZ, H-1), 4.03 (t, 1H, J 5.5 H2, H-5 '), 3.30 (dd, 1H, J 7.5, 9.2 H2, H-2), 1.58 (m, 2H, OCH2C§2CH2), 1.24-1.03 (m, 14H, (C2) 7CH3), 0.66 (t, 3H, J 6.7 H2, (CH2) gC§3); 13 C-NMR 400MHz (CDCl3: CD3OD: D2O) δ 188.7, 182.7, 176.9, 172.5, 103.1 , 100.6, 77.6, 74.1, 73.6, 73.5, 72.7, 71.0, 70.9, 69.3, 69.1, 68.9, 68.7, 60.9, 59.3, 43.7, 43.0, 32.3, 31.3, 10 15 20 25 30 35 520 256 §j ;;: fu¿_; 16 31.0, 24.7, (M + Na): 30.4, 29.5, 22.1, 13.3; 704,2828; Typical procedure for conjugation of square acid decyl ester (1-9) to BSA Bovine serum albumin (BSA, mg, 5.44 pmol) was dissolved in NaHCO 3 buffer 29.0, 28.9, 28.7, 28.63, 28.58, 24.8, HR FAB-MS calculated for C3OH51NO14SNa found: 704.2916. glycosides 62 mg, 0.93 pmol) and 1 (2.5 (2.5 mL) and stirred at room temperature for 24 hours, then dialyzed against 5x25 mL and lyophilized to give the dD-mannopyranoside neoglycoprotein as a white powder. -TOF MS and center of the easily charged protein peak (Fig. 4).

Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester~ glykosider (1-9) till Sepharose EAH 4B Den svavelinnehàllande kvadratsyradecylestern 7 (5.0 mg) sattes till en suspension av sedimenterad Sepharose EAH 0.05 mL) i NaHCO3 buffert (1.5 mL). Sepharosen filtrerades efter 24 timmar på en 4B (Pharmacia Amersham, glasfiltertratt och tvättades noggrant med vatten.Typical Procedure for Conjugating Square Acid Decyl Ester Glycosides (1-9) to Sepharose EAH 4B The sulfur-containing square acid decyl ester 7 (5.0 mg) was added to a suspension of sedimented Sepharose EAH 0.05 mL) in NaHCO 3 buffer (1.5 mL). The sepharose was filtered after 24 hours on a 4B (Pharmacia Amersham, glass filter funnel and washed thoroughly with water.

Svavelatomen 7 möjliggjorde differentiell svavel förbrànningsanalysis: små prov av Sepharosen togs före och efter konjugering med 7, frystorkades, och utsattes för svavel förbrånningsanalysis. Ökningen av svavelinnehåll efter konjugering motsvarade ett a-D- mannopyranosid innehåll på 3.1 pmol/mL sedimenterad Sepharose.The sulfur atom 7 enabled differential sulfur combustion analysis: small samples of the Sepharose were taken before and after conjugation with 7, lyophilized, and subjected to sulfur combustion analysis. The increase in sulfur content after conjugation corresponded to an α-D-mannopyranoside content of 3.1 pmol / mL sedimented Sepharose.

Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester- glykosider (8-9) till aminofunktionaliserade polymerkulor (500 4% suspension i Portland, USA) (2 mL), centrifugerades, varefter supernatanten En suspension av aminofunktionaliserade polymerkulor pL, IDC amino polystyren latex 3.0 pm, vatten, Interfacial Dynamics Corporation, suspenderades ytterligare i NaHCO3 buffert blandades, kastades. Denna tvàttprocedur upprepades 5 gånger. Till polymerkulorna i NaHCO3 buffert (2 mL) tillsattes 8 (7,6 mg, 15 pM). Suspensionen rördes försiktigt om i 15 timmar, varefter den tvättades med vatten som ovan. Ren 10 15 20 25 30 35 520 256 17 oreagerad 8 àtervanns sà som beskrivet för mikrotiter~ plattor nedan.Typical procedure for conjugating square acid decyl ester glycosides (8-9) to amino-functionalized polymer beads (500 4% suspension in Portland, USA) (2 mL), centrifuged, after which the supernatant A suspension of amino-functionalized polymer beads pL, IDC amino polystyrene latex 3.0 μm, water , Interfacial Dynamics Corporation, was further suspended in NaHCO 3 buffer mixed, discarded. This washing procedure was repeated 5 times. To the polymer beads in NaHCO 3 buffer (2 mL) was added 8 (7.6 mg, 15 pM). The suspension was gently stirred for 15 hours, after which it was washed with water as above. Pure 10 15 20 25 30 35 520 256 17 unreacted 8 was recovered as described for microtiter plates below.

