KR101778687B1

KR101778687B1 - 새로운 데옥시콜레이트 기반의 양친매성 화합물 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101778687B1
Application number: KR1020150148737A
Authority: KR
Inventors: 채필석; 배형은
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2015-10-26
Filing date: 2015-10-26
Publication date: 2017-09-27
Also published as: KR20170048646A

Abstract

본 발명은 데옥시콜레이트 기반의 양친매성 화합물, 이의 제조방법 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 데옥시콜레이트 기반의 화합물을 이용하면 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고 작은 막단백질-미셀 복합체를 형성하여 막단백질 결정화 효과가 우수할 것으로 기대되며, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다. 막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이고, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타겟으로 하므로 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 막단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

Description

새로운 데옥시콜레이트 기반의 양친매성 화합물 및 이의 이용{Novel deoxycholate-linked amphiphiles and uses thereof}

본 발명은 새롭게 개발한 데옥시콜레이트(deoxycholate) 기반의 양친매성 화합물 및 이를 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법에 관한 것이다.

막단백질(membrain proteins)은 생물학적 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이 생체거대분자(bio-macromolecules)는 친수성 및 소수성 부분을 포함하므로, 막단백질을 지질 환경으로부터 추출하고, 수용액에서 용해화와 안정화시키기 위해서는 양친매성 분자가 필요하다.

막단백질의 구조 분석을 위해서는 양질의 막단백질 결정을 얻어야 하는데 이를 위해서는 수용액에서의 막단백질의 구조적 안정성이 선행되어야 한다. 막단백질 연구에 사용되어 온 기존의 양친매성 분자들의 개수는 100가지 이상으로 다수가 존재하지만 그 중 5개 정도만 막단백질 구조 연구에 활발히 활용되어 왔다. 이 5개의 양쪽성 분자는 OG (n-octyl-β-D-glucopyranoside), NG (n-nonyl-β-D-glucopyranoside), DM (n-decyl-β-D-maltopyranoside), DDM (n-dodecyl-β-D-maltopyranoside), 및 LDAO (lauryldimethylamine-N-oxide)를 포함한다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 하지만 이들 분자에 의해 둘러싸여 있는 막단백질은 그 구조가 쉽게 변성되거나 응집되어 그 기능을 빠르게 상실하기 때문에 이 분자들을 활용한 막단백질의 기능 및 구조 연구에 상당한 제한점이 있다. 이는 종래의 분자들이 화학구조가 간단하여 다양한 특성을 나타내주지 못하기 때문이다.

또한 3-[3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS)나 3-([3-Cholamidopropyl]dimethylammonio)-2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO)와 같은 콜린산(cholic acid)을 이용한 양친매성 분자들은 마일드(mild)한 물질로 알려져 있으나, 이를 이용할 경우 단백질 응집이 잘 일어나므로 이 물성의 개선이 필요하다. CHAPS나 CHAPSO는 친수성기가 설포베타인(sulfobetaine) 그룹이기 때문에 탄수화물을 포함하는 양친매성 분자보다 막단백질 안정성에서 뛰어나지 못했다. N,N'-Bis(3-D-gluconamidopropyl)cholamide (Big CHAP) 또는 N,N'-Bis(3-D-gluconamidopropyl)deoxycholamide (deoxy Big CHAP)의 경우, 비이온성 친수성기를 갖고 있지만, 열려있는 사슬구조이기 때문에 고리구조를 가지고 있는 글루코스나 말토오스에 비해 특성이 열등하여 사용에 한계가 있다. 따라서 새로운 구조를 통한 새롭고 우수한 특성을 지니는 새로운 양쪽성 물질 개발이 필요하다.

이에 본 발명자들은 막단백질 연구에 이용할 수 있는 새로운 양친매성 화합물을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

S. Newstead et al., Protein Sci. 17 (2008) 466-472. S. Newstead et al., Mol. Membr. Biol. 25 (2008) 631-638.

본 발명의 목적은 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물을 이용하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 구체예는 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, 상기 R¹, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C₁-C₄의 알킬기일 수 있고; 상기 L¹은 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기일 수 있고; 그리고 상기 X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, 상기 R¹, R²,X¹ 및 X²는 화학식 1에서 정의한 바와 같고; 그리고 상기 L¹ 및 L²는 각각 독립적으로 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기일 수 있다.

[화학식 3]

상기 화학식 3에서, 상기 R¹, L¹ 및 X¹은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

[화학식 4]

상기 화학식 4에서, 상기 L¹ 및 X¹은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

본 발명의 일 실시예에서, 데옥시콜레이트(deoxycholate)를 소수성기로 가지고, 당류(saccharide)를 친수성기로 가지는 화합물을 제공하며, 이를 "DCGs(Deoxycholate-based glycosides)"로 명명하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "데옥시콜레이트(deoxycholate)"는 데옥시콜린산(deoxycholic acid)이라는 일반명을 가지는 3α,12α-디하이드록시-5β-콜란-24-오인산(3α,12α-dihydroxy-5β-cholan-24-oic acid)의 염을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물에서 상기 데옥시콜레이트(deoxycholate)는 소수성기로 작용할 수 있다. 세 개의 알코올 작용기를 가지는 콜레이트(cholate)와 달리 상기 데옥시콜레이트에는 두 개의 알코올 작용기가 존재하므로, 막단백질과의 인력이 강화될 수 있다. 따라서 막단백질의 안정성을 향상시킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "당류(saccharide)"는 탄수화물 중에서 비교적 분자가 작고, 물에 녹아서 단맛이 나는 화합물을 의미한다. 당류는 당을 구성하는 분자의 수에 따라 단당류, 이당류, 다당류로 구분된다.

상기 구체예에서, 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)일 수 있고, 보다 구체적으로 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)일 수 있고, 보다 더 구체적으로 2개의 글루코스(glucose) 또는 1개의 말토오스(maltose)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물에서 상기 당류는 친수성기로 작용할 수 있다. 따라서 본 발명에 따른 화합물은 비이온성 친수성기를 도입하였기 때문에 이온성 친수성기를 가지는 양친매성 분자보다 막단백질 안정화 효력이 우수할 수 있다.

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 5 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물에서 R¹, R³ 및 R⁴는 수소이고; R²는 메틸기(C₁)이고; L¹은 직접결합이고; 그리고 X¹ 및 X²는 글루코스인 화합물을 "DCG-1"로 명명하였다. 즉, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 데옥시콜레이트를 소수성기로 가지고, 아마이드(amide) 링커를 가지며, 2개의 글루코스를 친수성기로 가질 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 5로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 5]

본 발명의 다른 실시예에서, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물에서 R¹및 R²는 메틸기(C₁)이고; L¹및 L²는 메틸렌기(C₁)이고; 그리고 X¹ 및 X²는 글루코스인 화합물을 "DCG-2"로 명명하였다. 즉, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 데옥시콜레이트를 소수성기로 가지고, 아마이드(amide) 링커를 가지며, 2개의 글루코스를 친수성기로 가질 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 6]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물에서 R¹은 메틸기(C₁)이고; L¹은 에틸렌기(C₂)이고; 그리고 X¹은 말토오스인 화합물을 "DCG-3"으로 명명하였다. 즉, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 데옥시콜레이트를 소수성기로 가지고, 아마이드(amide) 링커를 가지며, 1개의 말토오스를 친수성기로 가질 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 7로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 7]

본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물에서 L¹은 메틸렌기(C₁)이고; 그리고 X¹은 말토오스인 화합물을 "DCG-4"로 명명하였다. 즉, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 데옥시콜레이트를 소수성기로 가지고, 1개의 말토오스를 친수성기로 가질 수 있다. 따라서, 상기 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있다:

[화학식 8]

본 발명에 다른 구체예에 따른 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "양친매성 분자"란 한 분자 내에 소수성기와 친수성기가 존재하여 극성, 비극성 용매에 대해 2가지 성질 모두에 친화성을 갖는 분자를 의미한다. 계면활성제나 세포막에 존재하는 인지질 분자들은 한 끝에는 친수성기, 다른 끝에는 소수성기를 가진 분자로 양친매성을 갖고 수용액 중에서 미셀이나 리포좀을 형성하는 특징이 있다. 친수성기가 극성을 갖고 있으나 비극성기가 공존하기 때문에 이들의 양친매성 분자는 물에 잘 녹지 않는 경향이 있다. 그러나 농도가 어느 한계농도(임계 미셀 농도, CMC) 이상이 되면 소수성 상호작용에 의해 소수성기가 내부로 집합하여 친수성기가 표면에 존재하는 미셀이 생성되어 물에 대한 용해성이 증가한다.

