KR102166783B1

KR102166783B1 - 새로운 트레할로스 중심을 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용

Info

Publication number: KR102166783B1
Application number: KR1020180155778A
Authority: KR
Inventors: 채필석; 다스 마나벤드라
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2020-10-16
Also published as: KR20200068883A

Abstract

본 발명은 새롭게 개발한 트레할로스 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 화합물은 기존의 화합물보다 다양한 구조와 특성을 지닌 막단백질들을 세포막에서 효율적으로 추출하고 이를 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 신약 개발에 밀접한 관계가 있는 만큼 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이다.

Description

새로운 트레할로스 중심을 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용 {Novel trehalose-cored amphiphiles and uses thereof}

본 발명은 새롭게 개발한 트레할로스 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.

막단백질(membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 세포막으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.

막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질들은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하는 경향이 있기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다. 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 트레할로스 중심구조에 소수성기와 친수성기를 도입한 양친매성 화합물을 개발하였고, 이 화합물의 막단백질 안정화 특성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472. S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.

본 발명의 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 아릴기일 수 있고;

상기 L¹ 내지 L⁴는 각각 독립적으로 직접결합 또는 -O(산소)-Y-로, 상기 Y는 치환 또는 비치환된 C₁-C₁₀의 알킬렌기일 수 있고; 그리고

상기 X¹내지 X⁴ 는 산소와 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

상기 L⁵ 내지 L⁸은 치환 또는 비치환된 C₁-C₁₀의 알킬렌기일 수 있고; 그리고

상기 X⁵내지 X¹² 는 산소와 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.

상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성기인 글루코스 또는 말토오스를 각각 4개 또는 8개를 병렬로 연결하여 친수성기의 크기를 크게 하면서도 길이의 증가를 최소화함으로써 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기를 작게하였다. 상기 화합물과 막단백질과의 복합체의 크기가 작으면 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있다 (G. G. Prive, Methods 2007, 41, 388-397).

또한, 상기 R¹ 내지 R⁴는 소수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성도와 소수성도의 밸런스(hydrophile-lipophile balance)를 최적으로 하기 위하여 길이를 달리한 4개의 치환 또는 비치환된 알킬기를 소수성기로 도입하였다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 중심구조로 트레할로스 링커를 가질 수 있다. 즉, 상기 화합물은 트레할로스를 중심구조로 하여 4개 또는 8개의 친수성기 및 4개의 소수성기를 도입한 양친매성 물질로, 막단백질 안정화 및 결정화에 우수한 성능을 가질 수 있다.

구체적으로, 상기 R¹내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₁-C₃₀의 알킬기일 수 있고; 그리고 상기 X¹ 내지 X¹² 는 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1에서 상기 R¹내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기일 수 있고; 상기 X¹ 내지 X⁴ 은 글루코스 또는 말토오스일 수 있고; 그리고 상기 L¹내지 L⁴은 직접결합일 수 있는 이러한 화합물을 각각 "TCGs (Trehalodse-cored glucosides) 또는 TCMs (Trehalodse-cored maltosides)"로 명명하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 화학식 2에서 상기 R¹내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기일 수 있고; 상기 X¹ 내지 X⁴ 은 글루코스일 수 있고; 그리고 상기 L⁵내지 L⁸은 -CH₂-일 수 있는 이러한 화합물을 각각 "TCG-Ls (Trehalodse-cored glucosides with a linker)"로 명명하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₅의 알킬기이고; 상기 X¹ 내지 X⁴는 글루코스(glucose)이고; 그리고 L¹내지 L⁴는 직접결합인 화합물을 "TCG-C5"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 3로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 3]

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₆의 알킬기이고; 상기 X¹ 내지 X⁴는 글루코스(glucose)이고; 그리고 L¹내지 L⁴는 직접결합인 화합물을 "TCG-C6"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 4]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₇의 알킬기이고; 상기 X¹ 내지 X⁴는 글루코스(glucose)이고; 그리고 L¹내지 L⁴는 직접결합인 화합물을 "TCG-C7"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 5]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₈의 알킬기이고; 상기 X¹ 내지 X⁴는 말토오스이고; 그리고 L¹내지 L⁴는 직접결합인 화합물을 "TCM-C8"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 6로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 6]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₉의 알킬기이고; 상기 X¹ 내지 X⁴는 말토오스이고; 그리고 L¹내지 L⁴는 직접결합인 화합물을 "TCM-C9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 7로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 7]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₁₀의 알킬기이고; 상기 X¹ 내지 X⁴는 말토오스이고; 그리고 L¹내지 L⁴는 직접결합인 화합물을 "TCM-C10"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 8]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₉의 알킬기이고; 상기 X⁵ 내지 X¹²은 글루코스이고; 그리고 L⁵내지 L⁸는 -CH₂-인 화합물을 "TCG-L9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 9로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 9]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₁₀의 알킬기이고; 상기 X⁵ 내지 X¹²은 글루코스이고; 그리고 L⁵내지 L⁸는 -CH₂-인 화합물을 "TCG-L10"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 10로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 10]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₁₁의 알킬기이고; 상기 X⁵ 내지 X¹²은 글루코스이고; 그리고 L⁵내지 L⁸는 -CH₂-인 화합물을 "TCG-L11"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 11로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 11]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R¹내지 R⁴는 C₁₂의 알킬기이고; 상기 X⁵ 내지 X¹²은 글루코스이고; 그리고 L⁵내지 L⁸는 -CH₂-인 화합물을 "TCG-L12"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 12로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 12]

본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 공존하여 극성, 비극성 용매 모두에 친화성을 가질 수 있는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 수용액에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하고 친수성기가 표면에 노출된 둥글거나 타원 형태의 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 크게 증가한다.

CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM일 수 있으며, 구체적으로 0.0001 내지 0.1 mM, 보다 구체적으로 0.001 내지 0.5 mM, 보다 더 구체적으로 0.004 내지 0.02 mM 일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 0.17 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 대부분의 TCGs 또는 TCMs은 매우 작은 CMC 값을 가지고 있다. 따라서, TCGs 또는 TCMs는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 활용측면에서 유리하다 할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 50 nm일 수 있고, 구체적으로 2.0 nm 내지 40.0 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.

상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부의 소수성으로 막단백질과 결합할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 세포막으로부터 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.

상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 5)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

1) 트레할로스에 다이벤질리덴화를 수행하여 보호기를 부착시키는 단계;

2) 상기 단계 1)의 생성물에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 테트라-O-알킬화를 반응을 수행하는 단계

3) 상기 단계 2)의 생성물의 다이벤질리덴 탈보호기화 반응을 수행하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 L¹ 내지 L⁴는 직접결합일 수 있고; 그리고

상기 X¹내지 X⁴ 는 산소와 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

구체적으로, 상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고; 상기 X¹내지 X⁴ 는 글루코스 또는 말토오스일 수 있고; 그리고 상기 L¹ 내지 L⁴은 직접결합일 수 있다..

상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 3 내지 8 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 구체예에서, 5단계의 합성 단계를 거쳐 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있으므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 6)의 단계를 포함하는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

2) 상기 단계 1)의 생성물에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 테트라-O-알킬화를 반응을 수행하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 생성물에 알릴 아이오다이드를 첨가하여 알릴기를 부착시킨 다음, 상기 알릴기의 이중결합을 산화제를 이용하여 산화시켜 옥타-올(octa-ol)을 생성시키는 단계;

5) 상기 단계 4)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및

6) 상기 단계 5)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법:

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

구체적으로, 상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고; 상기 X⁵내지 X¹² 은 글루코스일 수 이고; 그리고 상기 L⁵ 내지 L⁸은 -CH₂-일 수 있다.

상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 9 내지 12 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 X¹내지 X⁴ 는 산소와 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서,

구체적으로, 상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₀의 알킬기이며; 상기 X¹내지 X¹² 는 산소와 연결된 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)이며; 상기 화학식 1에서 상기 L¹ 내지 L⁴는 직접결합이며; 그리고 상기 화학식 2에서 L⁵ 내지 L⁸은 -CH₂-일 수 있다.

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 3 내지 14 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬과 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 LHI-RC, LeuT (Leucine transporter), β₂AR (human β₂ adrenergic receptor), 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출(extraction)"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analysis)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy) 또는 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.

본 발명의 구체예들에 따른 트레할로스 기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.

막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 TCGs 및 TCMs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 TCG-Ls 의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 3은 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls 에 의해 형성된 미셀의 크기 분포도를 나타낸 도이다.
도 4는 TCG-L10의 DLS 프로파일 및 TEM 이미지를 도시한 것이다.
도 5는 TCGs에 의해 용해된 LHI-RC를 포함하는 R. capsulatus 조립체의 장기간 안정성을 측정한 결과를 나타낸 도이다:
(a) TCGs 또는 DDM 농도가 CMC + 0.05 wt%; 및
(b) TCGs 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%.
도 6은 TCGs에 의해 용해된 LHI-RC를 포함하는 R. capsulatus 조립체의 장기간 안정성을 측정한 결과를 나타낸 도이다:
(a) TCMs, TCG-Ls 또는 DDM 농도가 CMC + 0.05 wt%; 및
(b) TCMs, TCG-Ls 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%.
도 7은 TCMs, TCG-Ls 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA (scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 14일 동안 상온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다:
(a) TCMs, TCG-Ls 또는 DDM 농도가 CMC + 0.04 wt%; 및
(b) TCMs, TCG-Ls 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%.
또한 도 7c는 TCMs 에 의한 β₂AR의 안정성에 대한 효과를 측정 시간의 흐름에 따라 측정한 결과이다. 단백질 리간드 결합 특성은 [³H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 8은 TCGs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA (scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 14일 동안 상온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다:
(a) TCGs 또는 DDM 농도가 CMC + 0.04 wt%; 및
(b) TCGs 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%.
도 9는 TCGs, TCMs, TCG-Ls 또는 DDM 에 의한 β₂AR의 안정성에 대한 효과를 측정 시간의 흐름에 따라 측정한 결과이다. 단백질 리간드 결합 특성은 [³H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

<실시예 1> TCGs 및 TCMs의 합성 방법

TCGs 및 TCMs의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-5>의 합성 방법에 따라 TCGs 3종 및 TCMs 3종의 화합물을 합성하였다.