Typisk procedur för konjugering av kvadratsyradecylester- (1-9) Kvadratsyradecylesterglykosiderlösning (150 pL/well, 0.02 mM i NaHCO3 buffert), glykosider till mikrotiterplattor sattes till en aminofunk- tionaliserad mikrotiterplatta (CovaLink, NUNC A/S, Rosklide, tvättades tre gånger med Cova buffert Danmark). Efter 24 timmar tömdes plattorna och (1+l+10 min), följt av noggrann tvätt med vatten. Till plattorna sattes en lösning av 20% ättiksyra anhydrid i vatten. Efter 2 timmar tvättades plattorna noga med vatten.Typical procedure for conjugation of square acid decyl ester- (1-9) Square acid decyl ester glycoside solution (150 pL / well, 0.02 mM in NaHCO 3 buffer), glycosides to microtiter plates were added to an amino-functionalized microtiter plate (CovaLink, NUNC with tvätt, Rosklide with tvätt, Rosklide med tvätt, Rosklide Cova buffer Denmark). After 24 hours, the plates were emptied and (1 + 1 + 10 min), followed by thorough washing with water. To the plates was added a solution of 20% acetic anhydride in water. After 2 hours, the plates were washed thoroughly with water.

Typisk procedur för återvinning av kvadratsyradecylester- glykosider (3, 5, och 6) 5) efter konjugeringsreaktion (Fig.Typical procedure for recovery of square acid decyl ester glycosides (3, 5, and 6) 5) after conjugation reaction (Fig.

Följande pà ett protokol för konjugering av kvadratsyra- decylesterglykosider till mikrotiter plattor som beskrivet ovan, togs reaktionsblandningarna ur brunnarna, slogs samman och tilläts passera genom en Isolute C-18 kolonn. Kolonnen tvättades med 2x5 mL H20 och eluerades därefter med 80% MeOH för att ge rena återvunna oreagerade kvadratsyra decyl ester glykosider 3, 5, och 6: I Kvadratsyradecylesterglykosiden 3 (8.2 mg 3 àtervunnet efter konjugeringsreaktion i 96 brunnar med totalt 11.3 mg 3, 1 mM, 150pL/well), 0 Kvadratsyradecylesterglykosiden 3 (O.93 mg 3 återvunnet efter konjugeringsreaktion i 96 brunnar med totalt 1.50 mg 3, 0.2 mM, 100pL/well), (1.2O mg 5 àtervunnet efter konjugeringsreaktion i 3840 brunnar med totalt 3.51 mg 5, 0.01 mM, l00pL/well), (1.20 mg 6 àtervunnet efter konjugeringsreaktion i 3840 brunnar med totalt 4.22 mg 6, 0.01 mM, 100pL/well).Following a protocol for conjugating quadric acid decyl ester glycosides to microtiter plates as described above, the reaction mixtures were taken from the wells, combined and allowed to pass through an Isolute C-18 column. The column was washed with 2x5 mL H 2 O and then eluted with 80% MeOH to give pure recovered unreacted square acid decyl ester glycosides 3, 5, and 6: I. mM, 150pL / well), 0 Square acid decyl ester glycoside 3 (O.93 mg 3 recovered after conjugation reaction in 96 wells with a total of 1.50 mg 3, 0.2 mM, 100pL / well), (1.2O mg 5 recovered after conjugation reaction in 3840 wells with a total of 3.51 mg 5, 0.01 mM, 100pL / well), (1.20 mg 6 recovered after conjugation reaction in 3840 wells with a total of 4.22 mg 6, 0.01 mM, 100pL / well).

