KR101998175B1 - 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 - Google Patents

새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 Download PDF

Info

Publication number
KR101998175B1
KR101998175B1 KR1020170011128A KR20170011128A KR101998175B1 KR 101998175 B1 KR101998175 B1 KR 101998175B1 KR 1020170011128 A KR1020170011128 A KR 1020170011128A KR 20170011128 A KR20170011128 A KR 20170011128A KR 101998175 B1 KR101998175 B1 KR 101998175B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
compound
nbm
nbms
membrane protein
protein
Prior art date
Application number
KR1020170011128A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180086986A (ko
Inventor
채필석
다스 마나벤드라
Original Assignee
한양대학교 에리카산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한양대학교 에리카산학협력단 filed Critical 한양대학교 에리카산학협력단
Priority to KR1020170011128A priority Critical patent/KR101998175B1/ko
Priority to CA3050677A priority patent/CA3050677C/en
Priority to US16/480,348 priority patent/US11279726B2/en
Priority to PCT/KR2017/001486 priority patent/WO2018139698A1/ko
Publication of KR20180086986A publication Critical patent/KR20180086986A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101998175B1 publication Critical patent/KR101998175B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1136—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by reversible modification of the secondary, tertiary or quarternary structure, e.g. using denaturating or stabilising agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation
    • C07K1/306—Extraction; Separation; Purification by precipitation by crystallization
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6842—Proteomic analysis of subsets of protein mixtures with reduced complexity, e.g. membrane proteins, phosphoproteins, organelle proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 새롭게 개발한 노르보닌 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 화합물은 기존의 화합물보다 다양한 구조와 특성을 지닌 막단백질들을 세포막에서 효율적으로 추출하고 이를 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 신약 개발에 밀접한 관계가 있는 만큼 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이다.