<1-1> 4,6,4′,6′- 디벤질리덴화 트레할로오스 (4,6,4′,6′-dibenzylidenated trehalose )(화합물 A)의 합성(도 1의 단계 a)

화합물 A를 J. Carbohydr . Chem. 2009, 28, 198-221.에 개시된 공정을 수정하여 88% 수율로 제조하였다. p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트 (0.12 g, 0.7 mmol)을 톨루엔 (30 mL) 내에서 현탁액의 회전 증발을 통해 탈수시켰다. 상업적으로 이용가능한 α, α-트레할로스 디하이드레이트 (5.00 g, 13.25 mmol)를 에탄올 (30 mL)에서 4 시간 동안 환류 건조시키고 결정성 물 분자를 제거하기 위해 고진공에서 60 ℃로 밤새 건조시켰다. 건조된 DMF (20 mL) 내 잔류 무수화 트레할로오스의 현탁액에 건조 DMF (20 mL)에 혼합된 p-톨루엔설폰산 (촉매량) 및 (디메톡시메틸)벤젠 (2 mL, 13.25 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 100 ℃에서 30 분간 가열하고 50 ℃에서 농축시켰다. 추가로 (디메톡시메틸)벤젠 (2 mL, 13.25 mmol)을 첨가하고 가열 절차를 반복 하였다. 추가량의 (디메톡시메틸)벤젠 (0.5 mL, 3.3 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 증기욕조에서 10 분 동안 가열하여 무색의 용액을 수득하였다. 반응을 Et₃N (pH> 7)을 적가함으로써 중단시켰다. 용매를 회전 증발기에서 증발시키고 두꺼운 유리질 액체를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 4, 6, 4', 6'- 디벤질리덴화 트레할로오스 (화합물 A)를 수득하였다.

<1-2> 테트라 -O- 알킬레이션 (tetra-O- alkylation )의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 b)

0 ℃에서 NaH (6.0 당량) 및 4, 6, 4', 6'- 디벤질리덴화 트레할로오스 (화합물 A) (1 당량, 550mg)을 DMF (15mL)에 용해시켰다. 알킬 아이오다이드 (6.5 당량)를 적가하고, 생성된 용액을 80 ℃에서 4 일 동안 교반하였다. 반응 완료 후 (TLC로 확인함), 용액을 디에틸 에테르 (170 mL)로 희석하고 1M HCl (2 x 20 mL) 용액 및 염수 (150 mL)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 목적하는 생성물 (화합물 B)을 액체형태로 수득하였다.

<1-3> 벤질리덴화 탈보호기화 반응 ( benzylidene deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 c)

화합물 B (500 ㎎, 1 당량)를 메탄올 및 DCM (1:1 혼합물 50 ㎖)의 혼합물에 용해시키고 p-톨루엔설폰산 (0.25 당량)으로 실온에서 11 시간 동안 교반하면서 처리 하였다. TLC 검사에 의해 반응 완료를 확인한 후, 용매를 진공에서 증발시켰다. 조 생성물을 건조 실리카 겔 분말과 혼합하고 진공하에 추가로 건조시켰다. 생성된 전흡착된 실리카 겔을 실리카 컬럼 (용리액: DCM / MeOH)에 적재하여 테트라-올 (화합물 C)을 92 내지 96 % 수율로 정제하였다.

<1-4> β -C- 당화(glycosycosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 d 및 e)

이는 Chae , P. S. 등의 합성 방법 (Nat Meth 2010, 7, 1003.)에 따랐다. 무수 CH₂Cl₂ 에 알코올(1 당량, 화합물 C), AgOTf, 및 2,4,6-collidine(1.1 당량)을 -25℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH₂Cl₂에 용해된 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide) 또는 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드(perbenzoylated maltosylbromide)용액을 50분 동안 서서히 첨가하였다. 상기 반응을 위해 -25℃에서 50분 동안 계속 교반하였다. 그 후 반응물을 0℃로 가온하고 CH₂Cl₂ (20 mL)로 희석시킨 다음 celite로 여과하였다. 여과물을 1M Na₂S₂O₃ (40 mL) 수용액, 0.1M HCl 수용액 (40 mL) 및 염수(brine)으로 세척하였다. 그 다음 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 고체 상태의 당화 화합물(D 및 E)을 얻었다.

<1-5> 탈보호기화 반응 ( deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 f)

이는 Chae , P. S. 등의 합성 방법 (Nat Meth 2010, 7, 1003.)에 따랐다. Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화(de-O-benzoylation)를 수행하였다. O-protected 화합물을 무수 CH₂Cl₂로 용해시킨 다음 MeOH를 지속적인 침전이 나타날때까지 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 0.5M의 메탄올성 용액(methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05 M이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 12시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H⁺ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건(in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. CH₂Cl₂/MeOH/diethyl ether를 이용하여 재결정화하여 추가 정제함으로써 완전히 보호기가 제거된 흰색 고체 화합물 (TCGs 또는 TCMs)을 얻었다.

<제조예 1> TCG-C5의 합성

<1-1> 화합물 A의 합성

실시예 1-1의 4,6,4′,6′-디벤질리덴화 트레할로오스 합성 절차에 따라 화합물 A를 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃: CD₃OD = 1:2): δ 7.49-7.34 (m, 5H), 5.56 (s, 1H), 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.27-4.02 (m, 3H), 3.76-3.65 (m, 2H), 3.50 (t, 1H, J = 8.0 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 138.2, 129.7, 128.8, 127.0, 102.6, 95.6, 82.3, 73.2, 71.0, 69.6, 63.7.

<1-2> 화합물 B1의 합성

실시예 1-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B1을 87%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.34 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.14 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.22-4.17 (m, 2H), 3.81-3.62 (m, 6H), 3.51 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 3.36 (dd, 1H, J = 3.6 & 9.1 Hz), 1.61-1.58 (m, 4H), 1.40-1.31 (m, 8H), 0.88 (app. t, J = 6.2 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.2, 101.4, 94.7, 82.3, 80.1, 78.3, 73.6, 72.2, 69.3, 62.9, 30.3, 30.0, 28.4 (2C), 22.7 (2C), 14.2, 14.1.

<1-3> 화합물 C7의 합성

실시예 1-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 C7을 93%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.99-3.27 (m, 10H), 2.81 (s, 1H), 2.26 (app. t, J = 4.0 Hz, 1H), 1.62-1.53 (m, 4H), 1.35-1.25 (m, 8H), 0.87 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.8, 80.9, 80.5, 73.6, 71.4 (2C), 70.2, 62.3, 30.3, 30.0, 28.5, 28.4, 22.8 (2C), 14.3, 14.2.

<1-4> 화합물 D13의 합성

실시예 1-4의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 D13를 82%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.22-7.78 (m, 16H), 7.57-7.23 (m, 24H), 5.87 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.75-5.46 (m, 5H), 4.90 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.67 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.52-4.38 (m, 5H), 3.83-3.02 (m, 12H), 1.24-1.20 (m, 2H), 1.09-1.05 (m, 10H), 0.90-0.87 (m, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 165.9, 165.3, 165.1, 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 133.2, 133.1, 130.4, 130.0, 129.9, 129.8 (2C), 129.7, 129.6, 129.4, 129.2, 129.0 (3C), 128.9, 128.5 (2C), 128.4 (2C), 101.6, 101.1, 93.0, 79.9, 78.9, 78.7, 73.4, 72.9, 72.7, 72.4, 72.3, 71.5, 71.0, 69.4, 69.2, 67.3, 63.6, 62.8, 32.5, 29.5, 28.4, 28.2, 22.9, 22.5, 14.3, 14.2.

<1-5> TCG-C5의 합성

실시예 1-5의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-C5를 91%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (d, J =4.0 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.15-3.84 (m, 14H), 3.70-3.10 (m, 33H), 1.65-1.57 (m, 8H), 1.37-1.31 (m, 17H), 0.94-0.92 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.5, 103.5, 94.9, 81.6, 81.0, 78.3, 78.0, 77.0, 75.7, 75.2, 75.0, 73.0, 72.4, 71.9, 71.6, 68.2, 63.7, 62.8, 31.1, 31.0, 29.6, 29.5, 23.9, 23.8, 14.7 (2C); HRMS (EI): calcd. for C₅₆H₁₀₂O₃₁Na⁺ [M+Na]⁺1293.6303, found 1293.6300.

