KR102515251B1 - 새로운 트라이아진 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 새롭게 개발한 트라이아진 중심의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이 화합물은 기존의 화합물보다 다양한 구조와 특성을 지닌 막단백질들을 세포막에서 효율적으로 추출하고 이를 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 신약 개발에 밀접한 관계가 있는 만큼 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이다.
Description
본 발명은 새롭게 개발한 트라이아진 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.
막단백질(membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 세포막으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.
막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질들은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하는 경향이 있기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다. 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.
트라이아진 중심구조는 3개의 치환기를 순차적으로 붙일 수 있는 분자 있어 합성이 매우 용이하고 두 개의 소수성기를 중심구조의 한쪽에 친수성기를 나머지 한쪽에 도입하여 양쪽성 분자을 설계하기에 적합한 구조를 가지고 있다. 또한 구조변화가 매우 용이하여 신약개발을 위한 library로 많이 사용되어왔지만 막단백질 연구를 위한 연구에는 활용되지 않았다.
이에 본 발명자들은 트라이아진 중심구조에 소수성기와 친수성기를 도입한 양친매성 화합물을 개발하였고, 이 화합물의 막단백질 안정화 특성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472.
S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.
본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 이성질체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 이성질체를 제공한다:
[화학식 1]
화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고;
E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며;
Z는 직접결합 또는 NH이고;
Y는 CH 또는 N이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-5의 알킬렌기이고;
X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소와 연결된 당류(saccharide)이며; 및
상기 Y가 CH일 때,
상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되거나 비치환될 수 있고, 여기서 상기 L3은 C1-5의 알킬렌기이며, 및 상기 X3은 산소와 연결된 당류일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다. 여기서 상기 당류는 상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다.
상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 R1 및 R2는 소수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성도와 소수성도의 밸런스(hydrophile-lipophile balance)를 최적으로 하기 위하여 2개의 소수성기를 도입하였다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물에서 트라이아진 중심구조는 3개의 치환기를 순차적으로 붙일 수 있는 분자 구조를 지니고 있어 합성이 매우 용이하고 두 개의 소수성기를 중심구조의 한쪽에 친수성기를 나머지 한쪽에 도입하여 양쪽성 분자을 설계하기에 적합한 구조를 가지고 있다. 치환된 두 개의 소수성기의 거리가 마이셀 내부의 알킬 사슬 밀도를 결정하는 데 매우 중요하고 이 밀도는 막단백질 안정성과 직결된다. 두 개의 소수성 거리가 육각형 구조를 활용하여 아주 밀접하게 연결 되어 높은 밀도의 수소성 내부를 달성할 수 있었다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 CH이고; 및 Z는 NH일 수 있고, 이러한 화합물을 "TSMs(Triazine-based maltosides with a serinol linker)"로 명명하였다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 글루코스이며; Z는 NH이고; 및 Y는 CH이며, 여기서 상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되고, 상기 L3은 C1-3의 알킬렌기이며, 상기 X3은 글루코스일 수 있고, 이러한 화합물을 "TTGs(Triazine-based glucosides with a TRIS linker)"로 명명하였다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 N이고; 및 Z는 직접결합일 수 있고, 이러한 화합물을 "TEMs(Triazine-based maltosides with a diethanolamine linker)"로 명명하였다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 8 중 하나로 표시되는 것인 화합물 또는 이의 이성질체일 수 있다:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C5-C20의 알킬기일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 화학식 2의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬의 길이에 따라, TSM-E7 내지 TSM-E11로 명명될 수 있고, 상기 화학식 3의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬의 길이에 따라, TSM-T7 내지 TSM-T11로 명명될 수 있으며, 상기 화학식 4의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬 길이에 따라, TTG-T7 내지 TTG-T12로 명명될 수 있고, 상기 화학식 5의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬 길이에 따라, TTG-E7 내지 TTG-E12로 명명될 수 있으며, 상기 화학식 6의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬 길이에 따라, TTG-A8 내지 TTG-A14로 명명될 수 있고, 상기 화학식 7의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬 길이에 따라, TEM-E7 내지 TEM-E11로 명명될 수 있으며, 상기 화학식 8의 화합물은 R1 및 R2의 알킬사슬 길이에 따라, TEM-T7 내지 TEM-T11로 명명될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 공존하여 극성, 비극성 용매 모두에 친화성을 가질 수 있는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 수용액에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하고 친수성기가 표면에 노출된 둥글거나 타원 형태의 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 크게 증가한다.
CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM일 수 있으며, 구체적으로 0.0001 내지 0.1 mM, 보다 구체적으로 0.0002 내지 0.1 mM, 보다 더 구체적으로 0.00021 내지 0.05 mM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 0.17 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 TSMs, TTGs 또는 TEMs는 매우 작은 CMC 값을 가지고 있다. 따라서, TSMs, TTGs 또는 TEMs는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 활용측면에서 유리하다 할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.
상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 미셀은 반지름이 1.0 nm 내지 200 nm일 수 있고, 구체적으로 2.0 nm 내지 150.0 nm일 수 있고, 예를 들어, 3.3 nm 내지 139..8 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.
상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부의 소수성으로 막단백질과 결합할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 세포막으로부터 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.
상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 4)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:
1) 2, 4, 6-트라이클로로-1, 3, 5-트라이아진에 알킬아민, 알코올 또는 싸이올을 반응시켜 알킬기를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 적어도 2개 이상의 하이드록시알킬로 치환된 아민 또는 적어도 2개 이상의 하이드록시알킬로 치환된 알킬아민을 반응시켜 하이드록시 말단을 도입하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계.
[화학식 1]
화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고;
E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며;
Z는 직접결합 또는 NH이고;
Y는 CH 또는 N이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-5의 알킬렌기이고;
X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소와 연결된 당류(saccharide)이며; 및
상기 Y가 CH일 때,
상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되거나 비치환될 수 있고, 여기서 상기 L3은 C1-5의 알킬렌기이며, 및 상기 X3은 산소와 연결된 당류일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 CH이고; 및 Z는 NH일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 글루코스이며; Z는 NH이고; 및 Y는 CH이며, 여기서 상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되고, 상기 L3은 C1-3의 알킬렌기이며, 상기 X3은 글루코스일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 N이고; 및 Z는 직접결합일 수 있다.
상기 방법에 의해 합성된 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2 내지 8 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 구체예에서, 4단계의 짧은 합성 단계를 거쳐 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있으므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.
본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 이성질체를 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:
[화학식 1]
화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C30의 알킬기이고;
E1 및 E2는 각각 독립적으로 N, O 또는 S이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-5의 알킬렌기이고;
X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소와 연결된 당류(saccharide)이며;
Y는 CH 또는 N이고; 및
Z는 직접결합 또는 NH일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 CH이고; 및 Z는 NH일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 글루코스이며; Z는 NH이고; 및 Y는 CH이며, 여기서 상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되고, 상기 L3은 C1-3의 알킬렌기이며, 상기 X3은 글루코스일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 N이고; 및 Z는 직접결합일 수 있다.
상기 방법에 사용되는 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2 내지 8 중 하나의 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 추출은 막단백질을 세포막으로부터 추출하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬과 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 UapA (Uric acid-xanthine/H+ symporter), LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor), MelB (Melibiose permease), BOR1(boron transporter 1), MOR(mouse μ-opioid receptor) 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출(extraction)"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analysis)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy) 또는 핵자기공명 (nuclear magnetic resonance)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.
본 발명의 구체예들에 따른 트라이아진 기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.
막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.
또한, 본 발명의 구체예들의 따른 화합물은 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기가 작아 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있어 막단백질의 결정화를 촉진시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.
도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 TSMs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 TTGs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 3는 본 발명의 실시예 3에 따른 TEMs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 4은 TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포도를 나타낸 도이다.
도 5는 TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포도를 나타낸 도이다.
도 6는 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 CMC + 0.04 wt%에서 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 13일 동안 실온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 7은 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 CMC + 0.2 wt%에서 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 12일 동안 실온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 8은 TTGs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 (a)CMC + 0.04 wt% 또는 (b) CMC + 0.2 wt%에서 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 12일 동안 실온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 9는 TEMs 또는 DDM을 사용하여 MelB 단백질을 0℃에서 90분 동안 추출 후, 추출된 단백질을 4개의 높은 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 90분 동안 추가적으로 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram).
도 10은 TSMs 또는 DDM을 사용하여 MelB 단백질을 0℃에서 90분 동안 추출 후, 추출된 단백질을 4개의 높은 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 90분 동안 추가적으로 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram).
도 11은 TTGs 또는 DDM을 사용하여 MelB 단백질을 0℃에서 90분 동안 추출 후, 추출된 단백질을 4개의 높은 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 90분 동안 추가적으로 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram).
도 12는 CMCs+0.2 wt%의 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 β2AR의 안정성에 대한 초기(양친매성 분자 교환후 30분) 효과를 측정한 결과이다. 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 13은 CMCs+0.2 wt%의 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 β2AR의 안정성에 대한 장시간 효과를 측정 시간(1h, 8h, 1day, 2day, 3day, 6day)의 흐름에 따라 측정한 결과이다. 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였고, 단백질 샘플은 실온에서 6일 동안 보관하면서 일정한 간격으로 sampling하여 측정하였다.
도 14는 CMCs+0.2 wt%의 TTGs 또는 DDM에 의한 β2AR의 안정성에 대한 초기(양친매성 분자 교환후 30분) 효과(a) 및 장시간 효과를 측정 시간(1h, 8h, 1day, 2day, 3day, 6day)의 흐름(b)에 따라 측정한 결과이다. 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 15은 CMCs+0.04 wt%의 TSMs (TSM-E9/E10/T8/T9), TEMs (TEM-E9/E10/T8/T9) 또는 DDM에 의해 가용화된 AtBOR1의 시간의 흐름에 따른 열 변성 프로파일을 나타낸 것이다(a, b). 이 결과는 40°C에서 120분 동안 CPM 분석을 통해서 측정하였다. 또한, FSEC(fluorescence size exclusion chromatography)을 이용하여 상기 양친매성 분제로 추출된 단백질의 열적 안정성을 테스트한 결과를 도시한 것이다(c, d).
도 16은 CMCs+0.2 wt%의 TSMs (TSM-E9/E10/T8/T9), TEMs (TEM-E9/E10/T8/T9) 또는 DDM에 의해 가용화된 AtBOR1의 시간의 흐름에 따른 열 변성 프로파일을 나타낸 것이다.
도 17은 TSMs (TSM-E9/E10/T8/T9), TEMs (TEM-E9/E10/T8/T9) 또는 DDM에 용해된 MOR의 열안정성 프로파일(a) 및 융점(Tm)(b)을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 TTGs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 3는 본 발명의 실시예 3에 따른 TEMs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 4은 TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포도를 나타낸 도이다.
도 5는 TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포도를 나타낸 도이다.
도 6는 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 CMC + 0.04 wt%에서 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 13일 동안 실온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 7은 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 CMC + 0.2 wt%에서 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 12일 동안 실온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 8은 TTGs 또는 DDM에 의한 수용액에서의 LeuT (Leucine transporter) 구조 안정성을 (a)CMC + 0.04 wt% 또는 (b) CMC + 0.2 wt%에서 측정한 결과이다. 단백질 안정성은 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 트랜스포터의 기질 결합 특성을 측정함으로써 확인하였다. 각각의 양친매성 화합물 존재하에 LeuT를 12일 동안 실온에서 인큐베이션하면서 단백질의 기질 결합 특성을 규칙적인 간격으로 측정하였다.
도 9는 TEMs 또는 DDM을 사용하여 MelB 단백질을 0℃에서 90분 동안 추출 후, 추출된 단백질을 4개의 높은 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 90분 동안 추가적으로 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram).
도 10은 TSMs 또는 DDM을 사용하여 MelB 단백질을 0℃에서 90분 동안 추출 후, 추출된 단백질을 4개의 높은 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 90분 동안 추가적으로 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram).
도 11은 TTGs 또는 DDM을 사용하여 MelB 단백질을 0℃에서 90분 동안 추출 후, 추출된 단백질을 4개의 높은 온도(0, 45, 55, 65℃)에서 90분 동안 추가적으로 인큐베이션한 다음 수용액에 용해되어 있는 MelB 단백질의 양을 측정한 결과이다:
(a) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 나타낸 SDS-PAGE 및 Western Blotting 결과; 및
(b) 각 양친매성 화합물을 사용하여 추출한 MelB 단백질의 양을 양친매성 화합물 미처리 멤브레인 샘플(Memb)에 존재하는 전체 단백질 양의 퍼센티지(%)로 나타낸 히스토그램(histogram).
도 12는 CMCs+0.2 wt%의 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 β2AR의 안정성에 대한 초기(양친매성 분자 교환후 30분) 효과를 측정한 결과이다. 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 13은 CMCs+0.2 wt%의 TSMs, TEMs 또는 DDM에 의한 β2AR의 안정성에 대한 장시간 효과를 측정 시간(1h, 8h, 1day, 2day, 3day, 6day)의 흐름에 따라 측정한 결과이다. 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였고, 단백질 샘플은 실온에서 6일 동안 보관하면서 일정한 간격으로 sampling하여 측정하였다.
도 14는 CMCs+0.2 wt%의 TTGs 또는 DDM에 의한 β2AR의 안정성에 대한 초기(양친매성 분자 교환후 30분) 효과(a) 및 장시간 효과를 측정 시간(1h, 8h, 1day, 2day, 3day, 6day)의 흐름(b)에 따라 측정한 결과이다. 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-dihydroalprenolol(DHA)의 ligand binding assay를 통해 측정하였다.
도 15은 CMCs+0.04 wt%의 TSMs (TSM-E9/E10/T8/T9), TEMs (TEM-E9/E10/T8/T9) 또는 DDM에 의해 가용화된 AtBOR1의 시간의 흐름에 따른 열 변성 프로파일을 나타낸 것이다(a, b). 이 결과는 40°C에서 120분 동안 CPM 분석을 통해서 측정하였다. 또한, FSEC(fluorescence size exclusion chromatography)을 이용하여 상기 양친매성 분제로 추출된 단백질의 열적 안정성을 테스트한 결과를 도시한 것이다(c, d).
도 16은 CMCs+0.2 wt%의 TSMs (TSM-E9/E10/T8/T9), TEMs (TEM-E9/E10/T8/T9) 또는 DDM에 의해 가용화된 AtBOR1의 시간의 흐름에 따른 열 변성 프로파일을 나타낸 것이다.
도 17은 TSMs (TSM-E9/E10/T8/T9), TEMs (TEM-E9/E10/T8/T9) 또는 DDM에 용해된 MOR의 열안정성 프로파일(a) 및 융점(Tm)(b)을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
<실시예 1> TSMs의 합성 방법
TSMs의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-4>의 합성 방법에 따라 TSMs(Resorcinarene-based maltosides)의 10종의 화합물을 합성하였다.