Description

새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 {Novel norbornene-based amphiphiles and uses thereof}
본 발명은 새롭게 개발한 노르보닌 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.
막단백질 (membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자 (bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 세포막으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.
막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질들은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하는 경향이 있기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다. 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.
이에 본 발명자들은 노르보넨 중심구조에 소수성기와 친수성기가 도입된 양친매성 화합물을 개발하였고, 이 화합물의 막단백질 안정화 특성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472. S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.
본 발명의 목적은 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017008477255-pat00001
[화학식 2]
Figure 112017008477255-pat00002
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C3-C30의 아릴기이고; 그리고
상기 X1 및 X2 은 당류 (saccharide)이다.
본 발명의 상기 화학식 1 또는 화학식 2는 서로 부분입체이성질체 관계에 있으며, 화학식 1은 엑소 (exo-)형이고, 화학식 2는 엔도 (endo-)형을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 용어, "당류 (saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.
상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류 (monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스 (glucose) 또는 말토오스 (maltose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성기인 당류 2개를 병렬로 연결하여 친수성기의 크기를 크게 하면서도 길이의 증가를 최소화함으로써 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기를 작게하였다. 상기 화합물과 막단백질과의 복합체의 크기가 작으면 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있다 (G. G. Prive, Methods 2007, 41, 388-397).
또한, 상기 R1 및 R2는 소수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성도와 소수성도의 밸런스 (hydrophile-lipophile balance)를 최적으로 하기 위하여 2개의 소수성기를 도입하였다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 중심구조로 노르보넨 (norbonane) 링커를 가질 수 있다. 즉, 상기 화합물은 노르보넨을 중심구조로 하여 2개의 친수성기 및 2개의 소수성기를 도입한 양친매성 물질로, 막단백질 안정화 및 결정화에 우수한 성능을 가질 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기일 수 있고; 그리고 상기 X1 및 X2 은 글루코스 (glucose) 또는 말토오스 (maltose)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 화학식 1 또는 화학식 2에서 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기일 수 있고; 상기 X1 및 X2 은 말토오스 (maltose)일 수 있는 이러한 화합물을 "NBMs (norbornene-based maltosides)"로 명명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R1 및 R2는 C9의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2은 말토오스 (maltose)이고; 그리고 엑소형 (exo-) 부분입체이성질체인 화합물을 "X-NBM-C9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 3로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 3]
Figure 112017008477255-pat00003
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R1 및 R2는 C9의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2은 말토오스 (maltose)이고; 그리고 엑소형 (exo-) 부분입체이성질체인 화합물을 "X-NBM-C10"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 4]
Figure 112017008477255-pat00004
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물로서, 상기 R1 및 R2는 C11의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2은 말토오스 (maltose)이고; 그리고 엑소형 (exo-) 부분입체이성질체인 화합물을 "X-NBM-C11"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 5]
Figure 112017008477255-pat00005
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R1 및 R2는 C9의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2은 말토오스 (maltose)이고; 그리고 엔도형 (endo-) 부분입체이성질체인 화합물을 "D-NBM-C9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 6로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 6]
Figure 112017008477255-pat00006
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R1 및 R2는 C10의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2은 말토오스 (maltose)이고; 그리고 엔도형 (endo-) 부분입체이성질체인 화합물을 "D-NBM-C10"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 7로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 7]
Figure 112017008477255-pat00007
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물로서, 상기 R1 및 R2는 C11의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2은 말토오스 (maltose)이고; 그리고 엔도형(endo-) 부분입체이성질체인 화합물을 "D-NBM-C11"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 8]
Figure 112017008477255-pat00008
본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 공존하여 극성, 비극성 용매 모두에 친화성을 가질 수 있는 분자를 의미한다. 양친매성 화합물이나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 수용액에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하고 친수성기가 표면에 노출된 둥글거나 타원 형태의 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 크게 증가한다.
CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔 (diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도 (CMC)가 0.0001 내지 1 mM일 수 있으며, 구체적으로 0.0001 내지 0.1 mM, 보다 구체적으로 0.001 내지 0.1 mM, 보다 더 구체적으로 0.001 내지 0.05 mM, 예를 들어 0.005 내지 0.05 mM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 0.17 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 NBMs는 매우 작은 CMC 값을 가지고 있다. 따라서, NBMs는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 활용측면에서 유리하다 할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 30 nm일 수 있고, 구체적으로 2.0 nm 내지 20.0 nm일 수 있고, 예를 들어, 3.0 nm 내지 17.5 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.
상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부의 소수성으로 막단백질과 결합할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 세포막으로부터 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 4)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1)5-노르보닌-2-엑소,3-엑소-디메탄올 (5-norbornene-2-exo,3-exo-dimethanol) 또는 이의 부분입체이성질체인 5-노르보닌-2-엔도,3-엔도-디메탄올 (5-norbornene-2-endo,3-endo-dimethanol)를 디알킬레이션 (dialkylation) 반응을 수행하여 알킬기를 도입하는 단계;
2)상기 단계 1)의 생성물을 디하이드록실레이션 (Dihydroxylation) 반응을 수행하여 노르보닌 (norbornene)내의 이중결합 (double bond)을 다이올 (diol)로 변환시키는 단계;
3)상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션 (glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
4)상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화 (deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 (엑소형) 또는 화학식 2로 표시되는 화합물(엔도형)의 제조 방법:
[화학식 1]
Figure 112017008477255-pat00009
[화학식 2]
Figure 112017008477255-pat00010
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C3-C30의 아릴기이고; 그리고
상기 X1 및 X2 은 당류 (saccharide)이다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고; 그리고 상기 X1 및 X2 는 글루코스 또는 말토오스 (maltose)일 수 있다. 바람직하게는 상기 X1 및 X2 는 말토오스 (maltose)일 수 있다.
상기 단계 2)의 디하이드록실레이션은 업존 디하이드록실레이션 (Upjohn dihydroxylation)일 수 있다. "업존 디하이드록실레이션" 반응은 알켄 (alkene)을 시스 비시날 디올 (cis vicinal diol)로 전환하는 반응이며, 알켄의 두 면에 대한 반응 선택성이 없어 두 가지 이성질체가 생성될 수 있다. 허나 본 반응물의 경우에는 두면의 입체장애의 차이로 하나의 이성질체만 선택적으로 얻어진다. 구체적인 반응 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있다.
상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 3 내지 8 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 구체예에서, 4단계의 짧은 합성 단계를 거쳐 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있으므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112017008477255-pat00011
[화학식 2]
Figure 112017008477255-pat00012
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C3-C30의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C3-C30의 아릴기이고; 그리고
상기 X1 및 X2 은 당류 (saccharide)이다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고; 그리고 상기 X1 및 X2 는 글루코스 또는 말토오스 (maltose)일 수 있다. 바람직하게는 상기 X1 및 X2 는 말토오스 (maltose)일 수 있다.
상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 3 내지 8 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬과 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 UapA (Uric acid-xanthine/H+ symporter), LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor), MelBst (Melibiose permease), 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출 (extraction)"이란 막단백질을 세포막 (membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화 (solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화 (stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화 (crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석 (analysis)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경 (electron microscopy) 또는 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 노르보닌 기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.
막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.
또한, 본 발명의 구체예들의 따른 화합물은 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기가 작아 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있어 막단백질의 결정화를 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.
도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 X-NBMs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 D-NBMs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 3은 NBMs의 화학 구조 및 뉴먼 투영도를 나타낸 것으로, D-NBMs와 X-NBMs는 서로 부분입체이성질체임을 보여준다.
도 4는 D-/X-NBM-C11의 아노머 양성자 (proton)를 중심으로 한 화학 구조 및 NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다. (a, c) D-/X-NBM-C11의 화학구조, (b) D-/X-NBM-C11의 아노머 영역에서 부분 1H NMR 스펙트럼, (d, e) D-/X-NBM-C11의 부분 2D NOESY NMR 스펙트럼.
도 5는 D-/X-NBM-C11의 화학 구조 (a 및 a`) 및 공간 채움 모델 (3차 구조)(b 및 b`)를 나타낸 것이다. 회색 큰 원은 탄소 원자, 회색 작은 원은 수소 원자 및 붉은색 원은 산소 원자를 나타낸다.