CMC를 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용한 형광 염색 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 화합물은 수용액에서 임계 미셀 농도(CMC)가 0.1 mM 내지 2.0 mM일 수 있으며, 구체적으로, 0.5 mM 내지 1.5 mM, 보다 구체적으로, 0.7 mM 내지 1.3 mM, 예를 들어 0.8 mM 내지 1.2 mM일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

기존 양친매성 분자인 LDAO의 경우 임계 미셀 농도가 약 1.0 mM인 것과 비교하여 본 구체예의 DCGs는 기존 양친매성 분자와 비슷한 수준의 CMC 값을 가졌다. 따라서, DCGs는 기존의 양친매성 분자만큼 미셀 형성이 용이함을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 다른 구체예는 상기 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

상기 미셀은 반지름이 1.0 nm 내지 5.0 nm일 수 있고, 구체적으로 1.5 nm 내지 4.5 nm일 수 있으며, 보다 구체적으로 2.0 nm 내지 4.0 nm일 수 있고, 예를 들어 2.0 nm 내지 3.5 nm일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

미셀의 반지름을 측정하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 당해 기술분야에서 널리 알려진 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 이용해 측정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 DCG-1 또는 DCG-2는 미셀 사이즈가 작아서 기존 양친매성 분자인 GLCs, GDN, DDM 보다 2~8배 정도 작은 막단백질-미셀 복합체를 형성하므로, 막단백질 결정화 효과가 우수할 수 있다. 본 발명자의 선행연구에 의해 개발된 GLCs(glyco-lithocholate amphiphiles)는 소수성기에 알코올 작용기가 없으며, GDN(glyco-diosgenin)은 소수성기의 구조가 본 발명의 구체예들에 따른 화합물과 상이하다(미국 공개특허공보 2013-0266656 참조). 이러한 화합물의 구조적 차이에 의해 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 기존 양친매성 분자에 비해 우수한 막단백질 안정화 및 결정화 효과를 가질 수 있다.

상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 내부에 막단백질을 포함할 수 있다. 즉, 상기 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자는 세포막 내부에 존재하는 막단백질을 추출하여 감싸안을 수 있다. 따라서, 상기 미셀에 의하여 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 것이 가능하다.

상기 조성물은 막단백질의 추출, 용해화, 안정화 또는 분석에 도움이 될 수 있는 버퍼 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 하기 1) 내지 3)의 단계를 포함하는 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물의 화합물의 제조 방법을 제공한다:

1) 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체에 아미노알코올(aminoalcohol)을 첨가하여 아미드 커플링(amide coupling) 반응을 수행하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 생성물에 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosyl bromide) 또는 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드(perbenzoylated maltosyl bromide)를 첨가하여 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 생성물에 탈벤젠화(de-O-benzoylation) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서, 상기 R¹, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C₁-C₄의 알킬기일 수 있고; 상기 L¹및 L²는 각각 독립적으로 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기일 수 있고; 그리고 상기 X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 5 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 단계 1) 대신 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체의 카르복실산 작용기를 알코올 작용기로 환원시키는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물의 제조 방법을 제공한다:

[화학식 4]

상기 화학식 4에서, 상기 L¹은 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기일 수 있고; 그리고 상기 X¹는 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

즉, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물의 제조 방법은 하기 1) 내지 3)의 단계를 포함하는 제조방법일 수 있다:

1) 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체의 카르복실산 작용기를 알코올 작용기로 환원시키는 단계;

상기 화합물은 본 발명의 일 실시예에 따른 화학식 8로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.

상기 구체예들에 따른 제조 방법에 의하면, 쉽게 구할 수 있는 데옥시콜린산(deoxycholic acid)으로부터 간단한 방법으로 화합물을 합성할 수 있다. 이처럼 본 발명의 제조 방법에 의하면 본 발명자가 기존에 개발한 GLCs 와 GDN 양친매성 분자에 비해 합성이 매우 용이하여 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에서, 도 1에 기재된 합성 스킴에 따라 하기의 단계를 수행하여 DCG-1 내지 DCG-3을 제조하였다:

1) 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체인 화합물1에 아미노알코올(aminoalcohol), 1-하이드록시벤조트리아졸 모노하이드레이트 (HOBt), DMF 및 1-(3-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC·HCl)를 넣고 아미드 커플링 반응을 수행하여 화합물2, 3 또는 4를 얻는다.

2) 화합물 2, 3 또는 4에 CH₂Cl₂, AgOTf, 2,4,6-콜리딘(collidine), 및 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosylbromide) 또는 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드(perbenzoylated maltosylbromide)를 첨가하고 글리코실레이션 반응하여 생성물 DCG-1a, DCG-2a 또는 DCG-3a를 얻는다.

3) 생성물 DCG-1a, DCG-2a 또는 DCG-3a에 MeOH 및 NaOMe를 첨가하고 탈벤젠화(de-O-benzoylation) 반응하여 생성물 DCG-1, DCG-2 또는 DCG-3을 얻는다.

본 발명의 다른 실시예에서, 도 1에 기재된 합성 스킴에 따라 하기의 단계를 수행하여 DCG-4를 제조하였다:

1) 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체인 화합물1에 THF, NaBH₄ 및 I₂를 첨가하여 카르복실산 작용기를 알코올 작용기로 환원시키는 단계를 수행하여 화합물5를 얻는다.

2) 화합물5에 CH₂Cl₂, AgOTf, 2,4,6-콜리딘(collidine), 및 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드(perbenzoylated maltosylbromide)를 첨가하고 글리코실레이션 반응하여 생성물 DCG-4a를 얻는다.

3) 생성물 DCG-4a에 MeOH 및 NaOMe를 첨가하고 탈벤젠화(de-O-benzoylation) 반응하여 생성물 DCG-4를 얻는다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 수용액에서 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법을 제공한다:

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 1 내지 4에서, 상기 R¹, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C₁-C₄의 알킬기일 수 있고; 상기 L¹및 L²는 각각 독립적으로 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기일 수 있고; 그리고 상기 X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질"이란 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질의 총칭이다. 이는 세포막 전체 층을 관통하거나, 표층에 위치하거나, 세포막을 배접하는 등 여러 상태로 존재하고 있다. 막단백질의 예로 효소, 펩티드호르몬, 국소호르몬 등의 수용체, 당 등의 수용담체, 이온채널, 세포막 항원 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 막단백질은 세포막 지질이중층으로 이입되는 단백질 또는 당단백질이라면 어느 것이나 포함하며, 구체적으로 광합성 어셈블리(Rhodobacter capsulatus photosynthetic superassembly), LeuT(leucine transporter), GlpG(rhomboid intramembrane serine protease GlpG) 또는 이들의 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 추출"이란 막단백질을 세포막(membrane)으로부터 분리하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 용해화(solubilization)"란 물에 녹지 않는 막단백질을 수용액에서 미셀에 녹아들도록 하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 안정화(stabilization)"란 막단백질의 구조, 기능이 변하지 않도록 3차 또는 4차 구조를 안정하게 보존하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 결정화(crystallization)"란 용액에서 막단백질의 결정을 형성하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막단백질의 분석(analyzation)"이란 막단백질의 구조 또는 기능을 분석하는 것을 의미한다. 상기 구체예에서, 막단백질의 분석은 공지의 방법을 이용할 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 전자현미경(electron microscopy)을 이용하여 막단백질의 구조를 분석할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, DCGs에 의한 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(Photosynthetic superassembly) 구조 안정화 능력을 평가한 결과, DCGs는 DDM 또는 LDAO와 비교해서 박테리아 광합성 어셈블리(LHI-RC)에 장기간동안 구조적으로 안정성을 부여하였으며, 기존의 본 발명자가 개발한 DCAO-2와 CAO 보다도 더욱 우수한 단백질 안정성을 보여주었다. DCGs 중에서는 특히 DCG-1과 DCG-2가 LHI-RC 안정화 효과가 우수하였다.