<제조예 2> TCG-C6의 합성

<2-1> 화합물 A의 합성

<2-2> 화합물 B2의 합성

실시예 1-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B2을 87%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.34 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.21-4.18 (m, 2H), 3.83-3.60 (m, 6H), 3.51 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.36 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.61-1.57 (m, 4H), 1.37-1.26 (m, 14H), 0.88 (app. t, J = 6.2 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.2, 101.3, 94.6, 82.3, 80.1, 78.3, 73.6, 72.2, 69.3, 62.9, 31.9, 30.6, 30.3, 25.9, 22.8, 22.7, 14.2.

<2-3> 화합물 C8의 합성

실시예 1-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 C8을 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.98-3.27 (m, 10H), 3.01 (s, 1H), 2.51 (app. t, J = 4.0 Hz, 1H), 1.62-1.50 (m, 4H), 1.35-1.24 (m, 12H), 0.87 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.8, 80.9, 80.4, 73.6, 71.5, 71.4, 70.0, 62.1, 31.9 (2C), 30.6, 30.3, 25.9, 22.8 (2C), 14.2.

<2-4> 화합물 D14의 합성

실시예 1-4의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 D14를 80%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.22-7.77 (m, 16H), 7.49-7.23 (m, 24H), 5.84 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.73-5.44 (m, 5H), 4.88 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.51-4.34 (m, 5H), 3.84-3.00 (m, 12H), 1.24-1.20 (m, 2H), 1.19-1.05 (m, 14H), 0.90-0.86 (m, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.0, 165.9, 165.3, 165.1, 134.4, 134.2 (2C), 134.1, 134.0, 132.5, 131.2, 130.8, 130.7 (2C), 129.9, 129.7, 129.6 (2C), 129.5, 129.4, 129.3 (2C), 129.2, 129.1, 129.0, 128.9, 128.2, 127.7 (2C), 101.9, 100.8, 100.2, 93.7, 92.0, 79.4, 79.2, 73.7, 73.4, 73.0, 72.2, 71.6, 70.8, 70.4, 68.9, 68.6, 63.6, 30.8, 22.9, 14.9, 13.6.

<2-5> TCG-C6의 합성

실시예 1-5의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-C6을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (d, J =4.0 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.15-3.84 (m, 14H), 3.70-3.10 (m, 33H), 1.64-1.55 (m, 8H), 1.40-1.31 (m, 24H), 0.94-0.92 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.5, 103.5, 94.8, 81.6, 81.0, 78.4, 78.1, 77.1, 75.8, 75.2, 75.1, 73.0, 72.5, 71.9, 71.6, 68.2, 63.7, 62.8, 33.2, 33.1, 31.4, 31.3, 27.1, 27.0, 23.9, 14.6 (2C); HRMS (EI): calcd. for C₆₀H₁₁₀O₃₁Na⁺ [M+Na]⁺1349.6929, found 1349.6935.

<제조예 3> TCG-C7의 합성

<3-1> 화합물 A의 합성

<3-2> 화합물 B3의 합성

실시예 1-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B3을 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.33 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.20-4.17 (m, 2H), 3.78-3.61 (m, 8H), 3.51 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.36 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.62-1.57 (m, 4H), 1.37-1.25 (m, 20H), 0.88 (app. t, J = 6.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.3, 101.4, 94.7, 82.3, 80.2, 78.3, 73.6, 72.2, 69.3, 63.1, 62.9, 33.0, 32.1, 32.0, 31.9, 30.6, 30.3, 29.4, 29.3, 26.3 (2C), 25.9, 22.9, 22.8 (2C), 14.3 (2C), 14.2.

<3-3> 화합물 C9의 합성

실시예 1-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 C9을 93%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.92-3.27 (m, 10H), 2.94 (s, 1H), 2.43 (br s, 1H), 1.60-1.52 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 16H), 0.88 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.9, 80.9, 80.5, 73.7, 71.5, 71.4, 70.1, 62.2, 32.1, 32.0, 30.7, 30.3, 25.9, 29.4, 26.3 (2C), 22.8, 14.3.

<3-4> 화합물 D15의 합성

실시예 1-4의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 D15를 80%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.22-7.77 (m, 16H), 7.57-7.24 (m, 24H), 5.85 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 5.75-5.47 (m, 5H), 4.88 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 4.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.51-4.37 (m, 5H), 3.82-2.99 (m, 12H), 1.41-1.38 (m, 2H), 1.28-1.12 (m, 18H), 0.90-0.86 (m, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.3, 165.2, 165.1, 133.7, 133.6, 133.4, 133.3, 133.2, 130.4, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8 (2C), 129.7, 129.4, 129.3, 129.1, 129.0, 128.9, 128.6, 128.5 (2C), 128.4, 101.6, 101.1, 92.8, 79.9, 78.9, 78.7, 73.5, 73.0, 72.7, 72.5, 72.4, 71.6, 70.9, 69.7, 69.5, 67.4, 63.7, 62.9, 32.1 (2C), 30.9, 29.9, 29.7, 29.3, 26.3, 26.1, 22.9, 22.8, 14.4, 14.3.

<3-5> TCG-C7의 합성

실시예 1-5의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-C7을 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (d, J =4.0 Hz, 2H), 4.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.15-3.84 (m, 17H), 3.67-3.10 (m, 36H), 1.64-1.55 (m, 9H), 1.34-1.31 (m, 36H), 0.93-0.89 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.5, 103.6, 94.8, 81.6, 81.0, 78.4, 78.2, 78.1, 78.0, 77.1, 75.8, 75.2, 75.1, 72.9, 72.4, 71.9, 71.6, 68.2, 63.7, 62.9, 33.3 (2C), 31.4, 30.7, 30.5, 27.4, 27.3, 23.9, 14.7 (2C); HRMS (EI): calcd. for C₆₄H₁₁₈O₃₁Na⁺ [M+Na]⁺ 1405.7555, found 1405.7560.

<제조예 4> TCM-C8의 합성

<4-1> 화합물 A의 합성

<4-2> 화합물 B4의 합성

실시예 1-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B4을 81%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.32 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.22-4.18 (m, 2H), 3.78-3.62 (m, 6H), 3.51 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.36 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.63-1.57 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 22H), 0.86 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.2, 126.2, 101.3, 94.7, 82.3, 80.1, 78.3, 73.6, 72.2, 69.3, 65.6, 62.9, 32.1, 32.0, 30.6, 30.3, 29.7, 29.5, 29.4, 26.3 (2C), 22.8 (2C), 14.3 (2C).

<4-3> 화합물 C10의 합성

실시예 1-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 C10을 96%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.00-3.28 (m, 10H), 2.61 (s, 1H), 2.02 (app. t, J = 2.0 Hz, 1H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 20H), 0.88 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.9, 80.9, 80.5, 73.6, 71.4 (2C), 70.4, 62.5, 32.1, 30.7, 30.3, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5 (2C), 26.4, 26.3, 22.9, 14.3.

<4-4> 화합물 D16의 합성

실시예 1-4의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 D16를 86%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.04-7.64 (m, 30H), 7.57-7.20 (m, 44H), 6.09 (q, 2H, J = 8.0 Hz), 5.68-5.13 (m, 11H), 4.81-3.96 (m, 16H), 3.89-3.00 (m, 12H), 1.24-1.10 (m, 24H), 0.89 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2, 166.1, 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.2 (2C), 165.1 (2C), 165.0, 133.5, 133.3, 133.1, 130.3, 130.0, 129.9 (2C), 129.8, 129.7, 129.6 (2C), 129.4, 129.2 (2C), 129.1, 128.8, 128.7, 128.5, 128.4, 128.3, 101.7, 100.5, 96.2, 95.7, 92.7, 78.8, 74.7, 73.2, 72.7, 72.1, 71.8, 71.3, 71.2, 70.7, 70.0, 69.2, 69.0, 68.8, 62.6, 53.6, 32.1, 32.0, 30.9, 30.0, 29.9, 29.6 (2C), 26.4, 26.1, 22.9, 14.3 (2C).

<4-5> TCM-C8의 합성

실시예 1-5의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCM-C8을 95%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 5.58-5.26 (m, 10H), 5.04-4.90 (m, 12H), 4.61-4.53 (m, 7H), 4.18-3.03 (m, 51H), 1.50-1.43 (m, 7H), 1.40-1.10 (m, 36H), 0.87-0.84 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ 102.9, 101.2, 100.6, 80.3, 76.4, 75.2, 73.5, 73.3, 72.5, 70.3, 69.9, 60.8, 31.4, 29.8, 29.6, 29.3, 29.2, 29.1, 29.0, 28.8, 25.8, 25.6, 22.1, 14.0; MS ( MALDI -TOF): calcd. for C₉₂H₁₆₆O₅₁Na⁺[M+Na]⁺ 2110.0294, found 2110.5188.

.

<제조예 5> TCM-C9의 합성

<5-1> 화합물 A의 합성

<5-2> 화합물 B5의 합성

실시예 1-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B5을 83%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.34 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.20-4.18 (m, 2H), 3.77-3.48 (m, 6H), 3.38 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 2.99 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.58-1.47 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 24H), 0.87 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.3, 101.4, 94.7, 82.4, 80.2, 78.3, 73.7, 72.2, 69.3, 63.2, 62.9, 33.0, 32.1 (2C), 30.7, 30.4, 29.9, 29.8 (2C), 29.6 (2C), 29.5 (2C), 26.4, 26.3, 26.0, 22.9 (2C), 14.4.