Exempel pà nyttjande av neoglykokonjugater erhållna med 0 kvadratsyradecylesterglykosiden 5 0 kvadratsyradecylesterglykosiden 6 den aktuella tekniken: 10 15 20 25 520 256 šgïïf 18 A) Detektion av växtlektin inbindning till mikrotiter plattor konjugerade med kvadratsyradecylesterglykosider (1-9) (Fig. 6) Till mikrotiterplattan framställd med 1, såsom beskrivet ovan, tillsattes en concanavalin A-pepparotsperoxidas- konjugatlösning (100 pL/well) och plattan inkuberades vid rumstemperatur i 45 minuter. Plattan tvättades därefter tre gànger med Cova buffert (1+l+l0min) följt av en gäng med citronsyra buffert. (lO0pL/brunn) o-Fenylendiamin lösning tillsattes som substrat och den optiska densiteten avlästes vid 490 nm.Examples of the use of neoglycoconjugates obtained with 0 square acid decyl ester glycoside 50 squared acid decyl ester glycoside 6 the current technique: 10 15 20 25 520 256 šgïïf 18 A) Detection of plant lectin binding to microtiter plates conjugated with quadratic nitride ester (9) Fig. with 1, as described above, a concanavalin A-horseradish peroxidase conjugate solution (100 μL / well) was added and the plate was incubated at room temperature for 45 minutes. The plate was then washed three times with Cova buffer (1 + 1 + 10min) followed by a batch of citric acid buffer. (100pL / well) o-Phenylenediamine solution was added as substrate and the optical density was read at 490 nm.

B) Kompetitiv inhibition av växtlektininbindning till mikrotiterplattor konjugerade med kvadratsyradecylester- (1-9) (Fig. 7) Till mikrotiterplattan glykosider (framställd med 1 säsom beskrivet wspm (36 mM i TWEEN20/PBS) (50 pL) En volym av 25 pL fràn första raden fördes därefter over ovan) tillsattes en lösning av 4-nitrofenyl a~D- mannopyranosid till första raden.B) Competitive inhibition of plant lectin binding to microtiter plates conjugated with square acid decyl ester (1-9) (Fig. 7) To the microtiter plate glycosides (prepared with 1 as described wspm (36 mM in TWEEN20 / PBS) (50 pL) A volume of 25 pL from the first row was then passed over) a solution of 4-nitrophenyl α-D-mannopyranoside was added to the first row.

Tween2O /PBS tillsattes till resterande brunnar. till andra raden och blandades. Denna procedur repeterades nedåt i raderna till sista raden, varifrån 25 pL kastades. Detta resulterade i en utspädningsfaktor pà tre för varje rad. Concavalin A-pepparotsperoxidaskon- jugat tillsattes därefter och bindningen detekterades som OVëlfl . 10 15 20 25 30 35 520 256 19 Referenser 1) Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Academic 1996.Tween2O / PBS was added to the remaining wells. to the second row and mixed. This procedure was repeated down the rows to the last row, from which 25 μL was discarded. This resulted in a dilution factor of three for each row. Concavalin A-horseradish peroxidase conjugate was then added and the binding was detected as OVëlfl. 10 15 20 25 30 35 520 256 19 References 1) Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques; Academic 1996.

Press Inc.: San Diego, 2) Glüsenkamp, K.-H.; Drosdziok, W.; Eberle, G.; Jähde, E.; Rajewsky, M. F. Z. Naturforsch. C: Biosci. 1991, 46, 498-501. 3) Tietze, L. P.; Schroter, C.; Gabius, 8.; Brinck, U.; Goerlach-Graw, A.; Gabius, H.-J. Bioconjugate Chem. 1991, 2, 148-153. 4) Kamath, V. P.; Diedrich, P.; Hindsgaul, O. Glycoconj.Press Inc .: San Diego, 2) Glüsenkamp, K.-H .; Drosdziok, W .; Eberle, G .; Jähde, E .; Rajewsky, M. F. Z. Naturforsch. C: Biosci. 1991, 46, 498-501. 3) Tietze, L. P .; Schroter, C .; Gabius, 8 .; Brinck, U .; Goerlach-Graw, A .; Gabius, H.-J. Bioconjugate Chem. 1991, 2, 148-153. 4) Kamath, V. P .; Diedrich, P .; Hindsgaul, O. Glycoconj.