도 6은 25oC에서 NBMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포도를 나타낸 것이다.
도 7은 NBMs (D-NBM-C10 (a), D-NBM-C11 (b), X-NBM-C10 (c) and X-NBM-C11(d))의 온도 변화별 미셀 크기 분포도를 나타낸 것이다.
도 8은 NBMs, MNG-3 또는 DDM에 의해 수용액에 용해된 UapA 단백질의 열적안정성을 형광 크기 배제 크로마토그래피(FSEC)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다:
(a) X-NBMs, MNG-3 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%; 및
(b) D-NBMs, MNG-3 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%.
도 9는 NBMs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA (scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 12일 동안 상온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다:
(a) NBMs 또는 DDM 농도가 CMC + 0.04 wt%; 및
(b) NBMs 또는 DDM 농도가 CMC + 0.2 wt%.
도 10은 NBMs 또는 DDM에 가용화된 β2AR의 초기 리간드 결합 능력을 나타낸 것으로, 단백질 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 11은 NBMs (X-NBM-C11 또는 D-NBM-C11)에 의해 가용화된 β2AR의 장기간 안정성을 검증한 결과이다. (a) 0일, 0.5일, 1.5일, 2일, 2.5일, 3.0일마다 측정한 수용체 리간드 결합 특성을 나타냄, (b) 0일, 7일 14일, 21일마다 측정한 NBMs (X-NBM-C11 또는 D-NBM-C11) 및 DDM의 β2AR-G단백질 결합 복합체의 크기를 평가하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography, SEC) 실험 결과.
도 12는 (a) X-NBM-C11 또는 DDM에 의해 세포막으로부터 추출 용해화된 β2AR의 초기 리간드 결합 능력을 비교한 결과, (b) X-NBM-C11 또는 DDM에 의해 세포막으로부터 추출 용해화된 β2AR의 장기간 리간드 결합 능력을 7일간 일정 간격으로 측정한 결과이다.
도 13은 양친매성 화합물을 교환한 후 X-NBM-C11 또는 DDM에 가용화된 β2AR에 대한 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography, SEC) 실험 결과이다.
도 14는 X-NBM-C11 또는 DDM로 가용화된 형광 물질 (mBBr)로 표지된 수용체 (mBBr-β2AR)의 형광 스펙트럼을 나타낸 것이다. mBBr-β2AR의 스펙트럼을 길항제 (agonist) 부존재, 길항제 (isoproterenol, ISO) 존재 또는 길항제 및 Gs-단백질 존재 하에서 측정하였다.
도 15는 X-NBM-C11으로 가용화된 β2AR-Gs 복합체의 전자 형미경 관찰 결과를 나타낸 것이다. (a) 전체 이미지, (b) 2D 분류 분석 이미지, (c) 같은 방향에 있는 대표적인 복합체의 평균 이미지, (d) β2AR-Gs 복합체의 각 구성요소에 대한 결정 구조.
도 16는 NBMs 또는 DDM을 1.5 wt% 농도로 사용하여 MelBSt 단백질을 4개의 온도(0, 45, 55, 65 )에서 추출 후, 90분 동안 같은 온도에서 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelBSt 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelBSt 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelBSt 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플 (Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지 (%)로 나타낸 히스토그램 (histogram).
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> NBMs의 합성
X-NBMs 또는 D-NBMs 합성 스킴을 도 1 또는 도 2에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-4>의 합성 방법에 따라 X-NBMs 및 D-NBMs를 각각 3종씩 6종의 화합물을 합성하였다.
<1-1> 디알킬레이션(dialkylation)의 일반 합성 절차 (도 1 및 도 2의 단계 a)
화합물 A 또는 G (1 당량 500 mg) 및 NaH (3.0 당량)를 DMF (15mL)에 0℃에서 용해시켰다. 알킬 아이오다이드 (alkyl iodide, 2.9 당량)를 천천히 첨가하고, 용액을 70℃에서 3일 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후에 (TLC에 의해 반응 완료를 확인함), 용액을 디에틸에터 (150 mL)로 희석시키고, 1M HCl 수용액 (2 x 20 mL) 및 brine (100 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 회전 증발기를 이용하여 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)에 의해 정제하여, 액체 상태의 화합물 B 또는 화합물 H를 얻었다.
<1-2> 업존 디하이드록실레이션(Upjohn Dihydroxylation)의 일반 합성 절차(도 1 및 도 2의 단계 b)
0 ℃에서 물 (50 중량 %) 중 NMO (1.5 당량)의 용액을 THF 및 물의 혼합물 (9:1 혼합물 15 mL)에 첨가하였다. 이어서, 화합물 B 또는 H (500mg, 1.5 당량)를 한꺼번에 첨가하고, 혼합물을 15분 동안 교반한 다음 OsO4(t-BuOH중 2.5 중량 % 용액 1.4mL)를 주사기로 20 분 이상 천천히 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 5일 동안 교반하였다. 반응을 나트륨 설파이트 (8.0g)를 첨가하여 중단시키고 물 (30mL)로 희석시켰다. 그 후 용액을 EtOAc (2 x 70 mL)로 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 무수 Na2SO4로 건조시키고 진공 농축시키고, 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 오렌지색 검(gum) 상태의 디올(diol) C 또는 I를 얻었다.
<1-3> 당화(glycosycosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 1 및 도2의 단계 c)
이 방법는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 3789-3796.)을 약간 수정하여 사용하였다. 무수 CH2Cl2(40mL)중의 화합물 C 또는 I (1 당량, 250 mg), AgOTf (2.4 당량) 및 콜리딘 (collidine, 1.0 당량)의 혼합물을 -45 ℃에서 교반하였다. CH2Cl2(10mL)중 2.4 당량의 퍼벤조일화된 말토실브로마이드(perbenzoylatedmaltosylbromide, D-(+)-말토오스 모노하이드레트로부터 합성됨)의 용액을 0.5 시간 동안 이 현탁액에 천천히 첨가하였다. -45 ℃에서 0.5 시간 동안 교반을 계속한 다음, 반응 혼합물을 0 ℃로 가온시키고 1 시간 동안 교반하였다. 반응 완료 후, 피리딘을 반응 혼합물에 첨가하고, 셀라이트 (celite)로 여과하기 전에 CH2Cl2(40mL)로 희석시켰다. 여과액을 1M Na2S2O3수용액 (40 mL), 0.1 M HCl 수용액 (40 mL) 및 brine (2 x 40 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고, 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여, 백색 교체상태의 화합물 D 또는 J을 얻었다.
<1-4> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 g)
이 방법은 Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화 (de-O-benzoylation)를 수행하였다 (Ashton, P. R.; Boyd, S. E.; Brown, C. L.; Jayaraman, N.; Nepogodiev, S. A.; Stoddart, J. F. Chem.-Eur. J. 1996, 2, 1115-1128). O-protected 화합물 D 또는 J를 무수 MeOH로 용해시고 상기 반응 혼합물에 0.5M의 메탄올성 용액 (methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05M이 되도록 처리하였다. 반응 혼합물을 상온에서 14시간 동안 교반시킨 다음, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H+form)resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건 (in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물을 CH2Cl2/MeOH/diethylether를 이용하여 재결정화하여 보호기가 완전히 제거된 백색 고체상태의 화합물 E 또는 K를 얻었다.
<제조예 1> X-NBM-C9의 합성
<1-1> 화합물 B1의 합성
실시예 1-1의 디알킬레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B1을 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3):δ 6.15 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.57 (dd, J = 8.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 3.44-3.34 (m, 4H), 3.27 (app. t, J = 8.2 Hz, 2H), 2.75 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 1.77-1.75 (m, 2H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.48 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 1.40-1.30 (m, 27H), 0.88 (t, J = 8.6 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz,CDCl3):δ 137.5, 72.3, 71.4, 45.0, 42.9, 40.7, 30.0, 29.8, 29.7, 29.5, 26.5, 22.9, 14.3.
<1-2> 화합물 C4의 합성
실시예 1-2의 업존 디하이드록실레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 C4를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.71 (br s, 2H), 3.51 (br s, 2H), 3.42 (dd, J = 8.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 3.37-3.32 (m, 4H), 3.22 (app. t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.09 (br s, 2H), 1.75-1.73 (m, 2H), 1.61 (d, J = 8 Hz, 1H), 1.54-1.49 (m, 4H), 1.40-1.20 (m, 27H), 0.86 (t, J = 8.1 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.3, 71.4, 70.3, 46.9, 40.6, 32.1, 29.8 (2C), 29.7, 29.5, 27.5, 26.4, 22.9, 14.3.
<1-3> 화합물 D7의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 D7을 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.12-7.78 (m, 9H), 7.71-7.50 (m, 14H), 7.42-7.12 (m, 43H), 6.12 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 6.09 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 5.79-5.55 (m, 5H), 5.54-5.48 (m, 2H), 5.39-5.33 (m, 3H), 5.03 (br s, 1H), 4.84-4.75 (m, 2H), 4.61-4.25 (m, 10H), 4.11-3.79 (m, 3H), 3.41-3.39 (m, 1H), 3.25-3.16 (m, 4H), 3.06-3.00 (m, 2H), 2.00-1.98 (m, 2H), 1.58-1.39 (m, 5H), 1.38-1.20 (m, 21H), 1.00-1.11 (m, 1H), 0.87 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.9, 165.8, 165.7, 165.6, 165.4, 165.1, 164.9, 164.7, 164.3, 133.4, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5 (2C), 129.0, 128.9 (2C), 128.8 (2C), 128.7, 128.6, 128.5 (2C), 128.4, 128.2 (2C), 128.1, 128.0, 99.0, 98.1, 96.9, 96.4, 81.0, 79.2, 72.4, 71.3, 71.0 (2C), 69.2, 69.1, 69.0, 64.1, 62.6, 60.4, 31.9, 29.8, 29.7, 29.6 (2C), 29.5, 29.4 (2C), 26.3, 26.2, 22.8, 22.7, 21.1, 14.2 (2C).
<1-4> X-NBM-C9의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 X-NBM-C9를 95%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 5.16 (dd, J = 12.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.03-3.99 (m, 2H), 3.93-3.78 (m, 7H), 3.67-3.59 (m, 10H), 3.54-3.22 (m, 24H), 2.27 (br s, 1H), 2.19 (br s, 1H), 1.85-1.74 (m, 3H), 1.55 (app. t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.45 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.40-1.22 (m, 26H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13 C NMR(100MHz, CD3OD):δ 103.4, 103.3, 103.0, 82.8, 82.1, 81.5, 81.3, 77.9, 77.7, 76.9, 76.7, 75.4, 75.2, 74.9, 74.2(2C), 72.3, 72.2, 71.5, 62.8, 62.4, 47.5, 45.4, 42.1, 41.8, 33.2, 30.9 (2C), 30.7, 30.6, 27.6, 27.5, 23.9, 14.6; HRMS (EI): calcd. for C51H92O24Na+ [M+Na]+ 1111.5876, found 1111.5873.
<제조예 2> X-NBM-C10의 합성
<2-1> 화합물 B2의 합성
실시예 1-1의 디알킬레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B2를 78%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.15 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 3.55 (dd, J = 8.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 3.40-3.30 (m, 4H), 3.27 (app. t, J = 8.6 Hz, 2H), 2.74 (t, J = 4.1 Hz, 2H), 1.77-1.75 (m, 2H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.47 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 1.40-1.28 (m, 30H), 0.89 (t, J = 7.8 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 137.5, 72.3, 71.4, 45.1, 42.9, 40.7, 32.1, 30.0, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 26.5, 22.9, 14.3.
<2-2> 화합물 C5의 합성