본 발명의 일 실시예에서, DCGs에 의한 LeuT (leucine transporter) 단백질의 구조 안정성을 측정한 결과, DCG-1 및 DCG-2는 CAO 보다 LeuT 단백질 안정화 능력이 우수하고, 특히 DCG-1은 DDM과 동등 수준의 LeuT 단백질 안정화 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서, DCGs에 의한 GlpG (rhomboid intramembrane serine protease GlpG) 단백질의 수용액상에서의 구조 안정성을 측정한 결과, LDAO로 용해화된 GlpG 단백질은 급격히 변성되었으며, DDM으로 용해화된 GlpG 단백질은 서서히 변성되었다. 그러나, DCG-1 및 DCG-2는 DDM과 비교하여 매우 우수한 GlpG 단백질 구조 안정화 능력을 보여주었다.

이러한 결과로부터 DCG-1 및 DCG-2는 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(Photosynthetic superassembly), LeuT (leucine transporter) 또는 GlpG (rhomboid intramembrane serine protease GlpG) 단백질 연구에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 구체예들에 따른 데옥시콜레이트 기반의 화합물을 이용하면 기존 화합물 대비 막단백질을 수용액에서 장기간 안정적으로 보관할 수 있고, 이를 통해 그 기능분석 및 구조 분석에 활용될 수 있다.

막단백질 구조 및 기능 분석은 현 생물학 및 화학에서 가장 관심을 갖고 있는 분야 중 하나이며, 현재 개발되고 있는 신약의 절반 이상이 막단백질을 타겟으로 하고 있으므로, 신약 개발과 긴밀한 관계가 있는 단백질 구조 연구에 응용이 가능하다.

구체적으로, 본 발명의 구체예들에 따른 양친매성 분자는 소수성 부분에 두 개의 극성 그룹(하이드록시 그룹)이 존재하여 막단백질 안정화에 우수한 특성을 보여줄뿐만 아니라, 미셀 사이즈가 작아서 작은 막단백질-마이셀복합체를 형성하므로 막단백질 결정화에 탁월한 효과를 가진다.

또한, 본 발명의 구체예들에 따른 화합물은 쉽게 구할 수 있는 출발물질로부터 간단한 방법으로 합성이 가능하므로, 막단백질 연구를 위한 화합물의 대량 생산이 가능하다.

도 1는 본 발명의 실시예 1에 따른 DCGs의 합성스킴을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 DCGs (DCG-1, DCG-2, DCG-3, DCG-4) 및 기존에 개발된 양친매성 분자 CAO(cholate-based N-oxide)와 DCAO-2(deoxycholate-base N-oxide)의 화학 구조를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 DCGs (DCG-1, DCG-2, DCG-3)에 의한 수용액상에서 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(Photosynthetic superassembly) (LHI-RC)의 장기간 구조 안정성을 UV-Vis를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다:
(a) 양친매성 분자(DCG-1, DCG-2, DCG-3, DCAO-2, CAO, DDM, LDAO)의 농도가 CMC + 0.04 wt%; 및
(b) 양친매성 분자(DCG-1, DCG-2, DCG-3, DCAO-2, CAO, DDM, LDAO)의 농도가 CMC + 0.2 wt%.
도 4는 본 발명에 따른 DCGs (DCG-1, DCG-2)에 의한 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(Photosynthetic superassembly) (LHI-RC)의 20일간 구조 안정성을 UV-Vis를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다. 이때 양친매성 분자 (DCG-1, DCG-2, DCAO-2, CAO, DDM, LDAO)는 CMC + 1.0 wt%를 사용하였다.
도 5는 본 발명에 따른 DCG-1에 의해 추출된 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(Photosynthetic superassembly) (LHI-RC)의 15일간 구조 안정성을 UV-Vis를 이용하여 15일간 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 DCGs에 의한 LeuT 또는 GlpG 단백질의 구조적 안정성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다:
(a) LeuT 단백질의 구조적 안정성을 SPA에 의해 측정한 결과이며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.2 wt%를 사용함; 및
(b) GlpG 단백질의 구조적 안정성을 CPM assay에 의해 측정 결과이며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.04 wt%를 사용함.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> DCGs의 합성 방법

본 발명에 따른 화합물 DCGs의 합성 스킴을 도 1에 나타내었다. 하기 <1-1> 내지 <1-4>의 합성 방법에 따라 DCGs(Deoxycholate-based glycosides) 4종을 합성하여 도 2에 나타내었다. 도 2에는 화합물 구조의 비교를 위해 종래 화합물인 CAO(cholate-based N-oxide) 및 DCAO-2(deoxycholate-base N-oxide)를 함께 나타내었다.

<1-1> 아미드 커플링을 위한 일반적인 합성 절차 (step a; 화합물1 → 2,3,4)

화합물1은 D.Gargiulo, T.A. 등의 논문(Tetrahedron 1989, 45, 5423-5432)에 기재된 방법에 의해 합성하였다. 카르복실산 유도체 (화합물1; 3.8mmol), 아미노알코올(aminoalcohol; 7.6 mmol), 1-하이드록시벤조트리아졸 모노하이드레이트 (HOBt) (1.2g, 9.1 mmol)를 무수 DMF (30 mL)에 녹였다. 아미노알코올은 예를 들어 세린올 (serinol; 7.6 mmol)을 사용할 수 있다. 그리고 1-(3-(디메틸아미노)프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC·HCl) (1.7g, 9.1 mmol)를 0℃에서 넣어준 후, 그 결과 용액을 상온에서 20 시간 동안 섞었다. 용액에 EtOAc (100 mL)를 넣고, 1 M 수용액 NaHCO₃ (100 mL), 0.1 M 수용액 HCl (100 mL) 및 brine (2×100 mL)으로 연속적으로 세척하였다. 그리고 유기층을 무수 Na₂SO₄로 물을 제거하고, 회전 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane)를 이용하여 고체 상태의 알콜 유도체(화합물2, 3 또는 4)를 얻었다.

<1-2> NaBH ₄ 및 I ₂ 를 이용한 일반적인 환원 절차 (step b; 화합물1 → 5)

이는 J. V. B. Kanth 등의 합성 방법(J. Org. Chem. 1991, 56, 5964-5965)에 따랐다. 요약하면, 무수 THF (20 mL)에 아세틸 보호기를 가진 콜산(cholic acid) 유도체(화합물1, 1.0 equiv.)를 녹인 후, NaBH₄ (1.2 equiv.)를 상온에서 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물은 가스 발생이 더이상 일어나지 않을 때까지 섞었다. 아이오딘 (0.5 equiv.)을 0℃에서 천천히 첨가하고, 반응이 완료될 때까지 같은 온도에 두었다 (반응 진행은 TLC로 모니터함). 반응이 끝난 후, 1.0M HCl 용액을 반응 혼합물에 첨가하고, 그 결과 용액을 ether (2×100 mL)로 추출하였다. 혼합된 유기 층은 1M NaOH 용액 및 brine으로 세척하였다. 수집된 유기 층은 무수 Na₂SO₄로 물을 제거하고, 회전 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane)로 정제하여 고체 상태의 생성물(화합물5)을 얻었다.