<1-1> 2-클로로-4, 6-다이알킬화-1,3,5-트라이아진(2-Chloro-4, 6-dialkylated-1,3,5-triazine)의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 i)
2,4,6-트라이클로로-1,3,5-트라이아진 (3.01mmol) 및 NaHCO3 (7.26mmol)의 혼합물을 아세톤 (10 mL)에서 10분 동안 교반하였다. 아세톤에 용해된 각 알코올 (ROH / RSH) (6.0 mmol)을 30분 동안 적가 하였다. 생성된 반응 혼합물을 ROH의 경우 36시간 동안 또는 RSH의 경우 1시간 동안 실온에서 유지하였다. 반응 혼합물을 CHCl3과 물로 추출하고 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매 제거 후 얻은 유성 잔류물을 컬럼 크로마토 그래피 정제하여 목적 화합물 1 또는 3을 얻었다.
<1-2> 2-아미노-1,3-프로페인다이올(2-amino-1,3-propanediol) 및 상기 생성된 다이알킬화 트라이아진 유도체의 커플링 반응의 일반 합성 절차(도 1의 단계 ii)
THF에 용해된 2-클로로-4,6-다이알킬화-1,3,5-트라이아진 (1.0 당량)의 혼합물에 질소 하에서 2-아미노-1,3-프로페인다이올 및 K2CO3를 첨가하였다. 용액을 40 
에서 24시간 동안 교반 하였다. 반응 혼합물을 물로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 에틸 아세테이트 용액을 증발시킨 후, 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토 그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 2 또는 4를 수득하였다.
<1-3> 당화(glycosycosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 iii)
이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat. Methods 2010, 7, 1003.)을 일부 변경하여 사용하였다. 간단히 말해서, 무수 CH2Cl2 (20 mL)에 다이알킬화 다이올 유도체 (화합물 2 또는 4), AgOTf (2.5 당량), 2,4,6-콜리딘 (0.5 당량)의 혼합물을 -45 
에서 교반하였다. 그 후 CH2Cl2 (30 mL) 에 용해된 퍼벤조일화 말토실브로마이드 (2.5 당량)를 0.5시간에 걸쳐 이 현탁액에 적가하였다. 반응은 1.5시간 동안 0 
에서 유지되었다. 반응 진행은 TLC로 모니터링하였다. 반응 완료 후 (TLC에 의해 검출됨), 피리딘 (1.0 mL)을 반응 혼합물에 첨가 하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (30 mL)로 희석한 후 셀 라이트로 여과하였다. 여과액을 1.0 M Na2S2O3 수용액 (30 mL), 0.1 M HCl 수용액 (30 mL) 및 염수 (30 mL)로 연속적으로 세척하였다. 그 다음 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발로 제거하였다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 글리코실화된 목적 화합물을 수득하였다.
<1-4> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 1의 단계 iv)
이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat. Methods 2010, 7, 1003.)에 따랐다. Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화(de-O-benzoylation)를 수행하였다. O-protected 화합물을 무수 CH2Cl2로 용해시킨 다음 MeOH를 지속적인 침전이 나타날때까지 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 0.5 M의 메탄올성 용액(methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05 M이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H+ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건(in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH)를 이용하여 정제하여 목적 화합물을 얻었다.
<제조예 1> TSM-E7의 합성
<1-1> 화합물 1a의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 1a를 48%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.82-1.75 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<1-2> 화합물 2a의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 2a를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.30-4.24 (m, 4H), 4.15-4.12 (m, 4H), 3.90-3.81 (m, 4H), 1.74-1.72 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 16H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.1, 171.6, 167.9, 68.0, 67.8, 62.8, 53.2, 31.9, 29.1, 28.8, 25.9, 22.7, 14.2.
<1-3> TSM-E7a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-E7a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07-7.95 (m, 16H), 7.89-7.87 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 7.82-7.80 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 7.77-7.74 (m, 4H), 7.63-7.21 (m, 42H), 6.12 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.71-5.66 (m, 4H), 5.49 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.35-5.30 (m, 2H), 5.17-5.08 (m, 4H), 4.47-4.53 (m, 4H), 4.34-4.10 (m, 12H), 3.76 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 3.24-3.19 (m, 2H), 2.97 (t, J = 9.3 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 1.71-1.64 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H).; 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.2, 171.9, 167.5, 166.2, 165.9, 165.8, 165.5, 165.1, 164.9, 134.0, 133.7, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7,128.5, 128.4, 71.0, 128.3, 100.9, 95.6, 77.5, 76.9, 71.8, 71.3, 69.8, 69.1, 69.0, 67.6, 62.6, 31.8, 31.7, 29.0, 28.8, 28.7, 25.9, 22.7, 21. 114.2.
<1-4>
TSM-E7의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-E7을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.30-4.16 (m, 4H), 3.97-3.93 (m, 1H), 3.86-3.85 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 3.86-3.84-3.77 (m, 2H), 3.72-3.69 (m, 4H), 3.59-3.40 (m, 10H), 3.36-3.28 (m, 4H), 3.19-3.14 (m, 4H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.32-1.19 (m, 16H), 0.78 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 173.2, 172.81, 169.0, 104.9, 104.7, 103.0, 81.3, 81.2, 77.7, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 68.3, 68.9, 68.7, 62.8, 62.2, 32.0, 33.0, 30.7, 30.5, 30.2, 30.0, 27.1, 27.0, 23.9, 23.7, 14.6, 14.5; HRMS (EI): For C44H78N4O24 [M+Na]+ 1069.4904, found 1069.4908.
<제조예 2> TSM-E8의 합성
<2-1> 화합물 1b의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 1b를 45%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.72 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 20H), 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<2-2> 화합물 2b의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 2b를 89%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.30-4.24 (m, 4H), 4.15-4.12 (m, 4H), 3.90-3.81 (m, 4H), 1.74-1.72 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 20H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.1, 171.6, 167.9, 68.0, 67.8, 62.8, 53.2, 31.9, 29.1, 28.8, 25.9, 22.7, 14.2.
<2-3> TSM-E8a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-E8a를 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07-7.95 (m, 16H), 7.89-7.87 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 7.82-7.80 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 7.77-7.74 (m, 4H), 7.63-7.21 (m, 42H), 6.08 (t, J = 9.2 Hz 2H), 5.77-5.65 (m, 4H), 5.49 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 5.36-5.30 (m, 2H), 5.18-5.08 (m, 4H), 4.47-4.53 (m, 4H), 4.35-4.10 (m, 12H), 3.76 (d, J = 8.3, Hz 2H), 3.24-3.19 (m, 2H), 2.97 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 8.4 Hz, 1H), 1.71-1.64 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.2, 171.9, 167.5, 166.2, 165.9, 165.8, 165.5, 165.1, 164.9, 134.0, 133.7, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.4, 71.0, 128.3, 100.9, 95.6, 77.5, 76.9, 71.8, 71.3, 69.8, 69.1, 69.0, 67.6, 62.6, 31.8, 31.7, 29.0, 28.8, 28.7, 25.9, 22.7, 21.1, 14.2.
<2-4>
TSM-E8의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-E8을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.32-4.21 (m, 4H), 4.00-3.96 (m, 1H), 3.89-3.88 (m, 2H), 3.83-3.79 (m, 2H), 3.75-3.70 (m, 4H), 3.61-3.42 (m, 10H), 3.37-3.30 (m, 4H), 3.20-3.16 (m, 4H), 1.68-1.62 (m, 4H), 1.36-1.22 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 173.2, 172.8, 169.0, 104.9, 104.7, 103.0, 81.3, 81.2, 77.7, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 68.3, 68.9, 68.7, 62.8, 62.2, 32.0, 33.0, 33.1, 30.7, 30.5, 30.2, 30.0, 29.9, 27.1, 27.1,27.0, 23.9, 23.7, 14.6, 14.5; HRMS (FAB + ): For C46H82N4O24 [M+Na]+ 1097.5217, found 1097.5220.
<제조예 3> TSM-E9의 합성
<3-1> 화합물 1c의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 1c를 50%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.82-1.72 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<3-2> 화합물 2c의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 2c를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.60-4.24 (m, 4H), 4.16-4.14 (m, 1H), 3.86-3.81 (m, 4H), 1.73-1.71 (m, 4H), 1.38-1.26 (m, 24H), 0.87 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.0, 171.4, 167.7, 67.9, 67.7, 62.1, 53.3, 31.9, 29.6, 29.4, 28.8, 25.9, 22.7, 14.1.
<3-3> TSM-E9a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-E9a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07-7.95 (m, 16H), 7.89-7.87 (d, J = 7.5 Hz, 4H), 7.82-7.80 (d, J = 8.2 Hz, 4H), 7.77-7.74 (m, 4H), 7.63-7.21 (m, 42H), 6.14 (t, J = 9.9 Hz, 2H), 5.71-5.66 (m, 4H), 5.52 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.37-5.31 (m, 2H), 5.19-5.10 (m, 4H), 4.46-4.45 (m, 4H), 4.37-4.18 (m, 12H), 3.77 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 3.27-3.22 (m, 2H), 2.99 (t, J = 9.2 Hz, 2H), 2.82 (t, J = 8.6 Hz, 1H), 1.71-1.65 (m, 4H), 1.40-1.23 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.2, 171.9, 167.5, 166.2, 165.9, 165.8, 165.5, 165.1, 164.9, 134.0, 133.7, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.4, 71.0, 128.3, 100.9, 95.6, 74.4, 73.2, 72.2, 71.1, 69.8, 69.1, 69.0, 67.9, 67.6, 63.2, 62.6, 48.2, 31.9, 29.6, 29.5, 29.3, 28.8, 28.7, 25.9, 22.7, 21.1, 14.2.
<3-4>
TSM-E9의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-E9를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.32-4.21 (m, 4H), 4.00-3.96 (m, 1H), 3.89-3.88 (m, 2H), 3.83-3.79 (m, 2H), 3.75-3.70 (m, 4H), 3.61-3.42 (m, 10H), 3.37-3.30 (m, 4H), 3.20-3.16 (m, 4H), 1.68-1.62 (m, 4H), 1.36-1.22 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 173.2, 172.8, 169.0, 104.9, 104.7, 103.0, 81.3, 81.2, 77.7, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 68.3, 68.9, 68.7, 62.8, 62.2, 32.0, 33.0, 33.1, 30.7, 30.5, 30.2, 30.0, 29.9, 27.1, 27.1,27.0, 23.9, 23.7, 14.6, 14.5; HRMS (FAB + ): For C46H82N4O24 [M+Na]+ 1097.5217, found 1097.5220.
<제조예 4> TSM-E10의 합성
<4-1> 화합물 1d의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 1d를 50%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 64.3, 32.0, 29.7, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<4-2> 화합물 2d의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 2d를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.53 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.28-4.27 (m, 4H), 4.16-4.14 (m, 1H), 3.86-3.81 (m, 4H), 1.72-1.73 (m, 4H), 1.38-1.26 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.9, 171.4, 167.7, 67.9, 67.7, 62.1, 53.3, 31.9, 29.6, 29.4, 28.8, 25.9, 22.7, 14.1.
<4-3> TSM-E10a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-E10a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.06-7.93 (m, 16H), 7.88-7.86 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.81-7.79 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.76-7.72 (m, 4H), 7.63-7.22 (m, 42H), 6.12 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.71-5.60 (m, 4H), 5.49 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 5.35-5.29 (m, 2H), 5.16-5.08 (m, 4H), 4.61-4.50 (m, 4H), 4.39-4.17 (m, 12H), 3.76-3.74 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.25-3.19 (m, 2H), 2.97 (t, J = 9.4 Hz, 2H), 2.80 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 1.70-1.66 (m, 4H), 1.26-1.23 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.9, 166.2, 165.9, 165.6, 165.1, 164.9, 134.1, 133.7, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.4, 100.4, 95.7, 71.0, 71.4, 69.8, 69.1, 68.0, 67.7, 62.6, 32.0, 29.7, 29.4, 28.9, 28.8, 26.0, 22.8, 21.2, 14.3, 14.2.
<4-4>
TSM-E10의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-E10를 91%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.18 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.22-4.26 (m, 4H), 3.97-3.93 (m, 1H), 3.87-3.86 (m, 2H), 3.80-3.77 (m, 2H), 3.73-3.70 (m, 4H), 3.58-3.57 (m, 10H), 3.43-3.31 (m, 4H), 3.20-3.3.14 (m, 4H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.32-1.17 (m, 28H), 0.78 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 173.1, 169.0, 105.0, 104.8, 103.1, 81.4, 77.8, 76.7, 75.2, 74.7, 74.2, 71.6, 69.0, 68.8, 62.8, 62.2, 50.7, 33.2, 30.6, 30.5, 30.0, 27.1, 27.1, 23.9, 14.6; HRMS (FAB + ): For C50H90N4O24 [M+Na]+ 1153.5843, found 1153.5839.
<제조예 5> TSM-E11의 합성
<5-1> 화합물 1e의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 1e를 48%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.82-1.72 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 29.6, 29.3, 28.5, 25.8, 22.8, 14.2.
<5-2> 화합물 2e의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 2e를 88%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.19 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.32-4.26 (m, 4H), 4.16-4.14 (m, 1H), 3.93-3.85 (m, 4H), 1.74-1.73 (m, 4H), 1.36-1.26 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): 172.1, 171.6, 168.0, 68.0, 67.9, 63.5, 53.2, 32.1, 29.8, 28.9, 26.0, 22.9, 14.3.
<5-3> TSM-E11a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-E11a를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.05-7.93 (m, 16H), 7.88-7.86 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.81-7.79 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.75-7.72 (m, 4H), 7.63-7.22 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.68-5.61 (m, 4H), 5.48 (d, J = 7.4 Hz, 2H), 5.35-5.28 (m, 2H), 5.17-5.14 (m, 4H), 4.66-4.52 (m, 4H), 4.33-4.10 (m, 12H), 3.74 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.25-3.17 (m, 2H), 2.93 (t, J = 9.5 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 8.2 Hz, 1H), 1.72-1.62 (m, 4H), 1.44-1.29 (m, 32H), 0.89 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.9, 166.2, 165.9, 165.6, 165.1, 164.9, 134.1, 133.7, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.5, 128.4, 100.4, 95.7, 71.0, 71.4, 69.8, 69.1, 68.0, 67.7, 62.6, 32.0, 29.7, 29.4, 28.9, 28.8, 28.9, 26.0, 22.8, 21.2, 14.3, 14.2.
<5-4>
TSM-E11의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-E11를 91%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.39 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.29-4.16 (m, 4H), 3.96-3.92 (m, 1H), 3.85-3.84 (m, 2H), 3.80-3.76 (m, 2H), 3.71-3.69 (m, 4H), 3.56-3.39 (m, 10H), 3.34-3.26 (m, 4H), 3.18-3.3.12 (m, 4H), 1.64-1.58 (m, 4H), 1.32-1.17 (m, 32H), 0.77 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 173.1, 169.0, 105.0, 104.8, 103.1, 81.4, 77.8, 76.7, 75.2, 74.7, 74.2, 71.6, 69.0, 68.8, 62.8, 62.2, 50.7, 33.2, 30.6, 30.5, 30.0, 27.1, 27.1, 23.9, 14.6; HRMS (FAB + ): For C52H94N4O24 [M+Na]+ 1181.6159, found 1181.6162.