<5-3> 화합물 C11의 합성

실시예 1-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 C11을 95%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.97-3.27 (m, 10H), 2.58 (s, 1H), 2.41 (br s, 1H), 1.60-1.52 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 24H), 0.88 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.8, 80.9, 80.4, 73.7, 71.6, 71.4, 70.0, 62.0, 32.1, 32.0, 30.6, 30.3, 29.8 (3C), 29.5, 26.3, 22.9, 14.3.

<5-4> 화합물 D17의 합성

실시예 1-4의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 D17를 87%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.04-7.63 (m, 30H), 7.60-7.20 (m, 47H), 6.14 (q, 2H, J = 8.0 Hz), 5.71-5.14 (m, 10H), 4.84-3.99 (m, 16H), 3.739-3.01 (m, 12H), 1.29-1.10 (m, 30H), 0.89 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2 (2C), 166.0, 165.8, 165.7, 165.6 (2C), 165.2 (2C), 165.1 (2C), 165.0, 133.4, 133.1, 130.1, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4 (2C), 129.2, 129.1, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7 (2C), 128.5, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 101.5, 101.3, 96.0, 95.5, 92.5, 79.9, 78.9, 78.6, 74.5, 73.0, 72.9, 72.6, 72.0, 71.7, 71.3, 71.2, 71.1, 70.5, 69.8, 68.9, 68.8, 68.6, 66.9, 63.5, 63.0, 62.5, 62.3, 31.9, 30.8, 30.0, 29.9, 29.8 (2C), 29.7, 29.5, 29.4 (2C), 26.5, 26.1, 22.8, 14.3.

<5-5> TCM-C9의 합성

실시예 1-5의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCM-C9을 93%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 5.57-5.22 (m, 10H), 5.03-4.89 (m, 13H), 4.57-4.51 (m, 7H), 4.20-3.05 (m, 46H), 1.48-1.42 (m, 7H), 1.40-1.19 (m, 44H), 0.86-0.83 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ 102.9, 101.2, 100.6, 80.4, 76.5, 75.2, 73.5, 73.3, 72.5, 70.2, 69.9, 60.8, 31.4, 29.8, 29.6, 29.3, 29.2 (2C), 29.1, 29.0, 28.8, 25.8, 25.7, 22.2, 14.2; MS (MALDI-TOF): calcd. for C₉₆H₁₇₄O₅₁Na⁺ [M+Na]⁺ 2167.0953, found 2167.5685.

<제조예 6> TCM-C10의 합성

<6-1> 화합물 A의 합성

<6-2> 화합물 B6의 합성

실시예 1-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B6을 83%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.34 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.21-4.16 (m, 2H), 3.81-3.62 (m, 10H), 3.51 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.36 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.60-1.54 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 30H), 0.88 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.3, 101.4, 94.7, 82.3, 80.1, 78.3, 73.7, 72.2, 69.3, 63.1, 62.9, 33.0, 32.1 (3C), 30.7, 30.3, 29.9 (2C), 29.8 (2C), 29.6 (2C), 29.5, 26.4, 26.3, 26.0, 22.9, 14.3.

<6-3> 화합물 C12의 합성

실시예 1-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 C12을 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.97-3.26 (m, 10H), 2.56 (s, 1H), 2.41 (br s, 1H), 1.60-1.50 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 28H), 0.88 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.8, 80.9, 80.4, 73.7, 71.6, 71.4, 69.9, 62.0, 32.1, 30.7, 30.3, 29.9 (2C), 29.8 (2C), 29.6, 26.3, 22.9, 14.3.

<6-4> 화합물 D18의 합성

실시예 1-4의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 D18를 83%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.03-7.62 (m, 30H), 7.49-7.18 (m, 44H), 6.12 (q, 2H, J = 8.0 Hz), 5.69-5.13 (m, 11H), 4.81-3.96 (m, 16H), 3.89-3.00 (m, 10H), 1.29-1.09 (m, 29H), 0.87 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.2 (2C), 166.0, 165.9, 165.8 (2C), 165.7, 165.2 (2C), 165.1, 165.0, 133.6, 133.3, 133.2, 130.3, 130.1, 129.9 (2C), 129.8, 129.7, 129.6 (2C), 129.4, 129.3, 129.2, 129.1, 128.9, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 101.8, 100.5, 96.2, 95.7, 80.1, 79.1, 74.7, 73.2, 73.1, 72.8, 71.9, 71.4, 71.3, 70.7, 70.0 (2C), 69.2, 69.0, 62.7, 62.5, 32.2, 31.0, 30.1, 30.0 (2C), 29.9 (2C), 29.7, 29.6, 26.5, 26.2, 22.9, 14.4.

<6-5> TCM-C10의 합성

실시예 1-5의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCM-C9을 90%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, DMSO-d6): δ 5.54-5.26 (m, 10H), 5.04-4.89 (m, 14H), 4.62-4.52 (m, 8H), 4.20-2.98 (m, 65H), 1.48-1.42 (m, 7H), 1.40-1.19 (m, 53H), 0.87-0.84 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, DMSO-d6): δ 102.9, 101.2, 100.6, 80.4, 76.4, 75.2, 73.4, 73.3, 72.5, 70.2, 69.9, 60.7, 31.4, 29.8, 29.6, 29.3, 29.2 (2C), 29.1, 29.0, 28.7, 25.8, 25.7, 25.6, 22.2, 14.1; MS (MALDI-TOF): calcd. for C₁₀₀H₁₈₂O₅₁Na⁺ [M+Na]⁺ 2223.1579, found 2223.1655.

<실시예 2> TCG-Ls 의 합성 방법

TCG-Ls 의 합성 스킴을 도 2에 나타내었다. 하기 <2-1> 내지 <2-7>의 합성 방법에 따라 TCG-Ls 4종의 화합물을 합성하였다.

<2-1> 4,6,4′,6′- 디벤질리덴화 트레할로오스 (4,6,4′,6′-dibenzylidenated trehalose )(화합물 A)의 합성(도 1의 단계 a)

화합물 A를 J. Carbohydr . Chem. 2009, 28, 198-221.에 개시된 공정을 수정하여 88% 수율로 제조하였다. p-톨루엔설폰산 모노하이드레이트 (0.12 g, 0.7 mmol)을 톨루엔 (30 mL) 내에서 현탁액의 회전 증발을 통해 탈수시켰다. 상업적으로 이용가능한 α, α-트레할로스 디하이드레이트 (5.00 g, 13.25 mmol)를 에탄올 (30 mL)에서 4 시간 동안 환류 건조시키고 결정성 물 분자를 제거하기 위해 고진공에서 60 °C로 밤새 건조시켰다. 건조된 DMF (20 mL) 내 잔류 무수화 트레할로오스의 현탁액에 건조 DMF (20 mL)에 혼합된 p-톨루엔설폰산 (촉매량) 및 (디메톡시메틸)벤젠 (2 mL, 13.25 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 100 ℃에서 30 분간 가열하고 50 ℃에서 농축시켰다. 추가로 (디메톡시메틸)벤젠 (2 mL, 13.25 mmol)을 첨가하고 가열 절차를 반복 하였다. 추가량의 (디메톡시메틸)벤젠 (0.5 mL, 3.3 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 증기욕조에서 10 분 동안 가열하여 무색의 용액을 수득하였다. 반응을 Et₃N (pH> 7)을 적가함으로써 중단시켰다. 용매를 회전 증발기에서 증발시키고 두꺼운 유리질 액체를 컬럼크로마토그래피로 정제하여 백색 고체로서 4, 6, 4', 6'- 디벤질리덴화 트레할로오스 (화합물 A)를 수득하였다.

<2-2> 테트라 -O- 알킬레이션 (tetra-O- alkylation )의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 a)

0 ℃에서 NaH (6.0 당량) 및 4, 6, 4', 6'- 디벤질리덴화 트레할로오스 (화합물 A) (1 당량, 550mg)을 DMF (15mL)에 용해시켰다. 알킬 아이오다이드 (6.5 당량)를 적가하고, 생성된 용액을 80 ℃에서 4 일 동안 교반하였다. 반응 완료 후 (TLC로 검출됨), 용액을 디에틸 에테르 (170 mL)로 희석하고 1M HCl (2 x 20 mL) 용액 및 염수 (150 mL)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔류물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피 (EtOAc / 헥산)로 정제하여 목적하는 생성물 (화합물 5, 6, 19 또는 20)을 액체형태로 수득하였다.

<2-3> 벤질리덴화 탈보호기화 반응 ( benzylidene deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 2의 단계 b)

화합물 5, 6, 19 또는 20 (500 ㎎, 1 당량)을 메탄올 및 DCM (1:1 혼합물 50 ㎖)의 혼합물에 용해시키고 p-톨루엔설폰산 (0.25 당량)으로 실온에서 11 시간 동안 교반하면서 처리 하였다. TLC 검사에 의해 완료시, 용매를 진공에서 증발시켰다. 조 생성물을 건조 실리카 겔 분말과 혼합하고 진공하에 추가로 건조시켰다. 생성된 전흡착된 실리카 겔을 실리카 컬럼 (용리액: DCM / MeOH)에 적재하여 테트라-올 (화합물 11, 12, 21 또는 22)을 92 내지 96% 수율로 정제하였다.