<1-3> 글리코실레이션 반응을 위한 일반적인 합성 절차 (step c; 화합물 2,3,4,5 → DCG-1a, DCG-2a, DCG-3a, DCG-4a)

이는 P.R.Ashton 등의 합성 방법(Chem . Eur . J. 1996, 2, 1115-1128.)을 일부 수정하여 수행하였다. 무수의 CH₂Cl₂ (40 mL)에 알코올 유도체인 화합물 2,3,4 또는 5와 AgOTf, 2,4,6-collidine을 녹인 후, -45℃에서 섞어 주었다. 이 용액에 CH₂Cl₂ (40 mL)에 녹아 있는 perbenzoylated glucosylbromide 또는 perbenzoylated maltosylbromide 용액을 천천히 첨가하였다. -45℃에서 10분 동안 반응을 진행시킨 후, 천천히 0℃로 온도를 올려 90분 동안 섞어주며 반응을 진행시켰다. 반응이 끝난 후 (TLC에 의해 분석함), 혼합물에 피리딘(pyridine)을 넣고, 이를 CH₂Cl₂ (40 mL)로 희석한 다음, celite를 통해 여과했다. 여과된 액체를 1M 수용액 Na₂S₂O₃ (40mL)와 0.1M 수용액 HCl (40 mL) 및 brine (2×40 mL)을 이용하여 연속적으로 세척하였다. 그리고 유기 층을 무수 Na₂SO₄를 사용하여 물을 제거하고 회전 증발기를 이용하여 용매를 증발시켰다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (EtOAc/hexane)을 이용하여 잔여물을 순수 정제하여 유리성(glassy) 고체상태의 생성물(DCG-1a, DCG-2a, DCG-3a 또는 DCG-4a)을 얻었다.

<1-4> Zemplen 조건에서 de- O - benzoylation을 위한 일반적인 합성 절차 (step d; 화합물 DCG -1a, DCG -2a, DCG -3a, DCG -4a → DCG -1, DCG -2, DCG -3, DCG -4)

O-benzoylated 화합물(DCG-1a, DCG-2a, DCG-3a 또는 DCG-4a)을 MeOH에 용해시킨 후, 0.5M 메탄올성 용액(methanolic solution) NaOMe의 마지막 농도가 0.05M가 되도록 처리하였다. 반응 혼합물을 상온에서 5시간 동안 반응한 후, Amberlite IR-120 (H⁺ form) resin을 이용하여 중화시켰다. 여과에 의해 resin을 제거하고, MeOH로 세척하고, 회전 증발기를 이용하여 여과물에서 용매를 제거하였다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (MeOH/CH₂Cl₂)에 의해 잔여물을 순수 정제하였다. CH₂Cl₂/MeOH/diethyl ether를 이용하여 재결정화하여 더욱 순수한 하얀 고체 생성물 을 얻었다. 이렇게 얻은 생성물이 본 발명의 화합물 DCGs이다.

< 제조예 1> DCG -1의 합성

<1-1> 화합물2의 합성

실시예 1-1의 아미드 커플링을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, 화합물1로부터 (3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((R)-5-(1,3-디하이드록시-2-메틸프로판-2-일아미노)-5-옥소펜탄-2-일)-10,13-디메틸헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,12-디일-디아세테이트 ((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((R)-5-(1,3-dihydroxy-2-methylpropan-2-ylamino)-5-oxopentan-2-yl)-10,13-dimethylhexadecahydro-1R-cyclopenta[a]phenanthrene-3,12-diyl diacetate) (화합물2)를 90% 수득율(two steps)로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 6.01 (s, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.78-4.62 (m, 1H), 4.36 (br s, 1H), 3.64 (q, J = 11.7 Hz, 4H), 2.35-2.19 (m, 2H), 2.12 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.95-1.71 (m, 5H), 1.71-1.55 (m, 7H), 1.55-0.94 (m, 16H), 0.91 (s, 3H), 0.82 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.73 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 175.2, 170.8, 170.7, 76.1, 74.4, 67.5, 59.1, 50.0, 47.9, 45.2, 42.0, 35.8, 34.9, 34.6, 34.4, 34.2, 32.4, 31.8, 27.4, 27.0, 26.8, 26.0, 25.8, 23.6, 23.2, 21.6, 20.2, 17.9, 12.6; HRMS ( ESI ): calcd. for C₃₂H₅₃NO₇[M+Na]⁺ 586.3715, found 586.3737.

<1-2> DCG -1a의 합성

실시예 1-3의 글리코실레이션을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, 화합물2로부터 DCG-1a를 87%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.15-8.06 (m, 4H), 8.06-7.98 (m, 4H), 7.96-7.88 (m, 4H), 7.88-7.78 (m, 4H), 7.72-7.47 (m, 10H), 7.47-7.33 (m, 10H), 7.33-7.20 (m, 4H), 5.72-5.49 (m, 5H), 5.47-5.34 (m, 2H), 5.09 (br s, 1H), 4.80-4.62 (m, 1H), 4.57-4.44 (m, 2H), 4.44-4.31 (m, 2H), 4.14 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.03 (dd, J = 7.5 Hz, 3.7 Hz, 1H), 3.64 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 3.50-3.36 (m, 3H), 3.27 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 2.09 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.96-1.78 (m, 5H), 1.78-1.55 (m, 7H), 1.55-0.95 (m, 16H), 0.94-0.82 (m, 5H), 0.82-0.74 (m, 3H), 0.72 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 173.7, 170.7, 170.6, 166.2, 166.1, 165.9, 165.8, 165.2, 165.0, 133.9, 133.8, 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 133.2, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.2, 129.0, 128.9, 128.6, 128.5, 101.4, 76.1, 74.3, 72.6, 72.5, 72.1, 72.0, 71.9, 69.7, 69.6, 63.0, 60.5, 55.9, 49.6, 48.0, 45.2, 42.0, 35.8, 35.0, 34.9, 34.5, 34.3, 34.2, 32.4, 31.5, 27.5, 27.0, 26.8, 26.0, 25.8, 23.6, 23.2, 21.6, 21.5, 21.2, 18.5, 17.7, 14.3, 12.6; MS (MALDI-TOF): calcd. for C₁₀₀H₁₀₅NO₂₅[M+Na]⁺ 1742.3, found 1742.7.

<1-3> DCG -1의 합성

실시예 1-4의 de-O-benzolyation을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, DCG-1a로부터 DCG-1을 92%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 4.34 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 4.15 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.05-3.97 (m, 2H), 3.95-3.86 (m, 2H), 3.86-3.74 (m, 2H), 3.74-3.66 (m, 2H), 3.43-3.28 (m, 2H), 2.38-2.23 (m, 1H), 2.20-2.04 (m, 1H), 2.01-1.72 (m, 7H), 1.72-1.25 (m, 18H), 1.16-0.99 (m, 5H), 0.96 (s, 3H), 0.74 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CD₃OD): ): δ 177.2, 105.0, 104.9, 78.2, 78.1, 75.2, 74.2, 72.8, 72.7, 71.8, 62.9, 58.0, 57.9, 47.7, 43.8, 37.6, 37.3, 37.0, 36.6, 35.5, 35.0, 33.3, 31.2, 300, 28.9, 28.6, 27.6, 25.0; HRMS ( ESI ): calcd. for C₄₀H₆₉NO₁₅[M+Na]⁺ 826.4560, found 826.4583.

< 제조예 2> DCG -2의 합성

<2-1> 화합물3의 합성

실시예 1-1의 아미드 커플링을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, 화합물1로부터 (3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((2R)-5-(비스(2-하이드록시프로필)아미노)-5-옥소펜탄-2-일)-10,13-디메틸헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,12-디일 디아세테이트 ((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((2R)-5-(bis(2-hydroxypropyl)amino)-5-oxopentan-2-yl)-10,13-dimethylhexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,12-diyl diacetate) (화합물3)을 86% 수득율(two steps)로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 5.10 (s, 1H), 4.78-4.61 (m, 1H), 4.31-4.09 (m, 1H), 4.07-3.94 (m, 1H), 3.86-3.52 (br s, 2H), 2.55-2.15 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.96-1.77 (m, 4H), 1.77-1.54 (m, 8H), 1.54-0.96 (m, 19H), 0.91 (s, 3H), 0.82 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.73 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 176.3, 170.8, 170.7, 76.8, 76.2, 74.4, 66.7, 60.6, 58.7, 53.6, 49.6, 48.2, 48.1, 45.3, 42.1, 35.9, 35.2, 35.0, 34.9, 34.6, 34.3, 32.5, 31.3, 30.9, 27.6, 27.1, 26.8, 26.1, 25.9, 23.7, 23.3, 21.9, 21.8, 21.7, 21.6, 21.3, 20.9, 18.1, 18.0, 14.4, 12.7; HRMS ( ESI ): calcd. for C₃₄H₅₇NO₇[M+Na]⁺ 614.4028, found 614.4023.