<제조예 6> TSM-T7의 합성
<6-1> 화합물 3a의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 3a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.44-1.30 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<6-2> 화합물 4a의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 4a를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.27 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.14-4.09 (m, 4H), 3.90-3.81 (m, 4H), 3.04-3.01 (m, 4H), 1.68-1.65 (m, 4H), 1.40-1.26 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.1 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.5, 63.2, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<6-3> TSM-T7a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-T7a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27-7.91 (m, 12H), 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.78-7.75 (m, 4H), 7.69-7.19 (m, 42H), 6.17 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.74-5.66 (m, 4H), 5.48-5.34 (m, 4H), 5.16-5.13 (m, 4H), 4.72-4.61 (m, 4H), 4.37-4.23 (m, 10H), 3.79-3.76 (m 2H), 3.33-3.24 (m, 2H), 3.05-2.85 (m, 6H), 1.66-1.60 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 16H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.7, 166.1, 165.8, 165.7, 165.4, 165.0, 164.8, 162.0, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 128.2, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 100.8, 95.6, 74.4, 71.9, 71.3, 69.7, 69.1, 68.8, 63.1, 62.5, 31.7, 30.1, 29.9, 29.3, 28.8, 28.7, 22.6, 14.1.
<6-4>
TSM-T7의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-T7을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.18 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.38-4.36 (m, 3H), 3.93-3.90 (m, 1H), 3.84-3.76 (m, 4H), 3.72-3.66 (m, 4H), 3.55-3.39 (m, 10H), 3.33-3.26 (m, 4H), 3.17-3.12 (m, 6H), 2.94 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.57-1.53 (m, 4H), 1.31-1.18 (m, 16H), 0.77 (t, J = 6.8 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 181.7, 180.9, 164.0, 105.3, 105.1, 103.4, 81.8, 81.6, 78.1, 77.1, 75.5, 75.2, 75.1, 75.0, 74.6, 71.9, 69.8, 69.6, 63.2, 62.6, 62.4, 52.2, 33.5, 31.5, 31.3, 31.2, 30.9, 30.5, 30.4, 24.2, 15.0; HRMS (FAB + ): For C44H78N4O22S2 [M+Na]+ 1101.4447, found 1101.4453.
<제조예 7> TSM-T8의 합성
<7-1> 화합물 3b의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 3b를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.44-1.30 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<7-2> 화합물 4b의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 4b를 92%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.26 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.11-4.09 (m, 4H), 3.92-3.83 (m, 4H), 3.05-3.01 (m, 4H), 1.68-1.65 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.5, 63.2, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<7-3> TSM-T8a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-T8a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27-7.91 (m, 12H), 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.78-7.75 (m, 4H), 7.69-7.19 (m, 42H), 6.17 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.74-5.66 (m, 4H), 5.48-5.34 (m, 4H), 5.16-5.13 (m, 4H), 4.72-4.61 (m, 4H), 4.37-4.23 (m, 10H), 3.79-3.76 (m 2H), 3.33-3.24 (m, 2H), 3.05-2.85 (m, 6H), 1.66-1.60 (m, 4H), 1.39-1.23 (m, 20H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.7, 166.1, 165.8, 165.7, 165.4, 165.0, 164.8, 162.0, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 128.2, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 100.8, 95.6, 74.4, 71.9, 71.3, 69.7, 69.1, 68.8, 63.1, 62.5, 31.7, 30.1, 29.9, 29.3, 28.8, 28.7, 22.6, 14.1.
<7-4>
TSM-T8의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-T8을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.39-4.35 (m, 3H), 3.93-3.89 (m, 1H), 3.83-3.76(m, 4H), 3.69-3.67 (m, 4H), 3.54-3.39 (m, 10H), 3.32-3.26 (m, 4H), 3.16-3.10 (m, 6H), 2.94 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.58-1.52 (m, 4H), 1.28-1.16 (m, 20H), 0.75 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 181.1, 180.8, 163.5, 105.3, 104.8, 104.6 102.9, 81.3, 81.2, 77.7, 76.6, 75.0, 74.8, 74.6, 74.1, 71.4, 69.3, 69.1, 62.7, 62.1, 52.2, 33.0, 31.0, 30.8, 30.6, 30.4, 30.3, 30.0, 29.9, 23.7, 14.5; HRMS (FAB + ): For C46H82N4O22S2 [M+Na]+ 1129.4760, found 1129.4757.
<제조예 8> TSM-T9의 합성
<8-1> 화합물 3c의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 3c를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 24H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<8-2> 화합물 4c의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 4c를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.36 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.11-4.09 (m, 4H), 3.90-3.81 (m, 4H), 3.03-3.01 (m, 4H), 1.68-1.65 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.6, 162.3, 62.6, 32.0, 30.4, 30.2, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<8-3> TSM-T9a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-T9a를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27-7.91 (m, 12H), 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.78-7.75 (m, 4H), 7.69-7.19 (m, 42H), 6.15 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.72-5.65 (m, 4H), 5.41-5.34 (m, 4H), 5.20-5.11 (m, 4H), 4.66-4.59 (m, 4H), 4.37-4.20 (m, 10H), 3.77-3.74 (m 2H), 3.28-3.23 (m, 2H), 3.05-2.95 (m, 6H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.30-1.21 (m, 24H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.7, 166.1, 165.8, 165.7, 165.4, 165.0, 164.8, 162.0, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 128.2, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 100.8, 95.6, 74.4, 71.9, 71.3, 69.8, 69.1, 68.9, 63.2, 62.5, 32.0, 31.9, 30.2, 30.0, 29.6, 29.5, 29.3, 29.2, 28.9, 28.8, 28.7, 22.7, 14.2.
<8-4>
TSM-T9의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-T9를 93%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.34-4.09 (m, 3H), 3.94-3.90 (m, 1H), 3.83-3.76 (m, 4H), 3.72-3.69 (m, 4H), 3.57-3.39 (m, 10H), 3.27-3.26 (m, 4H), 3.17-3.12 (m, 6H), 2.93 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.60-1.50 (m, 4H), 1.30-1.16 (m, 24H), 0.76 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 181.7, 180.9, 164.0, 105.3, 105.1, 103.4, 81.8, 81.6, 78.1, 77.1, 75.5, 75.2, 75.0, 74.6, 71.9, 69.8, 69.6, 63.2, 62.6, 52.2, 33.5, 35.1, 31.3, 31.2. 30.9, 30.5, 30.1, 24.2, 14.9; HRMS (FAB + ): For C48H86N4O22S2 [M+Na]+ 1157.5073, found 1157.5068.
<제조예 9> TSM-T10의 합성
<9-1> 화합물 3d의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 3d를 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 64.3, 32.0, 29.7, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<9-2> 화합물 4d의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 4d를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.0 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.10-4.08 (m, 4H), 3.91-3.89 (m, 4H), 3.05-3.01 (m, 4H), 1.68-1.65 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.6, 63.2, 34.2, 32.1, 32.0, 30.4, 30.2, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 28.5, 24.8, 22.8, 14.2.
<9-3> TSM-T10a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-T10a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27-7.91 (m, 12H), 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.78-7.75 (m, 4H), 7.69-7.19 (m, 42H), 6.15 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.72-5.65 (m, 4H), 5.41-5.34 (m, 4H), 5.20-5.11 (m, 4H), 4.66-4.59 (m, 4H), 4.37-4.20 (m, 10H), 3.77-3.74 (m 2H), 3.28-3.23 (m, 2H), 3.05-2.95 (m, 6H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.30-1.21 (m, 28H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.8, 166.1, 165.8, 165.7, 165.4, 165.0, 164.8, 162.0, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 128.2, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 100.8, 95.6, 74.5, 72.5, 71.9, 71.3, 69.8, 69.1, 69.0, 63.2, 62.6, 32.0, 31.9, 30.3, 30.1, 30.0, 29.7, 29.4, 29.5, 29.3, 29.2, 28.9, 28.8, 28.7, 22.8, 14.2.
<9-4>
TSM-T10의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-T10을 92%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.34-4.30 (m, 3H), 3.94-3.90 (m, 1H), 3.83-3.76 (m, 4H), 3.72-3.69 (m, 4H), 3.57-3.39 (m, 10H), 3.27-3.26 (m, 4H), 3.17-3.12 (m, 6H), 2.93 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.60-1.50 (m, 4H), 1.30-1.16 (m, 28H), 0.76 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 181.6, 180.8, 163.7, 104.9, 104.7, 103.0, 81.4, 77.7, 76.7, 75.1, 74.9, 74.7, 74.2, 71.5, 62.8, 62.2, 33.2, 30.8, 30.6, 30.5, 30.1, 23.9, 14.6; HRMS (FAB + ): For C50H90N4O22S2 [M+Na]+ 1185.5386, found 1185.5392.
<제조예 10> TSM-T11의 합성
<10-1> 화합물 3e의 합성
실시예 1-1에 따라 화합물 3e를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 32H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 29.6, 29.3, 28.5, 25.8, 22.8, 14.2.
<10-2> 화합물 4e의 합성
실시예 1-2에 따라 화합물 4e를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 6.38 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.10-4.08 (m, 4H), 3.91-3.89 (m, 4H), 3.05-3.01 (m, 4H), 1.68-1.65 (m, 4H), 1.39-1.27 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.6, 63.2, 34.2, 32.1, 32.0, 30.4, 30.2, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 28.5, 24.8, 22.8, 14.2.
<10-3> TSM-T11a의 합성
실시예 1-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TSM-T11a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.27-7.91 (m, 12H), 7.90 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.83 (d, J = 7.6 Hz, 4H), 7.78-7.75 (m, 4H), 7.69-7.19 (m, 42H), 6.15 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.72-5.65 (m, 4H), 5.41-5.34 (m, 4H), 5.20-5.11 (m, 4H), 4.66-4.59 (m, 4H), 4.37-4.20 (m, 10H), 3.77-3.74 (m 2H), 3.28-3.23 (m, 2H), 3.05-2.95 (m, 6H), 1.65-1.59 (m, 4H), 1.30-1.21 (m, 32H), 0.87 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.8, 166.1, 165.8, 165.7, 165.4, 165.0, 164.8, 162.0, 133.4, 133.2, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.4, 129.3, 129.2, 128.2, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4, 128.3, 100.8, 95.6, 74.5, 72.3, 71.9, 71.3, 69.8, 69.1, 69.0, 68.9, 63.2, 62.6, 32.0, 31.9, 30.3, 30.1, 30.0, 29.7, 29.4, 29.5, 29.3, 29.2, 28.9, 28.8, 28.7, 22.8, 14.2.
<10-4>
TSM-T11의 합성
실시예 1-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TSM-T11을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.39-4.34 (m, 3H), 3.95-3.91 (m, 1H), 3.82-3.77 (m, 4H), 3.72-3.69 (m, 4H), 3.57-3.40 (m, 10H), 3.35-3.29 (m, 4H), 3.18-3.14 (m, 6H), 2.95 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.62-1.52 (m, 4H), 1.30-1.17 (m, 32H), 0.78 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 180.5, 162.9, 104.6, 103.0, 81.3, 77.9, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 69.1, 62.8, 62.2, 31.2, 31.1, 31.0, 30.9, 30.8, 30.6, 30.5, 30.1, 23.9, 14.6; HRMS (FAB + ): For C52H94N4O22S2 [M+Na]+ 1213.5699, found 1213.5702.
<실시예 2> TTGs의 합성 방법
TTGs의 합성 스킴을 도 2에 나타내었다. 하기 <2-1> 내지 <2-4>의 합성 방법에 따라 TTGs의 20종의 화합물을 합성하였다.
<2-1> 2-클로로-4, 6-다이알킬화-1,3,5-트라이아진(2-Chloro-4, 6-dialkylated-1,3,5-triazine)의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 i)
2,4,6-트라이클로로-1,3,5-트라이아진 (3.01 mmol) 및 NaHCO3 (7.26 mmol)의 혼합물을 아세톤 (10 mL)에서 10분 동안 교반하였다. 아세톤에 용해된 각 싸이올(RSH) (6.0 mmol) 또는 알킬 아민을 30분 동안 적가 하였다. 생성된 반응 혼합물을 1시간 동안 실온에서 유지하였다. 반응 혼합물을 CHCl3과 물로 추출하고 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매 제거 후 얻은 유성 잔류물을 컬럼 크로마토 그래피 정제하여 목적 화합물 1 또는 3을 얻었다.
<2-2> 2-아미노-1,3-프로페인다이올(2-amino-1,3-propanediol) 및 상기 생성된 다이알킬화 트라이아진 유도체의 커플링 반응의 일반 합성 절차(도 2의 단계 ii)
THF (50 mL)에 용해된 2-클로로-4,6-다이알킬화-1,3,5-트라이아진(1.00g, 5.42 mmol)의 건조 플라스크 용액에 트리스(하이드록시메틸)아미노메테인 (1.5당량) 및 다이아이소프로필에틸아민 (DIPEA)을 질소 하에 첨가하였다. 첨가 후 온도를 점차적으로 100 ℃까지 높이고 34시간 더 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석한 다음 에틸아세테이트로 추출하였다. 유기층을 1.0 M HCl, 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 에틸아세테이트 용액을 농축한 후, 잔류물을 플래시 컬럼크로마토그래피(EtOAc/헥산)로 정제하여 원하는 목적 화합물 2 또는 4를 수득하였다
<2-3> 당화(glycosycosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 iii)
이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat. Methods 2010, 7, 1003.)을 일부 변경하여 사용하였다. 간단히 말해서, 무수 CH2Cl2 (40 mL)에 다이알킬화 트라이올 유도체 (1 당량, 250mg), AgOTf (2.4 당량), 2,4,6-콜리딘 (1 당량)의 혼합물을 -45 
에서 교반하였다. 그 후 CH2Cl2 (10 mL) 에 용해된 퍼벤조일화 말토실브로마이드 (2.4 당량)를 0.5시간에 걸쳐 이 현탁액에 적가하였다. 반응은 30분 동안 -45 
에서 계속 교반하였다. 그 다음 반응 혼합물을 0 
로 가온하여 1시간 계속 교반하였다. 반응 완료 후 (TLC에 의해 검출됨), 피리딘 (1.0 mL)을 반응 혼합물에 첨가 하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (40 mL)로 희석한 후 셀 라이트로 여과하였다. 여과액을 1.0 M Na2S2O3 수용액 (40 mL), 0.1 M HCl 수용액 (40 mL) 및 염수 (2 x 40 mL)로 연속적으로 세척하였다. 그 다음 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발로 제거하였다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 글리코실화된 목적 화합물을 수득하였다.
<2-4> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 2의 단계 iv)
이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat. Methods 2010, 7, 1003.)에 따랐다. Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화(de-O-benzoylation)를 수행하였다. O-protected 화합물을 무수 CH2Cl2로 용해시킨 다음 MeOH를 지속적인 침전이 나타날때까지 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 0.5 M의 메탄올성 용액(methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05 M이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H+ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건(in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH)를 이용하여 정제하여 목적 화합물을 얻었다.