실시예 1-2의 업존 디하이드록실레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 C5를 95%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.89 (br s, 2H), 3.67 (br s, 2H), 3.39 (dd, J = 8.0 Hz, 4.1 Hz, 2H), 3.37-3.31 (m, 4H), 3.20 (app. t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.06 (br s, 2H), 1.72-1.68 (m, 2H), 1.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 1.51-1.48 (m, 4H), 1.35-1.25 (m, 31H), 0.84 (t, J = 8.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.1, 71.4, 70.3, 46.8, 40.5, 32.0, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 27.5, 26.4, 22.8, 14.2.
<2-3> 화합물 D8의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 D8을 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.10-7.77 (m, 9H), 7.75-7.43 (m, 14H), 7.42-7.17 (m, 40H), 6.18 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 6.08 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.75-5.64 (m, 5H), 5.51-5.44 (m, 2H), 5.36-5.32 (m, 3H), 5.99 (br s, 1H), 4.80-4.70 (m, 2H), 4.60-4.18 (m, 10H), 3.84-3.53 (m, 3H), 3.40-3.34 (m, 1H), 3.23-3.13 (m, 4H), 3.04-2.97 (m, 2H), 1.96-1.95 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 5H), 1.40-1.20 (m, 22H), 1.05-0.95 (m, 1H), 0.89 (t, J = 7.7 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.3 (2C), 166.0 165.9, 165.8, 165.7, 165.5, 165.4, 165.2, 165.0, 164.8, 164.4, 133.5 (2C), 133.4, 133.2, 130.2, 130.1, 130.0 (2C), 129.9 (2C), 129.8, 129.7 (2C), 129.6, 129.1, 128.9 (2C), 128.7, 128.6, 128.5 (2C), 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 99.9, 98.2, 96.9, 96.8, 81.2, 78.9, 71.4, 71.2, 70.7, 70.3, 70.1, 69.3, 69.2, 69.1, 64.2, 62.7, 40.3, 32.1 (2C), 29.9, 29.8 (2C), 29.7 (2C), 29.5, 26.5, 26.3, 22.9, 22.8, 14.3 (2C).
<2-4> X-NBM-C10의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 X-NBM-C10를 89%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 5.15 (dd, J = 12.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.03-3.98 (m, 2H), 3.92-3.81 (m, 7H), 3.65-3.59 (m, 10H), 3.53-3.22 (m, 29H), 2.27 (br s, 1H), 2.20 (br s, 1H), 1.84-1.74 (m, 3H), 1.55 (app. t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.46 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.40-1.22 (m, 31H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13 CNMR(100 MHz, CD3OD):δ 103.5, 103.2, 103.0, 82.9, 82.5, 81.8, 81.6, 81.4, 81.3, 77.8, 77.7, 76.9, 76.7, 76.6, 75.2, 75.0, 74.9, 74.1, 72.2, 71.6, 71.5, 62.7, 62.1, 47.5, 45.4, 42.0, 41.8, 33.2, 30.9 (3C), 30.7, 30.6, 29.7, 27.5 (2C), 23.9, 14.6; HRMS (EI): calcd. for C53H96O24Na+ [M+Na]+ 1139.6189, found 1139.6187.
<제조예 3> X-NBM-C11의 합성
<3-1> 화합물 B3의 합성
실시예 1-1의 디알킬레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 B3을 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.14 (t, J = 4.2 Hz, 2H), 3.56 (dd, J = 8.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 3.41-3.36 (m, 4H), 3.27 (app. t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.74 (t, J = 4.4 Hz, 2H), 1.77-1.75 (m, 2H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.48 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 1.40-1.20 (m, 41H), 0.88 (t, J = 7.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 137.5, 72.3, 71.4, 45.0, 42.9, 40.7, 32.1, 30.0, 29.8 (2C), 29.7, 29.6, 29.5 (2C), 26.5, 22.9, 14.3.
<3-2> 화합물 C6의 합성
실시예 1-2의 업존 디하이드록실레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 C6를 91%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.84 (br s, 2H), 3.71 (br s, 2H), 3.44 (dd, J = 8.1 Hz, 4.1 Hz, 2H), 3.40-3.31 (m, 4H), 3.24 (app. t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.10 (br s, 2H), 1.80-1.70 (m, 2H), 1.62 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 1.56-1.51 (m, 4H), 1.40-1.20 (m, 34H), 0.88 (t, J = 7.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 74.2, 71.4, 70.3, 46.8, 40.5, 32.1, 29.8, 29.6, 29.5, 27.5, 26.4, 22.8, 14.3.
<3-3> 화합물 D9의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 D9을 87%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.09-7.87 (m, 9H), 7.77-7.51 (m, 15H), 7.42-7.14 (m, 48H), 6.16 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 6.08 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 5.76-5.61 (m, 5H), 5.51-5.44 (m, 2H), 5.32-5.29 (m, 3H), 5.00 (br s, 1H), 4.83-4.71 (m, 2H), 4.59-4.21 (m, 11H), 3.93-3.71 (m, 3H), 3.40-3.34 (m, 1H), 3.29-3.10 (m, 4H), 3.09-2.95 (m, 2H), 1.97-1.95 (m, 2H), 1.55-1.47 (m, 6H), 1.40-1.20 (m, 33H), 1.02-0.92 (m, 1H), 0.86 (t, J = 7.8 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.3 (2C), 166.1, 165.9, 165.8, 165.7, 165.5, 165.3, 165.2, 165.1, 164.8, 164.4, 133.4, 133.3, 133.2 (2C), 133.0, 130.2, 130.1, 129.9 (2C), 129.8, 129.7, 129.6, 129.2, 129.0, 128.9 (2C), 128.7, 128.6 (2C), 128.5 (2C), 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 99.7, 98.5, 97.3, 97.0, 80.7, 79.6, 71.8, 71.4, 71.2, 70.7, 70.6, 70.3, 70.1, 69.4, 69.3, 69.2, 69.1, 64.2, 62.7, 40.5, 40.3, 32.1 (2C), 29.9, 29.8, 29.7 (2C), 29.6, 29.5, 28.6, 26.4 (2C), 22.9, 14.3.
<3-4> X-NBM-C11의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 X-NBM-C10를 97%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 5.16 (dd, J = 12.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 4.57 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.03-3.98 (m, 2H), 3.93-3.81 (m, 7H), 3.68-3.58 (m, 9H), 3.53-3.22 (m, 22H), 2.27 (br s, 1H), 2.19 (br s, 1H), 1.84-1.74 (m, 3H), 1.54 (app. t, J = 4.0 Hz, 4H), 1.45 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 1.40-1.22 (m, 35H), 0.90 (t, J = 6.4 Hz, 6H); 13 CNMR(100 MHz, CD3OD):δ 103.5, 103.3, 103.1, 82.9, 82.2, 81.6, 81.4, 77.9, 77.7, 76.9, 76.8, 75.5, 75.2, 74.9, 74.3, 74.2, 72.3 (2C), 71.6, 62.9, 62.4, 47.5, 45.5, 42.1, 41.9, 33.2, 30.9 (2C), 30.8, 30.7, 29.6, 27.6 (2C), 23.9, 14.6; HRMS (EI): calcd. for C55H100O24Na+ [M+Na]+ 1167.6502, found 1167.6499.
<제조예 4>D-NBM-C9의합성
<4-1> 화합물 H10의 합성
실시예 1-1의 디알킬레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 H10을 81%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.12 (s, 2H), 3.38-3.28 (m, 4H), 3.22 (dd, J = 12.0 Hz, 8.0 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 2.91 (br s, 2H), 2.45 (br s, 2H), 1.59-1.50 (m, 4H), 1.44 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 1.39-1.22 (m, 28H), 0.88 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 135.5, 71.3, 71.0, 49.2, 45.8, 41.7, 32.1, 30.0, 29.8, 29.7, 29.5, 26.5, 22.9, 14.3.
<4-2> 화합물 I13의 합성
실시예 1-2의 업존 디하이드록실레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 I13를 91%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.99 (br s, 2H), 3.44 (dd, J = 8.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 7.8 Hz, 6H), 3.29 (br s, 2H), 2.25 (br s, 4H), 1.88 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 1.60-1.51 (m, 4H), 1.33-1.22 (m, 24H), 1.20 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 0.88 (t, J = 8.4 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.5, 69.5, 68.1, 47.2, 38.7, 33.2, 32.1, 29.9, 29.8, 29.7, 29.5, 26.4, 22.8, 14.3.
<4-3> 화합물 J16의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 J16을 78%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11-8.09 (m, 10H), 7.99-7.68 (m, 14H), 7.52-7.16 (m, 45H), 6.08 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 6.06 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.77-5.64 (m, 5H), 5.54-5.45 (m, 3H), 5.38-5.31 (m, 2H), 4.96 (br s, 1H), 4.87-4.84 (m, 1H), 4.69-4.44 (m, 9H), 4.33-4.28 (m, 3H), 4.04-3.97(m, 2H), 3.87-3.78 (m, 2H), 3.49-3.31 (m, 3H), 3.20-3.03 (m, 4H), 2.22 (br s, 1H), 2.18 (br s, 1H), 2.05 (br s, 2H), 1.66-1.58 (m, 3H), 1.43-1.23 (m, 23H), 0.87 (t, J = 6.4 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2 (2C), 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.5, 165.2 (2C), 165.0, 164.7, 164.4, 133.4 (2C), 133.2, 133.1, 133.0, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9 (2C), 129.7 (2C), 129.5 (2C), 129.1, 129.0, 128.9 (2C), 128.8, 128.7 (2C), 128.6, 128.5 (2C), 128.3 (2C), 128.2, 128.1, 99.6, 98.7, 97.3, 97.0, 75.3, 75.0, 74.9, 74.3, 73.9, 72.8, 72.5, 71.9, 71.6, 71.3, 71.1, 70.6, 70.2, 70.1, 69.3, 69.2, 69.1, 68.2, 67.5, 64.7, 64.1, 62.7, 62.6, 46.5, 44.7, 38.6, 37.9, 33.9, 32.0, 30.1, 29.8 (3C), 29.6 (2C), 29.4, 26.5, 26.4, 22.8, 14.3 (2C).
<4-4> D-NBM-C9의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 D-NBM-C9를 92%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 5.08(t, J = 4.8 Hz, 2H), 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.16 (br s, 2H), 3.81-3.73 (m, 7H), 3.66-3.43 (m, 12H), 3.37-3.15 (m, 17H), 2.33 (br s, 1H), 2.27 (br s, 1H), 2.15 (br s, 2H), 1.99 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 1.48 (app. t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.32-1.12 (m, 26H), 0.82 (app. t, J = 5.6 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD):δ 103.8, 103.5, 103.1, 103.0, 81.4, 78.2, 78.0, 77.9, 77.7, 77.0, 76.7, 75.4, 75.2, 74.9, 74.2, 74.1, 72.3 (2C), 71.5, 69.5, 69.1, 62.8, 62.3, 48.0, 45.7, 39.9 (2C), 35.4, 33.2 (2C), 31.0, 30.9, 30.8, 30.7, 30.6, 27.6, 27.5, 23.9, 14.6; HRMS (EI): calcd. for C51H92O24Na+ [M+Na]+ 1111.5876, found 1111.5872.