<2-2> DCG -2a의 합성

실시예 1-3의 글리코실레이션을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, 화합물3으로부터 DCG-2a를 85%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.09-7.96 (m, 4H), 7.96-7.84 (m, 8H), 7.84-7.72 (m, 4H), 7.60-7.17 (m, 24H), 5.96-5.76 (m, 2H), 5.76-5.33 (m, 4H), 5.21?4.90 (m, 1H), 4.87-4.64 (m, 3H), 4.64-4.30 (m, 4H), 4.30-3.92 (m, 3H), 3.92-3.50 (m, 2H), 3.46-3.18 (m, 2H), 3.10-2.48 (m, 2H), 2.31-1.95 (m, 8H), 1.95-1.37 (m, 20H), 1.37-0.97 (m, 12H), 0.97-0.56 (m, 17H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 174.8, 174.5, 174.3, 173.3, 170.8, 170.6, 166.2, 165.9, 165.8, 165.4, 165.1, 165.0, 164.8, 164.7, 133.8, 133.7, 133.6, 133.5, 133.4, 133.3, 133.2, 133.1, 133.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.4, 129.2, 129.1, 129.0, 128.9, 128.7, 128.6, 128.4 ,102.2, 102.1, 101.8, 100.6, 99.7, 99.4, 78.7, 78.2, 78.0, 77.7, 76.3, 76.2, 76.0, 74.4, 74.2, 73.3, 73.1, 72.6,,72.4, 72.2, 72.1, 70.0, 69.6, 63.7, 63.5, 63.4, 63.0, 61.3, 54.7, 52.2, 49.6, 48.7, 48.4, 48.3, 47.9, 45.3, 45.2, 45.1, 42.1, 35.9, 35.5, 35.3, 34.9, 34.6, 34.2, 32.5, 31.6, 30.7, 30.6, 27.9, 27.7, 27.6, 27.1, 26.8, 26.1, 25.9, 23.8, 23.7, 23.3, 21.6, 20.0, 19.6, 19.0, 18.1, 18.0, 17.9, 17.4, 17.3, 12.7, 12.6 ; MS (MALDI-TOF): calcd. for C₁₀₂H₁₀₉NO₂₅[M+Na]⁺ 1770.4, found 1770.8.

<2-3> DCG -2의 합성

실시예 1-4의 de-O-benzolyation을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, DCG-2a로부터 DCG-2를 93%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 4.40-4.24 (m, 2H), 4.24-3.96 (m, 3H), 3.96-3.77 (m, 3H), 3.77-3.63 (m, 2H), 3.63-3.44 (m, 3H), 3.44-2.98 (m, 6H), 2.70-2.27 (m, 2H), 2.03-1.72 (m, 7H), 1.72-1.36 (m, 12H), 1.36-0.99 (m, 13H), 0.97 (s, 3H), 0.75 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 177.9, 177.8, 176.4, 103.8, 103.1, 77.1, 76.8, 76.7, 76.4, 75.2, 74.0, 72.9, 71.4, 70.4, 69.9, 61.5, 61.2, 46.4, 42.4, 36.3, 36.0, 35.8, 35.7, 35.3, 34.1, 33.7, 31.4, 30.4, 29.9, 28.7, 27.7, 27.2, 26.3, 23.7, 22.5, 19.2, 18.9, 17.6, 16.8, 16.7, 16.6, 12.1, 12.0; HRMS ( ESI ): calcd. for C₄₂H₇₃NO₁₅[M+Na]⁺ 854.4873, found 854.4869.

< 제조예 3> DCG -3의 합성

<3-1> 화합물4의 합성

실시예 1-1의 아미드 커플링을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, 화합물1로부터 (3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((R)-5-(2-하이드록시에틸아미노)-5-옥소펜탄-2-일)-10,13-디메틸헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,12-디일 디아세테이트올 ((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((R)-5-(2-hydroxyethylamino)-5-oxopentan-2-yl)-10,13-dimethylhexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,12-diyl diacetateol) (화합물4)를 85% 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 5.10 (s, 1H), 4.78-4.62 (m, 1H), 3.77 (q, J = 5.1 Hz, 2H), 3.59-3.41 (m, 2H), 3.25 (t, J = 5.1 Hz, 1H), 3.07 (s, 2H), 2.95 (s, 1H), 2.46-2.15 (m, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.97-1.71 (m, 5H), 1.71-1.54 (m, 7H), 1.54-0.94 (m, 13H), 0.91 (s, 3H), 0.83 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 0.73 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 175.8, 174.4, 170.8, 170.7, 76.1, 74.4, 62.0, 60.0, 52.0, 51.7, 49.6, 48.2, 48.0, 45.2, 42.0, 37.1, 35.8, 35.2, 34.9, 34.6, 34.2, 33.9, 32.4, 31.5, 31.1, 30.9, 30.4, 27.6, 27.1, 26.8, 26.0, 25.8, 23.6, 23.3, 21.6, 18.0, 12.6; HRMS ( ESI ): calcd. for C₂₈H₄₆O₅[M+Na]⁺ 485.3238, found 485.3248.

<3-2> DCG -3a의 합성

실시예 1-3의 글리코실레이션을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, 화합물4로부터 DCG-3a를 92%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.15-8.05 (m, 2H), 8.05-7.95 (m, 2H), 7.92-7.78 (m, 4H), 7.78-7.69 (m, 4H), 7.67-7.13 (m, 22H), 6.09 (t, J = 10.1 Hz, 1H), 5.83-5.72 (m, 2H), 5.66 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 5.39-5.20 (m, 2H), 5.06 (br s, 1H), 5.00-4.87 (m, 1H), 4.84-4.60 (m, 3H), 4.55-4.38 (m, 3H), 4.35-4.21 (m, 1H), 4.14-4.05 (m, 1H), 4.04-3.90 (m, 1H), 3.79-3.54 (m, 2H), 3.48-3.17 (m, 1H), 2.85-2.70 (m, 3H), 2.08 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 2.01-1.77 (m, 5H), 1.77-1.34 (m, 14H), 1.34-0.94 (m, 8H), 0.94-0.77 (m, 4H), 0.76-0.63 (m, 6H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 173.5, 170.7, 170.6, 166.2, 166.0, 165.8, 165.7, 165.6, 165.3, 165.2, 165.1, 133.6, 133.5, 133.4, 133.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.5, 129.2, 129.1, 129.0, 128.8, 128.5, 128.3, 128.2, 101.0, 96.6, 76.1, 75.0, 74.9, 74.3, 73.1, 72.5, 72.1, 71.0, 70.0, 69.5, 69.3, 63.5, 62.7, 60.5, 49.6, 48.4, 48.3, 48.0, 45.1, 42.0, 37.5, 35.8, 35.2, 35.0, 34.9, 34.5, 34.2, 33.9, 32.4, 30.8, 30.5, 27.5, 27.0, 26.0, 25.8, 23.6, 23.2, 21.6, 21.5, 17.8, 14.3, 12.6; MS ( MALDI - TOF ): calcd. for C₈₉H₉₄NO₂₂[M+Na]⁺ 1537.2, found 1537.8

<3-3> DCG -3의 합성

실시예 1-4의 de-O-benzolyation을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, DCG-3a로부터 DCG-3을 95%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 5.18 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.32 (dd, J = 7.6 Hz, 3.8 Hz, 1H), 4.08-3.95 (m, 2H), 3.95-3.78 (m, 3H), 3.78-3.44 (m, 10H), 3.44-3.20 (m, 3H), 3.17 (s, 1.5H), 2.98 (s, 1.5H), 2.63-2.24 (m, 2H), 2.02-1.71 (m, 7H),1.71-1.59 (m, 3H), 1.59-1.25 (m, 11H), 1.25-0.99 (m, 6H), 0.96 (s, 3H), 0.75 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 177.7, 176.9, 104.9, 104.6, 103.1, 81.4, 77.9, 76.9, 75.2, 74.9, 74.8, 74.3, 74.2, 72.7, 71.6, 68.7, 68.6, 62.9, 62.3, 47.7, 43.8, 37.6, 37.3, 37.1, 37.0, 36.6, 35.5, 35.0, 34.4, 32.8, 32.5, 31.6, 31.2, 31.1, 30.0, 28.9, 28.5, 27.6, 25.0, 23.9, 18.1, 17.9, 13.4; HRMS ( ESI ): calcd. for C₃₆H₆₂NO₁₄ [M+Na]⁺ 725.4083, found 725.4113.