<제조예 11> TTG-T7의 합성
<11-1> 화합물 1a의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 1a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.44-1.30 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<11-2> 화합물 2a의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 2a를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.07 (b, 3H), 3.69 (s, 6H), 3.04-3.01(m, 4H), 1.67-1.66 (m, 4H), 1.39-1.28 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.04 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.5, 63.2, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<11-3> TTG-T7a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-T7a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8 Hz 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (t, J = 8 Hz, 3H), 5.44 (t, J = 12 Hz, 3H), 5.29-5.2 (m, 4H), 4.50-4.37 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.57-3.50 (m, 5H), 2.94-2.90 (m 4H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.26-1.21 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.3, 165.1, 164.7, 162.6, 133.8, 133.6, 133.4, 133.3, 130.1, 129.9, 129.8, 129.6, 129.5, 129.2, 128.9, 128.8, 128.6, 128.4, 101.5, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.3, 63.2, 59.8, 31.8, 29.2, 28.9, 22.7, 14.2.
<11-4>
TTG-T7의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-T7을 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.35 (d, J = 8 Hz, 3H), 4.19 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.87 (d, J = 12 Hz, 3H), 3.75-3.72 (m, 3H), 3.59-3.55 (m, 3H), 3.25-3.16 (m, 10H), 3.08 (t, J = 8 Hz, 3H), 2.97-2.94 (m, 4H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.31-1.19 (m, 16H), 0.78 (t, J = 8.0 Hz 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 163.9, 105.6, 78.2, 78.21, 75.3, 71.7, 70.3, 62.8, 61.5, 33.3, 31.2, 31.0, 30.7, 30.5, 30.3, 24.0, 14.8.
<제조예 12> TTG-T8의 합성
<12-1> 화합물 1b의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 1b를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<12-2> 화합물 2b의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 2b를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.92 (b, 3H), 3.69 (s, 6H), 3.04-3.01(m, 4H), 1.70-1.66 (m, 4H), 1.28-1.26 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.5, 63.2, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<12-3> TTG-T8a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-T8a를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8 Hz, 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (t, J = 8 Hz, 3H), 5.44 (t, J = 12 Hz, 3H), 5.29-5.2 (m, 4H), 4.50-4.37 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.57-3.50 (m, 5H), 2.94-2.90 (m 4H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.26-1.21 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.1, 164.6, 162.5, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 72.5, 71.9, 71.8, 69.5, 68.2, 63.2, 59.8, 31.9, 29.6, 29.4, 29.2, 29.0, 22.7, 22.1, 14.2.
<12-4>
TTG-T8의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-T8을 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.35 (d, J = 8 Hz, 3H), 4.19 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.87 (d, J = 12 Hz, 3H), 3.75-3.72 (m, 3H), 3.59-3.55 (m, 3H), 3.25-3.16 (m, 10H), 3.08 (t, J = 8 Hz, 3H), 2.97-2.94 (m, 4H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.31-1.19 (m, 20H), 0.78 (t, J = 8.0 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 163.9, 105.6, 78.2, 78.21, 75.3, 71.7, 70.3, 62.8, 61.5, 33.3, 31.2, 31.0, 30.7, 30.5, 30.3, 24.0, 14.8.
<제조예 13> TTG-T9의 합성
<13-1> 화합물 1c의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 1c를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 24H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 64.3, 32.0, 29.7, 29.5, 29.4, 28.5, 25.9, 22.7, 14.2.
<13-2> 화합물 2c의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 2c를 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.92 (b, 3H), 3.69 (s, 6H), 3.04-3.01(m, 4H), 1.70-1.66 (m, 4H), 1.28-1.26 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.04 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.5, 63.2, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<13-3> TTG-T9a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-T9a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8 Hz 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (t, J = 8 Hz, 3H), 5.44 (t, J = 12 Hz, 3H), 5.29-5.2 (m, 4H), 4.50-4.37 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.57-3.50 (m, 5H), 2.94-2.90 (m 4H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.26-1.21 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.1, 164.5, 162.4, 133.8, 133.5, 133.3, 133.1, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 72.4, 71.9, 71.8, 69.5, 68.5, 63.2, 59.6, 31.8, 29.6, 29.4, 29.2, 29.0, 22.7, 22.1, 14.2.
<13-4>
TTG-T9의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-T9을 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.35 (d, J = 8 Hz, 3H), 4.19 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.87 (d, J = 12 Hz, 3H), 3.75-3.72 (m, 3H), 3.59-3.55 (m, 3H), 3.25-3.16 (m, 10H), 3.08 (t, J = 8 Hz, 3H), 2.97-2.94 (m, 4H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.31-1.19 (m, 24H), 0.78 (t, J = 8.0 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 163.9, 105.6, 78.2, 78.21, 75.3, 71.7, 70.3, 62.8, 61.5, 33.3, 31.2, 31.0, 30.7, 30.5, 30.3, 24.0, 14.8.
<제조예 14> TTG-T10의 합성
<14-1> 화합물 1d의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 1d를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 32H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.8, 29.7, 29.6, 29.3, 28.5, 25.8, 22.8, 14.2.
<14-2> 화합물 2d의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 2d를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.92 (b, 3H), 3.69 (s, 6H), 3.04-3.01(m, 4H), 1.70-1.66 (m, 4H), 1.28-1.26 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.04 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.6, 162.5, 63.1, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.7, 14.2.
<14-3> TTG-T10a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-T10a를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8 Hz, 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (t, J = 8 Hz, 3H), 5.44 (t, J = 12 Hz, 3H), 5.29-5.2 (m, 4H), 4.50-4.37 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.57-3.50 (m, 5H), 2.94-2.90 (m 4H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.26-1.21 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.1, 164.6, 162.5, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 72.5, 71.9, 71.8, 69.5, 68.2, 63.2, 60.4, 59.8, 53.5, 31.9, 29.6, 29.4, 29.2, 29.0, 22.7, 22.1, 14.2.
<14-4>
TTG-T10의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-T10을 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.33 (d, J = 12 Hz, 3H), 4.18 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.87 (d, J = 8 Hz, 3H), 3.77-3.71 (m, 3H), 3.58-3.54 (m, 3H), 3.24-3.15 (m, 10H), 3.07 (t, J = 8 Hz, 3H), 2.95-2.93 (m, 4H), 1.59-1.53 (m, 4H), 1.30-1.17 (m, 28H), 0.77 (t, J = 8.0 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 163.5, 105.3, 78.0, 78.01, 75.2, 71.5, 70.1, 62.6, 61.3, 33.2, 30.8, 30.7, 30.6, 23.8, 14.6.
<제조예 15> TTG-T11의 합성
<15-1> 화합물 1e의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 1e를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 32H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.8, 29.7, 29.6, 29.3, 28.5, 25.8, 22.8, 14.2.
<15-2> 화합물 2e의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 2e를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.19 (b, 3H), 3.69 (s, 6H), 3.04-3.01(m, 4H), 1.67-1.66 (m, 4H), 1.28-1.26 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.04 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.5, 162.3, 62.5, 53.0, 30.0, 30.4, 30.2, 29.8, 29.7, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<15-3> TTG-T11a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-T11a를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.97 (s, 1H), 5.61 (t, J = 8 Hz, 3H), 5.45 (t, J = 12.0 Hz, 3H), 5.29-5.2 (m, 4H), 4.51-4.37 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.57-3.50 (m, 5H), 2.94-2.90 (m 4H), 1.58-1.55 (m, 4H), 1.26-1.21 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.3, 165.2, 164.5, 162.4, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.9, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 73.1, 72.8, 72.1, 71.9, 71.9, 69.4, 68.2, 63.2, 60.4, 59.8, 53.5, 48.4, 31.9, 30.2, 29.7, 29.6, 29.5, 29.2, 29.0, 22.7, 22.1, 14.2.
<15-4>
TTG-T11의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-T11을 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.19 (d, J = 8.0 Hz 3H), 3.88 (d, J = 12 Hz, 3H), 3.76-3.73 (m, 3H), 3.6-3.55 (m, 3H), 3.25-3.16 (m, 10H), 3.08 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 2.97-2.94 (m, 4H), 1.60-1.54 (m, 4H), 1.32-1.17 (m, 32H), 0.78 (t, J = 8.0 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 163.9, 105.6, 78.2, 78.21, 75.3, 71.7, 70.3, 62.8, 61.5, 33.3, 31.2, 31.0, 30.7, 30.5, 30.3, 24.0, 14.8.
<제조예 16> TTG-T12의 합성
<16-1> 화합물 1f의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 1f를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.43 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 36H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.6, 172.2, 69.7, 32.0, 29.7, 29.8, 29.6, 29.3, 28.5, 25.7, 22.8, 14.2.
<16-2> 화합물 2f의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 2f를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.92 (b, 3H), 3.69 (s, 6H), 3.04-3.01(m, 4H), 1.70-1.66 (m, 4H), 1.28-1.26 (m, 36H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.7, 162.5, 63.2, 32.0, 30.4, 30.2, 29.6, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<16-3> TTG-T12a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-T12a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.95 (s, 1H), 5.61 (t, J = 8.0 Hz 3H), 5.46 (t, J = 12.0 Hz, 3H), 5.28-5.24 (m, 4H), 4.49-4.39 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.51-3.49 (m, 5H), 2.95-2.90 (m 4H), 1.59-1.57 (m, 4H), 1.29-1.21 (m, 36H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.2, 164.6, 162.4, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 72.6, 72.0, 71.4, 69.6, 68.2, 63.2, 59.9, 48.4, 31.9, 32.0, 29.6, 29.3, 29.1, 22.8, 14.2.
<16-4>
TTG-T12의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-T12를 88%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.35 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.19 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.88 (d, J = 12.0 Hz, 3H), 3.76-3.73 (m, 3H), 3.6-3.55 (m, 3H), 3.25-3.16 (m, 10H), 3.08 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 2.97-2.94 (m, 4H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.31-1.19 (m, 36H), 0.78 (t, J = 8.0 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 163.7, 105.5, 78.2, 78.21, 75.3, 71.7, 70.3, 62.8, 61.5, 33.3, 31.2, 31.0, 30.7, 30.5, 30.3, 24.0, 14.8.
<제조예 17> TTG-A8의 합성
<17-1> 화합물 3a의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 3a를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.86 (br, 2H, NH), 3.27-3.42 (m, 4H), 1.50-1.63 (m, 4H), 1.19-1.41 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): 167.8, 65.4, 41.5, 32.5, 30.2, 29.8, 27.4, 23.3, 14.4.
<17-2> 화합물 4a의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 4a를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.78-3.72 (m, 6H), 3.41-3.38 (m, 4H), 1.53-1.50 (m, 4H), 1.28-1.24 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.3, 179.4, 162.2, 62.4, 32.1, 30.1, 29.8, 29.4, 29.3, 29.1, 22.8, 14.2.
<17-3> TTG-A8a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-A8a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.26 (m, 46H), 5.97 (s, 1H), 5.60 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 5.44 (t, J = 8.0 Hz 3H), 5.29-5.20 (m, 4H), 4.50-4.37 (m, 8H), 4.10-3.90 (m, 4H), 3.57-3.50 (m, 5H), 2.94-2.90 (m 4H), 1.59-1.55 (m, 4H), 1.26-1.21 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.3, 165.1, 164.7, 162.6, 133.8, 133.6, 133.4, 133.3, 130.1, 129.9, 129.8, 129.6, 129.5, 129.2, 128.9, 128.8, 128.6, 128.4, 101.5, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.3, 63.2, 59.8, 31.8, 29.2, 28.9, 22.7, 14.2.
<17-4>
TTG-A8의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-A8을 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.32-4.29 (m, 6H), 4.09-4.05 (m, 6H), 3.92-3.86 (m, 4H), 3.73-3.68 (m, 4H), 3.34-3.20 (m, 24H), 1.62-1.60 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 164.7, 105.4, 78.2, 78.0, 75.1, 71.6, 70.2, 62.7, 33.2, 30.7, 30.6, 30.2, 23.6 14.5.
<제조예 18> TTG-A9의 합성
<18-1> 화합물 3b의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 3b를 78%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.87 (br, 2H, NH), 3.27-3.43 (m, 4H), 1.50-1.63 (m, 4H), 1.19-1.41 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): 167.9, 65.5, 41.5, 32.5, 30.2, 29.9, 27.4, 23.3, 14.4.
<18-2> 화합물 4b의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 4b를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.77-3.73 (m, 6H), 3.40-3.37 (m, 4H), 1.52-1.48 (m, 4H), 1.26-1.23 (m, 24H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.5, 162.3, 62.5, 54.1, 32.1, 30.0, 29.8, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<18-3> TTG-A9a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-A9a를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.27 (m, 46H), 6.03 (s, 2H), 5.73-5.28 (m, 22H), 4.51-4.47 (m, 18H), 4.03-3.89 (m, 8H), 3.59-3.48 (m, 10H), 3.23-3.12 (m, 4H), 1.60-1.57 (m, 4H), 1.25-1.18 (m, 24H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.1, 164.8, 162.5, 133.7, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.2, 63.2, 59.8, 48.4, 31.9, 32.0, 29.7, 29.2, 29.0, 22.9, 14.2.
<18-4>
TTG-A9의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-A9를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.31-4.29 (m, 6H), 4.09-4.06 (m, 6H), 3.91-3.86 (m, 4H), 3.73-3.67 (m, 4H), 3.34-3.21 (m, 24H), 1.62-1.60 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 164.6, 105.3, 78.2, 78.1, 75.1, 71.5, 70.2, 62.7, 33.2, 30.8, 30.5, 30.2, 23.5,14.5.
<제조예 19> TTG-A10의 합성
<19-1> 화합물 3c의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 3c를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.86 (br, 2H, NH), 3.28-3.43 (m, 4H), 1.51-1.63 (m, 4H), 1.18-1.41 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3):167.8, 165.6, 41.6, 32.5, 30.6, 29.9, 29.8, 27.4, 23.2, 14.3.
<19-2> 화합물 4c의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 4c를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.78-3.74 (m, 6H), 3.41-3.38 (m, 4H), 1.53-1.48 (m, 4H), 1.27-1.24 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.2, 179.2, 162.2, 62.5, 54.2, 32.3, 30.0, 29.7, 29.3, 29.4, 29.0, 22.6, 14.2.
<19-3> TTG-A10a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-A10a를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.27 (m, 46H), 6.03 (s, 2H), 5.73-5.28 (m, 22H), 4.51-4.47 (m, 18H), 4.03-3.89 (m, 8H), 3.59-3.48 (m, 10H), 3.23-3.12 (m, 4H), 1.60-1.57 (m, 4H), 1.25-1.18 (m, 28H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.1, 164.7, 162.5, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.2, 63.2, 59.8, 48.4, 31.9, 32.0, 29.7, 29.2, 29.0, 22.9, 14.2.
<19-4>
TTG-A10의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-A10을 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.48 (d, J = 8.0 Hz,3H), 4.32-4.29 (m, 6H), 4.08-4.05 (m, 6H), 3.91-3.87 (m, 4H), 3.72-3.67 (m, 4H), 3.33-3.21 (m, 24H), 1.62-1.60 (m, 4H), 1.33-1.28 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 164.8, 105.3, 78.2, 78.0, 75.1, 71.4, 70.3, 62.8, 33.3, 30.9, 30.2, 28.8, 23.7, 14.5.