<제조예 5> D-NBM-C10의합성
<5-1> 화합물 H11의 합성
실시예 1-1의 디알킬레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 H11을 78%의 수득률로 합성하였다. 1 HNMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.08 (s, 2H), 3.38-3.27 (m, 4H), 3.20 (dd, J = 12.0 Hz, 8.0 Hz, 2H), 2.97 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 2.88 (br s, 2H), 2.42 (br s, 2H), 1.53-1.45 (m, 4H), 1.43 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 1.38-1.24 (m, 30H), 0.85 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 135.4, 71.2, 71.0, 49.2, 45.8, 41.6, 32.1, 29.9, 29.8 (2C), 29.7, 29.5, 26.4, 22.9, 14.3.
<5-2> 화합물 I14의 합성
실시예 1-2의 업존 디하이드록실레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 I14를 94%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.92 (br s, 2H), 3.65 (br s, 2H), 3.39 (dd, J = 8.0 Hz, 4.2 Hz, 2H), 3.32 (t, J = 8.0 Hz, 6H), 2.19 (br s, 4H), 1.83 (d, J = 12 Hz, 1H), 1.52-1.48 (m, 4H), 1.33-1.17 (m, 30H), 1.14 (d, J = 11.7 Hz, 1H), 0.83 (t, J = 7.8 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.4, 69.3, 68.4, 47.1, 38.6, 33.2, 32.1, 29.8 (2C), 29.7, 29.6, 29.5, 26.3, 22.8, 14.2.
<5-3> 화합물 J17의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 J17을 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11-8.06 (m, 10H), 7.99-7.70 (m, 15H), 7.51-7.18 (m, 44H), 6.18 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 6.08 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 5.78-5.67 (m, 5H), 5.52-5.46 (m, 3H), 5.34-5.31 (m, 2H), 4.97 (br s, 1H), 4.87-4.84 (m, 1H), 4.67-4.44 (m, 9H), 4.33-4.29 (m, 3H), 4.04-3.98 (m, 2H), 3.82-3.78 (m, 2H), 3.49-3.33 (m, 3H), 3.21-3.03 (m, 4H), 2.22 (br s, 1H), 2.18 (br s, 1H), 2.06 (br s, 2H), 1.66-1.60 (m, 2H), 1.44-1.23 (m, 26H), 0.87 (app. t, J = 6.4 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2 (2C), 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.5, 165.2 (2C), 165.0, 164.7, 164.4, 133.4, 133.2, 133.1, 133.0, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7 (3C), 129.5, 129.4, 129.1, 129.0, 128.9 (2C), 128.8, 128.7 (2C), 128.6, 128.5, 128.3 (2C), 128.2, 128.1, 99.6, 98.6, 97.3, 97.0, 75.4, 75.3, 75.0, 74.9, 74.2, 73.8, 72.8, 72.5, 71.8, 71.6, 71.3, 71.2, 71.1, 70.6, 70.2, 69.3, 69.2 (2C), 69.0, 68.2, 67.5, 64.6, 64.0, 62.7, 62.6, 46.5, 44.7, 38.5, 37.8, 33.9, 32.1, 30.1, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6 (2C), 29.5, 26.5, 26.4, 22.8 (2C), 14.3.
<5-4> D-NBM-C10의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 D-NBM-C10를 96%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 5.15(t, J = 4.0 Hz, 2H), 4.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.24 (br s, 2H), 3.93-3.79 (m, 7H), 3.69-3.53 (m, 13H), 3.45-3.22 (m, 19H), 2.40 (br s, 1H), 2.35 (br s, 1H), 2.22 (br s, 2H), 2.08 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.56 (app. t, J = 4.0 Hz, 4H), 1.40-1.20 (m, 30H), 0.90 (t, J = 8.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD):δ 103.9, 103.6, 103.2, 103.1, 81.5, 78.2, 78.0, 77.9, 77.8, 77.1, 76.8, 75.4, 75.2, 74.9, 74.3, 74.2, 72.4, 72.3, 71.6, 69.5, 69.1, 62.9, 62.4, 48.0, 45.7, 40.0, 39.9, 35.4, 33.2, 31.0 (2C), 30.9, 30.8 (2C), 30.7, 30.6, 27.6 (2C), 23.9, 14.6; HRMS (EI): calcd. for C53H96O24Na+ [M+Na]+ 1139.6189, found 1139.6187.
<제조예 6> D-NBM-C11 의합성
<6-1> 화합물 H12의 합성
실시예 1-1의 디알킬레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 H12을 83%의 수득률로 합성하였다. 1 HNMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.11 (s, 2H), 3.37-3.30 (m, 4H), 3.22 (dd, J = 11.8 Hz, 8.0 Hz, 2H), 3.00 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 2.91 (br s, 2H), 2.45 (br s, 2H), 1.56-1.45 (m, 4H), 1.46 (d, J = 12.2 Hz, 1H), 1.38-1.21 (m, 34H), 0.88 (t, J = 7.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 135.4, 71.2, 71.0, 49.2, 45.8, 41.6, 32.1, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 26.5, 22.9, 14.3.
<6-2> 화합물 I15의 합성
실시예 1-2의 업존 디하이드록실레이션의 일반적인 합성 절차에 따라 화합물 I15를 93%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.00 (br s, 2H), 3.44 (dd, J = 8.2 Hz, 4.1 Hz, 2H), 3.37 (t, J = 7.9 Hz, 6H), 3.13 (br s, 2H), 2.26 (br s, 4H), 1.88 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.39-1.17 (m, 34H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 71.5, 69.6, 68.1, 47.3, 38.7, 33.2, 32.1, 29.9, 29.8, 29.7, 29.5, 26.4, 22.9, 14.3.
<6-3> 화합물 J18의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 화합물 J18을 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11-7.99 (m, 10H), 7.89-7.68 (m, 14H), 7.50-7.16 (m, 46H), 6.15 (t, J = 8.1 Hz, 1H), 6.08 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 5.78-5.67 (m, 5H), 5.51-5.45 (m, 3H), 5.34-5.31 (m, 2H), 4.96 (br s, 1H), 4.87-4.84 (m, 1H), 4.67-4.44 (m, 9H), 4.33-4.29 (m, 3H), 4.04-4.02 (m, 2H), 3.81-3.79 (m, 2H), 3.49-3.30 (m, 3H), 3.15-3.00 (m, 4H), 2.22 (br s, 1H), 2.18 (br s, 1H), 2.05 (br s, 2H), 1.64-1.61 (m, 3H), 1.49-1.23 (m, 33H), 0.87 (app. t, J = 4.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2 (2C), 166.0, 165.9, 165.8, 165.7, 165.5, 165.2 (2C), 165.0, 164.8, 164.4, 133.4 (2C), 133.2, 133.1, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9 (2C), 129.7 (3C), 129.5 (2C), 129.1, 129.0, 128.9 (2C), 128.8, 128.7 (2C), 128.6, 128.5 (3C), 128.3 (2C), 128.2, 128.1, 99.6, 98.7, 97.3, 97.0, 75.3, 75.0, 74.9, 74.3, 73.9, 72.8, 72.5, 71.8, 71.6, 71.3, 71.2, 71.1, 70.6, 70.2, 69.2 (2C), 69.1, 68.2, 67.5, 64.7, 64.1, 62.7, 62.6, 60.5, 46.5, 44.7, 38.6, 37.8, 33.9, 32.1 (2C), 30.1, 29.9, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5 (2C), 26.5, 26.4, 22.8, 14.3.
<6-4> D-NBM-C11의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 D-NBM-C11를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD):δ 5.15 (app.t, J = 4.4 Hz, 2H), 4.56 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.25 (br s, 2H), 3.93-3.82 (m, 7H), 3.69-3.53 (m, 13H), 3.43-3.24 (m, 27H), 2.41 (br s, 1H), 2.36 (br s, 1H), 2.22 (br s, 2H), 2.08 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 1.56 (app. t, J = 4.0 Hz, 4H), 1.42-1.22 (m, 37H), 0.90 (t, J = 6.4 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD):δ 103.9, 103.6, 103.2, 81.5, 81.4, 78.3, 78.2, 77.8, 77.7, 77.0, 76.8, 75.4, 75.1, 74.9, 74.2, 74.1, 72.4, 72.3, 71.6, 69.5, 69.1, 62.8, 62.3, 48.0, 45.7, 39.9, 35.4, 33.2, 31.0 (2C), 30.9 (2C), 30.8, 30.7, 30.6, 27.6 (2C), 23.9, 14.6; HRMS (EI): calcd. for C55H100O24Na+ [M+Na]+ 1167.6502, found 1167.6500.
< 실시예 2> NBMs의 구조
NBMs은 중심구조인 노르보넨 (norbonane) 링커를 통해 연결된 소수성 그룹인 두개의 알킬 사슬과 분지된 디말토사이드(dimaltoside) 친수성 헤드 그룹을 가지고 있다. 링커에 부착된 알킬 사슬의 공간적 배향에 따라, 이 신규 화합물은 2개의 군으로 분류될 수 있는데 그 중 하나인 D-NBMs은 링커에 연결된 2개의 알킬 사슬을 엔도형(2-endo, 3-endo 또는 2R, 3S)으로, 다른 하나인 X-NBMs은 엑소형(2-exo, 3-exo 또는 2S, 3R)이다.
D-/X-NBMs의 개별 소수성 알킬기는 노르보넨 (norbonane)를 기준으로 긴 축 방향으로 중심을 가로지르는 내부 대칭 평면 (도 3의 화합물 A와 B)을 가지므로 광학적으로 비활성인 메조 화합물이다. 알킬 사슬이 엔도 또는 엑소형으로 중심 링커에 연결되어 있어, 화합물 A 및 B는 부분 입체이성질체 (즉, 비거울면 입체이성질체)이다. 최종 D-/X-NBMs은 또한 서로 부분 입체이성질체이지만, 대칭 평면이 없기 때문에 광학 활성을 가진다. 친수성-소수성 균형 (HLB)이 양친매성 화합물의 성질에 영향을 미치는 핵심 변수이기 때문에 C9에서 C11까지의 다양한 알킬 사슬 길이를 갖는 NBMs를 제조하였다. 이들 신규 화합물은 4단계의 합성 과정 즉, 노르보닌-2,3-디메탄올의 디알킬레이션 단계, 사산화 오스뮴-N-메틸모르폴린-N-옥사이드 (OsO4-NMO)를 이용한 디하이드록실레이션 단계, 과벤조일화된 말토실 브로마이트 (perbenzoylated maltosyl bromide)를 이용한 당화 (glycosylation) 단계 및 보호기 제거단계를 거쳐서 합성되었다(도 1 및 도 2).
당화 단계는 벤조일기의 이웃 작용기 참여 (neighboring group participation, NGP)를 이용하여 입체 특이적으로 수행되었다(도 3). 결과적으로, 상기 단계를 통해서 높은 부분 입체이성질체 순도를 가진 NBMs을 생산할 수 있고, 이는 각각의 1H NMR 스펙트럼을 통해서 확인할 수 있다(도 4). Ha로 명명된 아노머 탄소에 부착된 D-NBM-C11의 축 방향 양성자는 4.55 및 4.33 ppm에서 두 개의 분리된 이중렛(doublet)의 1H NMR 피크를 나타내었다(도 4a). 또한 X-NBM-C11의 아노머 탄소에 부착된 축 방향 양성자는 상기 D-NBM-C11와 다른 위치인 4.57과 4.42ppm에 두 개의 이중선 신호를 나타내었다. 또한, 두 이성질체의 아노머 양성자 (Ha)에 대한 비시날 커플링 상수 (vicinal coupling constants, 3 J aa)는 당화 단계에서 확실한 β-글리코시드 결합 형성을 입증하는 β-이성질체의 전형적인 값인 8.0 Hz였다. α-글리코시드 결합에서 아노머 양성자는 5.10 ~ 5.20 ppm의 영역에서 더 작은 커플링 상수 (3 J ae=4.0Hz)로 이중렛 (doublet) 신호를 나타낸다는 점에서 구별된다. 이 스펙트럼 특성은 또 다른 아노머 양성자 He에서 확인할 수 있다(도 4a-c). 중심 링커에 대한 알킬 사슬의 엑소형 또는 엔도형 결합은 D-/X-NBM-C11의 2D NOESY 스펙트럼을 통해서도 확인할 수 있다(도 4d,e). 공간에서의 근접성 때문에, X-NBM-C11에서는 검출되지 않는, 양성자 H7과 양성자 (H2및 H3)간의 강한 NOE 상관 신호가 D-NBM-C11에서 관찰되었다. 반면에, 강렬한 NOE 상관 신호가 X-NBM-C11의 양성자 (H2및 H3)와 양성자(H6및 H5)간에서 얻어졌고, 이는 이 양성자들 사이에 공간적으로 근접함을 나타낸다.
알킬 사슬과 노르보넨 링커의 엑소형 연결 때문에 X-NBM-C11의 분자 형태는 D-NBM-C11보다 더 편평하고 직선이어서 미셀 내에서 각각의 양친매성 화합물 사이에 더 큰 상호 작용을 가능하게 하고 이는 미셀의 안정성과 막단백질 안정화 효력에도 영향을 미칠 것으로 본다(도 5).
<실시예 3> NBMs의 특성
상기 실시예 1의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 1 내지 6의 NBMs의 특성을 확인하기 위하여, NBMs의 분자량 (M.W.), 임계미셀농도 (critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름 (hydrodynamic radii; R h)을 측정하였다.
구체적으로, 임계미셀농도 (CMC)는 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제 (1.0 wt%)에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름 (R h)은 동적 광산란 (dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자 (detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.