J. 1996, l3, 315-319. 5) Tietze, L. F., Arlt, M.; Beller, M.; Glüsenkamp, K.- H.; Jähde, E.; Rajewsky, M. F. Chem. Ber. 1991, 124, 1215-1221. 6) Hällgren, C., Hindsgaul, O. J. Carbohydr. Chem. 1994, 14, 453-456.J. 1996, l3, 315-319. 5) Tietze, L. F., Arlt, M .; Beller, M .; Glüsenkamp, K.- H .; Jähde, E .; Rajewsky, M. F. Chem. Ber. 1991, 124, 1215-1221. 6) Hällgren, C., Hindsgaul, O. J. Carbohydr. Chem. 1994, 14, 453-456.

F.-I.; 2003-2010. 7) Auzanneau, 1996, 4, Pinto, B. M. Bioorg. Med. Chem. 8) Pozsgay, V.; Dubois, E. P.; 1997, 62, 2832-2846. 9) Zhang, J.; Pannell, L. J. Org. Chem.F.-I .; 2003-2010. 7) Auzanneau, 1996, 4, Pinto, B. M. Bioorg. With. Chem. 8) Pozsgay, V .; Dubois, E. P .; 1997, 62, 2832-2846. 9) Zhang, J .; Pannell, L. J. Org. Chem.

Yergey, A.; Kowalak, J.; Kovác, P.Yergey, A .; Kowalak, J .; Kovác, P.

Carbohydrate Res. 1998, 313, 15-20. 10) Blixt, 0.; Norberg, T. Carbohydr. Res. 1999, 319, 80- 91. 11) Zhang, J.; Kovác, P. Bioorg. med. Chem. Lett. 1999, 9, 487-490. 12) Zhang, J.; Kovác, P. Carbohydrate Res. 1999, 321, 157-167. 13) Kitov, P. 1.; Sadowska, J. M.; Mulvey, G.; Armstrong, G. D.; Ling, H.; Pannu, N. S.; Read, R. J.; Bundle, D. R.Carbohydrate Res. 1998, 313, 15-20. 10) Blixt, 0 .; Norberg, T. Carbohydr. Res. 1999, 319, 80- 91. 11) Zhang, J .; Kovác, P. Bioorg. with. Chem. Easy. 1999, 9, 487-490. 12) Zhang, J .; Kovác, P. Carbohydrate Res. 1999, 321, 157-167. 13) Kitov, P. 1 .; Sadowska, J. M .; Mulvey, G .; Armstrong, G. D .; Ling, H .; Pannu, N. S .; Read, R. J .; Bundle, D. R.

Nature 2000, 403, 669-672. 14) Fan, E.; Zhang, Z.; Minke, W. E.; Hou, Z.; Verlinde, C. L. M. J.; H01, W. G. J. Jﬂ Am. Chem. SOC. 2000, 122, 2663-2664. 15) Chernyak, A.; Karavanov, A.; Ogawa, Y.; Kovác, P.Nature 2000, 403, 669-672. 14) Fan, E .; Zhang, Z .; Minke, W. E .; Hou, Z .; Verlinde, C. L. M. J .; H01, W. G. J. J ﬂ Am. Chem. SOC. 2000, 122, 2663-2664. 15) Chernyak, A .; Karavanov, A .; Ogawa, Y .; Kovác, P.

Carbohydr. Res. 2001, 330, 479-486. 16) Kitov, P. I.; Bundle, D. R. J. Chem. Soc., Perkin Trans. l 2001, 838-853. 520 256 20 17) Lindhorst, T. K.; Kötter, S.; Krallmann-Wenzel, U.; Ehlers, S. J. Chem. Soc , Perkin Trans.l 2001, 823-831. 18) Dahmën, J.; Frejd, T.; Grönberg, G.; Lave, T.; Magnusson, G.; Noori, G. Carbohydr. Res. 1983, 116, 303- 307.Carbohydrate. Res. 2001, 330, 479-486. 16) Kitov, P. I .; Bundle, D. R. J. Chem. Soc., Perkin Trans. l 2001, 838-853. 520 256 20 17) Lindhorst, T. K .; Meat, S .; Krallmann-Wenzel, U .; Ehlers, S. J. Chem. Soc, Perkin Trans.l 2001, 823-831. 18) Dahmën, J .; Frejd, T .; Grönberg, G .; Lave, T .; Magnusson, G .; Noori, G. Carbohydr. Res. 1983, 116, 303-307.