<제조예 20> TTG-A11의 합성
<20-1> 화합물 3d의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 3d를 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.85 (br, 2H, NH), 3.28-3.41 (m, 4H), 1.52-1.63 (m, 4H), 1.18-1.42 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3):167.8, 165.7, 41.5, 32.5, 30.6, 29.9, 29.7, 29.5, 27.4, 23.2, 14.3.
<20-2> 화합물 4d의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 4d를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.77-3.73 (m, 6H), 3.41-3.38 (m, 4H), 1.53-1.549 (m, 4H), 1.25-1.23 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.3, 179.4, 162.2, 62.4, 54.1, 32.1, 30.1, 29.8, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<20-3> TTG-A11a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-A11a를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.27 (m, 46H), 6.03 (s, 2H), 5.73-5.28 (m, 22H), 4.51-4.47 (m, 18H), 4.03-3.89 (m, 8H), 3.59-3.48 (m, 10H), 3.23-3.12 (m, 4H), 1.60-1.57 (m, 4H), 1.25-1.18 (m, 32H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.2, 165.1, 164.7, 162.5, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.2, 63.2, 59.8, 48.4, 31.9, 32.0, 29.7, 29.2, 29.0, 22.9, 14.2.
<20-4>
TTG-A11의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-A11을 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.49 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.33-4.30 (m, 6H), 4.08-4.04 (m, 6H), 3.90-3.87 (m, 4H), 3.72-3.68 (m, 4H), 3.36-3.21 (m, 24H), 1.62-1.60 (m, 4H), 1.32-1.28 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 164.7, 105.4, 78.1, 78.0, 75.1, 71.5, 70.3, 62.7, 33.2, 30.9, 30.6, 30.3, 28.8, 23.8, 14.5.
<제조예 21> TTG-A12의 합성
<21-1> 화합물 3e의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 3e를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.84 (br, 2H, NH), 3.29-3.41 (m, 4H), 1.53-1.63 (m, 4H), 1.18-1.42 (m, 36H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3):167.8, 165.5, 41.5, 32.7, 30.6, 29.9, 29.7, 29.5, 27.8, 23.1, 14.2.
<21-2> 화합물 4e의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 4e를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.77-3.73 (m, 6H), 3.41-3.38 (m, 4H), 1.53-1.549 (m, 4H), 1.25-1.23 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.3, 179.4, 162.2, 62.4, 54.1, 32.1, 30.1, 29.8, 29.5, 29.4, 29.1, 22.8, 14.2.
<21-3> TTG-A12a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-A12a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.27 (m, 46H), 6.04 (s, 2H), 5.71-5.26 (m, 22H), 4.51-4.47 (m, 18H), 4.03-3.89 (m, 8H), 3.59-3.48 (m, 10H), 3.23-3.12 (m, 4H), 1.59-1.57 (m, 4H), 1.26-1.18 (m, 36H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.3, 164.5, 162.2, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.2, 63.1, 59.8, 48.4, 31.9, 32.0, 29.7, 29.3, 29.0, 22.8, 14.2.
<21-4>
TTG-A12의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-A12을 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.49 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.33-4.29 (m, 6H), 4.08-4.05 (m, 6H), 3.89-3.86 (m, 4H), 3.71-3.68 (m, 4H), 3.36-3.21 (m, 24H), 1.63-1.60 (m, 4H), 1.32-1.28 (m, 36H), 0.89 (t, J = 7.8 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 164.8, 105.4, 78.1, 78.0, 75.1, 71.5, 70.3, 62.7, 33.2, 30.9, 30.7, 30.6, 30.3, 23.8, 23.5,14.5.
<제조예 22> TTG-A14의 합성
<22-1> 화합물 3f의 합성
실시예 2-1에 따라 화합물 3f를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 5.85 (br, 2H, NH), 3.29-3.41 (m, 4H), 1.53-1.63 (m, 4H), 1.18-1.42 (m, 44H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3):167.8, 165.5, 41.5, 32.7, 31.8, 30.6, 29.9, 29.7, 29.5, 27.8, 23.1, 14.2.
<22-2> 화합물 4f의 합성
실시예 2-2에 따라 화합물 4f를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.78-3.74 (m, 6H), 3.42-3.28 (m, 4H), 1.55-1.39(m, 4H), 1.29-1.25 (m, 44H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.4, 179.2, 162.4, 62.5, 54.2, 32.1, 30.0, 29.9, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 22.6, 14.2.
<22-3> TTG-A14a의 합성
실시예 2-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TTG-A14a를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.08-8.01 (m, 12H), 7.91 (d, J = 7.2 Hz, 6H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz, 6H), 7.71-7.27 (m, 46H), 6.03 (s, 2H), 5.73-5.28 (m, 22H), 4.51-4.47 (m, 18H), 4.03-3.89 (m, 8H), 3.59-3.48 (m, 10H), 3.23-3.12 (m, 4H), 1.60-1.57 (m, 4H), 1.25-1.18 (m, 44H), 0.87 (t, J = 7.4 Hz, 6H), 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 166.1, 165.1, 164.7, 162.5, 133.8, 133.5, 133.3, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.6, 129.1, 128.8, 128.5, 128.4, 101.5, 101.4, 92.7, 72.6, 72.0, 71.8, 69.6, 68.2, 63.2, 59.8, 48.4, 31.9, 31.6, 32.0, 29.7, 29.2, 29.0, 22.9, 14.2.
<22-4>
TTG-A14의 합성
실시예 2-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TTG-A14을 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 4.48 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.34-4.30 (m, 6H), 4.07-4.05 (m, 6H), 3.88-3.85 (m, 4H), 3.72-3.68 (m, 4H), 3.35-3.21 (m, 24H), 1.63-1.60 (m, 4H), 1.31-1.28 (m, 44H), 0.88 (t, J = 7.8 Hz, 6H) 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 164.7, 105.3, 78.1, 78.2, 75.8, 71.4, 70.3, 62.6, 33.2, 30.8, 30.5, 30.2, 23.8, 23.3 14.5.
<실시예 3> TEMs의 합성 방법
TEMs(Triazine-based maltosides with a diethanolamine linker)의 합성 스킴을 도 3에 나타내었다. 하기 <3-1> 내지 <3-4>의 합성 방법에 따라 TEMs의 10종의 화합물을 합성하였다.
<3-1> 2-클로로-4, 6-다이알킬화-1,3,5-트라이아진(2-Chloro-4, 6-dialkylated-1,3,5-triazine)의 일반 합성 절차 (도 1의 단계 i)
2,4,6-트라이클로로-1,3,5-트라이아진 (3.01 mmol) 및 NaHCO3 (7.26 mmol)의 혼합물을 아세톤 (10 mL)에서 10분 동안 교반하였다. 아세톤에 용해된 각 알코올 (ROH / RSH) (6.0 mmol)을 30분 동안 적가 하였다. 생성된 반응 혼합물을 ROH의 경우 36시간 동안 또는 RSH의 경우 1시간 동안 실온에서 유지하였다. 반응 혼합물을 CHCl3과 물로 추출하고 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 용매 제거 후 얻은 유성 잔류물을 컬럼 크로마토 그래피 정제하여 목적 화합물 1 또는 3을 얻었다.
<3-2> 다이에탄올아민(diethanolamine) 및 상기 생성된 다이알킬화 트라이아진 유도체의 커플링 반응의 일반 합성 절차(도 2의 단계 ii)
THF에 용해된 2-클로로-4,6-다이알킬화-1,3,5-트라이아진 (1.0 당량)의 혼합물에 질소 하에서 다이에탄올아민 및 K2CO3를 첨가하였다. 용액을 40 
에서 24시간 동안 교반 하였다. 반응 혼합물을 물로 희석한 다음 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 염수로 세척하고 무수 Na2SO4로 건조시켰다. 에틸 아세테이트 용액을 증발시킨 후, 잔류물을 플래시 컬럼 크로마토 그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 목적 화합물 5 또는 6을 수득하였다.
<3-3> 당화(glycosycosylation)반응 의 일반 합성 절차 (도 2의 단계 iii)
이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat. Methods 2010, 7, 1003.)을 일부 변경하여 사용하였다. 간단히 말해서, 무수 CH2Cl2 (20 mL)에 다이알킬화 다이올 유도체 (화합물 5 또는 6), AgOTf (2.5 당량), 2,4,6-콜리딘 (0.5 당량)의 혼합물을 -45 
에서 교반하였다. 그 후 CH2Cl2 (30 mL) 에 용해된 퍼벤조일화 말토실브로마이드 (2.5 당량)를 0.5시간에 걸쳐 이 현탁액에 적가하였다. 반응은 1.5시간 동안 0 
에서 유지되었다. 반응 진행은 TLC로 모니터링하였다. 반응 완료 후 (TLC에 의해 검출됨), 피리딘 (1.0 mL)을 반응 혼합물에 첨가 하였다. 반응 혼합물을 CH2Cl2 (30 mL)로 희석한 후 셀 라이트로 여과하였다. 여과액을 1.0 M Na2S2O3 수용액 (30 mL), 0.1 M HCl 수용액 (30 mL) 및 염수 (30 mL)로 연속적으로 세척하였다. 그 다음 유기층을 무수 Na2SO4로 건조시키고 용매를 회전 증발로 제거하였다. 생성된 잔류물을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/헥산)로 정제하여 글리코실화된 목적 화합물을 수득하였다.
<3-4> 탈보호기화 반응 (deprotection reaction)을 위한 일반 합성 절차 (도 2의 단계 iv)
이는 Chae, P. S. 등의 합성 방법 (Nat.Methods 2010, 7, 1003.)에 따랐다. Zemplen's 조건하에 데-O-벤조일화(de-O-benzoylation)를 수행하였다. O-protected 화합물을 무수 CH2Cl2로 용해시킨 다음 MeOH를 지속적인 침전이 나타날때까지 천천히 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 0.5 M의 메탄올성 용액(methanolic solution)인 NaOMe를 최종 농도가 0.05 M이 되도록 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 Amberlite IR-120 (H+ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과하여 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 진공 조건(in vacuo)에서 여과물로부터 용매를 제거하였다. 잔여물을 실리카 겔 컬럼크로마토그래피(CH2Cl2/MeOH)를 이용하여 정제하여 목적 화합물을 얻었다.
<제조예 23> TEM-E7의 합성
<23-1> 화합물 1a의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 1a를 48%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.82-1.75 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 16H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<23-2> 화합물 5a의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 5a를 85%의 수득률로 합성하였다. 11 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.29 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.92 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 3.80 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 1.77-1.72 (m, 4H), 1.39-1.26 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.6, 168.2, 67.9, 62.0, 52.4, 32.0, 29.6, 29.4, 28.9, 26.6, 22.8, 14.2.
<23-3> TEM-E7a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-E7a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.52-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.76-5.62 (m, 6H), 5.45-5.2130 (m, 4H), 4.92 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 4.78-4.75 (m, 2H), 4.65-4.56 (m, 4H), 4.47-4.24 (m, 4H), 4.10-4.03 (m, 6H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.58-3.49 (m, 4H), 1.67-1.62 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.3, 166.5, 166.2, 165.8, 165.7, 165.4, 165.1, 161.0, 164.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 100.8, 96.3, 74.9, 72.8, 72.2, 70.8, 69.9, 69.1, 67.3, 63.4, 62.5, 48.8, 31.8, 29.5, 29.4, 29.3, 29.0, 28.7, 25.9, 22.6, 14.1.
<23-4>
TEM-E7의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-E7을 95%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.39-4.35 (m, 6H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.83-3.71 (m, 12H), 3.58-3.42 (m, 10H), 3.37-3.28 (m, 4H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.32-1.18 (m, 16H), 0.78 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 173.2, 172.8, 169.0, 104.9, 104.7, 103.0, 81.3, 81.2, 77.7, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 68.9, 68.7, 62.8, 62.2, 32.0, 33.0, 30.7, 30.5, 30.2, 30.0, 27.1, 27.0, 23.9, 23.7, 14.6, 14.5; HRMS (FAB + ): For C45H80N4O24 [M+Na]+ 1083.5060, found 1083.5058.
<제조예 24> TEM-E8의 합성
<24-1> 화합물 1b의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 1b를 45%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.72 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 20H), 0.86 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<24-2> 화합물 5b의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 5b를 88%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.29 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.90 (t, J = 7.1 Hz, 4H), 3.79 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 1.76-1.73 (m, 4H), 1.40-1.27 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.5, 167.8, 67.8, 61.6, 52.6, 31.9, 29.4, 29.3, 28.8, 26.0, 22.7, 14.1.
<24-3> TEM-E8a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-E8a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.52-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.76-5.62 (m, 6H), 5.45-5.2130 (m, 4H), 4.92 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 4.78-4.75 (m, 2H), 4.65-4.56 (m, 4H), 4.47-4.24 (m, 4H), 4.10-4.03 (m, 6H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.58-3.49 (m, 4H), 1.67-1.62 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.3, 166.5, 166.2, 165.8, 165.7, 165.4, 165.1, 161.0, 164.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 100.8, 96.3, 74.9, 72.8, 72.2, 70.8, 69.9, 69.1, 67.3, 63.4, 62.5, 48.8, 31.8, 29.5, 29.4, 29.3, 29.0, 28.7, 25.9, 22.6, 14.1.
<24-4>
TEM-E8의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-E8을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.39-4.35 (m, 6H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.83-3.71 (m, 12H), 3.58-3.42 (m, 10H), 3.37-3.28 (m, 4H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.32-1.18 (m, 20H), 0.78 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 172.6, 168.2, 104.6, 102.9, 81.2, 77.9, 76.6, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 69.0, 68.7, 62.8, 62.2, 50.0, 49.5, 49.3, 49.1, 48.9, 48.7, 33.0, 30.5, 30.4, 30.0, 27.1, 23.8, 14.6; HRMS (FAB + ): For C47H84N4O24 [M+Na]+ 1111.5373, found 1111.5377.
<제조예 25> TEM-E9의 합성
<25-1> 화합물 1c의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 1c를 50%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.82-1.72 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 24H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<25-2> 화합물 5c의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 5c를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.28 (t, J = 6.7 Hz, 4H), 3.90 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.79 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 1.77-1.72 (m, 4H), 1.39-1.26 (m, 24H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.6, 168.2, 67.9, 62.0, 52.4, 32.0, 29.6, 29.4, 28.9, 26.6, 22.8, 14.2.
<25-3> TEM-E9a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-E9a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.52-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 8.0 Hz, 2H), 5.76-5.62 (m, 6H), 5.45-5.2130 (m, 4H), 4.92 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.78-4.75 (m, 2H), 4.65-4.56 (m, 4H), 4.47-4.24 (m, 6H), 4.10-4.03 (m, 6H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.58-3.49 (m, 4H), 1.67-1.62 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.01, 166.5, 166.2, 165.8, 165.7, 165.4, 165.1, 161.0, 164.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 100.8, 96.3, 74.9, 72.8, 72.2, 70.8, 69.9, 69.1, 68.6, 67.3, 63.4, 62.5, 48.8, 31.9, 31.6, 29.5, 29.4, 29.3, 29.0, 28.7, 25.9, 22.6, 14.2.