<2-4> 화합물 H의 합성(도 2의 단계 c)

건조 테트라하이드로푸란 (THF, 20 mL)에 혼합된 화합물 11, 12, 21 또는 22 (1 g, 1.0 당량)의 용액에 0 ℃에서 NaH (미네랄 오일 내 60%, 5.0 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 서서히 실온으로 가온시키고 1 시간 동안 교반한 다음, 알릴 아이오다 이드 (5.0 당량)를 첨가하였다. 밤새 반응시킨 후, 포화 NH₄Cl 용액을 첨가하였다. 유기상을 EtOAc로 추출하고, 염수로 세척하고, Na₂SO₄상에서 건조시켰다. 여과하고 진공에서 용매를 제거한 후, 잔류물을 실리카 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 H를 수득하였다.

<2-5> 화합물 I의 합성(도 2의 단계 d)

0 ℃에서 물 (50 중량%)에 혼합된 NMO (5.0 당량)의 용액을 THF 및 물의 혼합물 (9:1 혼합물 15 mL)에 첨가하였다. 그 다음, 화합물 H (500 mg, 1 당량)를 한 번에 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반한 다음, OsO4 (tBuOH 중 2.5 중량% 용액의 1.4 ml)를 주사기로 20분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 반응을 아황산 나트륨 (8 g)을 첨가하여 종료시키고 물 (30 mL)로 희석시켰다. 그 후 용액을 EtOAc (2x70 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 건조시키고 (Na₂SO4), 진공에서 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc / 헥산)로 정제하여 오렌지색 검으로서 목적하는 옥타-놀 (화합물 I)을 수득하였다.

<2-6> β -C- 당화(glycosycosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 e)

이는 Chae , P. S. 등의 합성 방법 (Nat Meth 2010, 7, 1003.)에 따랐다. 무수 CH₂Cl₂ 에 알코올(1 당량, 화합물 I), AgOTf, 및 2,4,6-collidine(1.1 당량)을 -25℃에서 교반하였다. 이 현탁액에 CH₂Cl₂에 용해된 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide) 또는 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드(perbenzoylated maltosylbromide)용액 50분 동안 서서히 첨가하였다. 상기 반응을 위해 -25℃에서 50분 동안 계속 교반하였다. 그 후 반응물을 0℃로 가온하고 CH₂Cl₂ (20 mL)로 희석시킨 다음 celite로 여과하였다. 여과물을 1M Na₂S₂O₃ (40 mL) 수용액, 0.1M HCl 수용액 (40 mL) 및 염수(brine)으로 세척하였다. 그 다음 유기층을 무수 Na₂SO₄로 건조시키고, 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 고체 상태의 당화 화합물 J를 얻었다.

<2-7> 탈보호기화 반응 ( deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 2의 단계 f)

이는 Chae , P. S. 등의 합성 방법 (Nat Meth 2010, 7, 1003.)에 따랐다. Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화(de-O-benzoylation)를 수행하였다. O-protected 화합물을 무수 CH₂Cl₂로 용해시킨 다음 MeOH를 지속적인 침전이 나타날때까지 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 0.5M의 메탄올성 용액(methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05M이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 상온에서 12시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H⁺ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건(in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. CH₂Cl₂/MeOH/diethyl ether를 이용하여 재결정화하여 추가 정제함으로써 완전히 보호기가 제거된 흰색 고체 화합물 K (TCG-Ls)를 얻었다.

<제조예 7> TCG-L9의 합성

<7-1> 화합물 A의 합성

실시예 2-1의 4,6,4′,6′-디벤질리덴화 트레할로오스 합성 절차에 따라 화합물 A를 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃: CD₃OD = 1:2): δ 7.49-7.34 (m, 5H), 5.56 (s, 1H), 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.27-4.02 (m, 3H), 3.76-3.65 (m, 2H), 3.50 (t, 1H, J = 8.0 Hz); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 138.2, 129.7, 128.8, 127.0, 102.6, 95.6, 82.3, 73.2, 71.0, 69.6, 63.7

<7-2> 화합물 5의 합성

실시예 2-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 5를 83%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.34 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.20-4.18 (m, 2H), 3.77-3.48 (m, 6H), 3.38 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 2.99 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.58-1.47 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 24H), 0.87 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.3, 101.4, 94.7, 82.4, 80.2, 78.3, 73.7, 72.2, 69.3, 63.2, 62.9, 33.0, 32.1 (2C), 30.7, 30.4, 29.9, 29.8 (2C), 29.6 (2C), 29.5 (2C), 26.4, 26.3, 26.0, 22.9 (2C), 14.4.

<7-3> 화합물 11의 합성

실시예 2-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 11을 95%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.97-3.27 (m, 10H), 2.58 (s, 1H), 2.41 (br s, 1H), 1.60-1.52 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 24H), 0.88 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.8, 80.9, 80.4, 73.7, 71.6, 71.4, 70.0, 62.0, 32.1, 32.0, 30.6, 30.3, 29.8 (3C), 29.5, 26.3, 22.9, 14.3.

<7-4> 화합물 H23의 합성

실시예 2-4의 화합물 H의 합성 절차에 따라 화합물 H23을 85%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.01-5.87 (m, 3H), 5.30-5.13 (m, 10H), 4.36-3.26 (m, 28H), 1.62-1.28 (m, 56H), 0.91 (t, J = 8.0 Hz, 12H), ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 135.3, 134.7, 117.2, 116.8, 94.2, 81.4, 80.5, 74.1, 73.7, 72.6, 71.4, 70.5, 68.5, 32.0, 30.8, 30.3, 29.7, 29.6, 26.4, 26.3, 22.8, 14.2.

<7-5> 화합물 I27의 합성

실시예 2-5의 화합물 I의 합성 절차에 따라 화합물 I27을 89%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.10 (broad s, 2H), 4.07 (broad s, 10H), 3.85-3.31 (m, 42H), 1.62-1.27 (m, 56H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 94.2, 81.2, 81.1, 81.1, 80.6, 74.1, 73.9, 73.0, 72.3, 71.8, 71.8, 71.5, 71.3, 71.0, 70.9, 70.6, 69.8, 69.7, 64.1, 63.3, 63.0, 53.7, 32.1, 30.7, 30.6, 30.4, 29.8, 26.2, 22.7, 14.1.

<7-6> 화합물 J31의 합성

실시예 2-6의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 J31을 82%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.18-7.20 (m, 146H), 5.97-2.70 (m, 82H), 1.24-1.19 (m, 48H), 0.83 (t, J = 8 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.1, 165.8 (2C), 165.7, 165.3 (2C), 165.1, 164.9, 133.3, 133.2, 130.1, 129.9, 129.8, 129.2, 128.6, 128.5, 128.4, 101.4, 101.0, 100.7, 73.3, 73.1, 72.9, 72.6, 72.1, 71.7, 70.7, 70.4, 70.0, 69.7, 63.6, 63.3, 63.2, 62.9, 60.5, 32.0, 30.9, 30.0, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 26.5, 26.2, 22.9, 21.2, 14.3.

<7-7> TCG-L9의 합성

실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-L9를 95%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (broad s, 2H), 4.61-4.38 (m, 8H), 4.07-3.21 (m, 60H), 1.62-1.32 (m, 56H), 0.92-0.89 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.8, 104.6, 104.5, 104.4, 104.2, 82.6, 81.5, 79.2, 78.9, 78.4, 78.0, 75.4, 75.2, 75.0, 74.7, 72.9, 72.8, 72.3, 72.1, 71.6 (2C), 62.9, 62.8, 33.3, 33.2, 31.9, 31.4, 31.0 (2C), 30.9, 30.7, 27.6, 27.5, 23.9, 14.7 (2C); MS ( MALDI - TOF ): calcd. for C₁₀₈H₁₉₈O₅₉Na⁺ [M+Na]⁺ 2463.2424, found 2463.1799.

<제조예 8> TCG-L10의 합성

<8-1> 화합물 A의 합성

<8-2> 화합물 6의 합성

실시예 2-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 6를 83%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.34 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.20-4.18 (m, 2H), 3.77-3.48 (m, 6H), 3.38 (t, J = 4.0 Hz, 1H), 2.99 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.58-1.47 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 24H), 0.87 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.3, 101.4, 94.7, 82.4, 80.2, 78.3, 73.7, 72.2, 69.3, 63.2, 62.9, 33.0, 32.1 (2C), 30.7, 30.4, 29.9, 29.8 (2C), 29.6 (2C), 29.5 (2C), 26.4, 26.3, 26.0, 22.9 (2C), 14.4.

<8-3> 화합물 12의 합성

실시예 2-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 12을 95%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.97-3.27 (m, 10H), 2.58 (s, 1H), 2.41 (br s, 1H), 1.60-1.52 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 24H), 0.88 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.8, 80.9, 80.4, 73.7, 71.6, 71.4, 70.0, 62.0, 32.1, 32.0, 30.6, 30.3, 29.8 (3C), 29.5, 26.3, 22.9, 14.3.

<8-4> 화합물 H24의 합성

실시예 2-4의 화합물 H의 합성 절차에 따라 화합물 H24을 83%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.98-5.85 (m, 3H), 5.27-5.10 (m, 10H), 4.34-3.23 (m, 28H), 1.58-1.25 (m, 64H), 0.87 (t, J = 8.0 Hz, 12H), ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 135.3, 134.8, 117.2, 116.8, 94.2, 81.4, 80.5, 74.1, 73.7, 72.6, 71.4, 70.5, 68.5, 32.0, 30.8, 30.3, 29.8 (2C), 29.5, 26.4, 26.3, 22.8, 14.2.