Claims

520 256 21 PATENT REQUIREMENTS

A process for non-polar extraction of a biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate of formula (I) obtained after a bioconjugation reaction: Xššš Åáçy (D in which X, Y and Z are, independently, selected from the group consisting of O and S; R1 is selected from the group consisting of an alkyl, an alkenyl, an alkynyl and an aryl group containing at least 6 carbon atoms; R 2 is a biomolecule; R 3 is selected from the group consisting of hydrogen, an alkyl, an alkenyl, an alkynyl group containing from 6 to 30 carbon atoms, and an aryl group containing from 6 to 18 carbon atoms, said extraction comprising: recovering said intermediate with non-polar agents.

The method of claim 1, wherein the method further comprises, prior to said recovery, collecting a reaction solution after said bioconjugation reaction and contacting said reaction solution, optionally after a change, concentration, dilution and / or addition of solvent, with non-polar agents.

A method according to claim 1 or 2, wherein said non-polar agent is selected from the group consisting of a non-polar solid phase and a hydrophobic solution.

A method according to any one of claims 1-3, wherein said biomolecule is selected from the group consisting of carbohydrate, a protein, a peptide, a nucleoside, a nucleotide, a steroid, a lipid, an alkaloid, a secondary metabolite, a saccharide , a saccharide-substituted alkyl group and a saccharide-substituted sulfur-containing alkyl group. 520 256 22

The method of claim 4, wherein said carbohydrate is selected from the group consisting of glucose, mannose, galactose, glucosamine, galactosamine, fucose, fructose, xylose, neuramic acid, glucuronic acid, iduronic acid, a disaccharide, an oligosaccharide consisting of at least two of the above-mentioned the monosaccharides and derivatives thereof.

A process according to any one of claims 1-5, wherein said R 1 contains from 6 to 30 carbon atoms.

A process according to claim 6, wherein said R 1 contains from 10 to 20 carbon atoms.

A process according to claim 3, wherein said non-polar solid phase is selected from the group consisting of alkylated silica (preferably C 2, C 4, C 6, C 8, C 18, cyclohexyl, cyanopropyl), arylated silica (preferably phenyl), resin-based solid phase extraction sorbents ( preferably polystyrene, copolymer resins) and mixed solid phase extraction orbents.

A method according to any one of claims 1-8, wherein said X is 0.

The method of claim 9, wherein said Y is 0.

The method of claim 10, wherein said Z is 0.

The method of claim 11, wherein said R 1 is a decyl group.

A process according to any one of claims 1-12, wherein said biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate is selected from the group consisting of 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl αD-mannopyranoside (1) , 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-glucopyranoside (2), 2 - [( 2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (dD-galactopyranosyl) - (1-4) - (β-D-galactopyranosyl) - (1-94) -β-D-glucopyranoside (3 ), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (2-acetamido-2-deoxy-BD-galactopyranosyl) - (1-a3) - (dD-galactopyranosyl) - ( 1- + 4) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β-D-glucopyranoside (4), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-dD-galacto-non-2-ulopyranosylonic acid) - (2- + 3) - (β-D-galactopyranosyl) - (1- + 4) -β -D- glucopyranoside (5), 2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1- 520 256 23 enyl) amino] ethyl (5-acetamido-3,5-dideoxy-D-glycero-αD-galacto -non-2-ulopyranosylonic acid) - (2- + 3) - (ß-D galactopyranosyl) - (1- + 4) - [(αL-fucopyranosyl) - (1- + 3)] - 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (6), 2- {2 - [( 2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl αD-mannopyranoside (7), 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio } ethyl β-D-glucopyranoside (8), or 2- {2 - [(2-decyloxy-3,4-dioxocyclobut-1-enyl) amino] ethylthio} ethyl (αD-galactopyranosyl) - (1-94) - BD-galactopyranoside (9).

A process as defined in any one of claims 2 to 13 for recovering said biomolecular square acid monoamide coupling reagent intermediate of formula (I) after a bioconjugation reaction and reusing said intermediate in further bioconjugation reactions.