<25-4>
TEM-E9의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-E9를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.18 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.35-4.30 (m, 6H), 4.04-3.97 (m, 2H), 3.83-3.71 (m, 12H), 3.58-3.42 (m, 10H), 3.37-3.28 (m, 4H), 1.66-1.59 (m, 4H), 1.32-1.18 (m, 24H), 0.78 (t, J = 7.2 Hz ,6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 172.6, 168.2, 104.6, 102.9, 81.2, 77.6, 75.1, 74.8, 74.6, 74.1, 71.4, 69.0, 68.7, 62.7, 50.0, 49.7, 49.5, 49.3, 48.9, 48.7, 48.5, 33.1, 30.7, 30.5, 30.4, 30.0, 27.1, 23.8, 14.6; HRMS (FAB + ): For C49H88N4O24 [M+Na]+ 1139.5686, found 1139.5682.
<제조예 26> TEM-E10의 합성
<26-1> 화합물 1d의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 1d를 50%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 64.3, 32.0, 29.7, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<26-2> 화합물 5d의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 5d를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.28 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 3.87 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 3.74 (t, J = 7.3 Hz, 4H), 1.77-1.72 (m, 4H), 1.39-1.26 (m, 28H), 0.87 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.6, 167.2, 67.8, 61.7, 52.6, 32.0, 29.6, 29.4, 28.9, 26.6, 22.8, 14.2.
<26-3> TEM-E10a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-E10a를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.52-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.76-5.62 (m, 6H), 5.45-5.21 (m, 4H), 4.92 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.78-4.75 (m, 2H), 4.65-4.56 (m, 4H), 4.47-4.24 (m, 6H), 4.10-4.03 (m, 6H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.58-3.49 (m, 4H), 1.67-1.62 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.0, 166.5, 166.2, 165.8, 165.7, 165.4, 165.1, 161.0, 164.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 100.8, 96.3, 74.9, 72.8, 72.2, 70.8, 69.9, 69.1, 68.6, 67.6, 63.4, 62.5, 48.8, 31.9, 29.6, 29.4, 29.3, 29.0, 28.7, 25.9, 22.7, 14.2.
<26-4>
TEM-E10의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-E10를 95%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.38-4.35 (m, 6H), 3.99-3.96 (m, 2H), 3.82-3.70 (m, 12H), 3.57-3.36 (m, 10H), 3.27-3.14 (m, 4H), 1.63-1.60 (m, 4H), 1.31-1.17 (m, 28H), 0.78 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 172.6, 168.2, 104.6, 102.9, 81.2, 77.8, 76.6, 75.1, 74.8, 74.6, 74.1, 71.4, 69.0, 68.7, 62.7, 62.2, 50.0, 49.7, 49.5, 49.3, 49.1, 48.9, 48.7, 48.5, 33.1, 30.7, 30.5, 30.0, 27.1, 23.8, 14.6; HRMS (FAB + ): For C51H92N4O24 [M+Na]+ 1167.5999, found 1167.6001.
<제조예 27> TEM-E11의 합성
<27-1> 화합물 1e의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 1e를 48%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.41 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.82-1.72 (m, 4H), 1.34-1.27 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 29.6, 29.3, 28.5, 25.8, 22.8, 14.2.
<27-2> 화합물 5e의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 5e를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.28 (m, J = 6.6 Hz, 4H), 3.90 (m, 4H), 3.79 (m, 4H), 1.76-1.72 (m, 4H), 1.39-1.26 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 171.5, 167.8, 67.8, 61.60, 52.6, 32.0, 29.7, 29.6, 29.4, 28.8, 26.0, 22.8, 14.2.
<27-3> TEM-E11a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-E11a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.11 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.4 Hz, 4H), 7.52-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.76-5.62 (m, 6H), 5.45-5.2130 (m, 4H), 4.92 (d, J = 10.4 Hz, 2H), 4.78-4.75 (m, 2H), 4.65-4.56 (m, 4H), 4.47-4.24 (m, 6H), 4.10-4.03 (m, 6H), 3.81-3.78 (m, 2H), 3.58-3.49 (m, 4H), 1.67-1.62 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.4, 166.5, 166.2, 165.8, 165.7, 165.4, 165.1, 161.0, 164.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 100.8, 96.3, 75.01, 72.9, 72.2, 70.9, 70.2, 69.2, 68.7, 67.4, 63.5, 62.5, 48.8, 32.0, 29.7, 29.7, 29.5, 29.4, 28.8, 26.0, 22.8, 14.2.
<27-4>
TEM-E11의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-E11를 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.39-4.34 (m, 6H), 3.99-3.97 (m, 2H), 3.83-3.57 (m, 12H), 3.41-3.26 (m, 10H), 3.20-3.13 (m, 4H), 1.66-1.61 (m, 4H), 1.32-1.18 (m, 32H), 0.79 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 172.7, 168.3, 104.7, 103.0, 81.3, 77.9, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 71.5, 69.0, 68.7, 62.8, 62.2, 50.0, 49.7, 49.5, 49.3, 49.1, 48.9, 48.7, 48.5, 33.2, 30.8, 30.6, 30.0, 27.1, 23.8, 14.6; HRMS (FAB + ): C53H96N4O24 [M+Na]+ 1195.6312, found 1195.6306.
<제조예 28> TEM-T7의 합성
<28-1> 화합물 3a의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 3a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.44-1.30 (m, 16H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<28-2> 화합물 6a의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 6a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.65 (bs, 2H), 3.90-3.88 (m, 4H), 3.78-3.75 (m, 4H), 2.99 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.71-1.67 (m, 4H), 1.42-1.27 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.2, 162.1, 61.3, 52.8, 31.8, 30.1, 29.5, 29.0, 28.9, 22.6, 14.1.
<28-3> TEM-T7a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-T7a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 8.00 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 7.56-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.77-5.66 (m, 4H), 5.41-5.21 (m, 4H), 4.90 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 4.79-4.75 (m, 2H), 4.62-4.46 (m, 4H), 4.47-4.23 (m, 4H), 4.12-4.03 (m, 4H), 3.76 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 3.54-3.45 (m, 4H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H) 1.57-1.53 (m, 4H), 1.29-1.20 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.3, 171.3, 166.5, 166.2, 165.8, 165.7, 165.4, 165.1, 161.0, 164.9, 133.5, 133.4, 133.3, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.2, 128.1, 100.8, 96.3, 74.9, 72.8, 72.2, 70.8, 69.9, 69.1, 67.3, 63.4, 62.5, 48.8, 48.8, 31.8, 29.5, 29.3, 29.0, 28.7, 25.9, 22.6, 14.1.
<28-4>
TEM-T7의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-T7을 90%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.96-3.92 (m, 2H), 3.83-3.79 (m, 4H), 3.75-3.65 (m, 8H), 3.54-3.38 (m, 10H), 3.32-3.22 (m, 4H), 3.15-3.10 (m, 4H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.60-1.53 (m, 4H), 1.31-1.16 (m, 16H), 0.78 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 181.6, 163.8, 104.7, 103.0, 81.4. 81.3, 77.7, 76.7, 75.1, 74.9, 74.7, 74.2, 71.5, 69.4, 62.8, 51.8, 33.1, 31.1, 31.0, 30.9, 30.8, 30.8, 30.1, 23.8, 14.6; HRMS (FAB + ): For C45H80N4O22S2 [M+Na]+ 1115.4603, found 1115.4601.
<제조예 29> TEM-T8의 합성
<29-1> 화합물 3b의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 3b를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.77 (m, 4H), 1.44-1.30 (m, 20H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<29-2> 화합물 6b의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 6b를 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.65 (bs, 2H), 3.92-3.90 (m, 4H), 3.81-3.79 (m, 4H), 3.03 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.71-1.67 (m, 4H), 1.42-1.27 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.8, 162.9, 62.0, 52.3, 32.0, 30.3, 29.6, 29.4, 29.1, 28.9, 22.6, 14.1.
<29-3> TEM-T8a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-T8a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 8.00 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 7.56-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.77-5.66 (m, 4H), 5.41-5.21 (m, 4H), 4.90 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 4.79-4.75 (m, 2H), 4.62-4.46 (m, 4H), 4.47-4.23 (m, 4H), 4.12-4.03 (m, 4H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.54-3.45 (m, 4H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H) 1.57-1.53 (m, 4H), 1.29-1.20 (m, 20H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.8, 166.2, 165.9, 165.8, 165.5, 165.1, 164.8, 162.0, 134.0, 133.7, 133.4, 133.3, 130.1, 130.0, 129.9, 129.7, 129.5, 129.4, 129.2, 128.9, 128.7, 128.5, 128.3, 101.0, 95.6, 71.9, 71.3, 69.8, 69.1, 68.9, 63.2, 62.5, 32.0, 30.3, 29.7, 29.5, 29.3, 28.9, 22.7, 14.2.
<29-4>
TEM-T8의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-T8을 94%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.33 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.96-3.92 (m, 2H), 3.82-3.80 (m, 4H), 3.74-3.68 (m, 8H), 3.57-3.39 (m, 10H), 3.27-3.24 (m, 4H), 3.15-3.11 (m, 4H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.59-1.52 (m, 4H), 1.30-1.15 (m, 20H), 0.77 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 180.6, 163.0, 104.7, 103.0, 81.3, 77.9, 76.7, 75.2, 74.9, 74.8, 74.2, 71.5, 69.1, 62.8, 62.2, 33.1, 31.0, 30.5, 30.2, 23.8, 14.6; HRMS (FAB + ): For C47H84N4O22S2 [M+Na]+ 1143.4916, found 1143.4923. found 1129.4757.
<제조예 30> TEM-T9의 합성
<30-1> 화합물 3c의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 3c를 86%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 24H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<30-2> 화합물 6c의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 6c를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.65 (bs, 2H), 3.92-3.90 (m, 4H), 3.81-3.79 (m, 4H), 3.03 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.71-1.67 (m, 4H), 1.42-1.27 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.2, 162.1, 61.3, 52.8, 31.8, 30.1, 29.5, 29.2, 29.0, 28.9, 22.6, 14.1.
<30-3> TEM-T9a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-T9a를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 8.00 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.8 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.6 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 7.56-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.77-5.66 (m, 4H), 5.41-5.21 (m, 4H), 4.90 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 4.79-4.75 (m, 2H), 4.62-4.46 (m, 4H), 4.47-4.23 (m, 4H), 4.12-4.03 (m, 4H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.54-3.45 (m, 4H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H) 1.57-1.53 (m, 4H), 1.29-1.20 (m, 24H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.8, 166.2, 165.9, 165.8, 165.5, 165.1, 164.8, 162.0, 134.0, 133.7, 133.4, 133.3, 130.1, 130.0, 129.9, 129.7, 129.5, 129.4, 129.2, 128.9, 128.7, 128.5, 128.3, 101.0, 95.6, 71.9, 71.3, 69.8, 69.1, 68.9, 63.2, 62.5, 32.0, 30.3, 29.7, 29.5, 29.3, 28.9, 22.7, 14.2.
<30-4>
TEM-T9의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-T9를 94%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.16 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.95-3.91 (m, 2H), 3.82-3.79 (m, 4H), 3.75-3.65 (m, 8H), 3.54-3.38 (m, 10H), 3.32-3.22 (m, 4H), 3.15-3.10 (m, 4H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.59-1.52 (m, 4H), 1.30-1.15 (m, 24H), 0.76 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 180.4, 162.9, 104.7, 103.0, 81.3, 77.9, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 72.5, 69.1, 62.8, 62.2, 33.2, 31.1, 31.0, 30.8, 30.5, 30.1, 14.6; HRMS (FAB + ): For C49H88N4O22S2 [M+Na]+ 1171.5229, found 1171.5233.
<제조예 31> TEM-T10의 합성
<31-1> 화합물 3d의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 3d를 83%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.6 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 28H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 64.3, 32.0, 29.7, 29.6, 29.4, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2.
<31-2> 화합물 6d의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 6d를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.92-3.90 (m, 4H), 3.80-3.78 (m, 4H), 3.02 (t, J = 8.0 Hz, 4H), 1.70-1.67 (m, 4H), 1.42-1.27 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.2, 162.9, 52.4, 34.2, 32.1, 30.3, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.2, 29.1, 22.8, 14.3.
<31-3> TEM-T10a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-T10a를 80%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 8.00 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 7.56-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.77-5.66 (m, 4H), 5.41-5.21 (m, 4H), 4.90 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 4.79-4.75 (m, 2H), 4.62-4.46 (m, 4H), 4.47-4.23 (m, 4H), 4.12-4.03 (m, 4H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.54-3.45 (m, 4H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H) 1.57-1.53 (m, 4H), 1.29-1.20 (m, 28H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 180.5, 179.8, 166.2, 166.1, 165.9, 165.5, 165.1, 164.9, 162.1, 134.1, 133.7, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.8, 129.7, 129.5, 129.4, 129.3, 129.0, 128.9, 128.7, 128.5, 128.4, 101.0, 95.6, 75.5, 71.9, 71.3, 69.8, 69.1, 69.0, 63.2, 62.6, 32.0, 30.3, 30.1, 29.7, 29.4, 29.3, 28.9, 22.8, 14.2.
<31-4>
TEM-T10의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-T10을 95%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.35 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.95-3.91(m, 2H), 3.82-3.79 (m, 4H), 3.75-3.65 (m, 8H), 3.54-3.38 (m, 10H), 3.32-3.22 (m, 4H), 3.15-3.10 (m, 4H), 2.91 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.59-1.52 (m, 4H), 1.30-1.15 (m, 28H), 0.76 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 180.4, 163.2, 104.9 104.7, 103.0, 81.4, 81.3, 77.7, 76.7, 75.1, 74.9, 74.7, 74.2, 71.5, 62.8, 62.2, 33.2, 31.1, 31.0, 30.8, 30.6, 30.5, 30.1, 23.9 14.6; HRMS (FAB + ): For C51H92N4O22S2 [M+Na]+ 1199.5542, found 1199.5549.
<제조예 32> TEM-T11의 합성
<32-1> 화합물 3e의 합성
실시예 3-1에 따라 화합물 3e를 82%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.42 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 1.81-1.78 (m, 4H), 1.43-1.30 (m, 32H), 0.89 (t, J = 6.9 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 172.7, 172.2, 69.6, 32.0, 29.7, 29.6, 29.6, 29.3, 28.5, 25.8, 22.8, 14.2.
<32-2> 화합물 6e의 합성
실시예 3-2에 따라 화합물 6e를 84%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 4.62 (bs, 2H), 3.92-3.88 (m, 4H), 3.78-3.75 (m, 4H), 2.99 (t, J = 7.4 Hz, 4H), 1.71-1.67 (m, 4H), 1.42-1.27 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.6, 162.6, 61.8, 52.6, 34.2, 32.1, 30.3, 29.8, 29.7, 29.6, 29.5, 29.2, 29.1, 28.5, 24.8, 22.6, 14.1.
<32-3> TEM-T11a의 합성
실시예 3-3의 일반적인 당화 반응 절차에 따라 TEM-T11a를 85%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.12 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 8.00 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.82 (d, J = 7.2 Hz, 4H), 7.79-7.73 (m, 12H), 7.61 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 7.56-7.12 (m, 42H), 6.11 (t, J = 10.0 Hz, 2H), 5.77-5.66 (m, 4H), 5.41-5.21 (m, 4H), 4.90 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 4.79-4.75 (m, 2H), 4.62-4.46 (m, 4H), 4.47-4.23 (m, 4H), 4.12-4.03 (m, 4H), 3.76 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.54-3.45 (m, 4H), 2.78 (t, J = 7.2 Hz, 2H) 1.57-1.53 (m, 4H), 1.29-1.20 (m, 32H), 0.88 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 179.0, 171.1, 166.1, 165.8, 165.6, 165.4. 165.1, 165.0, 164.9, 161.2, 149.4, 133.4, 133.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.3, 129.0, 128.9, 128.7, 128.6, 128.5, 128.4. 128.2. 128.1, 100.8, 96.3, 72.8, 72.7, 72.2, 69.9, 69.0, 68.3, 63.4, 62.5, 60.4, 53.5, 48.7, 31.9, 31.6, 30.0, 29.6, 29.4, 29.3, 29.0, 22.7, 21.0, 14.2.
<32-4>
TEM-T11의 합성
실시예 3-4의 탈보호기화 반응을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 TEM-T11을 92%의 수득률로 합성하였다. 1 H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 5.17 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 4.34 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 3.96-3.92 (m, 2H), 3.80-3.67 (m, 4H), 3.75-3.65 (m, 8H), 3.51-3.31 (m, 10H), 3.26-3.25 (m, 4H), 3.13-3.10 (m, 4H), 2.90 (t, J = 7.2 Hz, 4H), 1.59-1.52 (m, 4H), 1.27-1.15 (m, 32H), 0.78 (t, J = 7.0 Hz, 6H); 13 C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 180.5, 163.0, 104.6, 103.0, 81.3, 77.9, 76.7, 75.1, 74.8, 74.7, 74.2, 72.5, 69.1, 62.8, 62.2, 33.2, 31.1, 31.0, 30.9, 30.8, 30.6, 30.5, 30.2, 23.9, 14.6; HRMS (FAB + ): For C53H96N4O22S2 [M+Na]+ 1227.5855, found 1227.5847.
<실험예 1> TSMs, TTGs 및 TEMs의 특성
상기 실시예 1 내지 3의 합성 방법에 따라 합성된 TSMs, TTGs 및 TEMs의 특성을 확인하기 위하여, TSMs, TTGs 및 TEMs의 분자량 (M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R h)을 측정하였다.
구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제(1.0 wt%)에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.
| detergent | MWa | CMC (mM) | R h b(nm) | solubility |
| TSM-E7 | 1047.1 | ~0.04 | 3.4±0.1 | ~10% |
| TSM-E8 | 1075.2 | ~0.02 | 3.6±0.1 | ~10% |
| TSM-E9 | 1103.2 | ~0.01 | 4.0±0.1 | ~10% |
| TSM-E10 | 1131.3 | ~0.004 | 8.7±0.7 | ~5% |
| TSM-E11 | 1159.3 | ~0.002 | 56.2±9.9 | ~1% |
| TSM-T7 | 1079.2 | ~0.01 | 3.6±0.1 | ~10% |
| TSM-T8 | 1107.3 | ~0.006 | 4.2±0.0 | ~10% |
| TSM-T9 | 1135.3 | ~0.004 | 5.1±0.1 | ~10% |
| TSM-T10 | 1163.4 | ~0.003 | 38.2±1.8 | ~5% |
| TSM-T11 | 1191.5 | ~0.001 | 94.8±45 | ~1% |
| TEM-E7 | 1093.3 | ~0.03 | 3.3±.0 | ~10% |
| TEM -E8 | 1121.3 | ~0.02 | 3.4±0.1 | ~10% |
| TEM -E9 | 1149.4 | ~0.009 | 3.9±0.1 | ~10% |
| TEM -E10 | 1177.4 | ~0.005 | 4.5±0.1 | ~5% |
| TEM -E11 | 1205.5 | ~0.001 | 25.2±1.2 | ~1% |
| TEM -T7 | 1125.4 | ~0.008 | 3.5±0.0 | ~10% |
| TEM -T8 | 1153.4 | ~0.004 | 3.6±0.0 | ~10% |
| TEM -T9 | 1181.5 | ~0.003 | 4.0±0.1 | ~10% |
| TEM -T10 | 1209.5 | ~0.0025 | 4.3±0.0 | ~5% |
| TEM -T11 | 1237.6 | ~0.001 | 31.8±0.3 | ~1% |
| TTG-T7 | 947.11 | ~0.02 | 2.8±0.16 | ~10% |
| TTG-T8 | 975.17 | ~0.015 | 2.9±0.09 | ~10% |
| TTG-T9 | 1003.22 | ~0.010 | 3.3±0.11 | ~10% |
| TTG-T10 | 1031.28 | ~0.006 | 3.6±0.10 | ~10% |
| TTG-T11 | 1059.33 | ~0.004 | 3.7±0.09 | ~10% |
| TTG-T12 | 1087.38 | ~0.0035 | 5.5±0.20 | ~5% |
| TTG-A8 | 941.08 | ~0.6 | 2.1±0.56 | ~10% |
| TTG-A9 | 969.17 | ~0.5 | 2.2±0.20 | ~10% |
| TTG-A10 | 997.19 | ~0.3 | 2.3±0.14 | ~10% |
| TTG-A11 | 1025.25 | ~0.2 | 2.4±0.11 | ~10% |
| TTG-A12 | 1053.30 | ~0.04 | 2.5±0.07 | ~5% |
| TTG-A14 | 1109.41 | ~0.008 | 3.2±0.05 | ~1% |
| TTG-10,10 | 1031.28 | ~0.005 | 3.6±0.01 | ~10% |
| TTG-9,11 | 1031.28 | ~0.004 | 3.7±0.07 | ~10% |
| TTG-8,12 | 1031.28 | ~0.003 | 3.6±0.07 | ~10% |
| TTG-6,14 | 1031.28 | ~0.002 | 3.6±0.04 | ~10% |
| TTG-4,16 | 1031.28 | ~0.001 | 3.6±0.03 | ~10% |
| TTG-11,11 | 1059.34 | ~0.004 | 3.7±0.09 | ~10% |
| TTG-10,12 | 1059.34 | ~0.003 | 3.6±0.06 | ~10% |
| TTG-8,14 | 1059.34 | ~0.003 | 2.6±0.02 | ~10% |
| TTG-6,16 | 1059.34 | ~0.002 | 4.0±0.04 | ~10% |
| DDM | 510.62 | ~0.17 | 3.4±0.03 | ~10% |
일부 TTG-As 화합물을 제외한 대부분의 TSMs, TTGs 및 TEMs의 CMC 값 (0.001 내지 0.6 mM)은 DDM의 CMC 값 (0.17 mM)과 비교하여 상당히 작았다. 따라서, TSMs, TTGs 및 TEMs는 낮은 농도에서도 미셀이 용이하게 형성되므로, 이는 자체 조립 경향이 더 높음을 나타낸다. 또한, TSMs, TTGs 및 TEMs의 CMC 값은 알킬 사슬의 길이가 증가함에 따라 감소하였는데, 이는 알킬 사슬 길이의 연장에 따라 소수성이 증가하기 때문인 것으로 판단된다. 또한, 싸이오에터를 포함하는 화합물 (TSM-Ts TTG-Ts 및 TEM-Ts)이 에터를 포함하는 화합물(TSM-Es 및 TEM-Es)보다 CMC 값이 낮았는데 이는 싸이오에터가 에터보다 더 높은 소수성을 나타내기 때문인 것으로 판단된다. TSMs, TTGs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기는 대체적으로 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 증가하는 경향을 보였다. 이는 알킬 사슬 길이가 증가함에따라 양친매성 분자의 기하구조가 원추형에서 원통형으로 변함에 따른 것이다. TTGs가 대체적으로 TEMs 및 TSMs 보다 작은 미셀을 형성함을 확인하였다.
한편, DLS를 통해 TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 조사한 결과, 수 및 부피 가중 크기 분포에서는 모두 단일 군집을 형성하여 높은 균질성을 나타내었다(도 4 및 도 5).
이러한 결과로부터 본 발명의 TSMs 및 TEMs는 DDM보다 낮은 CMC 값을 가져 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로 자가조립경향성이 DDM 보다 훨씬 크다는 점, TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀의 크기는 링커의 구조 및 링커를 구성하는 원자(산소 또는 황)의 종류에 따라 차이가 있다는 점, TSMs 및 TEMs에 의해 형성된 미셀은 균질성이 높다는 점을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> TSMs, TTGs 및 TEMs의 LeuT 막단백질 구조 안정화 능력 평가
TSMs, TTGs 및 TEMs에 의한 LeuT 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 각각의 양친매성 화합물은 (a) CMC + 0.04 wt% 또는 (b) CMC + 0.2 wt% 농도로 사용하였으며, LeuT의 기질 결합 특성을 [3H]-Leu를 사용하여 SPA(scintillation proximity assay)를 통해 측정하였다. 측정은 각각 실온에서 13일 및 12일간 인큐베이션 기간 동안 규칙적인 간격으로 수행하였다.
구체적으로, 호열성 박테리아 아퀴펙스 아에오리쿠스(Aquifex aeolicus) 유래 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)를 이전에 설명된 방법에 의해 정제하였다 (G. Deckert 등의 Nature 1998, 392, 353-358). LeuT를 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41 (DE3)에서 발현시켰다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA로부터 제공받음). 요약하면, 박테리아 멤브레인의 분리 및 1 중량% DDM에서 용해화 후에, 단백질을 Ni2+-NTA 수지 (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05%(w/v) DDM 및 300 mM 이미다졸(imidazole)에서 용리하였다. 그 후에, 정제된 LeuT (0.5 mg/ml)는 상기와 동등한 버퍼에서 DDM 및 이미다졸을 제외하고, TSMs, TTGs, TEMs 또는 DDM이 최종 농도 CMC + 0.04% (w/v) 또는 CMC + 0.2% (w/v)로 보충된 버퍼로 희석하였다. 단백질 샘플은 실온에서 13일간 인큐베이션하고, 지정된 시간에 원심분리하고, 단백질 특성을 SPA를 사용하여 [3H]-Leucine 결합 능력을 측정함에 의하여 확인하였다. SPA는 450 mM NaCl 및 각각의 TSMs, TEMs (또는 DDM)을 함유하는 버퍼에서 각각의 단백질 샘플 5 μL로 수행하였다. SPA 반응은 20 nM [3H]-Leucine 및 1.25 mg/ml copper chelate (His-Tag) YSi beads (Perkin Elmer, Denmark)의 존재하에 수행하였다. 각각의 샘플에 대한 전체 [3H]-Leucine 결합도는 MicroBeta liquid scintillation counter (Perkin Elmer)를 사용하여 측정하였다.
도 6 내지 도 8에 나타난 바와 같이, 모든 TSMs, TTGs 및 TEMs는 13일 인큐베이션 기간 동안 LeuT의 기질 결합 특성을 유지하는 효과가 DDM 보다 우수하였다. 즉, 대부분의 TSMs, TTGs 및 TEMs는 높은 화합물 농도에서도 오랜 기간 동안 트랜스포터 기질 결합 특성을 완전히 보유하였다. 반면 DDM은 초기 활성은 높지만 시간이 지남에 따라 기질 결합 능력이 급격히 감소함을 확인하였다. 특히, 중간 알킬 사슬 길이를 갖는 화합물(TSM-E8/T9/T10, TTG-T10/T11/T12 및 TEM-E10/T8/T9/T10)에서 가장 우수한 기질 결합 활성을 확인한 반면에, 알킬 사슬 길이가 짧은 화합물은 장기 안정성 면에서는 우수하였다. 또한, TEMs이 TSMs, TTGs 보다 전반적으로 LeuT 안정성 유지에 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
CMC+0.2 wt%에서는 대부분의 TSMs, TTGs 및 TEMs이 DDM과 비교하여 초기활성은 낮았지만, 초기 활성을 장기적으로 유지하는데는 효과적임을 확인하였고, 일정 시간이 지난 후 DDM 보다 우수한 활성을 나타내었다.
이러한 결과는 전체적인 TSMs 및 TEMs의 구조 링커의 종류(세리놀 또는 다이에탄올아민) 및 알킬 사슬의 길이가 LeuT 구조적 안정성 유지에 중요한 요소로 작용했음을 암시한다.
<실험예 3> TSMs, TTGs 및 TEMs의 MelB 막단백질 구조 안정화 능력 평가
TSMs, TTGs 및 TEMs에 의한 MelBSt(Salmonella typhimurium melibiose permease) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. MelB 단백질을 TSMs, TTGs, TEMs 또는 DDM을 사용하여 멤브레인에서 추출 후, 추출된 단백질의 양과 그 구조를 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)을 통해 분석하였다. 사용한 양친매성 화합물의 농도는 1.5 wt%이며, 0℃에서 90분 동안 단백질을 추출한 다음 추출 단백질을 3개의 높은 온도(45, 55, 및 65℃)에서 추가적으로 90분 동안 인큐베이션하였다. 추출한 단백질과 열적 처리를 마친 단백질 수용액에서 용해된 상태로 남아있는 단백질의 양을 측정함으로서 화합물의 단백질 추출 효율과 안정화 능력 두 가지 성능을 동시에 평가하고자 하였다. 각각의 양친매성 분자에 의해 추출 및 안정화된 단백질의 양은 양친매성 분자를 처리하지 않은 멤브레인 샘플에 들어 있는 전체 단백질의 양에 상대적인 값 (%)으로 나타내었다.
구체적으로, 플라스미드 pK95βAHB/WT MelBSt/CH10를 사용하여 C-말단에 10-His tag를 가지는 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) MelBSt (melibiose permease)를 E. coli DW2 세포 (βmelB 및 βlacZY)에서 발현하였다. A. S. Ethayathulla 등의 논문(Nat. Commun. 2014, 5, 3009)에 기재된 방법에 따라 세포 성장 및 멤브레인 준비를 수행했다. 단백질 검정은 Micro BCA 키트 (Thermo Scientific, Rockford, IL)로 수행했다. P. S. Chae 등의 Nat. Methods 2010, 7, 1003-1008에 기재된 프로토콜을 사용하여 MelBSt 안정성에 대해 TSMs, TEMs 또는 DDM을 평가하였다. MelBSt를 함유하는 멤브레인 샘플 (최종 단백질 농도는 10 mg/mL)을 1.5% (w/v) DDM, TSMs, TTGs 또는 TEMs를 함유하는 용해화 버퍼 (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM melibiose)에 90분 동안 4개의 온도 (0, 45, 55, 65℃)에서 인큐베이션하였다. 불용성 물질을 제거하기 위하여, 45분 동안 4℃에서 TLA-100 rotor가 구비된 Beckman Optima? MAX 초원심분리기로 355,590g에서 초원심분리를 수행하였다. 용해된 부분은 SDS-16% PAGE에 의해 분리하고, 그 다음 HisProbe-HRP 항체(Thermo Scientific)로 면역블로팅했다. 처리 없이 20 ㎍의 단백질을 함유하는 멤브레인 분획은 전체 MelB를 나타내기 위해 사용하였고, 처리된 샘플은 동등 부피로 각각의 웰에 로딩하였다. MelBSt는 SuperSignal West Pico chemiluminescent 기질을 이용해 ImageQuant LAS 4000 Biomolecular Imager (GE Health Care Lifer Science)에 의해 측정했다.
도 9 내지 도 11에 나타난 결과와 같이, 0℃에서 DDM은 TEM-E8을 제외한 모든 TEMs, TTGs 및 TSMs와 비교하여 높은 MelB 단백질 추출 효율을 보여주었다.
그러나, 온도를 45℃로 올렸을 때, DDM은 MelB 단백질 가용화 능력이 떨어지는 반면에 모든 TEMs은 0℃와 비교하여 MelB 단백질 가용화 능력이 증가함을 확인할 있고, TEMs(E7/E8/E9/T7/T8/T9)는 DDM보다 우수한 단백질의 가용화 상태를 유지하는 능력을 나타내었다. TSMs의 경우에는 TEMs 마찬가지로 45℃에서 MelB 단백질 가용화 효율이 0℃와 비교하여 증가하였으나, DDM 보다는 떨어졌다. TTGs는 0℃와 비교하여 MelB 단백질 가용화 능력이 증가함을 확인할 수 있고, TTGs(T9/T10)는 DDM보다 우수한 단백질의 가용화 상태를 유지하는 능력을 나타내었다.
온도를 55℃로 올렸을 때, DDM은 현저하게 단백질 가용화 능력이 떨어졌지만 대부분의 TEMs, TTGs 및 TSMs는 DDM보다 우수한 MelB 단백질 가용화 상태 유지 능력을 나타내었다. 온도가 65℃에서는 TEMs, TTGs, TSMs 및 DDM 모두 가용화된 MelB 단백질이 확인되지 않았다.
전체적으로 낮은 온도 (0℃)에서는 DDM이 TEMs, TTGs 및 TSMs보다 높은 단백질 추출 효율을 보여준 반면 온도가 높아질수록(45℃ 및 55℃) TEMs, TTGs 및 TSMs에 의해 가용된 MelB 단백질량이 DDM보다 더 증가함을 확인할 수 있는 바, 단백질 추출 효율은 DDM이 우수하지만 단백질의 가용화 상태를 유지하는 능력 즉 단백질 안정화 능력은 TEMs, TTGs 및 TSMs이 더 우수함을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> TSMs, TTGs 및 TEMs의 β 2 AR 막단백질 구조 안정화 능력 평가
TSMs, TTGs 및 TEMs에 의한 인간 β2 아드레날린성 수용체 (β2AR), G-단백질 연결 수용체(GPCR) 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. 즉, DDM으로 정제된 수용체는 CHS (cholesteryl hemisuccinate) 없이 각각의 TSMs, TTGs 및 TEMs만을 함유하는 버퍼 용액 또는 CHS와 DDM을 함유하는 버퍼 용액으로 희석시켰 양친매성 분자 교환을 수행하였다. 양친매성 분자의 최종 농도는 CMC+0.2 wt%이었으며, 수용체의 리간드 결합 특성은 [3H]-디하이드로알프레놀올 ([3H]-DHA)의 결합에 의해 측정하였다.
구체적으로, 방사성 리간드 결합 시험은 다음과 같은 방법을 이용하였다. β2AR는 0.1% DDM을 사용하여 정제하였으며 (D. M. Rosenbaum 등, Science, 2007, 318, 1266-1273.), 약 10 mg/ml (약 200 μM)로 최종 농축하였다. DDM으로 정제된 β2AR를 사용하여 0.2% 양친매성 화합물 (DDM, TSMs, TTGs 또는 TEMs)에서 0.5 mg/ml BSA로 보충된 10 nM [3H]-Dihydroalprenolol (DHA)를 함유하는 마스터 결합 혼합물을 제조하였다. DDM, TSMs, TTGs 또는 TEMs로 정제된 수용체는 실온에서 6일간 10 nM의 [3H]-DHA와 함께 인큐베이션하였다. 혼합물을 G-50 컬럼에 로딩하고, 통과액을 1 ml 바인딩 버퍼 (0.5 mg/ml BSA 및 20xCMC 각각의 양친매성 화합물로 보충된 20 mM HEPES pH 7.5, 100 mM NaCl)로 수집하고, 그리고 15 ml 섬광 유체(scintillation fluid)로 채웠다. 수용체-결합된 [3H]-DHA는 섬광 카운터 (Beckman)로 측정했다. [3H]-DHA의 결합도는 컬럼 그래프로 나타내었다.
도 12 내지 도 14에 나타난 바와 같이, 양친매성 분자 교환 직후 수용체의 리간드 결합 특성에 있어서, 대부분의 TSMs, TTGs 및 TEMs는 DDM과 비교하여 유사하거나 우수하였다(도 12 및 도 14a).
또한, 상기 결과 효과가 우수한 TSMs(E10/E11/T7/T8/T9), TTGs(T9/T10/T11/T12) 및 TEMs(T8/T9)에 대하여 장기간 수용체의 리간드 결합 유지 특성을 확인하는 시험을 수행하였다. 구체적으로 TSMs(E10/E11/T7/T8/T9), TTGs(T9/T10/T11/T12), TEMs(T8/T9) 또는 DDM에 용해된 수용체에 대한 리간드 결합 특성을 상온에서 6일 동안 인큐베이션하면서 규칙적인 간격으로 모니터링하였고 그 결과는 도 13 및 도 14b에 나타내었다. 그 결과, TSMs(E10/E11/T7/T8/T9), TTGs(T9/T10/T11/T12) 및 TEMs(T8/T9)은 DDM 보다 수용체의 리간드 결합 능력을 장기간 유지하는데 더 우수하였다..
<실험예 5> TSMs 및 TEMs의 AtBOR1 단백질 안정화 능력
형광 크기 배제 크로마토 그래피 (FSEC) : Arabidopsis thaliana의 BOR1은 Saccharomyces cerevisiae FGY217 세포에서 C-말단 GFP 태그가 있는 융합 단백질로 발현되었다. 세포는 0.1% 글로코스가 보충된 URA 배지에서 성장되었다. 2% 갈락토스를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 다음 앞서 설명한 대로 20°C에서 18시간 동안 배양하였다. 세포를 수확하여 멤브레인을 제조하는데 사용하였다. BOR1-GFP 융합 단백질을 포함하는 멤브레인을 다음과 같이 희석하였다. 1% DDM 또는 1% 개별 TSM (TSM-E9/E10/T8/T9) 및 TEM (TEM-E9/E10/T8/T9)이 보충된 PBS (pH 7.4)로 최종 총 단백질 농도가 2.8mg/ml-1이 되도록 희석하였다. 샘플을 25°C에서 1시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양한 다음 불용성 물질을 4°C에서 1 시간 동안 14,000g에서 원심 분리하여 제거하였다. 가용화된 단백질 샘플을 포함하는 상청액을 47°C에서 10분 동안 가열하였다. 큰 응집체를 제거하기 위한 추가 원심 분리 후, 샘플의 200μl 분취량을 20mM Tris (pH 7.5), 150mM NaCl 및 0.03 % DDM으로 평형화된 Superose 6 10/300 컬럼에 주입하였다. 각 분획의 GFP 형광은 470 nm의 여기 파장과 512 nm의 방출 파장을 사용하여 판독하였다.
CPM 분석 : AtBOR1을 100kDa MWCO 원심 분리 필터가 있는 완충액 (20mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 0.03 % DDM)에서 10mg/ml로 농축하고 -80°C 에서 보관하고 열 안정성 분석 직전에 해동하였다. 분석 용액은 CMC+0.04 또는 CMC+0.2 wt%의 각 세제(TSM-E9/E10/T8/T9 및 TEM-E9/E10/T8/T9), 20mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl 및 1μL AtBOR1로 최종 부피가 150 μL 가 되도록 96-웰 플레이트에서 제조되었다. 7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-Methylcoumarin (CPM) 염료 (Invitrogen)를 DMSO에 4mg/ml로 용해시키고 완충액 (20mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.03% DDM이 보충된 150mM NaCl)으로 1:100으로 희석하였다. 3μL의 CPM 염료를 어두운 곳에서 각 웰에 첨가한 다음 플레이트를 투명한 뚜껑으로 덮고 40°C에서 120분 동안 배양하였다. 전이 파장이 387nm이고 방출 파장이 463nm 인 SpectraMax M2 (Molecular Devices)를 사용하여 5분마다 형광 방출을 모니터링하였다. 상대적으로 폴딩이 풀린 단백질의 백분율을 계산하기 위해 형광 판독값을 가장 불안정한 조건으로 정규화하였다. 데이터는 GraphPad Prism 6을 사용하여 단일 지수 붕괴 곡선으로 분석되었다.
선택된 양친매성 분자를 CMC+0.04 wt %에서 테스트했을 때, 폴딩 상태로 AtBOR1을 보존하는 능력에 있어서, 모든 화합물이 DDM보다 훨씬 우수했으며, 특히TEM-E10에서 가장 우수한 성능이 관찰되었다(도 15a, 15b). 또한, CMCs+0.2wt%의 증가된 양친매성 분자 농도에서도 유사한 결과를 확인하였다(도 16). DDM 또는 TEMs(TEM-E9/E10/T8/T9)에 대하여 형광 크기 배제 크로마토 그래피 (FSEC)를 사용하여 추가로 평가한 결과, DDM로 가용화된 단백질은 단백질 응집에 기인한 피크 (분획 번호 2)의 큰 증가와 함께 원래의 균일한단백질 피크 (분획 번호 35)에서 상당한 감소를 보여주었다(도 15c). 대조적으로, 테스트된 모든 TEMs는 동일한 조건에서 응집에 의한 피크가 크게 줄어들었고 원래 단백질 피크의 감소량도 크게 줄어들어 단백질의 초기상태를 유지하는데 매우 효과적이었다(도 15c, 15d). 이 결과는 본 발명의 화합물은 DDM과 비교하여 AtBOR1 추출에서 덜 효율적이지만 열적 안정화에서 DDM보다 우수하다는 것을 나타낸다.
<실험예 6> MOR 열안정성 테스트
DMSO (3mg/ml)에 용해된 N-[4-(7-다이에틸아미노-4-메틸-3-쿠마린일)페닐]말레이마이드(CPM) 염료를 20mM HEPES pH 7.5 및 150mM NaCl을 포함하는 버퍼에서 40x 희석하였다. DDM(0.05%)/CHS(0.005%)에 용해된 μ-오피오이드 수용체(μ-opioid receptor)(~ 4 μM)를 250L의 1.0% 화합물(TSM-E9/E10/T8/T9 및 TEM-E9/E10/T8/T9) 용액과 함께 배양하였다. 실온에서 1시간 후, 수용체 용액을 20mM HEPES pH 7.5, 150mM NaCl에서 2x 희석하여 0.5 중량%의 최종 화합물 농도로 제조하였다. 희석된 5L CPM 염료를 첨가한 다음 각 온도에서 2분 배양하면서 20℃에서 65℃까지 5℃마다 형광 스펙트럼 (여기 387 nm)을 기록하여 서로 다른 화합물의 수용체 안정성을 측정하였다. 녹는점(Tm)은 470 nm에서 판독 값을 플로팅하고 GraphPad Prism을 사용하여 비선형 회귀 곡선을 피팅하여 계산되었다.
그 결과, DDM/CHS에 용해된 수용체는 31.6℃의 낮은 녹는점를 나타냈다(도 17). 대조적으로, 테스트된 모든 TSM/TEM은 DDM보다 더 높은 녹는점을 나타냈다. 테스트된 화합물 중 가장 효과가 적은 TEM-T8도 DDM보다 4.3℃ 높은 35.9℃의 녹는점을 나타냈다. TEM-E10 및 TSM-E10은 각각 48.0 및 48.9℃로 가장 높은 녹는점을 나타내었고, 이 수치는 다수의 GPCR의 구조 결정에 상당히 기여한 최적화된 신규 화합물인 LMNG(38.3℃)보다 높은 수치이다.
Claims (20)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]
화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C30의 알킬기이고;
E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며;
Z는 직접결합 또는 NH이고;
Y는 CH 또는 N이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-5의 알킬렌기이고;
X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소와 연결된 당류(saccharide)이며; 및
상기 Y가 CH일 때,
상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되거나 비치환될 수 있고, 여기서 상기 L3은 C1-5의 알킬렌기이며, 및 상기 X3은 산소와 연결된 당류이다.
- 제 1항에 있어서, 상기 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)인 화합물.
- 제 1항에 있어서, 상기 당류는 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
- 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 CH이고; 및 Z는 NH인 화합물.
- 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 글루코스이며; Z는 NH이고; 및 Y는 CH이며, 여기서 상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되고, 상기 L3은 C1-3의 알킬렌기이며, 상기 X3은 글루코스인 화합물.
- 제 1항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 N이고; 및 Z는 직접결합인 화합물.
- 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 2 내지 8 중 하나로 표시되는 것인 화합물:
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
상기 식에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C5-C20의 알킬기이다.
- 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
- 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.0001 내지 1 mM인 화합물 또는 이의 이성질체.
- 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출용 조성물.
- 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 용해화용 조성물.
- 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 안정화용 조성물.
- 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 결정화용 조성물.
- 제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 분석용 조성물.
- 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
- 제 10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 막단백질은 LeuT (Leucine transporter), β2AR (human β2 adrenergic receptor), MelB (Melibiose permease), BOR1(boron transporter 1), MOR(mouse μ-opioid receptor) 또는 이들의 2 이상의 조합인 조성물.
- 1) 2, 4, 6-트라이클로로-1, 3, 5-트라이아진에 알킬아민, 알코올 또는 싸이올을 반응시켜 알킬기를 도입하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 적어도 2개 이상의 하이드록시알킬로 치환된 아민 또는 적어도 2개 이상의 하이드록시알킬로 치환된 알킬아민을 반응시켜 하이드록시 말단을 도입하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하는 단계;를 포함하는, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]
화학식 1에서,
R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C30의 알킬기이고;
E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며;
Z는 직접결합 또는 NH이고;
Y는 CH 또는 N이며;
L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-5의 알킬렌기이고;
X1 및 X2는 각각 독립적으로 산소와 연결된 당류(saccharide)이며; 및
상기 Y가 CH일 때,
상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되거나 비치환될 수 있고, 여기서 상기 L3은 C1-5의 알킬렌기이며, 및 상기 X3은 산소와 연결된 당류이다.
- 제 17항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 CH이고; 및 Z는 NH인 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 글루코스이며; Z는 NH이고; 및 Y는 CH이며, 여기서 상기 Y는 -L3X3로 표시되는 치환기가 추가로 치환되고, 상기 L3은 C1-3의 알킬렌기이며, 상기 X3은 글루코스인 방법.
- 제 17항에 있어서, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 비치환된 C3-C20의 알킬기이고; E1 및 E2는 각각 독립적으로 NH, O 또는 S이며; L1 및 L2는 각각 독립적으로 C1-3의 알킬렌기이고; X1 및 X2는 말토오스이며; Y는 N이고; 및 Z는 직접결합인 방법.
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