< 제조예 4> DCG -4의 합성

<4-1> 화합물5의 합성

실시예 1-2의 일반적인 환원 절차에 따라, 화합물1로부터 (3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((R)-5-하이드록시펜탄-2-일)-10,13-디메틸헥사데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-3,12-디일 디아세테이트 ((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-17-((R)-5-hydroxypentan-2-yl)-10,13-dimethylhexadecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthrene-3,12-diyl diacetate) (화합물5)를 80% 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 5.09 (s, 1H), 4.79-4.62 (m, 1H), 3.61 (s, 1H), 2.10 (s, 3H), 2.03 (s, 3H), 1.94-1.77 (m, 3H), 1.77-1.54 (m, 9H), 1.54-0.94 (m, 16H), 0.91 (s, 3H), 0.82 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 0.73 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 170.8, 170.7, 76.2, 74.4, 63.7, 52.0, 49.7, 48.0, 45.2, 42.1, 35.9, 35.1, 34.9, 34.6, 34.3, 32.5, 31.9, 29.5, 27.6, 27.1, 26.8, 26.1, 25.9, 23.6, 23.3, 21.7, 21.6, 18.1, 12.6; HRMS ( ESI ): calcd. for C₃₁H₅₁NO₆[M+Na]⁺ 556.3609, found 556.3625.

<4-2> DCG -4a의 합성

실시예 1-3의 글리코실레이션을 위한 일반적인 합성 절차에 따라 화합물5로부터 DCG-4a를 90%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8.14-8.07 (m, 2H), 8.03-7.96 (m, 2H), 7.90-7.80 (m, 4H), 7.77-7.69 (m, 4H), 7.68-7.61 (m, 2H), 7.61-7.16 (m, 20H), 6.08 (t, J = 10.2 Hz, 1H), 5.80-5.70 (m, 2H), 5.64 (t, J = 9.8 Hz, 1H), 5.36-5.21 (m, 2H), 5.03-4.86 (m, 2H), 4.80-4.62 (m, 31H), 4.55-4.35 (m, 3H), 4.31-4.20 (m, 1H), 4.12-4.04 (m, 1H), 3.93-3.81 (m, 1H), 3.51-3.36 (m, 1H), 2.03 (s, 6H), 1.90-1.70 (m, 2H), 1.70-1.32 (m, 15H), 1.32-0.79 (m, 13H), 0.67 (d, J = 6.6 Hz, 3H), 0.59 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CDCl₃): δ 170.8, 170.6, 166.4, 166.0, 165.9, 165.6, 165.3, 165.2, 133.6, 133.4, 133.3, 133.2, 130.2, 130.1, 130.0, 129.9, 129.8, 129.7, 129.6, 129.5, 129.1, 129.0, 128.9, 128.8, 128.7, 128.4, 128.3, 101.0, 96.6, 76.1, 75.2, 74.4, 73.5, 73.1, 72.6, 71.1, 70.8, 70.1, 69.3, 63.8, 62.8, 49.5, 47.8, 45.1, 42.1, 35.9, 34.9, 34.8, 34.6, 34.2, 32.4, 32.0, 27.3, 27.1, 26.8, 26.1, 25.8, 23.6, 233, 21.7, 21.5, 17.9, 12.5; MS ( MALDI - TOF ): calcd. for C₉₂H₉₉NO₂₃[M+Na]⁺ 1608.4, found 1608.8.

<4-3> DCG -4의 합성

실시예 1-4의 de-O-benzolyation을 위한 일반적인 합성 절차에 따라, DCG-4a로부터 DCG-4를 95%의 수득율로 합성하였다. ¹ H NMR (300 MHz, CD₃OD): δ 5.19 (d, J = 3.8 Hz, 1H), 4.30 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 3.99 (br s, 1H), 3.96-3.78 (m, 4H), 3.76-3.43 (m, 8H), 3.43-3.20 (m, 3H), 2.00-1.71 (m, 7H),1.71-1.36 (m, 14H), 1.36-0.99 (m, 10H), 0.96 (s, 3H), 0.74 (s, 3H); ¹³ C NMR (75 MHz, CD₃OD): δ 104.5, 103.1, 85.2, 81.5, 78.0, 76.8, 75.2, 74.9, 74.8, 74.3, 72.7, 71.7, 62.9, 62.4, 55.5, 47.7, 43.8, 37.6, 37.4, 36.6, 35.5, 35.0, 33.4, 31.2, 30.1, 28.9, 28.6, 27.7, 25.0, 23.9, 18.1, 13.4; HRMS ( ESI ): calcd. for C₃₉H₆₇NO₁₄[M+Na]⁺ 796.4454, found 796.4446.

< 실시예 2> DCGs 화합물의 특성

상기 실시예 1의 합성 방법에 따라 합성된 제조예 1 내지 3의 DCGs (DCG-1, DCG-2, DCG-3)의 특성을 확인하기 위하여, 임계미셀농도(critical micelle concentration; CMC) 및 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(hydrodynamic radii; R_h)을 측정하였다.

구체적으로, 임계미셀농도(CMC)는 형광 염색, 디페닐헥사트리엔(diphenylhexatriene; DPH)을 이용하여 측정하였고, 각각의 제제에 의해 형성된 미셀의 유체역학적 반지름(R_h)은 동적 광산란(dynamic light scattering; DLS) 실험을 통해 측정하였다. 측정된 결과를 기존의 양친매성 분자(detergent)인 GLC(glyco-lithocholate), GDN(glyco-diosgenin), LDAO(lauryldimethylamine-N-oxide), DDM(n-dodecyl-β-D-maltoside)과 비교하여 표 1에 나타내었다.

Detergent	분자량 ( M.W .)	CMC ( mM )	CMC ( % )	R _h (nm)
DCG-1	804	~1.1	~0.09	2.6±0.11
DCG-2	832	~1.1	~0.1	2.2±0.04
DCG-3	508.7	~0.84	~0.36	3.3±0.05
GLC-1	1112.3	~0.052	~0.006	3.2±0.03
GLC-2	1127.3	~0.008	~0.0009	3.3±0.04
GLC-3	1083.3	~0.007	~0.0008	3.3±0.08
GDN	1165.3	~0.018	~0.0021	3.9±0.05
LDAO	229.4	~1.0	~0.023	2.0
DDM	510.1	~0.17	~0.0087	3.4±0.02

DCGs의 CMC 값은 각 화합물의 친수성기의 차이에도 불구하고 약 1.0 mM 내외로 유사하게 나타났다. 이는 같은 소수성기인 데옥시콜레이트(deoxycholate)를 가지기 때문이다. 이는 양친매성 분자의 CMC 값이 친수성기보다 소수성기에 더 의존적이라는 기존 연구와 일치한다. 또한, DCGs의 CMC 값은 기존 양친매성 분자인 LDAO와 비슷한 수준인 것을 확인할 수 있었다.

2개의 글루코사이드기를 가지는 DCG-1 또는 DCG-2에 의해 형성된 미셀의 사이즈는 LDAO에 의해 형성된 미셀 사이즈와 유사하였으며, GLCs, GDN, DDM에 의해 형성된 미셀 사이즈보다는 작았다. 말토사이드기를 가지는 DCG-3은 DDM과 비슷한 수준의 미셀 사이즈를 나타냈다.

미셀 부피가 반지름의 세제곱(R³)에 비례한다는 것을 감안할 때, 실제 DCG-1 또는 DCG-2의 미셀 크기는 GLCs, GDN, DDM 보다 2~8배 정도 작게 된다. 막단백질 결정에 중요한 역할을 하는 것은 막단백질-미셀 복합체의 크기인데, 일반적으로 작은 미셀을 형성하는 detergents가 작은 복합체를 형성하는 경향이 있다. 따라서 표 1의 데이터는 DCG-1 또는 DCG-2가 GLCs, GDN, DDM 보다 작은 막단백질-미셀 복합체를 형성함을 시사한다. 또한, DCG-1 또는 DCG-2의 소수성기와 친수성기가 GLCs 또는 GDN 보다 길이 측면에서 짧다는 구조적인 특징도 이를 잘 뒷받침해준다.