Detergent
M.W.a
CMC (mM)
CMC (wt%)
R h(nm)b

D-NBM-C9
1089.3
~ 0.012
~ 0.0013
3.3±0.04

X-NBM-C9
1089.3
~ 0.010
~ 0.0011
3.7±0.03

D-NBM-C10
1117.3
~ 0.008
~ 0.0009
3.5±0.03

X-NBM-C10
1117.3
~ 0.007
~ 0.0008
4.0±0.02

D-NBM-C11
1145.4
~ 0.007
~ 0.0008
3.7±0.05

X-NBM-C11
1145.4
~ 0.006
~ 0.0007
17.3±0.10

DDM
510.1
~0.17
~0.0087
3.4±0.03
모든 NBMs의 CMC 값 (0.006 내지 0.012 mM)은 DDM의 CMC 값 (0.17 mM)과 비교하여 상당히 작았다. 따라서, NBMs는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, DDM 보다 적은 양을 사용하고도 동일하거나 우월한 효과를 나타낼 수 있다. 또한, NBMs의 CMC 값은 알킬 사슬의 길이가 증가함에 따라 감소하였는데, 이는 알킬 사슬 길이의 연장에 따라 소수성이 증가하기 때문인 것으로 판단된다. NBMs에 의해 형성된 미셀의 크기는 대체적으로 알킬 사슬이 길어짐에 따라증가하는 경향을 보였다.
이성질체간을 비교할 때, X-NBMs의 CMC 값이 D-NBMs의 값보다 더 낮았다. 이러한 결과는 X-NBMs이 D-NBMs보다 자기 조립되는 경향이 더 높음을 나타낸다. 또한, 두 NBMs 이성질체에 의해 형성된 미셀의 크기는 알킬 사슬의 길이가 늘어남에 따라 원뿔형에서 원통형으로 분자의 기하학적 구조가 변하기 때문에 알킬 사슬 길이에 따라 증가하는 경향이 있었다. 특히, X-NBMs이 알킬 사슬 길이에 대한 미셀 크기 의존성이 높은 것으로 나타났다.
특히 도 7에 나타나는 것과 같이, X-NBM-C11은 온도에 따라서 미셀 크기가 변화함을 확인할 수 있었다. 반면 D-NBM-C11은 미셀 크기가 온도 변화에 무관하였다. 이것은 이하 실시예에서 확인된 온도 변화에 따른 X-NBM-C11과 D-NBM-C11이 나타내는 막 단백질 안정화 특징과 깊이 관련되어 있는 것으로 판단되었다.
여기에서 관찰된 전체적으로 D-NBMs에 비해 X-NBMs의 더 큰 미셀 크기는 X-NBMs의 직선 구조의 결과로서 화합물의 구조를 기하학적으로 원통형 형상에 가깝게 만듦으로써 양친매성 물질간의 상호반응이 증가하여 나타나는 것으로 생각되었다. 이 결과는 양친매성 화합물의 알킬 사슬 방향의 작은 변화가 멤브레인 단백질 연구에영향을 줄 수 있는 자가조립 어셈블리의 특성에 큰 차이를 유발할 수 있음을 나타낸다. 실온 (25℃)에서 모든 NBM 분자들의 미셀의 크기 분포를 조사했을 때, 모든 이성질체는 하나의 미셀 집단을 나타내어 매우 균일한 미셀 구조를 나타내었다(도 6).
<실시예 4> NBMs의 UapA 막단백질 구조 안정화 능력 평가
NBMs에 의한 아스페르길러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans)로부터 분리된 UapA(uric acid-xanthine/H+ symporter)의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. UapA의 구조적 안정성은 (sulfhydryl-specific fluorophore, N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)을 사용하여 평가되었다.
구체적으로, UapAG411V△1-11(이하 'UapA'라고 함)은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) FGY217 균주에서 GFP 융합으로 발현되었고, 샘플 버퍼 (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% DDM, 0.6 mM xanthine) 내로 분리하였으며, 이는 J. Leung 등의 논문(Mol . Membr . Biol . 2013, 30, 32-42)에 기재된 방법을 따랐다. UapA를 포함하는 멤브레인을 PBS, 10 mM imidazole pH 8.0, 150 mM NaCl, 10% glycerol 내에서 재현탁하고 상기 단백질 농도를 측정하였다. 멤브레인을 1 mg/ml 농도로 조정하고 1ml 분취량을 최종 양친매성 물질 농도 1.0wt %로 DDM 또는 NBMs와 각각 40 ℃에서 10 분간 열처리하였다. 100 ml 분취량을 각 튜브로부터 제거하고 불용성 물질을 제거하기 위해 150,000g로 10분동안 원심분리를 하기 전후에 각각 형광 판독을 각 샘플에 대해 실시하였다. 각 조건에 대한 잔류 가용성 분획을 DDM으로 평준화된 Superose 6 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 형광 크기 배제 크로마토그래피 (fluorescent size exclusion chromatography, FSEC)에 적용하였다.
DDM으로 가용화된 UapA-GFP는 상대적으로 높은 강도의 단일 단 분산 피크(~ 40 분획수)를 나타내어 열변성에 안정한 능력을 나타내었다(도 8). X-NBMs 경우에는, 양친매성 물질의 효능이 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 향상되었다. X-NBM-C9/C10은 단 분산 단백질 피크를 유지함에 있어 DDM과 거의 비슷하지만 X-NBM-C11은 DDM보다 상당히 우수하였다(도 8a). 이와 비슷한 경향성이 D-NBMs에서도 관찰되었다. 가장 짧은 알킬 사슬을 가진 D-NBMs (즉, D-NBM-C9)는 단 분산 단백질의 낮은 회수율을 보여 주었으며, 이는 열처리 과정 동안 상당부분의 단백질 응집/변성이 일어났음을 의미한다. D-NBM-C10은 DDM보다 약간 덜 우수한 효과를 나타내었다(도 8b). 가장 긴 알킬 사슬을 갖는 D-NBMs (즉, D-NBM-C11)는 DDM보다 약간 더 우수했다. 이성질체를 서로 비교할 때, 전반적으로 X-NBMs가 D-NBMs 보다 효과가 우수하였다. 또한 전반적으로 X-NBMs이 D-NBMs보다 UapA 추출 효율이 더 높은 것으로 측정되었다. 특히 X-NBM-C11은 본 트랜스포터를 세포막에서 거의 정량적으로 추출할 수 있었다. 흥미롭게도, 막 단백질 구조 연구를 위한 가장 성공적인 신규 양친매성 물질 중 하나인 MNG-3는 동일한 분석 조건 (도 8a, b)에서 단백질 변성/응집을 억제하는데 효과적이지 못했다. 이러한 결과로부터 NBMs은 세포막으로부터 UapA를 효율적으로 추출할 뿐 만 아니라 추출한 단백질을수용액에서 구조적으로 안정한 상태로 유지하는 데 우수한 효과를 나타내므로, 막단백질을 추출하고 안정화시키는 데 효과적으로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
< 실시예 5> NBMs에 의해 추출된 LeuT 막단백질 안정성 평가
NBMs에 의한 LeuT 단백질의 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 각각의 양친매성 화합물은 (a) CMC + 0.04 wt% 또는 (b) CMC + 0.2 wt% 농도로 사용하였으며, LeuT 단백질의 안정성 평가는 LeuT의 기질에 대한 결합 특성을 [3H]-Leu를 사용하여 SPA (scintillation proximity assay)를 통해 수행하였다. 측정은 상온에서 12일 인큐베이션 기간 동안 규칙적인 간격으로 수행하였다.
구체적으로, 호열성 박테리아 아퀴펙스 아에오리쿠스 (Aquifex aeolicus) 유래 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)를 이전에 설명된 방법에 의해 정제하였다 (G. Deckert 등의 Nature 1998, 392, 353-358). LeuT를 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41 (DE3)에서 발현시켰다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA로부터 제공받음). 요약하면, 박테리아 멤브레인의 분리 및 1% (w/v) DDM에서 용해화 후에, 단백질을 Ni2 +-NTA수지 (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05%(w/v) DDM 및 300 mM 이미다졸(imidazole)에서 용리하였다. 그 후에, 정제된 LeuT (약 1.5 mg/ml)는 상기와 동등한 버퍼에서 DDM 및 이미다졸을 제외하고, NBMs 또는 DDM이 최종 농도 CMC + 0.04% (w/v) 또는 CMC + 0.2% (w/v)로 보충된 버퍼로 희석하였다. 단백질 샘플은 실온에서 12일 동안 저장하고, 지정된 시간에 원심분리하고, 단백질 특성을 SPA를 사용하여 기질 ([3H]-Leucine)결합 능력을 측정함에 의하여 확인하였다. SPA를 450 mM NaCl 및 각각의 NBMs를 함유하는 버퍼를 상기 특정된 농도에서 수행하였다. SPA 반응은 20 nM [3H]-Leucine및 1.25 mg/ml copper chelate (His-Tag) YSi beads (Perkin Elmer, Denmark)의 존재하에 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 전체 [3H]-Leucine결합도는 MicroBeta liquid scintillation counter (Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다.
모든 NBMs에서의 LeuT는 DDM보다 실질적으로 더 높은 트랜스포터(transporter) 구조 보존 능력을 나타냈다. DDM에 비해 LeuT의 향상된 기질 결합능력은 모든 NBMs에 대해 12일 동안 잘 유지되었다. 따라서 LeuT가 X-/D-NBM-C11에 가용화 되었을 때 인큐베이션 말기 (t = 12 일)의 트랜스포터의 기질 결합 능력은 DDM에 가용화된 LeuT의 초기 활성보다도 약간 낮았다(도 9a). 또한 양친매성 물질의 농도가 증가함에 따라 DDM에 비해 NBMs의 양친매성 효력이 더욱 증가함을 확인하였다(도 9b). 전반적으로, 모든 NBMs은 트랜스포터의 기질 결합 능력을 보존하는데 DDM보다 효과적이었다.
<실시예 6> NBMs의 β 2 AR막단백질 구조 안정화 능력 평가
NBMs에 의한 인간 β2아드레날린성 수용체 (β2AR),G-단백질 연결 수용체(GPCR) 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 즉, 수용체를 세포막으로부터 DDM으로 추출하고 동일한 양친매성 화합물로 정제하였다. 상기 DDM으로 정제된 수용체를 DDM 또는 NBMs를 함유하는 버퍼 용액으로 희석시시켜 최종 화합물 농도를 CMC+0.2 wt%로 맞추었다. 수용체의 안정성은 [3H]-디하이드로알프레놀올 ([3H]-dihydroalprenolol(DHA))를 이용한 리간드 결합 능력을 측정하여 평가하였다.
그 결과, 초기 수용체의 리간드 결합 능력에 있어서 NBM-C9s 및 NBM-C10s은 DDM보다 낮은 수치를 보였고, NBM-C11s은 DDM과 동등한 수치를 나타내었다. 또한, X-NBMs는 사슬 길이에 관계 없이 모두 D-NBMs 보다 우수한 수치를 보였다(도 10).
<6-1> 장기간 안정성 측정(Long-term stability measurement)
