KR101797826B1

KR101797826B1 - 새로운 트리스 또는 네오펜틸 글리콜 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용

Info

Publication number: KR101797826B1
Application number: KR1020150177860A
Authority: KR
Inventors: 채필석; 사더프아이만
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2015-12-14
Filing date: 2015-12-14
Publication date: 2017-11-15
Also published as: US10781229B2; WO2017104897A1; US20190284221A1; KR20170070400A

Abstract

본 발명은 트리스(TRIS) 또는 네오펜틸 글리콜(neopentyl glycol) 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화 또는 결정화하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 트리스(TRIS) 또는 네오펜틸 글리콜(neopentyl glycol) 기반의 화합물을 이용하면 막단백질 용해화 효과가 우수할 뿐 아니라 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 막단백질의 구조적 유동성을 유지하는 데도 탁월하기 때문에, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이고, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타겟으로 하므로 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 막단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

Description

새로운 트리스 또는 네오펜틸 글리콜 기반의 양친매성 화합물 및 이의 활용{Novel TRIS- or neopentyl glycol-based amphiphiles and uses thereof}

본 발명은 새롭게 개발한 트리스(TRIS) 또는 네오펜틸 글리콜(neopentyl glycol) 기반의 양친매성 화합물 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.

막단백질(membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 지질 환경으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.

막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 많은 막단백질은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 충분히 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다.

특히 막단백질의 결정화를 통한 구조 분석에 사용되는 양친매성 분자는 글루코사이드(glucoside)를 포함하고 있는 분자가 널리 사용되고 있지만, 일반적으로 글루코사이드를 포함하는 양친매성 분자들은 막단백질 안정화에 탁월하지 않아 많은 한계점이 있었다. 구체적으로, 종래 제시한 글루코사이드를 3개 포함하고 있는 양친매성 분자 TPA-5(Tripod amphiphile-5)의 경우, 단백질 추출 효율이 매우 낮아 상용화되기에 어려움이 있었다(특허문헌 1). 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 글루코사이드를 친수성기로 가지면서도 단백질 안정화 효과가 매우 우수하여 막단백질 연구에 이용할 수 있는 새로운 양친매성 화합물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

미국 등록특허공보 제8,263,754호 (2012.09.11)

S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472. S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.

본 발명의 목적은 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₀의 알킬기, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₀의 사이클로알킬기, 또는 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₀의 아릴기일 수 있고;

상기 X¹, X²및 X³는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있고;

상기 Y는 -CH₂O- 또는 NH일 수 있고; 그리고

상기 Z는 존재하지 않거나(absent) 또는 O(산소)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.

상기 구체예에서 사용된 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있으며, 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있고, 보다 구체적으로 글루코스(glucose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성기인 당류 3개를 병렬로 연결하여 친수성기의 크기를 크게 하면서도 길이의 증가를 최소화함으로써 막단백질과의 복합체 형성시 그 크기를 작게하였다. 상기 화합물과 막단백질과의 복합체의 크기가 작으면 양질의 막단백질 결정을 얻을 수 있다 (G. G. Prive, Methods 2007, 41, 388-397). 특히, 글루코사이드(glucoside)와 같은 작은 친수성기를 갖고 있는 양친매성 분자는 막단백질 결정화에 있어서 탁월한 효과를 가질 수 있다.

또한, 상기 R¹ 및 R²는 소수성기로 작용할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 친수성도와 소수성도의 밸런스(hydrophile-lipophile balance)를 최적으로 하기 위하여 두 개의 알킬기를 소수성기로 도입하였다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 아마이드(amide) 또는 에터(ether) 결합에 의해 소수성기와 친수성기가 연결되어 있을 수 있다. 즉, 분자 중심부의 강직도(rigidity)를 유지하면서 알킬 사슬의 유동성을 충분히 확보하기 위한 링커를 도입하였다. 구체적으로, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 상기 Y가 NH이고, 상기 Z가 O인 아마이드(amide) 결합을 가지거나, 또는 상기 Y가 O이고, 상기 Z가 존재하지 않는 에터(ether) 결합을 가질 수 있다. 상기 아마이드 결합은 TRIS(tris(hydroxylmethyl)aminomethane) 링커를 이용하여 도입한 것일 수 있고, 상기 에터 결합은 네오펜틸 글리콜(neopentyl glycol) 링커를 이용하여 도입한 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기일 수 있고; 상기 R¹ 및 R²는 동일할 수 있고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있고; 상기 Y는 NH일 수 있고; 그리고 상기 Z는 O일 수 있다.

또한, 상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기일 수 있고; 상기 R¹ 및 R²는 동일할 수 있고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있고; 상기 Y는 -CH₂O-일 수 있고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₉-C₁₂ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 NH이고; 그리고 상기 Z는 O인 화합물을 "TDTs(TRIS-derived triglucosides)"로 명명하였다.

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₉-C₁₂ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 -CH₂O-이고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것인 화합물을 "NDTs(neopentyl glycol-derived triglucosides)"로 명명하였다.

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8, 또는 화학식 9로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₉ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 NH이고; 그리고 상기 Z는 O인 것인 화합물을 "TDT-C9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 2]

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₁₀ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 NH이고; 그리고 상기 Z는 O인 것인 화합물을 "TDT-C10"으로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 3]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₁₁ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 NH이고; 그리고 상기 Z는 O인 것인 화합물을 "TDT-C11"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 4]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₁₂ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 NH이고; 그리고 상기 Z는 O인 것인 화합물을 "TDT-C12"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 5]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₉ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 -CH₂O-이고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것인 화합물을 "NDT-C9"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 6]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₁₀ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 -CH₂O-이고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것인 화합물을 "NDT-C10"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 7로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 7]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₁₁ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 -CH₂O-이고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것인 화합물을 "NDT-C11"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 8]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 R¹ 및 R²는 C₁₂ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 -CH₂O-이고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것인 화합물을 "NDT-C12"로 명명하였다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 9로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 9]

본 발명의 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 존재하여 극성, 비극성 용매에 대해 2가지 성질 모두에 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 물에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하여 친수성기가 표면에 오는 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 증가한다.

CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.1μM 내지 500μM일 수 있으며, 구체적으로, 0.1μM 내지 100μM, 보다 구체적으로, 0.1μM 내지 80μM, 보다 더 구체적으로, 0.5μM 내지 80μM, 예를 들어 1μM 내지 50μM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

기존에 막단백질 연구에 주로 사용되고 있는 DDM의 경우 임계 미셀 농도가 170 μM인 것과 비교하여 본 구체예의 TDTs 또는 NDTs는 DDM 보다 작은 CMC 값을 가졌다. 따라서, TDTs 또는 NDTs는 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로, 적은 양을 사용하여 막단백질을 효과적으로 연구 분석할 수 있어 DDM 보다 유리함을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

상기 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 60.0 nm일 수 있고, 구체적으로 3.0 nm 내지 55.0 nm일 수 있으며, 보다 구체적으로 본 발명의 실시예들에 따른 TDTs에 의해 형성된 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 60.0 nm일 수 있고, 예를 들어 3.0 내지 55.0 nm일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 본 발명의 다른 실시예들에 따른 NDTs에 의해 형성된 미셀은 반지름이 2.0 nm 내지 4.5 nm일 수 있고, 예를 들어 3.0 nm 내지 4.0 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.

NDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 DDM과 거의 비슷한 수준의 범위에 있는 반면, TDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 범위가 넓었는데, 이로부터 TDTs와 NDTs 간의 화학적 구조(즉, 아마이드(amide) 또는 에터(ether)의 구조적 차이일 수 있음)의 작은 차이가 수용액에서 자가-응집 형태에 상당한 영향을 미침을 확인할 수 있었다.

상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부에 막단백질을 포함할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막 내부에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.

상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 5)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

1) 디메틸말론산염(dimethylmalonate)에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)을 생성하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 생성물에 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation) 반응을 수행하여 디알킬화 모노에스터(dialkylated monoester)를 생성하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 생성물에 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 첨가하여 아마이드(amide) 링커를 도입하는 단계;

4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및

5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기일 수 있고; 상기 R¹ 및 R²는 동일할 수 있고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있고; 상기 Y는 NH일 수 있고; 그리고 상기 Z는 O일 수 있다.

상기 구체예에 따른 제조 방법은 본 발명의 일 실시예에 따른 TDTs의 제조 방법일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 구체예에서, 디메틸말론산염(dimethylmalonate)을 출발물질로 사용해서 5단계의 합성단계를 거쳐 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있다. 이처럼 본 발명의 제조 방법에 의하면 화합물의 합성이 용이하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

2) 상기 단계 1)의 생성물에 디알킬화 에스터(dialkylated ester)를 환원하는 반응을 수행하여 디알킬화 모노-올(dialkylated mono-ol)을 생성하는 단계;

3) 상기 단계 2)의 생성물에 4-(브로모메틸)-l-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2.2.2]-옥탄(4-(bromomethyl)-l-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane)를 첨가하여 에터(ether) 링커가 도입된 디알킬화 트리-올(dialkylated tri-ol)을 생성하는 단계;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기일 수 있고; 상기 R¹ 및 R²는 동일할 수 있고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있고; 상기 Y는 -CH₂O-일 수 있고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것일 수 있다.

상기 구체예에 따른 제조 방법은 본 발명의 다른 실시예에 따른 NDTs의 제조 방법일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 도 1에 기재된 합성 스킴에 따라 하기의 단계를 수행하여 TDT-C9 내지 TDT-C12를 제조하였다:

1) 디메틸말론산염(dimethylmalonate)이 용해된 DMSO 용액에 NaH 및 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate) (화합물 A)를 생성하는 단계;

2) DMSO에 용해된 상기 화합물 A에 LiCl, H₂O를 첨가하고 160℃로 가열하여 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation) 반응을 수행하여 디알킬화 메틸 에스터(dialkylated methyl ester)(화합물 B)를 생성하는 단계;

3) DMSO에 용해된 상기 화합물 B에 TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethane) 및 NaOMe를 첨가하여 50℃에서 반응시켜 아마이드(amide) 링커가 도입된 화합물 C를 생성하는 단계;

4) 상기 화합물 C에 AgOTf, 2,4,6-collidine 및 CH₂Cl₂를 첨가하여 -45℃에서 반응시킨 후, 페르벤조일화 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide)를 추가로 첨가하여 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 글루코스(glucose)가 도입된 화합물 D를 생성하는 단계; 및

5) 상기 화합물 D에 NaOMe 및 MeOH를 첨가하여 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 O-벤조일기가 제거된 화합물 E를 생성하는 단계.

본 발명의 일 실시예에서, 도 3에 기재된 합성 스킴에 따라 하기의 단계를 수행하여 NDT-C9 내지 NDT-C12를 제조하였다:

2) DMSO에 용해된 상기 화합물 A에 LiCl, H₂O를 첨가하고 160℃로 가열하여 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation) 반응을 수행한 후 추출과정을 거쳐 중간생성물을 얻은 다음, 이 중간생성물에 LiAlH₄ 및 THF를 첨가하여 디알킬화 에스터(dialkylated ester)를 환원하는 반응을 수행하여 디알킬화 모노-올(dialkylated mono-ol) (화합물 B)를 생성하는 단계;

3) DMF에 용해된 상기 화합물 B에 THF에 용해된 4-(브로모메틸)-l-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2.2.2]-옥탄(4-(bromomethyl)-l-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane) 및 NaH를 첨가하여 100℃로 가열하여 반응시킨 후 추출과정을 거쳐 중간생성물을 얻은 다음, 이를 DCM 및 MeOH에 녹인 후, HCl과 NaOH를 순차로 첨가하여 에터(ether) 링커가 도입된 디알킬화 트리-올(dialkylated tri-ol) (화합물 C)을 생성하는 단계;

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서,

상기 Y는 -CH₂O- 또는 NH일 수 있고; 그리고

상기 Z는 존재하지 않거나(absent) 또는 O일 수 있다.

구체적으로, 상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기일 수 있고; 상기 R¹ 및 R²는 동일할 수 있고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있고; 상기 Y는 NH일 수 있고; 그리고 상기 Z는 O인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기일 수 있고; 상기 R¹ 및 R²는 동일할 수 있고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)일 수 있고; 상기 Y는 -CH₂O-일 수 있고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5, 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬, 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 UapA (uric acid-xanthine/H⁺ symporter), MelB (melibiose permease), LeuT (Leucine transporter), GPCRs(G-protein coupled receptors) 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analyzation)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.

막단백질 연구에 이용하기 위한 양친매성 분자는 화학적 구조의 작은 변화에 의해 상당한 영향을 받는다. 본 발명에 따른 TDTs 및 NDTs는 경직된 링커(TRIS 또는 NPG)를 통해 트리글루코사이드(triglucoside)기가 두 개의 유연한 알킬 사슬과 연결되어 있는 유사한 구조를 가진다. 두 양친매성 분자의 구조적 차이점은 링커 부위의 작용기에 있다. TDTs는 아마이드 결합을 가지는 반면, NDTs는 에터 결합을 가진다. 화학적 구조의 이런 작은 변화에도 불구하고, 두 양친매성 분자의 효율은 모든 테스트된 막단백질 (UapA, MelB 및 LeuT)에서 큰 차이가 있었으며, NDTs(특히 NDT-C11)가 TDTs 보다 현저히 우수하였다. 두 양친매성 분자에 의해 형성된 미셀의 사이즈에서도 큰 차이점이 발견되었다. TDTs에 의해 형성된 미셀은 같은 길이의 알킬 사슬을 가지는 NDTs에 의해 형성된 미셀보다 컸다. 아마이드와 에터 결합의 결합 강직도의 차이가 이러한 미셀 사이즈와 막단백질 안정화 효율에 관련이 있는 것으로 생각된다. 특히, 에터 결합으로 연결된 알킬 사슬은 유연성이 높아서 아마이드 결합을 가지는 화합물 보다 미셀을 더욱 잘 형성한다. NDTs의 유동적인 링커는 TDTs와 비교하여 상대적으로 작은 CMC 값을 가지는 NDTs의 자가-조립체의 사이즈를 감소시키는 데도 역할을 한다. 에터 결합의 유연성이 막단백질 주위를 둘러싸는 양친매성 분자의 알킬 사슬의 밀도를 증가시켜 막단백질 표면에 강하게 패킹(packing)하고, 이에 의하여 표적 단백질의 안정성을 강화시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 양친매성 분자의 작은 glucoside기는 작은 단백질-양친매성 분자 복합체(protein-detergent complexes; PDC)를 형성하는 경향이 있다. 작은 PDC 사이즈는 넓은 친수성 단백질 표면 영역을 제공하여 막단백질 결정화(crystallization)에 유리한 것으로 알려져 있다. 결정 형성은 막단백질의 친수성 부분과의 상호작용에 의해 촉진된다. 양친매성 분자의 작은 친수성기의 이점은 종래 글루코사이드 양친매성 분자(OG 및 NG)들이 막단백질 결정화에 널리 이용되는 것과 관련이 있다. 반면, 양친매성 분자의 친수성기가 글루코스처럼 작은 경우는 비교적 큰 말토사이드(maltoside)를 친수성기로 가지는 양친매성 분자보다 막단백질을 안정화(stabilization)하는 데 불리하다. 따라서, 현재까지 DDM 보다 막단백질의 안정화 효과가 좋은 글루코사이드 양친매성 분자는 거의 개발되지 않았다. 그러나, 본 발명에 따른 TDTs 및 NDTs는 친수성기로 글루코스를 가짐에도 불구하고, DDM 보다 막단백질 안정화 효과가 우수하므로, 막단백질의 결정화 뿐만 아니라 막단백질의 안정화를 위하여도 우수하게 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 NDT-C11은 가장 유망한 신규 양친매성 분자 중 하나인 MNG(maltose-neopentyl glycol amphiphiles)-3과 비교하였을 때, 멤브레인 단백질 안정화에 높은 효과를 제공한다는 점에서는 유사하지만, 단백질 기능에 필수적인 구조적 유연셩을 제공한다는 점에서는 보다 우수하였다. 이러한 결과는 NDT-C11이 구조가 안정하고 기능성이 유지된 단백질을 요구하는 생물물리학 연구에서 최적의 신규 화합물로 이용될 수 있음을 나타낸다.

본 발명의 구체예들에 따른 트리스- 또는 네오펜틸 글리콜-기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 막단백질의 구조적 유동성을 유지하는 데도 탁월하기 때문에, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.

막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이며, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타겟으로 하고 있으므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

구체적으로, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 작은 친수성기를 가져 막단백질 결정화에 있어서 탁월한 효과를 가질 수 있을 뿐만 아니라, 작은 친수성기를 사용하였을 때 발생하는 막단백질의 안정성이 다소 떨어지는 문제점이 발생하지 않고 기존 화합물 보다 우수한 막단백질 안정성을 보여준다.

또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 TDTs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 실시예들에 따른 TDTs의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에 따른 NDTs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 실시예들에 따른 NDTs의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 5은 TDTs 또는 NDTs에 의해 형성된 미셀의 크기(D(diameter), nm) 분포도를 나타낸 도이다.
도 6은 수용액 속에서 CMC+0.04 wt% 농도로 사용된 (a) TDTs 또는 (b) NDTs에 의한 UapA 단백질의 구조적 안정성을 CPM assay를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다(DDM, TDT-C9, TDT-C10, TDT-C11, TDT-C12, NDT-C9, NDT-C10, NDT-C11 및 NDT-C12의 평균 표준편차(n=2)는 각각 4.9, 9.3, 2.3, 5.8, 6.1, 2.7, 9.4, 10.2, 9.5이다).
도 7은 CMC+0.2 wt% 농도로 사용된 (a) TDTs 또는 (b) NDTs에 의한 UapA 단백질의 구조적 안정성을 CPM assay를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다(DDM, TDT-C9, TDT-C10, TDT-C11, TDT-C12, NDT-C9, NDT-C10, NDT-C11 및 NDT-C12의 평균 표준편차(n=2)는 각각 3.8, 5.0, 10.5, 14.6, 3.6, 7.1, 5.1, 3.0, 8.9이다).
도 8은 NDT-C11, MNG-3 및 DDM을 CMC+0.2 wt% 농도로 사용했을 때 UapA 단백질의 구조적 안정성을 CPM assay를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 0℃에서 TDTs 또는 NDTs에 의한 MelB 단백질의 추출 효율과 구조적 안정성을 SDS-PAGE와 웨스턴 면역블롯팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 0, 45, 55 및 65℃에서 TDTs 또는 NDTs에 의한 MelB 단백질의 추출 효율과 구조적 안정성을 SDS-PAGE와 웨스턴 면역블롯팅을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 DDM 또는 NDT-C11로 용해된 MelB 단백질(MelB_St 또는 MelB_Ec)의 기능적 안정성을 확인하기 위한 FRET 측정 결과이다.
도 12는 (a) CMC+0.04 wt% 농도 또는 (b) CMC+0.2 wt% 농도로 사용된 TDTs 또는 NDTs에 의한 LeuT 단백질의 안정성을 SPA(scintillation proximity assay)를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 (a) CMC+0.04 wt% 농도의 DDM 또는 NDT-C11을 이용하였을 때, SPA에 의해 측정된 돌연변이 단백질(LeuT E192C^TMR)의 [³H]-leucine 포화 결합도(%), (b) CMC+0.04 wt% 농도의 DDM, NDT-C11 또는 MNG-3를 이용하였을 때 leucine 농도에 따른 각각의 Ksv 값을 나타낸 그래프이다.
도 14는 다양한 leucine 농도(0, 0.01nM, 0.1nM, 1nM, 10nM, 100nM, 1uM, 10uM)따라 LeuT에 붙어있는 TMR fluorophore의 수용액 접근성 변화를 알아보기 위해 요오드화물(iodide)의 농도(0.00, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25 M)에 따라 측정된 LeuT E192C^TMR의 형광 퀀칭(F₀/F)을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> TDTs ( TRIS -derived triglucosides )의 합성 방법

TDTs의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-5>의 합성 방법에 따라 TDTs(tris(hydroxylmethyl)aminomethane (TRIS)-derived triglucosides) 4종을 합성하여 도 2에 나타내었다.

<1-1> 디알킬화 디메틸말론산염( dialkylated dimethylmalonate )의 일반적인 합성 절차 (화합물 A의 합성)

얼음중탕을 사용하여 차갑게 유지된 NaH (3.0 equiv.)가 용해되어 있는 DMSO 용액에 디메틸말론산염(dimethylmalonate) (1.0 equiv.)을 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 가스 생성이 중단될 때까지 교반하였다. 이 용액에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide) (2.5 equiv.)을 천천히 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응은 차가운 10% NH₄Cl 용액의 첨가에 의해 끝냈다. 얻어진 용액은 에틸아세테이트(ethylacetate)로 두 번 세척하였다. 에틸아세테이트 유기층을 모은 다음, 이를 brine으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 유기 용매의 농축으로 오일 잔여물을 얻었다. 잔여물의 컬럼 크로마토그래피 정제 후에 (EtOAc/hexane), 원하는 생산물인 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate) (화합물 A)을 무색의 오일로 얻었다.

<1-2> Krapcho의 데카르복실레이션 ( decarboxylation ) 조건에서 데메톡시 카 르보닐레이션(demethoxy carbonylation)을 위한 일반적인 절차 (step a; A→B)

화합물 A가 용해된 DMSO 용액에 LiCl (2.2 equiv.) 및 증류수 (1.1 equiv.)를 첨가하였다. 혼합물을 몇 분 동안 교반한 후, 160 ℃에서 12시간 동안 가열하였다. 이 반응혼합물에 brine의 첨가 후에, 반응 혼합물은 EtOAc로 두 번 추출하였다. 유기층을 모은 다음, 이를 brine으로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 회전 증발기에 의해 반응 혼합물을 농축하여 어두운 오일 잔여물을 얻었다. 컬럼 크로마토그래피 정제 후에, 원하는 디알킬화 모노에스터(dialkylated monoester) (화합물 B)를 무색의 오일로 얻었다.

<1-3> 디알킬화 메틸 에스터( dialkylated methyl ester)와 트리스 커플링(tris coupling)을 위한 일반적인 절차 (step b; B→C)

DMSO에 용해된 디알킬화 메틸 에스터 (화합물 B) (1.0 equiv.)의 혼합물에 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane) (1.5 equiv.) 및 NaOMe (2.0 equiv.)를 질소 조건에서 첨가하였다. 용액은 50℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석한 후, 에틸아세테이트(ethylacetate)로 추출하였다. 유기층은 brine으로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 에틸아세테이트 용액의 농축 후에, 잔여물을 플래쉬(flash) 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/hexane)로 정제하여 원하는 생산물인 화합물 C를 흰색 고체로 얻었다.

<1-4> 글리코실레이션 ( glycosylation ) 반응을 위한 일반적인 절차 (step c; C→D)

질소 하에, 무수 CH₂Cl₂에 용해된 화합물 C (1.0 equiv.), AgOTf (3.6 equiv.) 및 2,4,6-콜리딘(collidine) (1.0 equiv.)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. CH₂Cl₂에 용해된 페르벤조일화 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide) (3.6 equiv.)의 용액을 상기 현탁액에 천천히 첨가하였다. 교반은 30분 동안 -45℃에서 계속하였고, 그 후 반응 혼합물을 0℃가 되도록 하였으며, 1.5시간 동안 이 온도에서 다시 교반하였다. 반응의 완결 후에(TLC에 의해 반응의 완결을 확인함), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가하고, CH₂Cl₂로 희석한 후, celite로 여과하였다. 여과물은 1M Na₂S₂O₃ 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 brine으로 연속적으로 세척하였다. 유기층은 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane)로 정제하여, 원하는 생산물인 화합물 D를 유리 같은 고체로 얻었다.

<1-5> Zemplen의 조건 하에 데- O - 벤조일레이션(de- O -benzoylation)을 위한 일반적인 절차 (step d; D→E)

O-벤조일화(benzoylated) 화합물 (화합물 D)을 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올성 용액을 필요한 양만큼 처리하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M이 되도록 하였다. 반응 혼합물은 6시간 동안 상온에서 교반한 후, Amberlite IR-120 (H+ form) resin으로 중화시켰다. resin은 여과로 제거하고, MeOH로 세척하고, 용매를 진공에서 반응 혼합물로부터 제거하였다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/CH₂Cl₂)로 정제하여 원하는 생성물인 화합물 E를 흰색 고체로 얻었다. 이렇게 얻은 화합물 E는 TDTs(TRIS-derived triglucosides)로 명명하였다.

< 제조예 1> TDT -C9의 합성

<1-1> 디메틸 2- 노닐말론산염 ( Dimethyl 2- nonylmalonate ) (화합물 1)의 합성

상기 실시예 1-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 노닐 아이오다이드(nonyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-노닐말론산염(Dimethyl 2-nonylmalonate) (화합물 1)을 91% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.83 (m, 4H), 1.34-1.05 (m, 28H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 172.34, 57.56, 52.05, 31.83, 29.75, 29.43, 29.27, 29.23, 23.93, 22.61, 14.00.

<1-2> 메틸 2- 노닐운데카논산염 (Methyl 2- nonylundecanoate ) (화합물 5)의 합성

상기 실시예 1-2의 방법에 따라 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation)을 수행하여 메틸 2-노닐운데카논산염(Methyl 2-nonylundecanoate) (화합물 5)을 80% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.66 (s, 3H), 2.32-2.23 (m, 1H), 1.67-1.40 (m, 4H) 1.34-1.25 (m, 28H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 169.81, 61.50, 52.32, 33.10, 29.80, 29.73, 29.54, 29.42, 28.91, 27.51, 22.93, 14.30.

<1-3> N -(1,3-디히드록시-2-( 히드록시메틸 )프로판-2-일)-2- 노닐운데칸아마이드 ( N -(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-nonylundecanamide) (화합물 9)의 합성

상기 실시예 1-3의 방법에 따라 트리스 커플링 반응을 수행하여 N-(1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일)-2-노닐운데칸아마이드(N-(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-nonylundecanamide) (화합물 9)를 74% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 6.48 (s, 1H), 4.64 (br s, 3H), 3.60 (s, 6H), 2.10-2.03 (m, 1H), 1.65-1.33 (m, 4H), 1.38-1.20 (m, 28H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 178.44, 131.03, 128.96, 62.51, 60.25, 48.17, 33.05, 32.02, 29.76, 29.70, 29.62, 29.42, 27.66, 22.81, 14.24.

<1-4> TDT - C9a의 합성

상기 실시예 1-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 TDT-C9a를 75% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.75 (s, 1H), 5.63 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.51 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.38 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.45-4.32 (m, 6H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6Hz, 3H), 3.4-3.3 (m, 3H), 3.21-3.05 (m, 6H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.45-1.10 (m, 32H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 176.42, 166.08, 165.71, 165.07, 164.64, 133.77, 133.49, 133.32, 133.31, 129.95, 129.84, 129.74, 129.70, 129.63, 129.58, 129.42, 129.09, 128.86, 128.80, 128.35, 101.47, 72.63, 71.95, 69.54, 68.19, 62.95, 59.36, 32.85, 32.03, 31.98, 29.96, 29.75, 29.46, 27.56, 27.35, 22.75, 14.21.

<1-5> TDT -C9의 합성

상기 실시예 1-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 9개인 알킬기를 두 개 가지는 TDT-C9를 90% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.50-4.31 (m, 6H), 3.89-3.85 (m, 6H), 3.67-3.63 (m, 3H), 3.37-3.17 (m, 12H), 2.2-2.1 (m, 1H), 1.38-1.21 (m, 32H), 0.80 (t, J = 6.8 Hz, 6H);¹³C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 179.57, 104.87, 78.13, 78.11, 75.21, 71.85, 69.46, 62.94, 61.22, 34.40, 34.32, 33.25, 33.23, 31.24, 31.01, 30.92, 30.84, 30.62, 28.72, 28.59, 23.88, 14.59. HRMS (EI): calcd. for C₄₂H₇₉NO₁₉[M+Na]⁺924.5144,found 924.5143.

< 제조예 2> TDT -C10의 합성

<2-1> 디메틸 2- 데실말론산염 ( Dimethyl 2- decylmalonate ) (화합물 2)의 합성

상기 실시예 1-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 데실 아이오다이드(decyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-데실말론산염(Dimethyl 2-decylmalonate) (화합물 2)을 91% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.83 (m, 4H), 1.34-1.25 (m, 32H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 172.55, 57.76, 52.25, 32.50, 32.03, 29.93, 29.71, 29.66, 29.45, 24.11, 23.66, 22.80, 14.20.

<2-2> 메틸 2- 데실운데카논산염 (Methyl 2- decylundecanoate ) (화합물 6)의 합성

상기 실시예 1-2의 방법에 따라 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation)을 수행하여 메틸 2-데실운데카논산염(Methyl 2-decylundecanoate) (화합물 6)을 82% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.66 (s, 3H), 2.32-2.23 (m, 1H), 1.67-1.40 (m, 4H), 1.34-1.25 (m, 32H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 169.81, 61.53, 52.30, 32.10, 29.80, 29.70, 29.51, 29.41, 28.93, 27.53, 22.94, 14.31.

<2-3> N -(1,3-디히드록시-2-( 히드록시메틸 )프로판-2-일)-2- 데실운데칸아마이드 ( N -(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-decylundecanamide) (화합물 10)의 합성

상기 실시예 1-3의 방법에 따라 트리스 커플링 반응을 수행하여 N-(1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일)-2-데실운데칸아마이드(N-(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-decylundecanamide) (화합물 10)를 72% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 6.49 (s, 1H), 5.20-5.1 (br s, 3H), 3.57 (s, 6H), 2.10-2.01 (m, 1H), 1.65- 1.39 (m, 4H), 1.38-1.20 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H);¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 178.30, 131.03, 62.35, 60.12, 48.03, 33.09, 31.90, 29.62, 29.58, 29.48, 29.33, 27.52, 22.68, 14.11.

<2-4> TDT - C10a의 합성

상기 실시예 1-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 TDT-C10a를 80% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.75 (s, 1H), 5.63 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.51 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.38 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.45-4.32 (m, 6H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.4-3.3 (m, 3H), 3.21-3.05 (m, 6H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.45-1.10 (m, 36H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 176.52, 166.18, 165.80, 165.15, 164.72, 133.82, 133.57, 133.38, 133.26, 130.04, 129.93, 129.90, 129.81, 129.73, 129.67, 129.54, 129.12, 128.98, 128.92, 128.56, 128.44, 101.52, 72.70, 72.01, 69.62, 68.24, 63.03, 59.40, 32.89, 32.07, 30.01, 29.85, 29.60, 29.55, 27.64, 27.43, 22.84, 14.26.

<2-5> TDT -C10의 합성

상기 실시예 1-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 10개인 알킬기를 두 개 가지는 TDT-C10을 95% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.50-4.31 (m, 6H), 3.89-3.85 (m, 6H), 3.67-3.63 (m, 3H), 3.37-3.17 (m, 12H), 2.2-2.1 (m, 1H), 1.38-1.21 (m, 36H), 0.80 (t, J = 6.8 Hz, 6H);¹³C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 179.67, 104.87, 78.13, 75.22, 71.86, 69.50, 62.95, 61.32, 34.39, 34.32, 33.24, 31.24, 31.07, 30.98, 30.92, 30.86, 30.84, 30.66, 28.73, 28.60, 23.89, 14.62. HRMS (EI): calcd. for C₄₄H₈₃NO₁₉[M+Na]⁺952.5457,found 952.5454.

< 제조예 3> TDT -C11의 합성

<3-1> 디메틸 2- 운데실말론산염 ( Dimethyl 2- undecylmalonate ) (화합물 3)의 합성

상기 실시예 1-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 운데실 아이오다이드(undecyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-운데실말론산염(Dimethyl 2-undecylmalonate) (화합물 3)을 86% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.83 (m, 4H), 1.30-1.24 (m, 36H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 172.44, 57.71, 52.15, 51.21, 45.78, 32.63, 32.49, 32.03, 29.91, 29.74, 29.64, 29.47, 29.43, 27.58, 24.09, 22.79, 14.16.

<3-2> 메틸 2- 운데실운데카논산염 (Methyl 2- undecylundecanoate ) (화합물 7)의 합성

상기 실시예 1-2의 방법에 따라 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation)을 수행하여 메틸 2-운데실운데카논산염(Methyl 2-undecylundecanoate) (화합물 7)을 78% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.66 (s, 3H), 2.32-2.23 (m, 1H), 1.67-1.40 (m, 4H), 1.30-1.24 (m, 40H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 169.81, 61.54, 52.32, 33.10, 29.81, 29.72, 29.64, 29.42, 28.92, 27.53, 22.91, 14.32.

<3-3> N -(1,3-디히드록시-2-( 히드록시메틸 )프로판-2-일)-2- 운데실운데칸아마이드 ( N -(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-undecylundecanamide) (화합물 11)의 합성

상기 실시예 1-3의 방법에 따라 트리스 커플링 반응을 수행하여 N-(1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일)-2-운데실운데칸아마이드(N-(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-undecylundecanamide) (화합물 11)를 70% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 6.51 (s, 1H), 5.63 (br s, 3H), 3.54 (s, 6H), 2.12-2.05 (m, 1H), 1.55-1.31 (m, 4H), 1.38-1.20 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 178.30, 131.03, 62.45, 60.12, 48.33, 33.09, 31.90, 29.65, 29.58, 29.48, 29.33, 28.43, 27.52, 22.68, 14.09.

<3-4> TDT - C11a의 합성

상기 실시예 1-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 TDT-C11a를 65% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.75 (s, 1H), 5.63 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.51 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.38 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.45-4.32 (m, 6H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.4-3.3 (m, 3H), 3.21-3.05 (m, 6H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.45-1.10 (m, 40H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H);¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 176.42, 166.07, 165.71, 165.06, 164.64, 133.71, 133.44, 133.27, 133.15, 129.96, 129.85, 129.76, 129.72, 129.62, 129.48, 129.03, 128.93, 128.86, 128.47, 128.34, 101.45, 72.64, 71.95, 69.57, 68.16, 62.96, 59.34, 53.47, 48.25, 32.83, 32.76, 31.99, 31.62, 29.98, 29.82, 29.45, 27.56, 27.36, 22.73, 22.72, 22.68, 14.14.

<3-5> TDT -C11의 합성

상기 실시예 1-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 11개인 알킬기를 두 개 가지는 TDT-C11을 90% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.65-4.37 (m, 6H), 3.92-3.89 (m, 6H), 3.72-3.67 (m, 3H), 3.45-3.22 (m, 12H), 2.31-2.20 (m, 1H), 1.41-1.21 (m, 40H), 0.92 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ179.5, 104.8, 78.0, 75.1, 71.8, 69.4, 62.9, 61.1, 39.6, 34.3, 34.2, 33.2, 31.2, 31.0, 30.9, 30.8, 30.6, 28.6, 28.5, 23.8, 14.6. HRMS (EI): calcd. for C₄₆H₈₇NO₁₉[M+Na]⁺980.5770,found 980.5766.

< 제조예 4> TDT -C12의 합성

<4-1> 디메틸 2- 도데실말론산염 ( Dimethyl 2- dodecylmalonate ) (화합물 4)의 합성

상기 실시예 1-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 도데실 아이오다이드(dodecyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-도데실말론산염(Dimethyl 2-dodecylmalonate) (화합물 4)을 89% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.6 (s, 6H), 1.90-1.87 (m, 4H), 1.30-1.25 (m, 40H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 169.97, 61.53, 52.30, 32.11, 29.98, 29.94, 29.75, 29.60, 29.51, 29.4, 28.93, 27.53, 22.93, 14.40.

<4-2> 메틸 2- 도데실운데카논산염 (Methyl 2- dodecylundecanoate ) (화합물 8)의 합성

상기 실시예 1-2의 방법에 따라 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation)을 수행하여 메틸 2-도데실운데카논산염(Methyl 2-dodecylundecanoate) (화합물 8)을 81% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.65 (s, 3H), 2.32-2.30 (m, 1H), 1.67-1.40 (m, 4H), 1.30-1.25 (m, 44H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 169.92, 61.51, 52.30, 32.15, 29.95, 29.96, 29.75, 29.61, 29.53, 29.41, 28.97, 27.53, 22.91, 14.43.

<4-3> N -(1,3-디히드록시-2-( 히드록시메틸 )프로판-2-일)-2- 도데실운데칸아마이드 ( N -(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-dodecylundecanamide) (화합물 12)의 합성

상기 실시예 1-3의 방법에 따라 트리스 커플링 반응을 수행하여 N-(1,3-디히드록시-2-(히드록시메틸)프로판-2-일)-2-도데실운데칸아마이드(N-(1,3-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)propan-2-yl)-2-dodecylundecanamide) (화합물 12)를 72% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 6.45 (s, 1H), 3.98 (br s, 3H), 3.64 (s, 6H), 2.11-2.05 (m, 1H), 1.63-1.39 (m, 4H), 1.38-1.20 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 178.44, 131.13, 128.96, 62.51, 61.25, 48.17, 33.45, 32.02, 29.76, 29.70, 29.62, 29.42, 28.34, 28.11, 27.66, 22.81, 14.14.

<4-4> TDT - C12a의 합성

상기 실시예 1-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 TDT-C12a를 70% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.75 (s, 1H), 5.63 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.51 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.38 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.45-4.32 (m, 6H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6Hz, 3H), 3.4-3.3 (m, 3H), 3.21-3.05 (m, 6H), 3.02-2.90 (m, 2H), 1.80-1.65 (m, 1H), 1.45-1.05 (m, 36H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H);¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 176.56, 166.21, 165.84, 165.18, 164.75, 133.84, 133.57, 133.40, 133.29, 130.07, 129.96, 129.89, 129.70, 129.57, 129.15, 129.03, 128.97, 128.59, 128.47, 101.54, 72.73, 69.65, 68.25, 63.06, 59.42, 53.60, 48.35, 32.91, 32.85, 32.09, 30.05, 29.94, 29.87, 29.57, 29.55, 27.67, 27.46, 22.84, 14.29.

<4-5> TDT -C12의 합성

상기 실시예 1-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 12개인 알킬기를 두 개 가지는 TDT-C12를 94% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.50-4.31 (m, 6H), 3.89-3.85 (m, 6H), 3.67-3.63 (m, 3H), 3.36-3.17 (m, 12H), 2.25-2.15 (m, 1H), 1.40-1.22 (m, 42H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H);¹³C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 179.60, 104.88, 78.15, 75.24, 71.87, 69.47, 62.97, 61.24, 33.25, 31.23, 31.07, 31.03, 30.96, 30.84, 30.65, 28.73, 28.59, 23.89, 14.61. HRMS (EI): calcd. for C₄₈H₉₁NO₁₉[M+Na]⁺1008.6083,found 1008.6086.

< 실시예 2> NDTs ( neopentyl glycol-derived triglucosides )의 합성

NDTs의 합성 스킴을 도 3에 나타내었다. NDTs의 합성 방법은 실시예 1의 TDTs 합성 방법 중 <1-2> 및 <1-3>에 차이가 있고 나머지 단계의 방법은 동일하였다. 따라서, 하기 <2-1> 내지 <2-5>의 합성 방법에 따라 NDTs(neopentyl glycol-derived triglucosides) 4종을 합성하여 도 4에 나타내었다.

<2-1> 디알킬화 디메틸말론산염( dialkylated dimethylmalonate )의 일반적인 합성 절차 (화합물 A의 합성)

얼음중탕을 사용하여 차갑게 유지된 NaH (3.0 equiv.)가 용해되어 있는 DMSO 용액에 디메틸말론산염(dimethylmalonate) (1.0 equiv.)을 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 가스 생성이 중단될 때까지 교반하였다. 이 용액에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide) (2.5 equiv.)을 천천히 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 3시간 동안 상온에서 교반하였다. 반응은 혼합물에 차가운 10% NH₄Cl 용액의 첨가에 의해 끝냈다. 이렇게 얻어진 용액은 에틸아세테이트(ethylacetate)로 두 번 세척하였다. 에틸아세테이트 유기층을 모은 다음 brine으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 유기 용매의 농축으로 오일 잔여물을 얻었다. 잔여물의 컬럼 크로마토그래피 정제 후에 (EtOAc/hexane), 원하는 생산물인 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate) (화합물 A)을 무색의 오일로 얻었다.

<2-2> LAH를 이용한 디알킬화 에스터( dialkylated ester)의 환원을 위한 일반적인 절차 (step a; A→B)

DMSO에 용해된 화합물 A에 LiCl 및 증류수를 첨가하였다. 혼합물은 12시간 동안 가열하여 환류(relux)하였다. 반응 혼합물을 상온으로 식힌 후, 증류수를 첨가한 다음, 에틸아세테이트(ethylacetate)로 추출하였다. 유기층을 모은 다음 brine으로 세척하고 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 농축한 후에, 오일 잔여물을 얻어 다음 환원 단계에 이용하였다. LiAlH₄ (2.0 equiv.)가 녹아있는 THF 용액을 아주 차갑게 유지된 디알킬화 모노 메틸 에스터(dialkylated mono methyl ester) 용액에 천천히 첨가하였다. 혼합물은 상온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응은 MeOH, 증류수, 1M HCl 용액을 0℃에서 연속적으로 첨가하는 것으로 종결한 후, 디에틸 에터(diethyl ether)로 두 번 추출하였다. 유기층은 결합한 후, brine으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 회전 증발 후에 얻은 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/hexane)로 정제하여, 원하는 생산물인 화합물 B를 얻었다.

<2-3> 디알킬화 트리-올( dialkylated tri- ol )의 일반적인 합성 절차 (step b; B→C)

DMF에 용해된 디알킬화 모노-올(dialkylated mono-ol) (화합물 B; 1.0 equiv.) 용액에 NaH (3.0 equiv.)를 첨가하였다. 혼합물은 50℃로 30분 동안 가열하였다. 혼합물을 상온으로 식힌 후에, THF에 용해된 4-(브로모메틸)-l-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2.2.2]-옥탄(4-(bromomethyl)-l-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane) (3.0 equiv.)을 천천히 첨가하였다. 얻어진 혼합물은 100℃에서 24시간 동안 가열하였다. 메탄올을 첨가하여 반응을 중단한 후, 유기 용매를 감압 조건에서 제거하였다. 고체 잔여물은 디에틸 에터(diethyl ether)에서 용해시키고, 이 용액을 brine으로 세척하고, 무수 Na₂SO₄로 건조하였다. 유기 용매를 농축한 후에, 잔여물은 DCM/MeOH 혼합물에 용해시켰다. 이 용액에 진한 HCl을 몇 방울 첨가하고, 얻어진 혼합물은 50℃에서 4시간 동안 가열하였다. NaOH로 반응 혼합물을 중화하고, 이를 농축한 후에, 잔여물은 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane)으로 정제하여 원하는 생산물인 화합물 C를 얻었다.

<2-4> 글리코실레이션 ( glycosylation ) 반응을 위한 일반적인 절차 (step c; C→D)

질소 하에, 무수 CH₂Cl₂에 용해된 화합물 C (1.0 equiv.), AgOTf (3.6 equiv.) 및 2,4,6-콜리딘(collidine) (1.0 equiv.)의 혼합물을 -45℃에서 교반하였다. CH₂Cl₂에 용해된 페르벤조일화 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide) (3.6 equiv.)의 용액을 상기 현탁액에 천천히 첨가하였다. 교반은 30분 동안 -45℃에서 지속하였고, 그 후 반응 혼합물을 0℃가 되도록 하였으며, 1.5시간 동안 이 온도에서 교반하였다. 반응의 완결 후에(TLC에 의해 반응의 완결을 확인함), 피리딘(pyridine)을 반응 혼합물에 첨가하고, CH₂Cl₂로 희석한 후, celite로 여과하였다. 여과물은 1M Na₂S₂O₃ 수용액, 0.1M HCl 수용액 및 brine으로 연속적으로 세척하였다. 추출 유기층은 무수 Na₂SO₄로 건조하고, 용매를 회전 증발기로 제거하였다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane)로 정제하여, 원하는 생산물인 화합물 D를 유리 같은 고체로 얻었다.

<2-5> Zemplen의 조건 하에 데- O - 벤조일레이션(de- O -benzoylation)을 위한 일반적인 절차 (step d; D→E)

O-벤조일화(benzoylated) 화합물 (화합물 D)을 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M NaOMe의 메탄올성 용액을 필요한 양만큼 첨가하여 NaOMe의 최종 농도가 0.05M이 되도록 하였다. 반응 혼합물은 6시간 동안 상온에서 교반한 후, Amberlite IR-120 (H+ form) resin으로 중화시켰다. resin은 여과로 제거하고, MeOH로 세척한 후, 용매를 진공에서 제거하였다. 잔여물은 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/CH₂Cl₂)로 정제하여 원하는 생성물인 화합물 E를 흰색 고체로 얻었다. 이렇게 얻은 화합물 E는 NDTs(neopentyl glycol-derived triglucosides)로 명명하였다.

< 제조예 5> NDT -C9의 합성

<5-1> 디메틸 2- 노닐말론산염 ( Dimethyl 2- nonylmalonate ) (화합물 1)의 합성

상기 실시예 2-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 노닐 아이오다이드(nonyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-노닐말론산염(Dimethyl 2-nonylmalonate) (화합물 1)을 91% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.83 (m, 4H), 1.34-1.05 (m, 28H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 172.34, 57.56, 52.05, 31.83, 29.75, 29.43, 29.27, 29.23, 23.93, 22.61, 14.00.

<5-2> 2- 노닐운데칸 -1-올(2- nonylundecan -1- ol ) (화합물 13)의 합성

상기 실시예 2-2의 방법에 따라 디알킬화 모노에스터의 환원 반응을 수행하여 2-노닐운데칸-1-올(2-nonylundecan-1-ol) (화합물 13)을 89% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 1.36-1.18 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 65.7, 40.5, 31.9, 30.9, 30.1, 29.6, 29.3, 26.9, 22.7, 14.1.

<5-3> 2-(((2- 노닐운데실 ) 옥시 ) 메틸 )-2-( 히드록시메틸 )프로판-1,3- 디올 (2-(((2-nonylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 17) 의 합성

상기 실시예 2-3의 방법에 따라 2-(((2-노닐운데실)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(2-(((2-nonylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 17)를 44% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.72 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 3.43 (s, 2H), 3.3 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.72 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 1.61-1.51 (m, 1H), 1.36-1.18 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 72.06, 70.56, 68.91, 68.59, 67.91, 66.82, 63.58, 44.40, 43.09, 30.87, 28.68, 28.61, 28.46, 28.33, 25.19, 21.67, 13.10.

<5-4> NDT - C9a의 합성

상기 실시예 2-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 NDT-C9a를 50% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.63 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.51 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.38 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.45-4.32 (m, 6H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.4-3.3 (m, 3H), 3.21-3.05 (m, 6H), 3.02-2.90 (m, 2H), 1.42-1.36 (m, 1H), 1.35-1.01 (m, 32H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ166.1, 165.9, 165.2, 164.8, 133.6, 133.5, 133.3, 133.2, 130.1, 129.9, 129.8, 129.7, 129.1, 129.0, 128.5, 128.4, 101.6, 72.8, 72.1, 71.8, 69.8, 68.0, 63.2, 53.6, 45.2, 38.0, 32.1, 31.4, 31.3, 30.3, 29.9, 29.6, 27.0, 26.9, 22.8, 14.3.

<5-5> NDT -C9의 합성

상기 실시예 2-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 9개인 알킬기를 두 개 가지는 NDT-C9를 90% 수율로 합성하였다. ¹HNMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.50 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 4.21 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.88 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 3.77-3.74 (m, 6H), 3.58-3.52 (m, 2H), 3.40-3.25 (m, 10H), 3.10 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 1.48-1.40 (m, 1H), 1.30-1.10 (m, 32H), 0.80 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 133.64, 132.50, 130.01, 129.03, 105.20, 78.11, 77.90, 76.07, 75.26, 71.70, 70.73, 70.21, 62.85, 46.73, 39.49, 33.22, 32.63, 31.31, 31.30, 30.90, 30.62, 28.06, 23.87, 14.65. HRMS (EI): calcd. for C₄₃H₈₂O₁₉[M+Na]⁺925.5348,found 925.5346.

< 제조예 6> NDT -C10의 합성

<6-1> 디메틸 2-데실말론산염(Dimethyl 2-decylmalonate) (화합물 2)의 합성

상기 실시예 2-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 데실 아이오다이드(decyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-데실말론산염(Dimethyl 2-decylmalonate) (화합물 2)을 91% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.83 (m, 4H), 1.34-1.25 (m, 32H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 172.55, 57.76, 52.25, 32.50, 32.03, 29.93, 29.71, 29.66, 29.45, 24.11, 23.66, 22.80, 14.20.

<6-2> 2- 데실운데칸 -1-올(2- decylundecan -1- ol ) (화합물 14)의 합성

상기 실시예 2-2의 방법에 따라 디알킬화 모노에스터의 환원 반응을 수행하여 2-데실운데칸-1-올(2-decylundecan-1-ol) (화합물 14)을 88% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 1.36-1.18 (m, 36H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 65.6, 40.5, 31.9, 30.9, 30.1, 29.7, 29.3, 26.9, 22.7, 14.0.

<6-3> 2-(((2- 데실운데실 ) 옥시 ) 메틸 )-2-( 히드록시메틸 )프로판-1,3- 디올 (2-(((2-decylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 18)의 합성

상기 실시예 2-3의 방법에 따라 2-(((2-데실운데실)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(2-(((2-decylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 18)를 42% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.72 (d, J = 6.0 Hz, 6H), 3.43 (s, 2H), 3.30 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.72 (t, J = 5.6 Hz, 3H), 1.61-1.50 (m, 1H), 1.36-1.18 (m, 32H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 72.03, 70.51, 68.91, 68.59, 67.91, 66.82, 63.60, 44.40, 43.19, 30.87, 28.68, 28.61, 28.46, 28.33, 25.19, 21.67, 13.15.

<6-4> NDT - C10a의 합성

상기 실시예 2-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 NDT-C10a를 50% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.10-7.80 (m, 18H), 7.60-7.10 (m, 42H), 5.62 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.50 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.38 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.43-4.32 (m, 6H), 4.02 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.79 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.35 (t, J = 4.8 Hz, 3H), 3.18-3.07 (m, 6H), 3.21-3.05 (m, 6H), 2.97-2.95 (m, 2H), 1.41-1.36 (m, 1H), 1.35-1.01 (m, 36H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ166.2, 165.9, 165.2, 164.9, 134.0, 133.8, 133.6, 133.5, 133.4, 133.2, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.1, 128.7, 128.6, 128.5, 101.6, 72.9, 72.8, 72.1, 71.8, 69.9, 63.3, 62.1, 32.1, 31.5, 30.4, 30.0, 29.9, 29.6, 27.0, 22.9, 14.3.

<6-5> NDT -C10의 합성

상기 실시예 2-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 10개인 알킬기를 두 개 가지는 NDT-C10을 93% 수율로 합성하였다. ¹HNMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.98 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.84 (d, J = 2 Hz, 3H), 3.70-3.60 (m, 6H), 3.48 (s, 2H), 3.34-3.21 (m, 10H), 3.19 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 1.48-1.40 (m, 1H), 1.30-1.10 (m, 36H), 0.80 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CD₃OD): δ 105.23, 78.15, 77.94, 76.09, 75.29, 71.74, 70.21, 62.87, 46.76, 39.50, 33.22, 32.63, 31.30, 30.92, 30.64, 28.06, 23.88, 14.62. HRMS (EI): calcd. for C₄₅H₈₆O₁₉[M+Na]⁺953.5661,found 953.5657.

< 제조예 7> NDT -C11의 합성

<7-1> 디메틸 2-운데실말론산염(Dimethyl 2-undecylmalonate) (화합물 3)의 합성

상기 실시예 2-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 운데실 아이오다이드(undecyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-운데실말론산염(Dimethyl 2-undecylmalonate) (화합물 3)을 86% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 1.88-1.83 (m, 4H), 1.30-1.24 (m, 36H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 172.44, 57.71, 52.15, 51.21, 45.78, 32.63, 32.49, 32.03, 29.91, 29.74, 29.64, 29.47, 29.43, 27.58, 24.09, 22.79, 14.16.

<7-2> 2- 운데실운데칸 -1-올(2- undecylundecan -1- ol ) (화합물 15)의 합성

상기 실시예 2-2의 방법에 따라 디알킬화 모노에스터의 환원 반응을 수행하여 2-운데실운데칸-1-올(2-undecylundecan-1-ol) (화합물 15)을 76% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 1.36-1.18 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 65.7, 40.6, 32.1, 31.1, 30.3, 29.9, 29.8, 29.5, 27.0, 22.8, 14.2.

<7-3> 2-(((2- 운데실운데실 ) 옥시 ) 메틸 )-2-( 히드록시메틸 )프로판-1,3- 디올 (2-(((2-undecylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 19)의 합성

상기 실시예 2-3의 방법에 따라 2-(((2-운데실운데실)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(2-(((2-undecylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 19)를 40% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.72 (s, 6H), 3.44 (s, 2H), 3.31 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.52 (s, 3H), 1.59-1.41 (m, 1H), 1.36-1.18 (m, 40H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 73.26, 71.77, 70.10, 69.78, 69.11, 68.03, 64.72, 45.60, 45.11, 32.07, 29.88, 29.81, 29.66, 29.53, 26.39, 22.87, 14.30.

<7-4> NDT - C11a의 합성

상기 실시예 2-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 NDT-C11a를 47% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 8.04-7.80 (m, 24H), 7.55-7.37 (m, 36H), 5.62 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.50 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.37 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.39-4.34 (m, 6H), 4.01 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.37-3.33 (m, 3H), 3.13-3.10 (m, 6H), 2.96-2.94 (m, 2H), 1.43-1.37 (m, 1H), 1.36-1.02 (m, 40H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃):δ166.2, 165.9, 165.4, 164.8, 133.6, 133.5, 133.3, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.1, 129.0, 128.6, 128.5, 101.5, 90.6, 72.8, 72.3, 72.0, 71.8, 71.7, 70.2, 69.9, 69.8, 69.6, 68.2, 68.0, 63.2, 63.0, 45.5, 45.0, 32.0, 29.8, 29.7, 29.5, 26.4, 22.8, 14.3.

<7-5> NDT -C11의 합성

상기 실시예 2-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 11개인 알킬기를 두 개 가지는 NDT-C11을 90% 수율로 합성하였다. ¹HNMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.98 (d, J = 10.0 Hz, 3H), 3.84 (d, J = 12 Hz, 3H), 3.69-3.62 (m, 6H), 3.48 (s, 2H), 3.34-3.21 (m, 10H), 3.18 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 1.56-1.50 (m, 1H), 1.36-1.20 (m, 40H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ105.0, 78.0, 77.8, 75.2, 72.6, 71.1, 70.8, 70.7, 70.1, 69.9, 69.7, 62.7, 46.7, 46.5, 39.5, 33.1, 31.0, 30.8, 30.6, 27.5, 23.8, 14.6. HRMS (EI): calcd. for C₄₇H₉₀O₁₉[M+Na]⁺981.5974,found 981.5977.

< 제조예 8> NDT -C12의 합성

<8-1> 디메틸 2-도데실말론산염(Dimethyl 2-dodecylmalonate) (화합물 4)의 합성

상기 실시예 2-1의 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)의 합성 방법에 따라, 도데실 아이오다이드(dodecyl iodide)를 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)로 사용하여, 디메틸 2-도데실말론산염(Dimethyl 2-dodecylmalonate) (화합물 4)을 89% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.6 (s, 6H), 1.90-1.87 (m, 4H), 1.30-1.25 (m, 40H), 0.87 (t, J = 7.2 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 169.97, 61.53, 52.30, 32.11, 29.98, 29.94, 29.75, 29.60, 29.51, 29.4, 28.93, 27.53, 22.93, 14.40.

<8-2> 2- 도데실운데칸 -1-올(2- dodecylundecan -1- ol ) (화합물 16)의 합성

상기 실시예 2-2의 방법에 따라 디알킬화 모노에스터의 환원 반응을 수행하여 2-도데실운데칸-1-올(2-dodecylundecan-1-ol) (화합물 16)을 83% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.53 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 1.45 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 1.36-1.18 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.4 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 65.7, 40.5, 31.9, 30.9, 30.1, 29.6, 29.3, 26.9, 22.7, 14.1.

<8-3> 2-(((2- 도데실운데실 ) 옥시 ) 메틸 )-2-( 히드록시메틸 )프로판-1,3- 디올 (2-(((2-dodecylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 20)의 합성

상기 실시예 2-3의 방법에 따라 2-(((2-도데실운데실)옥시)메틸)-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올(2-(((2-dodecylundecyl)oxy)methyl)-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol) (화합물 17)를 44% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl₃): δ 3.70 (s, 6H), 3.42 (s, 2H), 3.30 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 2.96 (s, 3H), 1.60-1.51 (m, 1H), 1.36-1.18 (m, 44H), 0.88 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 73.05, 71.77, 71.10, 69.78, 69.11, 68.03, 66.31, 64.72, 45.60, 45.11, 32.07, 29.88, 29.81, 29.66, 29.53, 28.64, 26.39, 21.87, 14.30.

<8-4> NDT - C12a의 합성

상기 실시예 2-4의 방법에 따라 글리코실레이션 반응을 수행하여 NDT-C12a를 65% 수율로 합성하였다. ¹H NMR (400MHz, CDCl3): δ 8.04-7.80 (m, 24H), 7.55-7.37 (m, 36H), 5.62 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.50 (t, J = 9.6 Hz, 3H), 5.37 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 4.39-4.34 (m, 6H), 4.01 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.78 (d, J = 9.6 Hz, 3H), 3.37-3.33 (m, 3H), 3.13-3.10 (m, 6H), 2.96-2.94 (m, 2H), 1.42-1.37 (m, 1H), 1.36-1.02 (m, 40H), 0.86 (t, J = 6.8 Hz, 6H) ); ¹³C NMR (100MHz, CDCl₃): δ 166.39, 166.09,165.96, 165.90, 165.35, 165.14, 164.75, 133.55, 133.43, 133.27, 133.16, 133.12, 130.10, 129.95, 129.89, 129.86, 129.75, 129.64, 129.20, 129.03, 128.96, 128.88, 128.47, 128.36, 101.53, 92.31, 90.50, 74.65, 74.13, 72.72, 72.34, 72.01, 71.70, 70.29, 69.55, 68.48, 67.70, 63.18, 62.93, 45.13, 37.97, 31.98, 30.25, 29.85, 29.75, 29.44, 26.90, 26.86, 22.74, 14.19.

<8-5> NDT -C12의 합성

상기 실시예 2-5의 방법에 따라 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 탄소수가 12개인 알킬기를 두 개 가지는 NDT-C12를 90% 수율로 합성하였다. ¹HNMR (400MHz, CD₃OD): δ 4.30 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 3.98 (d, J = 10.0 Hz, 3H), 3.84 (d, J = 12 Hz, 3H), 3.69-3.62 (m, 6H), 3.48 (s, 2H), 3.34-3.21 (m, 10H), 3.18 (t, J = 8.0 Hz, 3H), 1.56-1.50 (m, 1H), 1.36-1.20 (m, 44H), 0.89 (t, J = 6.8 Hz, 6H); ¹³C NMR (100 MHz, CD₃OD):δ105.1, 78.0, 77.7, 76.0, 75.1, 71.5, 71.3, 70.6, 70.1, 62.7, 46.6, 39.3, 33.1, 32.5, 31.2, 30.8, 30.5, 27.9, 23.8, 14.6. HRMS (EI): calcd. for C₄₉H₉₄O₁₉[M+Na]⁺1009.6287,found 1009.6290.

< 실시예 3> TDTs 및 NDTs의 특성

상기 실시예 1의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 1 내지 4의 TDTs 및 상기 실시예 2의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 5 내지 8의 NDTs의 특성을 확인하기 위하여, TDTs 및 NDTs의 분자량(M.W.), 임계미셀농도(critical micellar concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R_h)을 측정하였다.

구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 소수성 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R_h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 DDM과 비교하여 표 1에 나타내었다.

Detergent	M.W .	CMC ( μM )	CMC ( wt% )	R _h (nm)
TDT-C9	902.1	47±1.5	0.0042±0.0001	3.4±0.4
TDT-C10	930.1	14±1.0	0.0013±0.0001	4.5±0.2
TDT-C11	958.2	11±1.5	0.0011±0.0001	37±8.0
TDT-C12	986.2	6.0±0.1	0.0006±0.0000	53±1.2
NDT-C9	903.1	26±4.0	0.0023±0.0004	3.1±0.1
NDT-C10	931.2	12±0.5	0.0011±0.0000	3.2±0.1
NDT-C11	959.2	6.1±1.8	0.0005±0.0002	3.5±0.0
NDT-C12	987.3	2.4±0.9	0.0002±0.0001	3.8±0.4
DDM	510.1	~170	~0.0087	3.4±0.0

TDTs 및 NDTs의 CMC 값은 DDM 보다 훨씬 작았다. 가장 긴 알킬 사슬 (C12)을 가지고 있는 TDT-C12 및 NDT-C12의 CMC 값은 DDM 보다 100배 이상 작았다. 따라서, TDTs 및 NDTs는 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로, DDM 보다 용해성이 좋음을 확인할 수 있었다. 또한, TDTs의 CMC 값은 같은 알킬 사슬을 가지는 NDTs 보다 큰 값을 가졌다. 그리고 TDTs 및 NDTs의 CMC 값은 알킬 사슬의 길이가 길어짐에 따라 감소하는 경향을 보였는데, 이는 알킬 사슬이 길어지면 소수성(hydrophobicity)이 증가하는 것에 의하여 설명될 수 있다.

NDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 DDM과 거의 비슷한 수준으로 3.1~3.8 nm의 범위에 있었다. 반면에, TDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 3.4~52.5 nm로 범위가 넓었다. 그러므로, TDTs와 NDTs 간의 화학적 구조(즉, 아마이드(amide) 또는 에터(ether))의 작은 차이가 수용액에서 자가-응집 형태에 상당한 영향을 미침을 알 수 있었다. TDTs 및 NDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 알킬 사슬 길이가 증가함에 따라 증가하였다.

한편, TDTs 및 NDTs에 의해 형성된 미셀의 크기 분포를 DLS를 이용해 측정해본 결과를 도 5에 나타내었다. TDTs 또는 NDTs는 각각 0.5 wt%로 사용되었다. 그 결과, TDTs 또는 NDTs의 미셀은 하나의 군집을 가지는 것으로 측정되었다.

이러한 결과로부터 본 발명의 TDTs 또는 NDTs는 DDM 보다 낮은 CMC 값을 가져 적은 양으로도 미셀이 용이하게 형성되므로 자가조립경향성이 DDM 보다 훨씬 크며, NDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 DDM과 비슷한 반면, TDTs에 의해 형성된 미셀의 크기는 알킬 사슬의 길이에 따라 차이가 커서, TDTs와 NDTs의 작은 구조적 차이에 의해 자가-응집 형태에 차이가 생김을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4> TDTs 및 NDTs의 막단백질 ( UapA ) 구조 안정화 능력 평가

수용액에서 TDTs 또는 NDTs에 의한 UapA(uric acid-xanthine/H⁺ symporter) 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. UapA의 구조적 안정성은 CPM assay를 이용하여 측정하였으며, TDTs, NDTs와 DDM 농도는 CMC + 0.04 wt%에서 측정하였다.

구체적으로, UapA 단백질은 아스페르길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 내의 요산(uric acid)-잔틴(xanthine)/H⁺ 동시수송체(symporter)이다. 단백질 안정성은 설프하이드릴(sulfhydryl)-특이적 형광단(fluorophore)인 CPM(N-[4-(7-Diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide)를 이용하여 형광 분광광도계(fluorescence spectroscopy)를 이용해 측정하였다. 시스테인 잔기의 프리(free) 설프하이드릴기는 단백질의 중심 안에 있으나, 단백질 풀림(unfolding)에 의해 용매에 접근 가능해진다. CPM은 프리 티올(thiol)과 반응하여 형광이 되고, 이에 의해 풀림 센서로 제공된다. 열 안정성 측정을 위해, 먼저 UapAG411V_△1-11은 사카로마이세스 세레비제(Saccharomyces cerevisiae) FGY217 균주에서 GFP 융합으로 발현되고, 샘플 버퍼(20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% DDM, 1mM xanthine) 내로 분리하였으며, 이는 J. Leung 등의 논문(Mol . Membr . Biol . 2013, 30, 32-42)에 기재된 방법을 따랐다. UapA 단백질은 100 kDa 분자량 컷 오프(cut off) 필터(Millipore)를 이용하여 약 10 mg/ml로 농축하였다. 농축된 단백질은 Greiner 96-well 플레이트에서 CMC+0.04 wt% 또는 CMC+0.2 wt%의 농도로 DDM, TDTs 또는 NDTs를 각각 포함하는 버퍼로 1:150으로 희석하였다. DMSO (sigma)에 저장된 CPM 염료 (Invitrogen)을 염료 버퍼 (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% DDM, 5 mM EDTA)에 희석시키고, 3㎕의 희석된 염료를 각각의 단백질 테스트 조건에 첨가하였다. 반응은 120분 동안 40℃에서 마이크로플레이트 스펙트로플루오로미터를 이용하여 모니터하였다. 40℃에서 130분 후에 남아있는 상대적인 접힌 단백질의 비율을 계산하기 위해 상대적인 최대 형광을 이용하였다. 상대적인 접힌 단백질은 GraphPad Prism을 이용하여 시간에 따라 나타냈다.

도 6은 양친매성 분자를 CMC+0.04 wt% 농도로 사용하였을 때 TDTs (도 6a) 또는 NDTs (도 6b)에 의한 UapA 단백질의 구조적 안정성을 측정한 결과이다. TDTs 또는 NDTs에 의해 접힌 UapA의 양은 DDM 보다 많았다. 아마이드 결합을 가지고 있는 TDTs는 단백질(UapA)의 접힌 상태를 유지하는 것이 DDM 보다 모두 우수하였다. NDTs 또한 UapA의 안정성이 DDM 보다 우수하였으며, TDTs 보다도 단백질 안정화 효과가 우수하였다. 특히 모든 양친매성 분자 중에 NDT-C11의 효과가 가장 우수하였다.

도 7은 양친매성 분자를 CMC+0.2 wt% 농도로 사용하였을 때 TDTs (도 7a) 또는 NDTs (도 7b)에 의한 UapA 단백질의 구조적 안정성을 측정한 결과이다. 전체적인 경향은 CMC+0.04 wt%와 유사하였으나, 양친매성 분자가 가지고 있는 결합(아마이드 또는 에터 결합)의 종류에 따라 단백질 안정성에 있어서 차이가 컸다. DDM 보다 TDTs가 현저하게 우수하였으며, NDTs는 TDTs 보다도 우수하였고, 특히 NDT-C11의 UapA 단백질 안정화 효과가 가장 우수하였다.

도 8은 양친매성 분자를 CMC+0.2 wt% 농도로 사용하였을 때 NDT-C11, MNG-3, DDM에 의한 UapA 단백질의 구조적 안정성을 측정한 결과이다. UapA 단백질의 접힌 상태를 유지하는 데 있어서, NDT-C11은 MNG(maltose-neopentyl glycol amphiphiles) 중에 가장 효과가 좋은 것으로 알려진 MNG-3보다 더 우수한 효과를 보여주었다(본 발명자의 논문 Nat. Methods., 2010, 7, 1003-1008 참조).

이러한 결과로부터 TDTs 및 NDTs는 높은 농도에서도 UapA 구조 안정화 능력이 매우 우수하며, 특히 NDTs는 TDTs 보다 UapA의 접힌 상태를 유지하는 효과가 더 우수하므로, 막단백질을 추출하거나 안정화시키는 데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 5> TDTs 및 NDTs의 막단백질 ( MelB ) 구조 안정화 능력 평가

<5-1> SDS-PAGE 및 웨스턴 면역블롯팅 실험

TDTs 또는 NDTs에 의한 MelB(Salmonella typhimurium melibiose permease) 단백질의 추출 효율과 구조적 안정성을 측정하는 실험을 하였다. MelB 단백질을 TDTs, NDTs 또는 DDM을 사용하여 추출 후, 추출된 단백질의 양과 그 구조를 SDS-PAGE와 웨스턴 면역블롯팅(Western immunoblotting)을 통해 정량적으로 분석하였다. 사용한 양친매성 분자의 농도는 1.5 wt%이며, 4개의 온도 (0, 45, 55 또는 65℃)에서 90분 동안 단백질을 추출하여 양친매성 분자의 단백질 추출 효율과 안정화 능력 두 가지 성능을 동시에 평가하였다.

구체적으로, 본 발명자의 2013년 논문(P. S. Chae, et al., Chemistry. 2013, 19, 15645-15651.)에 기재된 방법에 따라, C-말단에 10-His tag를 가지는 wild-type MelB를 암호화하는 플라스미드 pK95△AHB/WT MelB_St/CH10 및 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium) DW2 세포 (△melB 및 △lacZY)를 이용하여 단백질(MelB_st)을 생산했다. A. S. Ethayathulla 등의 논문(Nat. Commun. 2014, 5,　3009)에 기재된 방법에 따라 세포 성장 및 멤브레인 준비를 수행했다. 단백질 분석은 Micro BCA 키트 (Thermo Scientific, Rockford, IL)로 수행했다. 용해화(solubilization)/안정성(stability)을 측정하기 위하여, MelB_St를 포함하는 멤브레인 샘플 (최종 단백질 농도는 10 mg/mL)을 용해화 버퍼 (20 mM sodium phosphate, pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 20 mM melibiose) 및 1.5% (w/v) DDM, TDTs 또는 NDTs와 함께 혼합했다. 추출물을 4개의 다른 온도(0, 45, 55 및 65 ℃)에서 90분 동안 배양했다. 45분 동안 4 ℃에서 TLA-100 rotor를 이용하여 Beckman Optima™ MAX 초원심분리기로 355,590g에서 초원심분리한 후, 20 ㎍ 단백질을 SDS-16% PAGE에 의해 분리하고, 그 다음 Penta-His-HRP 항체 (Qiagen, Germantown, MD)로 면역블로팅했다.

도 9는 0℃에서의 SDS-PAGE와 웨스턴 면역블롯팅 결과이다. TDT-C12 및 NDT-C12를 제외한 모든 TDTs 및 NDTs는 0℃에서 멤브레인으로부터 MelB 단백질을 추출하는 효율이 우수하였다. TDT-C12 및 NDT-C12의 용해화 효과가 다소 떨어지는 이유는, 낮은 온도에서 TDT-C12 및 NDT-C12가 하이드로젤(hydrogel)을 형성하는 경향을 보이기 때문인 것으로 판단된다.

도 10은 0, 45, 55, 65℃에서의 SDS-PAGE와 웨스턴 면역블롯팅 결과이다. 45℃에서 90분 동안 인큐베이션한 후에, TDTs 또는 NDTs에 의해 용해화된 MelB의 양은 DDM에 의해 용해된 양과 비슷하였다. 특히 TDT-C12 및 NDT-C12는 온도가 증가함에 따라 MelB 단백질 용해화 효과가 증가하는 것을 보여주었다. 이는 온도가 증가함에 따라 하이드로젤의 형성이 감소하는 경향에 따른 결과인 것으로 판단된다. 55℃의 온도에서, DDM에 의해 용해된 MelB는 거의 검출되지 않은 반면, 모든 TDTs에 의해 용해된 MelB 단백질이 검출되었으며, 특히 TDT-C11에 의해 용해된 단백질의 양은 65%였다. 모든 NDTs는 TDTs 또는 DDM 보다도 우수한 MelB 단백질 용해화 능력을 보여주었고, 특히 NDT-C11이 가장 우수하였다.

<5-2> Forster 공명에너지전이 (FRET) 측정

양친매성 분자에 의해 용해된 MelB 단백질의 기능적 상태를 확인하기 위하여, 트립토판(tryptophans, Trp)에서 형광 리간드 2'-(N-dansyl)aminoalkyl-1-thio-β-D-galactopyranoside(D²G)로의 forster 공명에너지전이 (forster resonance energy transfer, FRET)를 측정하였다. 이 실험의 원리를 설명하면 다음과 같다. D²G가 결합된 MelB 단백질은 FRET 쌍 (Trp 와 D²G)의 밀접한 거리 때문에 에너지전이에 의해 형광을 띤다. 그러나, 양친매성 분자에 의해 용해된 단백질이 활성을 띤다면, 멜리비오스(melibiose)를 추가했을 때, 멜리비오스가 결합된 D²G 분자를 대체하기 때문에 더 이상 에너지 전이가 일어나지 않고 따라서 형광 강도가 감소한다. 따라서, Trp에서 D²G FRET이 멜리비오스에 의해 전환(reversal)이 일어나는 것을 통해 DDM 또는 NDT-C11에 용해된 MelB 단백질이 활성을 띠는지 알아볼 수 있어 양친매성 분자의 막단백질 구조 안정화를 측정할 수 있는 효율적인 방법이다.

구체적으로, RSO(Right-side-out) 멤브레인 베지클은 MelB_St 또는 MelB_Ec를 함유하는 E.coli DW2 세포로부터 삼투압 용해에 의해 준비하였고, 100 mM KP_i (pH 7.5)로 재현탁하고, -80℃에서 저장하였다. D²G는 H. Ronald Kaback 및 Gerard Leblanc로부터 제공받았다. 100 mM KP_i, pH 7.5, 및 50 mM NaCl 내 RSO 멤브레인 베지클은 1 mg/ml 단백질 농도를 가지는데, 이를 DDM 또는 NDT-C11 (1.0 wt%)로 23℃에서 30분 동안 용해화시키고, TLA 120.2 rotor를 이용하여 >300,000g로 45분 동안 4℃에서 초원심분리하였다. 용해된 분획물(상층액)은 Amico-Bowman Series 2 (AB2) spectrofluorometer를 이용한 Trp→D²G FRET 측정에 사용하였다. Trp 잔여물은 290 nm에서 여기되고, 방출은 MelB_Ec는 465 nm, MelB_St는 490 nm에서 측정되었다. FRET을 측정하기 시작한 후 1분 후에 10 μM의 D²G를 넣어주고 2분 후에는 과량의 멜리비오스 또는 동량의 물을 넣었다. 양친매성 분자에 용해화된 단백질은 D²G의 첨가에 의해 이 분자와 결합하고 이 상태에서 과량의 멜리비오스를 넣으면 단백질의 구조 변성도에 따라 다른 결과를 초래한다. 구조가 안정화된 단백질은 멜리비오스와 강한 결합력을 갖고 있어 D²G 대신에 활성자리에 결합하여 D²G는 결합자리에서 떨어져나와 더 이상의 FRET이 일어나지 않아 그 형광 강도가 감소하는 반면, 구조가 변형된 단백질의 경우에는 추가로 넣어준 멜리비오스와 결합성을 잃어버리므로 FRET 세기에 변화가 없다.

도 11은 DDM 또는 NDT-C11로 용해된 MelB 단백질의 FRET 결과이다. DDM과 NDT-C11은 기능성 MelB_St 단백질을 생산하였고, 이는 이전 연구에서 MNG-3을 이용하였을 때와 유사한 결과였다(본 발명자의 논문 Biochemistry 2015, 54, 5849-5855 참조). 양친매성 분자의 효율을 구별하기 위하여, MelB_St 보다 덜 안정한 MelB_Ec를 비교군으로 사용하였다. DDM으로 추출하였을 때, MelB_Ec 단백질은 멜리비오스와의 결합성을 완전히 상실하였다. 반면, NDT-C11로 용해화된 MelB_Ec는 기능성을 효과적으로 유지하였다. 이러한 결과는 DDM은 더 안정한 MelB_St에서만 오직 효과적인 반면, NDT-C11이 MelB_St 및 MelB_Ec 모두의 멜리비오스 결합 활성을 유지할 수 있음을 보여준다.

이러한 결과로부터 본 발명의 TDTs 또는 NDTs는 DDM 보다 MelB 단백질 안정화 능력이 우수하고, MelB 단백질 추출 효율이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> TDTs 및 NDTs의 막단백질 ( LeuT ) 구조 안정화 능력 평가

<6-1> NDTs에 의한 LeuT 단백질의 안정성 측정

TDTs 또는 NDTs에 의한 LeuT (leucine transporter) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. LeuT 단백질 활성도를 리간드([³H]-Leu)를 활용한 SPA (scintillation proximity assay)에 의해 측정하였으며, TDTs, NDTs 또는 DDM의 농도는 (a) CMC + 0.04 wt%, 또는 (b) CMC + 0.02 wt%를 사용하였다.

구체적으로, LeuT 안정성 측정 실험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. UapA 및 MelB의 결과에 따라, 본 발명에 따른 양친매성 분자는 TDT-C11, TDT-C12, NDT-C10, NDT-C11 및 NDT-C12만을 선택하여 사용하였다. G.Deckert 등의 논문(Nature 1998, 392, 353-358.)에 게재된 방법에 따라, 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus)로부터 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)의 정제를 수행하였다. LeuT는 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41(DE3)에서 발현된다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA에 의해 제공받음). 요약하면, MelB 단백질을 분리하고, 1.0 wt% DDM에 용해화한 후에, 단백질을 Ni² ^+-NTA resin (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05 % DDM 및 300 mM 이미다졸로 용출시킨다. 그 다음, 약 1.5 mg/ml 단백질 스톡(stock)을 DDM 및 이미다졸이 없으나 TDTs, NDTs 또는 DDM (대조군)을 최종 농도가 CMC + 0.04 wt% 또는 CMC + 0.2 wt%가 되도록 보충한 동등한 버퍼에 10배 희석하였다. 단백질 샘플은 상온에 저장하고, 지정된 시간에 원심분리하였으며, 단백질 활성은 SPA (scintillation proximity assay) (M. Quick et al., Proc . Natl , Acad . Sci . U.S.A . 2007, 104, 3603-3608.)를 이용하여 [³H]-Leu 결합을 측정하였다. 200 mM NaCl 및 각각의 테스트 화합물을 함유하는 버퍼에 녹아 있는 5 μL의 각각의 단백질 샘플로 분석을 수행하였다. 20 nM [³H]-Leu 및 copper chelate (His-Tag) YSi beads (둘 모두 PerkinElmer, Denmark 로부터 구매함)의 존재 하에 SPA 반응을 수행하였다. [³H]-Leu 결합은 MicroBeta liquid scintillation counter (PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다.

도 12에 나타난 결과와 같이, 테스트한 TDTs 및 NDTs는 모두 두 가지 농도에서 DDM 보다 우수한 LeuT 단백질 안정화 능력을 나타냈다. 특히, CMC+0.04wt% 농도에서는 NDT-C11가 가장 우수하였고(도 12a), CMC+0.2 wt% 농도에서는 NDT-C10 및 NDT-C12가 우수하였다(도 12b).

<6-2> NDTs에 의한 LeuT 단백질의 구조적 유연성 측정

LeuT 안정성 측정에 더하여, 본 발명자들은 트랜스포터의 구조적 유동성을 보존하는 NDT-C11의 능력을 측정하는 실험을 하였다.

그 원리는 다음과 같다. 시스테인(cysteine) 잔기를 LeuT의 192번 위치에 삽입하고 (E192C), 티올-반응성 형광단 (tetramethylrhodamine-5-maleimide, TMR)과 커플링하였다. 이렇게 제조한 TMR-결합된 LeuT인 LeuT E192C^TMR은 리간드 결합에 반응하는 단백질 구조적 변화를 민감하게 모니터링하는 매우 좋은 시스템이다. 생물학적 리간드인 류신이 LeuT의 활성자리에 결합하면 단백질은 형태적 변화를 일으키고, 이러한 형태적 변화로 인해 LeuT에 결합한 TMR이 이동하게 되어 수용액 환경에 더 노출되게 되어 소수성 환경에서 친수성 환경으로의 변화가 일어난다. 그러므로 이러한 변화로 수용액에 노출된 TMR 형광분자는 물에 용해되는 퀀처(quencher)인 요오드화물 (iodide, I^-)과 거리가 가까워져 강한 형광 퀀칭이 일어나게 된다. 류신 결합에 따른 TMR 퀀칭 강도는 스턴볼머(Stern-Volmer) 플롯으로 표현 가능하며 이를 통해 단백질의 구조적 유연성을 직접적으로 측정할 수 있다. TMR-라벨된 트랜스포터의 리간드 결합성은 SPA를 이용하여 [³H]류신의 양을 증가시키면서 측정하였다.

구체적으로, 구조, 발현, 정제 및 형광 라벨링은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. C. B. Billesbolle 등의 논문(J. Biol . Chem . 2015, 290, 26725-26738)에 기재된 방법에 따라, 류신 트랜스포터 돌연변이 (LeuT E192C^TMR)를 생성하고, 정제하고, 라벨링하였다. 요약하면, E192의 잔기는 QuikChange(Agilent Technologies)를 이용하여 시스테인(cysteine)으로 돌연변이시켜서 말레인이미드(maleimide) 라벨링을 통해 형광 커플링이 가능하도록 하였다. LeuT 변이체는 E.coli C41 (DE3)에서 발현시켰다. 멤브레인은 붕괴(disruption)에 의해 분리하였고, LeuT는 1%(w/v) DDM으로 용해화하였으며, 그 후 양친매성 분자로 용해화된 LeuT는 Chelating Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 고정시키고, 테트라메틸로다민-5-말레인이미드 (tetramethylrhodamine-5-maleimide, TMR, Life Technologies, Carlsbad, California, USA)로 16시간 동안 4℃에서 세척하였다. 그 후, LeuT는 300 mM 이미다졸, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM NaCl, 199 mM KCl 및 0.05% DDM을 함유하는 버퍼로 용리하였다.

방사능리간드 결합은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 결합 측정은 Scintillation Proximity Assay (SPA)를 이용하여 수행하였다. 정제된 LeuT E192C^TMR은 버퍼 A (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 100 μM TCEP)와 CMC+0.04% 농도의 DDM 또는 NDT-C11로 희석하고, 정해진 농도의 [³H]류신 (25.1 Ci mmol^-1, PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, USA)과 0.125 mg ml^-1 YSi-Cu Histag SPA beads (PerkinElmer)와 혼합하였다. 데이터는 비-선형 회귀로 분석하였고, 단일-사이트 쌍곡선 함수로 맞추어졌다.

형광 분광(Fluorescence Spectroscopy)은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 형광-기반 실험은 0.5μg ml^-1 형광 라벨된 LeuT를 CMC+0.04 wt% DDM, MNG-3 또는 NDT-C11로 보충된 버퍼 A로 희석하여 수행하였다. LeuT의 부분 표본에 류신을 농도별로 첨가한 후, 상온에서 1시간 동안 shaker에서 배양하였다. 지속적인 상태의 형광 강도를 FluoroMax4 (Horiba Scientific, Edison, New Jersey, USA)로 방출 파장 572 nm, 여기 파장 552 nm에서 25℃에서 기록하였다. Quencher-titration은 10 mM Na₂S₂O₃으로 보충된 버퍼 A 내에 1M KI를 함유하는 작은 부분 표본의 연속적인 추가에 의해 수행하였다. 형광 강도 (F)는 샘플 희석에 따른 농도 감소를 보정하였고, 샘플의 최초 강도 (F₀)로 정규화하였다. 모든 데이터는 직선- (스턴볼머(Stern-Volmer) 플롯) 또는 비직선 회귀로 GraphPad Prism 6.0 (GraphPad Software)를 이용하여 분석되었다. 요오드화물 (I^-) 접근성(accessibility)의 정도는 하기 스턴볼머 관계식으로부터 얻었다: F₀/F = 1 + K _sv x [Q], 여기에서 F₀/F는 정규화된 형광 퀀칭(quenching)이고, K _sv 는 스턴볼머 상수이고, [Q]는 퀀처(quencher) 농도이다. 평균이 로그자로 계산되었을 때, 평균은 pIC₅₀ 및 pIC₅₀ ± s.e.m으로부터 [s.e.m. 간격]으로 나타내었다.

방사능리간드 결합 상수는 SPA 포화 결합 실험에 의해 계산되었다. 요오드화물 퀀칭-반응 상수 및 ΔK_sv의 값은 site-directed 형광 퀀칭 분광학 실험에 의해 계산되었다. 친화도(K_d)는 평균±s.e.m으로 나타내었고, ΔK_sv는 표준 [s.e.m. 간격]으로 나타내었다. 모든 데이터는 3~4번 독립적인 실험의 평균이다.

TMR-라벨된 트랜스포터의 리간드 결합도를 SPA를 이용하여 [³H]류신의 증가하는 농도에 따라 측정하여 도 13a에 나타내었다. 방사능리간드 결합 상수 및 요오드화물(iodide) 퀀칭-반응 상수를 하기 표 2에 나타내었다. LeuT E192C^TMR의 형광 퀀칭은 다양한 류신 농도하에서 요오드화물(iodide)의 농도를 점차적으로 증가시켜 측정하였는데, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 이 데이터로부터, 추가된 류신 농도에 따른 스턴볼머 상수 (K _sv) 변화를 함수로써 도 13b에 나타내었다.

도 13, 도 14 및 표 2에 나타난 결과를 종합적으로 검토하였다. NDT-C11로 용해화된 트랜스포터는 K _d 값이 DDM으로 용해화된 단백질 보다 다소 낮았는데, 이는 리간드인 류신에 보다 강하게 결합함을 의미한다(표 2). K _sv 와 [Leu]의 플롯으로부터 확인한 결과, DDM, NDT-C11, MNG-3으로 각각 용해화된 트랜스포터는 류신 농도에 따라 포화 반응을 보여주었고 EC₅₀ 값은 각각 163 nM, 41 nM, 94 nM로 측정되었다(표 2). 관찰된 EC₅₀ 값은 SPA에 의해 측정된 [³H]류신 친화도와 대응된다. I^- 에 의한 상대적인 TMR 접근성의 변화 (ΔK _sv)는 양친매성 분자 미셀에 의한 단백질 구조적 변화의 제한 정도에 대한 지표로써 주어질 수 있다. K_sv 값은 NDT-C11이 0.9 M^-1이고, DDM이 1.1 M^-1이어서 유사하였으나, MNG-3은 훨씬 작은 0.4 M^-1을 나타내었다(표 2). 이러한 데이터로부터, MNG-3과는 대조적으로, NDT-C11은 DDM과 유사하게 LeuT 단백질의 구조적 유동성을 잘 유지함을 유추할 수 있었다. 또한, 흥미롭게도 류신이 존재하지 않을 때 K_sv는 DDM과 비교하여 NDT-C11에서 현저하게 증가하였다(DDM의 1.6에서 NDT-C11의 2.5까지 증가). 이는 리간드와 결합하지 않은 LeuT 단백질의 초기 TMR의 수용액 접근성이 NDT-C11에서 더 크게 나타나고, 이로부터 이 양친매성 분자들에 LeuT 단백질이 덜 둘러싸인 것으로 판단하였다. 즉, NDT-C11은 이 단백질의 친수성 부분 (특히 세포내 루프(loop) 영역)을 덜 점유하여 이 부분이 더 외부로 노출되어 있어 단백질 결정화를 촉진할 것으로 기대하고 있다. 막단백질의 친수성 부분이 수용액에 많이 노출될수록 단백질 결정이 잘 형성되는 경향이 있기 때문이다.

이러한 결과로부터, NDT-C11은 LeuT 단백질 안정화에 있어서 DDM 보다 우수하고 그 효력이 MNG-3과 비슷하면서도, DDM에서 관찰되는 LeuT 단백질 구조적 유연성은 그대로 유지하므로, 양친매성 분자로서의 능력이 우수함을 확인할 수 있었다. MNG-3는 막단백질 안정화에는 탁월하지만 단백질의 구조적 유동성을 크게 제한하는 경향이 있다. 따라서 NDT-C11은 막단백질 구조 결정에 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 막단백질의 구조적 유동성을 요구하는 단백질 기능연구에도 널리 활용될 것으로 기대된다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 C₃-C₂₀의 알킬기, C₃-C₂₀의 사이클로알킬기, 또는 C₃-C₂₀의 아릴기이고;
상기 X¹, X²및 X³는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이고;
상기 Y는 -CH₂O- 이고; 그리고
상기 Z는 존재하지 않는다(absent).
제 1항에 있어서, 상기 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 당류는 글루코스(glucose)인 화합물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 그리고 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 6, 화학식 7, 화학식 8 또는 화학식 9로 표시되는 것인 화합물:

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]

[화학식 9]
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.1μM 내지 500μM인 화합물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물.
제 9항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
1) 디메틸말론산염(dimethylmalonate)에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)을 생성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 데메톡시 카르보닐레이션(demethoxy carbonylation) 반응을 수행하여 디알킬화 모노에스터(dialkylated monoester)를 생성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)을 첨가하여 아마이드(amide) 링커를 도입하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 NH이고; 그리고 상기 Z는 O이다.
1) 디메틸말론산염(dimethylmalonate)에 알킬 아이오다이드(alkyl iodide)를 첨가하여 디알킬화 디메틸말론산염(dialkylated dimethylmalonate)을 생성하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 디알킬화 에스터(dialkylated ester)를 환원하는 반응을 수행하여 디알킬화 모노-올(dialkylated mono-ol)을 생성하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 생성물에 4-(브로모메틸)-l-메틸-2,6,7-트리옥사바이사이클로[2.2.2]-옥탄(4-(bromomethyl)-l-methyl-2,6,7-trioxabicyclo[2.2.2]-octane)를 첨가하여 에터(ether) 링커가 도입된 디알킬화 트리-올(dialkylated tri-ol)을 생성하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 생성물에 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 생성물에 탈보호기화(deprotection) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)이고; 상기 Y는 -CH₂O- 이고; 그리고 상기 Z는 존재하지 않는(absent) 것이다.
수용액에서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
상기 R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 C₃-C₂₀의 알킬기, C₃-C₂₀의 사이클로알킬기, 또는 C₃-C₂₀의 아릴기이고;
상기 X¹, X²및 X³는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이고;
상기 Y는 -CH₂O- 이고; 그리고
상기 Z는 존재하지 않는다(absent).
삭제
제 13항에 있어서, 상기 R¹ 및 R²는 C₇-C₁₄ 알킬기이고; 상기 R¹ 및 R²는 동일하고; 상기 X¹ 내지 X³은 산소로 연결된 글루코스(glucose)인 것인 방법.
제 13항에 있어서, 상기 막단백질은 UapA (uric acid-xanthine/H⁺ symporter), MelB (melibiose permease), LeuT (Leucine transporter), GPCRs(G-protein coupled receptors) 또는 이들의 2 이상의 조합인 방법.