이러한 결과로부터 본 발명의 DCGs는 LDAO와 비슷한 수준의 CMC 값을 가져 기존의 양친매성 분자만큼 미셀 형성이 용이하여, DCGs의 소수성기 및 친수성기가 기존 양친매성 분자들 (GLC, GDN, DDM)의 그것들보다 길이 측면에서 짧아 DCGs를 사용할 경우 기존 분자들보다 작은 막단백질-미셀 복합체를 형성할 수 있음을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> DCGs 화합물의 막단백질 (박테리아의 광합성 어셈블리) 구조 안정화 능력 평가

DCGs에 의한 로도박터 캡슐라터스(Rhodobacter capsulatus)의 광합성 어셈블리(Photosynthetic superassembly) 구조 안정화 능력을 평가하는 실험을 하였다. 광합성 어셈블리는 LHI (light-harvesting complex I) 및 RC (reaction centre complex)로 구성되어 있다. LHI-RC의 구조적 안정성은 UV-Vis 분광법을 활용하여 20일간 단백질의 구조를 모니터링하는 방법으로 측정하였다. 양친매성 분자는 본 발명의 DCG-1, DCG-2, DCG-3과 기존 양친매성 분자인 DCAO-2, CAO, DDM, LDAO를 사용하였으며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.04 wt% (도 3a), CMC + 0.2 wt% (도 3b), CMC + 1.0 wt% (도 4)에서 측정하여 양친매성 분자의 농도에 따른 LHI-RC 단백질 안정성을 조사하였다.

구체적으로, R. capsulatus의 광합성 어셈블리의 안정성은 본 발명자의 2008년 논문(P. S. Chae et al., ChemBioChem 2008, 9, 1706-1709.)에 게재된 방법을 이용하여 측정하였다. 요약하면, 본 발명자는 LHII(light-harvesting complex II)를 가지고 있지 않은 R. capsulatus, U43[pUHTM86Bgl] 박테리아로부터 얻은 멤브레인을 이용하였다. R. capsulatus 멤브레인의 동결액을 해동하고, 유리 균질기(glass homogenizer)를 이용하여 이를 균질화하였다. 멤브레인 샘플은 30분 동안 32 ℃에서 배양하고, 1.0 wt% detergents (DCG-1, CAO 또는 DDM)을 처리하였다. 30분 동안 추가 배양한 후에, 샘플은 315,000 g로 4 ℃에서 20분 동안 초원심분리하여, 용해화된 단백질 분획을 얻었다. DDM-용해화 상층액은 Ni² ^+-NTA resin (10 mM Tris, pH 7.8 및 100 mM NaCl을 포함하는 버퍼에서 전-평형 및 저장됨)과 혼합하여 1 시간 동안 4 ℃에서 resin과 결합되도록 하였다. resin을 수집하고 0.5 mL 결합 버퍼 (1×CMC 농도의 각각의 detergent가 포함된 pH 7.8 Tris 버퍼 용액)로 두 번 세척하였다. 단백질은 1M 이미다졸을 포함하는 0.20 mL 용출 버퍼(결합 버퍼로서 이미다졸을 제외하고 동일한 조성 및 pH를 가짐)를 이용하여 세 번 용출하였다. 수집된 용액은 0.4 mL 결합 버퍼에 희석하고, 복합체의 안정성은 광학 분광광도법(optical spectrophotometry)에 의해 15일 동안 상온에서 모니터하였다. 또한, 0.5 ml의 DDM-정제된 LHI-RC 복합체는 각각의 DCGs (DCG-1, DCG-2, DCG-3) 또는 기존 detergents (DCAO-2, CAO, LDAO, DDM)을 포함하는 0.95 mL 수용액으로 옮겼으며, detergent의 농도는 CMC + 0.04 wt%, CMC + 0.2 wt% 및 CMC + 1.0 wt%에서 실험하였다. 이러한 수용액의 UV-Vis 스펙트럼은 20일 동안 상온에서 규칙적인 간격으로 측정되었다. 복합체의 UV-Vis 스펙트럼은 875 nm에서 강한 흡광도를 나타냈다.

도 3a에 나타난 결과와 같이, LDAO 안의 LHI-RC 복합체는 급격한 분해가 일어난 반면, DDM으로 용해한 복합체는 천천히 분해가 일어났다. DCAO-2 및 CAO는 DDM보다는 LHI-RC 복합체의 구조를 잘 유지하였다. 두 개의 글루코사이드기를 가지는 DCG-1 및 DCG-2는 단백질 안정화 능력이 매우 우수하였다. 도 3b 및 도 4에 나타난 결과와 같이, detergent의 농도가 CMC + 0.2 wt% 또는 CMC + 1.0 wt%로 증가하여도 그 결과는 CMC + 0.04 wt% 농도일 때의 결과와 유사한 경향을 보였다. 도 5에 나타난 결과와 같이, LHI-RC 단백질을 막으로부터 추출한 후에 그 안정성을 15일 동안 상온에서 측정한 경우에도 DCG-1은 CAO 및 DDM보다 LHI-RC 단백질 안정화 능력이 매우 우수하였다.

도 3 내지 도 5에 나타난 결과와 같이, 새로 개발한 본 발명의 DCGs는 전통적으로 널리 사용되는 DDM 또는 LDAO와 비교해서 박테리아 광합성 어셈블리(LHI-RC)에 장기간동안 구조적으로 안정성을 부여하였다. 또한, 기존의 본 발명자가 개발한 DCAO-2와 CAO 보다도 더욱 우수한 단백질 안정성을 보여주었다. DCGs 중에서는 DCG-1과 DCG-2가 특히 LHI-RC 안정화 효과가 우수하였다. 또한 박테리아 광합성 어셈블리를 DCGs로 막으로부터 직접 추출한 경우에도 DDM 또는 LDAO와 비교해서 우수한 막단백질 안정성을 보여주었으며 DCG의 광합성 어셈블리 추출 효율은 대략 30%로 기존에 보고된 GLC보다 우수하다. 이에 비해 기존에 보고된 GLCs 양친매성 분자는 광합성 어셈블리를 추출하는 능력이 거의 없다 (<5%이내).

< 실시예 4> DCGs 화합물의 막단백질 ( LeuT ) 구조 안정화 능력 평가

DCGs에 의한 LeuT (leucine transporter) 단백질의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. LeuT 단백질 활성을 SPA (scintillation proximity assay)에 의해 측정하였으며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.2 wt%를 사용하였다.

구체적으로, 본 발명자의 2010년 논문(P. S. Chae, et al., J. Am. Chem . Soc. 2010, 132, 16750-16752.)에 게재된 방법에 따라, 아퀴펙스 에오리쿠스(Aquifex aeolicus)로부터 와일드 타입 LeuT (leucine transporter)의 정제를 수행하였다. LeuT는 C-말단 8xHis-태그된 트랜스포터를 암호화하는 pET16b로 형질전환된 E. coli C41(DE3)에서 발현된다 (발현 플라스미드는 Dr E. Gouaux, Vollum Institute, Portland, Oregon, USA에 의해 제공받음). 요약하면, 박테리아 멤브레인을 분리하고 1% DDM에 용해화한 후에, 단백질을 Ni² ^+-NTA resin (Life Technologies, Denmark)에 결합시키고 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM NaCl, 199 mM KCl, 0.05 % DDM 및 300 mM 이미다졸로 용출시킨다. 그 다음, 약 1.5 mg/ml 단백질 스톡(stock)을 DDM 및 이미다졸이 없으나 DCGs (DCG-1, DCG-2), CAO (cholated-based N-oxide) 또는 DDM (대조군)을 최종 농도가 CMC + 0.2 wt%가 되도록 보충한 동등한 버퍼에 10x 희석하였다. 단백질 활성은 SPA (scintillation proximity assay) (M. Quick et al., Proc . Natl , Acad . Sci . U.S.A . 2007, 104, 3603-3608.)를 이용하여 [³H]-Leu 결합을 측정하였다. 200 mM NaCl을 포함하는 버퍼에 녹아 있는 5 μL의 각각의 단백질 샘플 및 CMC + 0.2 wt% 농도의 각각의 테스트 화합물을 이용하여 SPA를 수행하였다. SPA 반응은 20 nM [³H]-Leu 및 copper chelate (His-Tag) YSi beads (both from PerkinElmer, Denmark)의 존재하에 수행되었다. 각각의 샘플의 [³H]-Leu 결합은 MicroBeta liquid scintillation counter (PerkinElmer)를 이용하여 측정하였다.