상기 실험에서 우수한 수용체의 리간드 결합 능력을 나타낸 NBMs(D-NBM-C11 및 X-NBM-C11)에 의한 β2AR의 장기간 안정성을 측정하기 위해 방사성 리간드 결합 시험을 다음과 같은 방법을 수행하였다. β2AR는 0.1% DDM을 사용하여 정제하였으며 (D. M. Rosenbaum 등, Science, 2007, 318, 1266-1273.), 약 10 mg/ml (약 200 μM)로 최종 농축하였다. DDM으로 정제된 β2AR를 사용하여 0.2% 양친매성 화합물 (DDM, NBMs(D-NBM-C11 및 X-NBM-C11))에서 0.5 mg/ml BSA로 보충된 10 nM [3H]-Dihydroalprenolol(DHA)를 함유하는 주 결합 혼합물을 제조하였다. DDM 또는 NBMs로 정제된 수용체는 실온에서 30분 동안 10 nM의 [3H]-DHA와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 통과액을 1 ml 바인딩 버퍼 (0.5 mg/ml BSA 및 20xCMC 각각의 양친매성 화합물이 포함된 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl)로 수집하였다. 그리고 15 ml 섬광 유체 (scintillation fluid)로 채우고 수용체-결합된 [3H]-DHA는 3일 동안 규칙적인 간격으로 섬광 카운터 (Beckman)로 측정했다. [3H]-DHA의 결합도는 바 차트 (bar chart)로 나타내었다(도 11a).
또한, 1.0wt%의 DDM 또는 X-NBM-C11을 사용하여 막으로부터 β2AR을 추출하고 동일한 개별 양친매성 화합물에 대해 0.2 wt%로 정제하였다. 수용체의 구조적 안정성을 리간드 결합 능력을 통해 평가하였는데 이는 실온에서 7일 인큐베이션하는 동안 규칙적인 간격으로 샘플을 분취해 측정하였다. 각각의 실험은 세 번씩 수행하였다(도 12b).
그 결과, DDM에 의해 용해된 수용체의 경우, 초기 리간드 결합 능력은 우수하지만 시간이 지나면 급격하게 그 결합 능력이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면에, D-NBM-C11 또는 X-NBM-C11는 장기간 수용체의 리간드 결합 능력을 잘 유지하였다(도 11a). 특히, X-NBM-C11에 용해된 수용체의 리간드 결합 유지 특성이 가장 우수하였다(도 11a 및 도 12b). 이와 같은 결과는 DDM 또는 X-NBM-C11을 사용하여 세포막으로부터 수용체를 직접 추출한 경우에도 마찬가지였다(도 12).
<6-2> 크기 배제 크로마토그래피(Size exclusion chromatography, SEC)
0.1 wt% DDM로 정제된 β2AR을 2 mM CaCl2존재 하에서 M1 Flag column에 로드하고 컬럼을 DDM 또는 X-NBM-C11 버퍼 (20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.2% 각 양친매성 물질)로 세척하였다. 상기 리셉터를 5 mM EDTA 및 0.2 mg/ml free Flag peptide를 포함하는 20×CMC DDM 또는 X-NBM-C11로 용출하였다. 융해물을 superdex-200 10/300 GL column (GE healthcare)에 0.5 ml/min로 첨가하여 280 nm에서 UV 흡광도를 측정하였다. 러닝 버퍼는 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl, 20×CMC individual detergents (DDM 및 X-NBM-C11)를 포함한다.
또한, DDM로 정제된 GPCR-Gs복합체를 양친매성 분자 교환과정을 통해 X-NBM-C11로 교환하고, 4 ℃에서 21 일 인큐베이션하는 과정 동안 일정한 간격으로 샘플을 분취해 복합체 안정성을 측정하였다.
그 결과, 도 13과 같이, X-NBM-C11은 DDM에 의해 형성된 크기와 동등한 크기의 균질한 PDC를 형성하였다. 또한, 21일 동안의 SEC 프로파일 결과는 X-NBM-C11이 이러한 조건에서 복합체 안정성을 완벽하게 유지함을 보여주었다(도 11b).
<6-3> G s 단백질 커플링 분석(G s -proteincouplingassay)
단백질 기능을 조사하기 위해 수용체를 형광 물질 (monobromobimane; mBBr)과 접합시켰다. mBBr-β2AR은 형광 측정을 통해 결합 파트너 (isopreoterenol (ISO) 및 Gs-단백질)의 존재 하에서 수용체의 구조적 변화를 모니터링하는데 사용되었고, 구체적인 실험방법은 다음과 같다.
DDM 중 50 μM에서 0.5 μl 비확산 mBBr-표지 수용체를 500 μl 0.1 % NBM 또는 DDM 함유 버퍼로 희석하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하여 50nM의 최종 농도를 가진 수용체를 얻었다. 2 μM 이소프로테레놀(isoproterenol, ISO)을 첨가하고 생성된 용액을 실온에서 15분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 250nM Gs를 추가로 첨가한 후, 단백질 샘플을 실온에서 추가로 20분 동안 인큐베이션하였다. 비만 형광(bimane fluorescence)을 370 nm의 자극으로 측정하고 발광 스펙트럼은 4 nm 방출 대역폭 패스로 설정된 광자 계수 모드에서 Spex FluoroMax-3 분광형광측정기(Jobin Yvon Inc.)로 0.5 nm/s 적분과 함께 1 nm 단위로 430 nm에서 510 nm까지 기록되었다. 0.1 % DDM에서의 mBBr 반응을 양성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 세 가지 독립적인 실험에서 대표를 보여준다(도 14).
그 결과, ISO가 부존재한 경우, DDM 또는 X-NBM-C11에 가용화된 수용체는 비활성(inactive) 수용체에 해당하는 형광 방출 스펙트럼을 나타냈다. ISO의 첨가시, 형광 방출 스펙트럼은 두 양친매성 화합물에서 부분적인 수용체 활성을 반영하는 방출 스펙트럼을 보여주었는데 이는 방출 강도 및 최대 파장(λmax)에 있어 현저한 변화로 나타난다. Gs단백질과 ISO가 동시에 수용체에 첨가될 때 완전한 수용체 활성에 해당하는 추가적인 스펙트럼 변화가 관찰되었다(도 14).
X-NBM-C11에 가용화된 수용체의 이러한 결과는 DDM에서 발생하는 것과 동일하였고 이는 X-NBM-C11에 가용화된 수용체가 부분 활성(ISO 단독) 또는 완전 활성(ISO + Gs포함)상태로의 구조적 변화가 원활히 진행됨을 의미한다. 따라서, X-NBM-C11에 의해 가용화된 수용체 또한 본연의 단백질 기능을 유지함을 확인할 수 있었다.
<6-4> X-NBM-C11로 가용화된 β 2 AR-G s 복합체의 negative stain EM analysis
β2AR-Gs단백질 복합체는 기존의 음성 염색 프로토콜을 사용하여 전자 현미경 검사를 위해 준비되었으며 저용량 절차를 사용하여 120kV에서 작동되는 Tecnai T12 전자 현미경으로 실내 온도에서 영상화하였다. 이미지는 Gatan US4000 CCD 카메라에서 71,138x의 배율 및 약 1.4m의 디포커스 값으로 기록하였다. 모든 이미지는 표본 수준에서 4.16A의 픽셀 크기를 얻기 위해 binned (2x2 픽셀)되었다. 입자는 e2boxer (EMAN2 소프트웨어 제품군의 일부)를 사용하여 수동으로 제거하였다. ISAC를 사용하여 2D reference-free alignment 및 입자 투영 분류를 수행하였다. β2AR-Gs의 14,556 투영은 양방향 매칭 및 10,100 개의 투영에 대해 일관된 199 개의 클래스를 생성하는 ISAC에 적용하였다.
그 결과, DDM으로부터 얻어진 β2AR-Gs단백질 복합체는 입자가 서로 응집된 형태를 가진 것과 달리, X-NBM-C11로부터 정제된 β2AR-Gs복합체는 매우 단 분산된 입자를 생성했다(도 15a). 또한 대표적인 2D 클래스 이미지에서 복합체의 각 구성요소 (β2AR, Gαs 및 Gβ)들은 명확하게 구별되었다(도 15b, c). Gα(Ras 및 α-helical(AH) 도메인)와 각 Gβ및 G단위체조차도 X-NBM-C11을 통해 얻어진 EM 이미지에서 식별 가능했다. 이는 본 발명의 양친매성 화합물이 EM 분석을 통해 막 단백질 복합체의 동적 구조 변화를 설명할 수 있는 중요한 잠재력을 가지고 있음을 나타낸다.
<실시예 7> NBMs의 MelB St 막단백질 구조 안정화 능력 평가
NBMs에 의한 MelBSt(Salmonella typhimurium melibiose permease) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. MelBSt단백질을 NBMs 또는 DDM을 사용하여 멤브레인에서 추출 후, 추출된 단백질의 양과 그 구조를 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯팅 (Western Blotting)을 통해 분석하였다. 사용한 양친매성 화합물의 농도는 1.5 wt%이며, 4개의 온도(0, 45, 55, 및 65 ℃)에서 단백질을 추출 후 같은 온도에서 90분 동안 인큐베이션한 다음 수용액에서 용해된 상태로 남아있는 단백질의 양을 측정함으로서 화합물의 단백질 추출 효율과 안정화 능력 두 가지 성능을 동시에 평가하고자 하였다. 각각의 양친매성 분자에 의해 추출 및 안정화된 단백질의 양은 양친매성 분자를 처리하지 않은 멤브레인 샘플에 들어 있는 전체 단백질의 양에 상대적인 값 (%)으로 나타내었다.
구체적으로, 플라스미드 pK95△AHB/WT MelBSt/CH10를 사용하여 C-말단에 10-His tag를 가지는 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) MelBSt(melibiosepermease)를 E. coli DW2 세포 (△melB 및 △lacZY)에서 발현하였다. A. S. Ethayathulla 등의 논문(Nat. Commun. 2014, 5,　3009)에 기재된 방법에 따라 세포 성장 및 멤브레인 준비를 수행했다. 단백질 검정은 Micro BCA 키트 (Thermo Scientific, Rockford, IL)로 수행했다. P.S. Chae 등의 Nat. Methods 2010, 7, 1003-1008에 기재된 프로토콜을 사용하여 MelBSt안정성에 대해 NBMs 또는 DDM을 평가하였다. MelBSt를 함유하는 멤브레인 샘플 (최종 단백질 농도는 10 mg/mL)을 1.5% (w/v) DDM 또는 NBMs(X-NBM-C10, D-NBM-C10, X-NBM-C11, D-NBM-C11)를 함유하는 용해화 버퍼 (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM melibiose)에 90분 동안 4개의 온도 (0, 45, 55, 65℃)에서 인큐베이션하였다. 불용성 물질을 제거하기 위하여, 45분 동안 4 ℃에서 TLA-100 rotor가 구비된 Beckman Optima™ MAX 초원심분리기로 355,590g에서 초원심분리를 수행한 후, 각 단백질 샘플의 20 μg을 SDS-16% PAGE로 분리하고, 그 다음 Penta-His-HRP 항체 (Qiagen, Germantown, MD)로 면역블로팅했다. MelBSt는 SuperSignal West Pico chemiluminescent 기질을 이용해 ImageQuant LAS 4000 Biomolecular Imager (GE Health Care Lifer Science)에 의해 측정했다.
도 16에 나타난 결과와 같이, 0℃ 및 45℃에서 DDM은 높은 MelBSt단백질 추출 효율을 보여주었다. NBMs는 0℃ 및 45℃에서는 멤브레인으로부터 단백질을 용해화하는 효율이 DDM보다 약간 낮았다.
그러나, 온도를 55℃로 올렸을 때 NBMs 중 D-NBMs 는 DDM 보다 많은 양의 용해된 단백질을 산출하였는데 이는 D-NBMs이 효율적으로 MelBSt단백질을 추출하였을 뿐 만 아니라 추출한 MelBSt의 용해도를 우수하게 유지하였다. 온도가 65℃에서는 DDM 및 NBMs 모두 수용액에 용해된MelBSt단백질을 확인할 수 없었다.
전체적으로 낮은 온도 (0 ℃)에서는 DDM이 NBMs보다 높은 단백질 추출 효율을 보여준 반면 비교적 높은 온도에서는 (45 ℃) NBMs는 DDM과 비슷하고 더 높은 온도 (55 ℃)에서는 NBMs이 더 우수한 것으로 보아 단백질 추출 효율은 DDM이 우수하지만 단백질 안정화 능력은 NBMs가 월등히 뛰어남을 알 수 있었다. 또한, NBMs의 이성질체 중 D-NBMs, 특히, D-NBM-C10 및 D-NBM-C11가 막 단백질 안정화 능력이 탁월하였다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물:
    [화학식 1]
    Figure 112018130193730-pat00013