<8-5> 화합물 I28의 합성

실시예 2-5의 화합물 I의 합성 절차에 따라 화합물 I28을 91%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.11 (broad s, 2H), 4.13 (broad s, 10H), 3.85-3.29 (m, 42H), 1.62-1.27 (m, 64H), 0.87 (t, J = 8.0 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 94.1, 81.3, 81.1, 81.1, 80.7, 74.1, 73.9, 73.0, 72.3, 71.9, 71.8, 71.5, 71.3, 71.0, 70.9, 70.6, 69.8, 69.7, 64.1, 63.3, 63.0, 53.7, 32.1, 30.7, 30.6, 30.4, 29.9, 29.8, 26.2, 22.8, 14.1.

<8-6> 화합물 J32의 합성

실시예 2-6의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 J32을 80%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.15-7.24 (m, 138H), 6.00-2.70 (m, 80H), 1.24-1.18 (m, 56H), 0.83 (t, J = 8 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.0, 165.8 (2C), 165.3, 165.2, 165.1, 133.3, 133.2, 130.2, 129.9 (2C), 129.8, 129.1, 128.6, 128.5, 128.4, 128.3, 101.5, 101.0, 100.7, 73.3, 73.1, 72.8, 72.6, 72.1, 71.7, 70.8, 70.4, 70.0, 69.7, 63.6, 63.3, 63.1, 60.5, 32.1, 32.0, 30.9, 30.0, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 26.5, 26.3, 22.8, 21.2, 14.3.

<8-7> TCG-L10의 합성

실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-L10를 94%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (broad s, 2H), 4.62-4.39 (m, 8H), 4.07-3.21 (m, 60H), 1.62-1.31 (m, 60H), 0.92-0.89 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.8 (2C), 104.6, 104.5, 104.2, 82.9, 82.6, 81.5, 79.4, 79.2, 78.9, 78.4, 78.0, 75.4, 75.2, 75.0, 74.7, 72.9, 72.8, 72.3, 72.1, 71.6 (2C), 62.9, 62.8, 33.3, 33.2, 31.4, 31.1, 31.0 (2C), 30.7, 27.6, 27.5, 23.9, 14.7 (2C); MS ( MALDI - TOF ): calcd. for C₁₁₂H₂₀₆O₅₉Na⁺ [M+Na]⁺ 2519.3050, found 2519.2441.

<제조예 9> TCG-L11의 합성

<9-1> 화합물 A의 합성

<9-2> 화합물 19의 합성

실시예 2-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 19를 81%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.51-7.33 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.23-4.19 (m, 2H), 3.85-3.62 (m, 10H), 3.51 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.36 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.65-1.55 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 36H), 0.88 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.8, 128.9, 128.3, 126.3, 101.4, 94.8, 82.3, 80.2, 78.3, 73.7, 72.2, 69.3, 63.1, 62.9, 32.1, 30.7, 30.4, 30.0, 29.9 (3C), 29.8, 29.6 (2C), 29.4, 26.4, 26.3, 26.0, 22.9, 14.3.

<9-3> 화합물 21의 합성

실시예 2-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 21을 96%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.14 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.96-3.26 (m, 10H), 2.56 (s, 1H), 2.41 (br s, 1H), 1.58-1.50 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 32H), 0.86 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.9, 80.9, 80.5, 73.7, 71.5, 71.3, 70.1, 62.2, 32.1, 30.7, 30.3, 29.9 (2C), 29.8, 29.6, 26.4, 26.3, 22.9, 14.3.

<9-4> 화합물 H25의 합성

실시예 2-4의 화합물 H의 합성 절차에 따라 화합물 H25을 87%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 6.00-5.85 (m, 3H), 5.28-5.11 (m, 10H), 4.35-3.24 (m, 28H), 1.60-1.26 (m, 72H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H), ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 135.4, 134.8, 117.1, 116.8, 94.2, 81.4, 80.5, 74.1, 73.7, 72.7, 71.4, 70.5, 68.5, 32.0, 30.8, 30.3, 29.8 (2C), 29.5, 26.4, 26.3, 26.2, 22.8, 14.2.

<9-5> 화합물 I29의 합성

실시예 2-5의 화합물 I의 합성 절차에 따라 화합물 I29을 89%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.10 (broad s, 2H), 4.08 (broad s, 10H), 3.84-3.29 (m, 42H), 1.62-1.27 (m, 72H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 94.1, 81.3, 81.2, 81.1, 80.7, 74.0, 73.9, 73.0, 72.3, 71.9, 71.8, 71.5, 71.3, 71.0, 70.9, 70.6, 69.8, 69.7, 64.1, 63.3, 63.0, 53.7, 32.1, 30.7, 30.6, 30.4, 29.9 (2C), 29.8, 26.3, 22.8, 14.2.

<9-6> 화합물 J33의 합성

실시예 2-6의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 J33을 84%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.17-7.22 (m, 146H), 5.98-2.70 (m, 84H), 1.24-1.19 (m, 68H), 0.83 (t, J = 8 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.1, 165.8 (2C), 165.3, 165.2, 165.1, 133.4, 133.2, 130.2, 129.9 (2C), 129.8, 129.1, 128.6, 128.5, 128.4, 101.5, 101.0, 73.3, 73.1, 72.9, 72.6, 72.1, 71.7, 70.8, 70.4, 70.0, 69.7, 63.6, 63.3, 63.1, 60.5, 32.1, 30.9, 30.0, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 26.5, 26.3, 22.9, 21.2, 14.3.

<9-7> TCG-L11의 합성

실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-L11를 91%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (broad s, 2H), 4.61-4.37 (m, 8H), 4.14-3.20 (m, 60H), 1.63-1.30 (m, 72H), 0.92-0.89 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.9 (2C), 104.7, 104.6, 104.5, 104.3, 104.1, 82.7, 81.5, 78.9, 78.1, 75.5, 75.2, 75.1, 74.7, 72.9, 72.5, 72.4, 72.2, 71.7 (2C), 71.6, 71.0, 70.4, 63.0, 62.8, 33.3 (2C), 32.0, 31.5, 31.2, 31.1, 31.0 (2C), 30.8, 30.7, 27.7, 27.0, 24.0; MS ( MALDI - TOF ): calcd. for C₁₁₆H₂₁₄O₅₉Na⁺ [M+Na]⁺ 2575.3676, found 2575.3853.

<제조예 10> TCG-L12의 합성

<10-1> 화합물 A의 합성

<10-2> 화합물 19의 합성

실시예 2-2의 테트라-O-알킬레이션(tetra-O-alkylation)의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 20을 87%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.52-7.36 (m, 5H), 5.53 (s, 1H), 5.15 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 4.24-4.20 (m, 2H), 3.85-3.62 (m, 10H), 3.51 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 3.37 (dd, 1H, J = 4.0 & 8.0 Hz), 1.65-1.55 (m, 4H), 1.36-1.25 (m, 42H), 0.88 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 137.7, 128.8, 128.3, 126.3, 101.5, 94.7, 82.3, 80.2, 78.3, 73.7, 72.2, 69.3, 63.1, 62.9, 32.1, 30.7, 30.4, 30.0, 29.9 (3C), 29.7, 29.6 (2C), 29.4, 26.4 (2C), 26.3, 26.0, 22.8, 14.3.

<10-3> 화합물 22의 합성

실시예 2-3의 벤질리덴화 탈보호기화 반응 (benzylidene deprotection reaction)의 일반적인 절차에 따라 화합물 22를 92%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.16 (d, 1H, J = 4.0 Hz), 3.97-3.26 (m, 10H), 2.56 (s, 1H), 2.41 (br s, 1H), 1.59-1.52 (m, 4H), 1.33-1.26 (m, 36H), 0.88 (app. t, J = 8.0 Hz, 6H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 93.9, 80.9, 80.5, 73.6, 71.4, 70.2, 62.3, 32.1, 30.7, 30.3, 29.9 (2C), 29.8 (2C), 29.6, 26.4, 26.3, 22.9, 14.3.

<10-4> 화합물 H26의 합성

실시예 2-4의 화합물 H의 합성 절차에 따라 화합물 H26을 84%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.98-5.85 (m, 3H), 5.28-5.11 (m, 10H), 4.34-3.24 (m, 28H), 1.60-1.26 (m, 78H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H), ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 135.4, 134.8, 117.3, 117.0, 94.3, 81.5, 80.6, 74.2, 73.8, 72.7, 71.5, 70.6, 68.6, 32.1, 30.9, 30.4, 29.9 (2C), 29.6, 26.5, 26.4, 22.9, 14.3.

<10-5> 화합물 I30의 합성

실시예 2-5의 화합물 I의 합성 절차에 따라 화합물 I30을 90%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 5.11 (broad s, 2H), 4.14 (broad s, 10H), 3.84-3.29 (m, 42H), 1.63-1.27 (m, 80H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 94.2, 81.3, 81.2, 81.1, 80.8, 74.0, 73.9, 73.0, 72.3, 71.9, 71.8, 71.5, 71.3, 71.0, 70.9, 70.6, 69.8, 69.7, 64.1, 63.3, 63.0, 53.8, 32.1, 30.7, 30.6, 30.4, 29.9 (2C), 29.8, 26.4, 26.3, 22.8, 14.2.

<10-6> 화합물 J34의 합성

실시예 2-6의 일반적인 β-C-당화 반응 절차에 따라 화합물 J34을 80%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8.15-7.25 (m, 146H), 5.98-2.61 (m, 90H), 1.24-1.19 (m, 78H), 0.84 (t, J = 8 Hz, 12H); ¹³ C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166.1, 165.8 (2C), 165.4, 165.2, 165.1, 133.4, 133.2, 130.2, 129.9 (2C), 129.8, 129.1, 128.6, 128.5, 128.4, 101.5, 100.9, 73.3, 73.1, 72.9, 72.6, 72.1, 71.7, 70.8, 70.4, 70.0, 69.7, 63.6, 63.3, 63.1, 60.5, 32.1, 30.9, 30.0, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 26.5, 26.3, 22.9, 21.2, 14.3.

<10-7> TCG-L12의 합성

실시예 2-7의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TCG-L12를 90%의 수득률로 합성하였다. ¹ H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 5.18 (broad s, 2H), 4.59-4.38 (m, 8H), 4.07-3.26 (m, 60H), 1.63-1.30 (m, 80H), 0.92-0.89 (m, 12H); ¹³ C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 104.9, 104.6, 104.5, 104.2, 104.1, 94.0, 82.6, 81.4, 79.4, 78.9, 78.5, 78.0, 75.4, 75.2, 75.0, 74.7, 72.9, 72.7, 72.3, 71.6, 70.5, 62.9, 62.8, 33.3, 33.2, 31.9, 31.5, 31.2, 31.1, 31.0, 30.7, 27.6, 23.9, 14.7; MS ( MALDI - TOF ): calcd. for C₁₂₀H₂₂₂O₅₉Na⁺ [M+Na]⁺ 2631.4302, found 2631.3655.

<실험예 1> TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의 특성

상기 실시예 1 및 2의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 1 내지 10의 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의 특성을 확인하기 위하여, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의 분자량(M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R _h)을 측정하였다.

구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제(1.0 wt%)에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R _h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.

Detergent	MW ^a	CMC (mM)	CMC (wt%)	R _h (nm)^b	Solubility (wt%)
TCG-C5	1271.40	~ 0.20	~ 0.025	28±1.0	~5.0
TCG-C6	1327.51	~ 0.15	~ 0.020	35±1.0	~2.5
TCG-C7	1383.62	~ 0.03	~ 0.0042	39±1.1	~2.0
TCM-C8	2088.29	~ 0.02	~ 0.0042	20±1.0	~2.5
TCM-C9	2144.40	~ 0.009	~ 0.0019	22±1.0	~2.5
TCM-C10	2200.51	~ 0.005	~ 0.0011	25±1.0	~2.0
TCG-L9	2440.71	~ 0.01	~0.0024	2.9±0.0	~10
TCG-L10	2496.82	~ 0.008	~ 0.0020	3.0±1.0	~10
TCG-L11	2552.93	~ 0.006	~ 0.0015	3.1±0.1	~5.0
TCG-L12	2609.04	~ 0.004	~ 0.0010	3.2±0.0	~2-3
DDM	510.10	~ 0.170	~0.0087	3.4±0.0	>10

대부분의 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의 CMC 값 (0.001 내지 0.20 mM)은 DDM의 CMC 값 (0.17 mM)과 비교하여 상당히 작았다. 따라서, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, DDM 보다 적은 양을 사용하고도 동일하거나 우월한 효과를 나타낼 수 있다. 또한, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의 CMC 값은 알킬 사슬의 길이가 증가함에 따라 감소하였는데, 이는 알킬 사슬 길이의 연장에 따라 소수성이 증가하기 때문인 것으로 판단된다. TCGs, TCMs 및 TCG-Ls에 의해 형성된 미셀의 크기는 대체적으로 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다. 이는 양친매성 화합물의 헤드 그룹의 부피가 일정하고, 꼬리 그룹의 부피가 알킬 사슬의 길이가 증가함에 따라 커져서 원뿔형에서 원통형으로 분자 기하 구조가 변하기 때문인 것으로 판단된다. 모든 TCG-Ls는 DDM과 유사한 크기의 미셀을 형성하는 반면에, TCGs 및 TCMs 는 DDM보다 큰 크기의 미셀을 형성함을 확인하였다.

한편, DLS를 통해 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 조사한 결과, 모든 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls는 오직 하나의 군집의 미셀을 나타내었으므로, 이는 미셀 균질성이 높음을 나타낸다 (도 3).

이러한 결과로부터 본 발명의 대부분의 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls는 DDM보다 낮은 CMC 값을 가져 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로 자가조립경향성이 DDM 보다 훨씬 크다는 점, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls에 의해 형성된 미셀의 크기는 친수성 헤드 그룹 및 알킬 사슬의 꼬리 그룹의 상대적 부피에 따라 차이가 있다는 점, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls에 의해 형성된 미셀은 균질성이 높다는 점을 확인할 수 있었다.

< 실험예 2> TCGs , TCMs 및 TCG - Ls에 의해 용해된 R. capsulatus superassembly 안정성 평가

조작된 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus) 균주에서 발현된 R. capsulatus 슈퍼어셈블리는 기존 문헌 (P. S. Chae, Analyst, 2015, 140, 3157-3163.)에 알려진 프로토콜에 따라 가용화되고 정제되었다. 동결된 멤브레인 (membrane)의 10 mL 분취량을 해동하고 실온에서 유리 조직 균질기 (glass tissue homogenizer)를 사용하여 균질화하였다. 균질액을 32 ℃에서 30 분 동안 천천히 교반하면서 인큐베이션하였다. 1.0 wt% DDM을 첨가 후, 균질액을 32 ℃에서 30 분 동안 더 인큐베이션하였다. 초 원심 분리 후, 가용화 된 LHI-RC (light harvesting complex I and the reaction centre) 복합체를 포함하는 상등액을 수집하고, Ni² ⁺-NTA 레진으로 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 레진을 10 개의 His-SpinTrap 컬럼에 각각 넣고 500 μL 결합 버퍼 (10 mM Tris (pH 7.8), 100 mL NaCl 및 1 x CMC DDM)으로 2 회 세척하였다. 1 M 이미다졸 (2 × 300 ㎕)을 포함하는 버퍼을 사용하여 DDM에 의해 정제된 LHI-RC 복합체를 컬럼으로부터 용출시켰다. CMC + 0.05 wt% 또는 CMC + 0.2 wt%의 최종 양친매성 분자 농도에 도달하기 위해 80 μL의 DDM에 의해 정제된 LHI-RC 복합체를 920 μL의 다음의 양친매성 분자 용액으로 각각 희석시켰다; (TCGs, TCMs, TCG-Ls, DDM 및 OG). 각각의 양친매성 분자에 의해 생성된 LHI-RC 복합체를 25℃에서 20일 동안 인큐베이션하였다. 650~950 nm의 범위에서 시료의 UV-가시광선 스펙트럼을 측정하여 단백질-양친매성분자 샘플을 인큐베이션하는 동안 일정한 간격으로 단백질 안정성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls 는 LHI-RC 복합체 안정성을 유지하는데 있어 DDM 보다 현저히 우수하였다. 세 그룹의 양친매성 화합물을 비교하는 경우, TCGs 보다 TCMs 및 TCG-Ls가 보다 우수한 효과를 나타내었다. 우수하였다. 양친매성 분자의 농도가 CMC + 0.2 wt%로 증가하는 경우, OG 및 DDM의 LHI-RC 복합체 안정성 유지 능력은 감소하지만, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls 에서는, 특히 TCMs 및 TCG-Ls에서는 단백질 안정성에 대한 농도의 영향은 크게 나타나지 않았다 (도 5 및 6). TCMs 및 TCG-Ls은 LHI-RC 장기 안정화에서 DDM 및 TCG보다 훨씬 더 효과적이었다.

<실험예 3> TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의 LeuT 막단백질 구조 안정화 능력 평가

TCMs 및 TCG-Ls에 의한 LeuT 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 각각의 양친매성 화합물은 (a) CMC + 0.04 wt% 또는 (b) CMC + 0.2 wt% 농도로 사용하였으며, LeuT의 기질 결합 특성을 [³H]-Leu를 사용하여 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 측정하였다. 측정은 상온에서 10일 인큐베이션 기간 동안 규칙적인 간격으로 수행하였다.

구체적으로, 호열성 박테리아 아퀴펙스 아에오리쿠스(Aquifex aeolicus) 유래 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)를 이전에 설명된 방법에 의해 정제하였다 (G. Deckert 등의 Nature 1998, 392, 353-358). LeuT를 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41 (DE3)에서 발현시켰다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA로부터 제공받음). 요약하면, 박테리아 멤브레인의 분리 및 1% (w/v) DDM에서 용해화 후에, 단백질을 Ni² ⁺-NTA 수지 (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05%(w/v) DDM 및 300 mM 이미다졸(imidazole)에서 용리하였다. 그 후에, 정제된 LeuT (약 1.5 mg/ml)는 상기와 동등한 버퍼에서 DDM 및 이미다졸을 제외하고, TCMs, TCG-Ls 또는 DDM이 최종 농도 CMC + 0.04% (w/v) 또는 CMC + 0.2% (w/v)로 보충된 버퍼로 희석하였다. 단백질 샘플은 상온에서 13일 동안 저장하고, 지정된 시간에 원심분리하고, 단백질 특성을 SPA를 사용하여 [³H]-Leucine 결합 능력을 측정함에 의하여 확인하였다. SPA는 450 mM NaCl 및 각각의 TCMs 또는 TCG-Ls (또는 DDM)을 함유하는 버퍼에서 수행하였다. SPA 반응은 20 nM [³H]-Leucine 및 1.25 mg/ml copper chelate (His-Tag) YSi beads (Perkin Elmer, Denmark)의 존재하에 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 전체 [³H]-Leucine 결합도는 MicroBeta liquid scintillation counter (Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다.

도 7a 및 도 7b에 나타난 바와 같이, 모든 TCMs 및 TCG-Ls는 13일 인큐베이션 기간 동안 LeuT의 기질 결합 특성을 유지하는 효과가 DDM 보다 우수하였다. 즉, 대부분의 TCMs 또는 TCG-Ls는 높은 화합물 농도에서도 오랜 기간 동안 트랜스포터 기질 결합 특성을 완전히 보유하였다. 반면 DDM은 화합물 농도가 증가함에 따라 용해화된 트랜스포터의 지속적인 구조적 붕괴가 관찰되었다. 화합물의 농도를 CMC+0.2 wt%로 증가시켰을 때, TCMs 또는 TCG-Ls 와 DDM 사이의 트랜스포터 안정화 효과의 차이는 더욱 명백해졌다 (도 7b). 특히 모든 농도에서 TCG-L12가 LeuT의 기질 결합 특성을 유지하는 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

반면에, 도 8에 나타난 바와 같이, TCGs 의 LeuT의 기질 결합 특성을 유지하는 효과를 측정한 결과, TCMs 및 TCG-Ls의 결과와는 상당한 차이가 있음을 확인하였다. TCGs 는 모든 농도에서 DDM 보다 현저히 낮은 효과를 나타냄을 확인하였다. 이와 같은 결과로 판단건대, 가장 짧은 알킬 사슬을 가진 TCGs의 효과가 가장 나쁘며, 가장 긴 알킬 사슬을 가진 TCG-Ls의 효과가 가장 우수한 것으로 나타났다. 이는 상기 화합물들의 소수성 길이가 트랜스포터의 너비와 상관관계가 있어야 효과적인 단백질 안정화가 이루어지기 때문에, 화합물의 소수성길이가 중요함을 확인할 수 있었다. 즉, TCGs 와 달리 TCMs 및 TCG-Ls는 긴 알킬 사슬로 인해 트랜스포터 안정화에 적합한 길이가 형성되어 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있었다.

이러한 결과는 전체적인 TCMs 및 TCG-Ls 구조 특히 길이가 LeuT 구조적 안정성 유지에 중요한 한가지 요소로 작용했음을 암시한다.

<실험예 4> TCGs, TCMs 및 TCG-Ls의

₂ AR 막단백질 구조 안정화 능력 평가

TCGs, TCMs 및 TCG-Ls에 의한 인간 β₂ 아드레날린성 수용체 (β₂AR), G-단백질 연결 수용체(GPCR) 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 즉, DDM으로 정제된 수용체는 CHS (cholesteryl hemisuccinate) 없이 각각의 TCGs, TCMs 및 TCG-Ls만을 함유하는 버퍼 용액 또는 CHS와 DDM을 함유하는 버퍼 용액으로 희석시켰다. 최종 화합물 농도는 CMC+0.2 wt%이었으며, 수용체의 리간드 결합 특성은 [³H]-디하이드로알프레놀올 ([³H]-DHA)의 결합에 의해 측정하였다.

구체적으로, 방사성 리간드 결합 시험은 다음과 같은 방법을 이용하였다. β₂AR는 0.1% DDM을 사용하여 정제하였으며 (D. M. Rosenbaum 등, Science, 2007, 318, 1266-1273.), 약 10 mg/ml (약 200 μM)로 최종 농축하였다. DDM으로 정제된

₂AR를 사용하여 0.2% 양친매성 화합물 (DDM, TCGs, TCMs 또는 TCG-Ls)에서 0.5 mg/ml BSA로 보충된 10 nM [³H]-Dihydroalprenolol (DHA)를 함유하는 마스터 결합 혼합물을 제조하였다. DDM, TCGs, TCMs 및 TCG-Ls로 정제된 수용체는 상온에서 30분 동안 10 nM의 [³H]-DHA와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 통과액을 1 ml 바인딩 버퍼 (0.5 mg/ml BSA 및 20xCMC 각각의 양친매성 화합물로 보충된 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl)로 수집하고, 그리고 15 ml 섬광 유체(scintillation fluid)로 채웠다. 수용체-결합된 [³H]-DHA는 섬광 카운터 (Beckman)로 측정했다. [³H]-DHA에 대한 비 특이적 결합은 동일한 결합 반응에서 2μM의 알프레놀올(alprenolol, Sigma)을 첨가함으로써 측정하였다. [³H]-DHA의 결합도는 컬럼 그래프로 나타내었고, 각각의 실험은 세 번씩 수행하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 수용체의 리간드 결합 특성을 유지하는 데 있어서 TCGs 및 TCG-Ls는 DDM 보다 낮고, TCMs는 DDM과 유사하거나 우수하였다.

또한, 상기 결과 효과가 우수한 TCM-C9 및 C10에 대하여 장기간 수용체의 리간드 결합 유지 특성을 확인하는 시험을 수행하였다. 구체적으로 TCM-C9, C10 및 DDM에 용해된 수용체에 대한 리간드 결합 특성을 상온에서 3일 동안 인큐베이션하면서 규칙적인 간격으로 모니터링한 결과는 도 7c에 나타내었다. 그 결과, TCM-C9는 DDM보다 수용체의 낮은 리간드 결합 유지 능력을 보여주었으나, TCM-C10은 DDM 보다 수용체의 높은 리간드 결합 능력을 보였다.

이것은 이전 다른 막 단백질에 대한 각 양친매성 화합물의 결과와는 다른 양상을 보인 것으로, 이것은 막 단백질이 가진 다양한 3차구조 및 특성으로 인하여 각각의 막 단백질 분석에 효과적인 양친매성 화합물의 구조 및 특성도 달라질 수 있음을 의미한다. 구체적으로 상기 실험예 3에서는 소수성의 알킬 사슬 길이가 단백질에 대한 결합 및 안정화에 중요한 역할을 한 것으로 판단할 수 있었으나, 실험예 4에서는 이와 반대로 친수성기에 해당하는 당류의 형태가 단백질에 대한 결합 및 안정화에 영향을 미치는 것으로 볼 수 있는 것으로부터 판단할 수 있다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고;
상기 L¹ 내지 L⁴는 직접결합이며; 그리고
상기 X¹내지 X⁴ 는 산소와 연결된 글루코스 또는 말토오스이다.
[화학식 2]

상기 화학식 2에서,
상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고;
상기 L⁵ 내지 L⁸은 비치환된 C₁-C₁₀의 알킬렌기이며; 그리고
상기 X⁵내지 X¹² 는 산소와 연결된 글루코스 또는 말토오스이다.
삭제
삭제
제 1항에 있어서, 상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₂₀의 알킬기이며; 그리고 상기 화학식 2에서 L⁵ 내지 L⁸은 -CH₂-인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 3 내지 12 중 하나인 화합물:
[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]

[화학식 10]

[화학식 11]

[화학식 12]
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM인 화합물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
1) 트레할로스에 다이벤질리덴화를 수행하여 보호기를 부착시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 테트라-O-알킬화를 반응을 수행하는 단계
3) 상기 단계 2)의 생성물의 다이벤질리덴 탈보호기화 반응을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 3의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고;
상기 L¹ 내지 L⁴는 직접결합이며; 그리고
상기 X¹내지 X⁴ 는 산소와 연결된 글루코스 또는 말토오스이다.
1) 트레할로스에 다이벤질리덴화를 수행하여 보호기를 부착시키는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 테트라-O-알킬화를 반응을 수행하는 단계
3) 상기 단계 2)의 생성물의 다이벤질리덴 탈보호기화 반응을 수행하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 생성물에 알릴 아이오다이드를 첨가하여 알릴기를 부착시킨 다음, 상기 알릴기의 이중결합을 산화제를 이용하여 산화시켜 옥타-올(octa-ol)을 생성시키는 단계;
5) 상기 단계 4)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
6) 상기 단계 5)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 2]

상기 화학식 2에서,
상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고;
상기 L⁵ 내지 L⁸은 비치환된 C₁-C₁₀의 알킬렌기이며; 그리고
상기 X⁵내지 X¹² 는 산소와 연결된 글루코스 또는 말토오스이다.
수용액에서 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고;
상기 L¹ 내지 L⁴는 직접결합이며; 그리고
상기 X¹내지 X⁴ 는 산소와 연결된 글루코스 또는 말토오스이다.
[화학식 2]

상기 화학식 2에서,
상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₃₀의 알킬기이고;
상기 L⁵ 내지 L⁸은 비치환된 C₁-C₁₀의 알킬렌기이며; 그리고
상기 X⁵내지 X¹² 는 산소와 연결된 글루코스 또는 말토오스이다.
제 12항에 있어서, 상기 R¹ 내지 R⁴는 각각 독립적으로 비치환된 C₃-C₂₀의 알킬기이며; 그리고 상기 화학식 2에서 L⁵ 내지 L⁸은 -CH₂-인 방법.
제 12항에 있어서, 상기 막단백질은 LHI-RC, LeuT (Leucine transporter), β₂AR (human β₂ adrenergic receptor), 또는 이들의 2 이상의 조합인 방법.