도 6a에 나타난 결과와 같이, 양친매성 분자를 CMC + 0.2 wt%로 사용하였을 때, LeuT의 구조적 안정화 능력은 DCG-1이 DDM과 동등 수준의 효과를 보여주었다. 또한, DCG-1 및 DCG-2은 모두 본 발명자가 기존에 개발한 CAO 보다 우수한 LeuT의 안정화 능력을 보여주었다.

이러한 결과로부터 본 발명의 DCG-1 및 DCG-2는 CAO 보다 LeuT 단백질 안정화 능력이 우수하고, 특히 DCG-1은 DDM과 동등 수준의 LeuT 단백질 안정화 능력을 가짐을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 본 발명에 따른 화합물의 막단백질 ( GlpG ) 구조 안정화 능력 평가

DCGs에 의한 GlpG (rhomboid intramembrane serine protease GlpG) 단백질의 수용액상에서의 구조 안정성을 측정하는 실험을 하였다. GlpG 단백질의 변성을 CPM assay 방법을 통해 130분간 측정하였으며, 양친매성 분자의 농도는 CMC + 0.04 wt%를 사용하였다.

구체적으로, GlpG는 대장균(Escherichia coli)에서 C-말단 GFP-His 태그를 가지는 융합단백질로서 발현되었다. 모든 단계는 4 ℃에서 수행하였다. GlpG를 포함하는 멤브레인을 10mM 이미다졸 pH 8.0, 150 mM NaCl 및 10% 글리세롤이 녹아있는 PBS에 재현탁하고, 1% DDM에 1시간 동안 가벼운 교반과 함께 용해시켰다. 100,000 g에서 45분 동안 초원심분리하여 DDM으로 용해화된 단백질을 포함하는 상층액을 얻었다. lpG-GFP-His 융합은 버퍼 A (PBS, 10 mM 이미다졸 pH 8.0, 150 mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.03% DDM)와 함께 전평형화(pre-equilibrated)된 Ni² ⁺-NTA resin (1ml 당 GFP 융합체 1mg)에 결합시켰으며, 2-3시간 동안 흔들어서 결합 반응을 수행하였다. resin은 10 CV의 버퍼 A로 세척하고, 30 mM 이미다졸이 보충된 버퍼 A 35 CV로 세척한 다음, 250 mM 이미다졸로 보충된 버퍼 A 2-3 CV를 이용하여 용출하였다. 동일한 양의 His-tagged TEV 프로테아제를 용출액 안의 GFP-His 융합체에 첨가하고, 샘플을 버퍼 B (20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.03% DDM)로 밤새 투석하였다. 절단된 GlpG는 역 Ni2+-NTA 결합을 이용하여 통과액 분획에서 분리하였다. 샘플은 원심농축기를 이용하여 0.5 ml 부피로 농축하고, 버퍼 B로 전평형화된 Superdex 200 10/300 컬럼을 이용하여 최종 폴리싱 겔 여과 단계를 수행하였다. GlpG는 원심농축기를 이용하여 5mg/ml로 농축했다. DMSO (Sigma)에 저장된 CPM (N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide) 염색약 (Invitrogen)은 5 mM EDTA로 보충된 버퍼 B에 희석하였다 (1:100). DCGs 또는 DDM은 테스트 버퍼로서 20 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl 내에 CMC + 0.04 wt% 농도로 하여 이용하였다. 1 ㎕의 GlpG (5 mg/ml)을 Greiner 96-well 플레이트 안에 들어 있는 테스트 버퍼 (150 ㎕)에 각각 첨가하고, 평형화시키기 위해 상온에서 5분 동안 둔 다음, 3 ㎕의 희석된 CPM 염색약을 첨가하였다. 각각의 well의 형광도는 30 ℃에서 130분 동안 모니터하였다. 비교를 위하여, LDAO를 10 x CMC의 높은 농도로 사용하여 GlpG의 급격한 변성을 유도하였다.

도 6b에 나타난 결과와 같이, LDAO로 용해화된 GlpG 단백질은 급격히 변성되었으며, DDM으로 용해화된 GlpG 단백질은 서서히 변성되었다. 그러나, DCG-1 및 DCG-2는 DDM과 비교하여 매우 우수한 GlpG 단백질 구조 안정화 능력을 보여주었다.

Claims

하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물:

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, 상기 R¹및 R²는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C₁-C₄의 알킬기이고; X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이고; 그리고 상기 L¹ 및 L²는 각각 독립적으로 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기이다.
[화학식 3]

상기 화학식 3에서, 상기 R¹, L¹ 및 X¹은 화학식 2에서 정의한 바와 같다.
[화학식 4]

상기 화학식 4에서, 상기 L¹ 및 X¹은 화학식 2에서 정의한 바와 같다.
제 1항에 있어서, 상기 당류는 단당류(monosaccharide) 또는 이당류(disaccharide)인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 당류는 글루코스(glucose) 또는 말토오스(maltose)인 화합물.
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 6 내지 8 중 어느 하나로 표시되는 것인 화합물:

[화학식 6]

[화학식 7]

[화학식 8]
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하기 위한 양친매성 분자인 화합물.
제 1항에 따른 화합물을 포함하는 막단백질의 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석용 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 조성물은 미셀, 리포좀, 에멀션 또는 나노입자의 제형인 것인 조성물.
1) 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체에 아미노알코올(aminoalcohol)을 첨가하여 아미드 커플링(amide coupling) 반응을 수행하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 생성물에 페르벤조일레이티드 글루코실브로마이드(perbenzoylated glucosyl bromide) 또는 페르벤조일레이티드 말토실브로마이드(perbenzoylated maltosyl bromide)를 첨가하여 글리코실레이션(glycosylation) 반응을 수행하여 보호기가 부착된 당류를 도입하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 생성물에 탈벤젠화(de-O-benzoylation) 반응을 수행하여 O-벤조일기를 제거하는 단계;를 포함하는 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물의 제조 방법:

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 2 및 3에서, 상기 R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C₁-C₄의 알킬기이고; 상기 L¹및 L²는 각각 독립적으로 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기이고; 그리고 상기 X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
제 8항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 6 또는 7로 표시되는 것인 방법:

[화학식 6]

[화학식 7]
제 8항에 있어서, 단계 1) 대신 데옥시콜린산(deoxycholic acid)의 카르복실산 유도체의 카르복실산 작용기를 알코올 작용기로 환원시키는 단계를 수행하는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물의 제조 방법:
[화학식 4]

상기 화학식 4에서, 상기 L¹은 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기이고; 그리고 상기 X¹는 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
제 10항에 있어서, 상기 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 화합물인 방법:
[화학식 8]
수용액에서 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 막단백질에 처리하는 단계를 포함하는, 막단백질을 추출, 용해화, 안정화, 결정화 또는 분석하는 방법:

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화학식 2 내지 4에서, 상기 R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 수소, 또는 치환 또는 비치환된 C₁-C₄의 알킬기이고; 상기 L¹및 L²는 각각 독립적으로 직접결합, 또는 치환 또는 비치환된 C₁ 내지 C₁₀의 알킬렌기이고; 그리고 상기 X¹ 및 X²는 각각 독립적으로 산소로 연결된 당류(saccharide)이다.
제 12항에 있어서, 상기 막단맥질은 광합성 어셈블리(Rhodobacter capsulatus photosynthetic superassembly), LeuT(leucine transporter), GlpG(rhomboid intramembrane serine protease GlpG) 또는 이들의 2 이상의 조합인 방법.