    [화학식 2]
    Figure 112018130193730-pat00014


    상기 화학식 1 또는 2에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고; 그리고
    상기 X1 및 X2 은 당류 (saccharide)이다.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 당류는 단당류 (monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 당류는 글루코스 (glucose) 또는 말토오스 (maltose)인 화합물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고; 그리고 상기 X1 및 X2 은 말토오스 (maltose)인 화합물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 3 내지 8 중 하나인 화합물:
    [화학식 3]
    Figure 112017008477255-pat00015

    [화학식 4]
    Figure 112017008477255-pat00016

    [화학식 5]
    Figure 112017008477255-pat00017

    [화학식 6]
    Figure 112017008477255-pat00018

    [화학식 7]
    Figure 112017008477255-pat00019

    [화학식 8]
    Figure 112017008477255-pat00020

  6. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도 (CMC)가 0.0001 내지 1 mM인 화합물.
  8. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출용 조성물.
  9. 삭제
  10. 1)5-노르보닌-2-엑소,3-엑소-디메탄올 (5-norbornene-2-exo,3-exo-dimethanol)또는 이의 부분입체이성질체인 5-노르보닌-2-엔도,3-엔도-디메탄올 (5-norbornene-2-endo,3-endo-dimethanol)를 디알킬레이션 (dialkylation) 반응을 수행하여 알킬기를 도입하는 단계;
    2)상기 단계 1)의 생성물을 디하이드록실레이션 (Dihydroxylation) 반응을 수행하여 노르보닌 (norbornene) 내의 이중결합 (double bond)을 다이올 (diol)로 변환시키는 단계;
    3)상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션 (glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
    4)상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화 (deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 제조 방법:
    [화학식 1]
    Figure 112018130193730-pat00021

    [화학식 2]
    Figure 112018130193730-pat00022

    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서,
    상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고; 그리고
    상기 X1 및 X2 은 당류 (saccharide)이다.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고; 상기 X1 및 X2 은 말토오스 (maltose)인 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 용해화용 조성물.
  16. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 안정화용 조성물.
  17. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 결정화용 조성물.
  18. 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 분석용 조성물.
  19. 제 8항 및 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
  20. 제 8항 및 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막단백질은 UapA (Uric acid-xanthine/H+ symporter), LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor), MelBst (Melibiose permease), 또는 이들의 2 이상의 조합인 조성물.
KR1020170011128A 2017-01-24 2017-01-24 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 KR101998175B1 (ko)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170011128A KR101998175B1 (ko) 2017-01-24 2017-01-24 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
CA3050677A CA3050677C (en) 2017-01-24 2017-02-10 Novel norbornene-based amphiphilic compound and use thereof
US16/480,348 US11279726B2 (en) 2017-01-24 2017-02-10 Norbornene-based amphipathic compound and utilization thereof
PCT/KR2017/001486 WO2018139698A1 (ko) 2017-01-24 2017-02-10 새로운 노르보넨 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170011128A KR101998175B1 (ko) 2017-01-24 2017-01-24 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180086986A KR20180086986A (ko) 2018-08-01
KR101998175B1 true KR101998175B1 (ko) 2019-07-09

Family

ID=62978141

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170011128A KR101998175B1 (ko) 2017-01-24 2017-01-24 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11279726B2 (ko)
KR (1) KR101998175B1 (ko)
CA (1) CA3050677C (ko)
WO (1) WO2018139698A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101998175B1 (ko) 2017-01-24 2019-07-09 한양대학교 에리카산학협력단 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
CN113880892B (zh) * 2020-07-03 2023-06-27 上海科技大学 一种小分子去垢剂

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040242897A1 (en) 2002-07-31 2004-12-02 Guzaev Andrei P. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
US20130001465A1 (en) 2008-04-08 2013-01-03 Uchicago Argonne, Llc Amphiphiles for protein solubilization and stabilization

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101998175B1 (ko) 2017-01-24 2019-07-09 한양대학교 에리카산학협력단 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040242897A1 (en) 2002-07-31 2004-12-02 Guzaev Andrei P. Universal support media for synthesis of oligomeric compounds
US20130001465A1 (en) 2008-04-08 2013-01-03 Uchicago Argonne, Llc Amphiphiles for protein solubilization and stabilization

Also Published As

Publication number Publication date
US11279726B2 (en) 2022-03-22
CA3050677C (en) 2021-07-27
WO2018139698A1 (ko) 2018-08-02
CA3050677A1 (en) 2018-08-02
US20190382434A1 (en) 2019-12-19
KR20180086986A (ko) 2018-08-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101998175B1 (ko) 새로운 노르보닌 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102124989B1 (ko) 새로운 오당류 친수성기를 가지는 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR101719122B1 (ko) 새로운 만니톨 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR101923584B1 (ko) 새로운 뷰테인-테트라올 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
US11591306B2 (en) Vitamin E-based amphipathic compound, and use thereof
US10793589B2 (en) Resorcinarene-based amphipathic compound and use thereof
US11524975B2 (en) Amphiphilic compound having dendronic hydrophobic group and application thereof
KR101778687B1 (ko) 새로운 데옥시콜레이트 기반의 양친매성 화합물 및 이의 이용
US11884693B2 (en) 1,3-acetonedicarboxylate-derived amphipathic compounds and uses thereof
KR102321563B1 (ko) 새로운 터페닐 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102515251B1 (ko) 새로운 트라이아진 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102164196B1 (ko) 새로운 스테로이드 기반 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102604632B1 (ko) 새로운 사이클로펜테인 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102007317B1 (ko) 벤젠 고리에서 파생된 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR20200118634A (ko) 새로운 실로-이노시톨 중심을 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102166783B1 (ko) 새로운 트레할로스 중심을 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR20220087385A (ko) 새로운 트리스(하이드록시메틸)메테인 중심 구조를 갖는 양친매성 화합물 및 이의 활용
KR102582645B1 (ko) 새로운 트라이아진 다이머 기반 양친매성 화합물 및 이의 활용

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant