DE69933310T2 - Lagerstabile zusammensetzung enthaltend quadratsäure-aktivierten träger, der für die immobilisierung von amingruppen enthaltenden substanzen benutzt werden kann - Google Patents

Lagerstabile zusammensetzung enthaltend quadratsäure-aktivierten träger, der für die immobilisierung von amingruppen enthaltenden substanzen benutzt werden kann Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen lagerungsstabilen, aktivierten Träger in der Form von Matrizen, die Oberflächen umfassen. Insbesondere bezieht sie sich auf derartige Matrizen, die als ein Träger geeignet sind, an den Verbindungen kovalent gebunden werden können, die eine Amingruppe enthalten.
  • Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Kit, das einen derartigen aktivierten Träger umfasst, wobei das Kit versendbar an Kunden ist aufgrund der Langzeitstabilität des Trägers.
  • Im Kontext dieser Beschreibung werden die Wörter der Träger/die Träger, die Matrix/die Matrizen und das Medium/die Medien austauschbar verwendet, falls nicht anders angegeben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Immobilisierung von Biomolekülen auf verschiedenen Trägern findet starke Anwendung in der Forschung und Industrie, und viele Verfahren wurden in der Literatur offenbart. Diese Verfahren umfassen eine Aktivierung eines Trägers, z.B. einer Matrix in der Form eines Gels, einer Oberfläche eines Polymerkügelchens etc. Der Aktivierungsprozeß umfasst allgemein das einem reaktiven Mittel Aussetzen des Trägers, das mit OH-Gruppen oder Amingruppen auf dem Träger reagiert, wodurch entweder direkt oder nachfolgend nach weiteren Schritten reaktive Zwischenstrukturen/stellen gebildet werden. Diese Strukturen können dann mit der in Frage stehenden Verbindung umgesetzt werden, wodurch die Verbindung immobilisiert wird.
  • Veranschaulichende Beispiele derartiger Verfahren sind das CNBr-Verfahren und die Epoxy-Aktivierung. Die aktivierten Zwischenstufen, die durch diese Verfahren erhal ten werden, müssen gefriergetrocknet werden, um an Kunden versendbar zu sein. Gefriertrocknen ist ziemlich kompliziert und erfordert zusätzliches Verarbeiten beim Kunden, bevor die gefriergetrockneten Zwischenstufen verwendet werden können.
  • Diese und andere Aktivierungs- und Immobilisierungsverfahren sind beschrieben in „Immobilized affinity ligand techniques" von G.T. Hermanson, Academic Press, 1992.
  • In WO 95/15983 (Glüsenkamp et al.) gibt es ein Verfahren zum Immobilisieren von Biomolekülen und Affinitätsliganden auf Trägern. Dieser Prozeß umfasst das Umsetzen eines aminierten Polymerträgers mit einem bifunktionellen elektrophilen Quadratsäurederivat als Aktivierungsmittel, um eine aktivierte Zwischenstufe (aktivierte Matrix oder aktivierte Medien oder aktivierte Träger) zu bilden, und Koppeln eines Biomoleküls an den aktivierten Träger.
  • Für die meisten der oben erwähnten Aktivierungsprozesse war es allgemein bekannt, dass die aktivierten Träger relativ instabil gegenüber Hydrolyse sind. Wenn man sich erinnert, dass kommerziell erhältliche aktivierte Trägermedien eine möglichst lange Lagerstabilität haben sollten, z.B. von einem bis zu mehreren Monaten, ist es keine Überraschung, dass kommerzielle Produkte, die aktivierte Matrizen umfassen, typischerweise in Form von lyophilisierten Zusammensetzungen verkauft worden sind. Für Squaratsäure-aktivierte Trägermedien sind wir uns keinerlei kommerzieller Produkte bewusst, die von dem, was oben dargelegt wurde, abweichen. Wenn man in die wissenschaftliche Literatur schaut, erscheint es, dass die meisten synthetischen Routen, bei denen Squaratsäure-aktiviertes Material erhalten wird, typischerweise in einem kristallisierten und/oder getrockneten Material enden. In der Alternative wird das aktivierte Material mehr oder weniger direkt bei der Synthese verwendet. Siehe z.B. Kamath et al., Glycoconjugate J. 13 (1996), 315–319; und Ola Blixt, Thesis: Enzymatic solid phase synthesis of carbohydrates, Swedish University of Agricultural Sciences, Uppsala, Schweden (1999) (siehe insbesondere Seite 50); DE 4341524 (Glüsenkamp et al.); und DE 19624990 (Glüsenkamp et al.). Eine Untersuchung der Hydrolyse von löslichen, Squarat-aktivierten Materialien (Monoamiden) wurde veröf fentlicht (Glüsenkamp et al., Z. Naturforsch. 46c (1991) 498–501). Die Lagerung von Squarat-aktivierten aminierten Matrizen, die mit Methanol oder in Ethanolatmosphäre befeuchtet sind, wurde im experimentellen Teil der WO 9515983 (Glüsenkamp et al.) beschrieben. Es wird erwartet, dass die Reaktivität während dieser Lagerbedingungen beibehalten wird, weil eine Reaktion mit Methanol bzw. Ethanol nur eine Umesterung bedeutet, die den Esterstatus der aktivierten Gruppe beibehält und so auch ihre Reaktivität beibehält.
  • Es wäre vorteilhaft, ein kommerzielles Produkt in der Form eines aktivierten Trägers bereitzustellen, der reaktive Quadratsäuregruppen umfasst, wobei der aktivierte Träger in wässrigem Medium dispergiert ist und eine Lagerstabilität von 1 bis 2 Monaten bis zu mehreren Monaten besitzt, ohne irgendeinen beträchtlichen Verlust in der Aktivität zu zeigen. Dies ist besonders wahr in dem Fall, dass die Verwendung zur Immobilisierung wasserlöslicher Verbindungen am aktivierten Medium dient, z.B. Amin enthaltende Biomoleküle, wie Proteine. Die wässrigen Medien sind typischerweise eine wässrige Flüssigkeit.
  • Es wäre auch vorteilhaft in dem Fall, dass derartige lagerstabile Zusammensetzungen resistent gegenüber mikrobiellem Wachstum wären.
  • Andere Veröffentlichungen, die mit Squarat-aktivierten Materialien verbunden sind, sind Tietze et al., Chem. Ber. 124(5) (1991) 1215–1221; Tietze et al., Bioconjugate Chem 2 (1991) 148–153; Hällgren et al., J. Carbohydrate Chem. 14 (4&5) (1995) 453–46; Ausanneau et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1996) 2003–2010; und Pozsgay et al., J. Org. Chem. 62 (1997) 2832–2846.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, einen lagerungsstabilen aktivierten Träger bereitzustellen, der reaktive Quadratsäuregruppen umfasst, wobei der Träger in einem wässrigen Medium dispergiert ist zur Verwendung bei der Immobili sierung von nukleophilen Verbindungen, typischerweise Amin-enthaltende Verbindungen. Das aktivierte Medium sollte stabil während der Lagerung und/oder resistent gegenüber Bakteriumwachstum über verlängerte Zeitdauern sein.
  • Für den Zweck der Erfindung bedeutet der Begriff „aktiviertes Medium" oder „aktivierter Träger" oder „aktivierte Matrix" einen Träger, der als ein Träger für eine nukleophile Verbindung verwendet werden soll. Dieser Träger wurde mit reaktiven Quadratsäuregruppen versehen, die ein einfaches Koppeln der Verbindung an den Träger ermöglichen. Der aktivierte Träger sollte als eine Zwischenstufe in dem Prozeß des Erzeugens immobilisierter Formen der Verbindungen betrachtet werden.
  • Nukleophile Verbindungen, die im Kontext der Erfindung in Betracht gezogen werden, enthalten typischerweise eine primäre und/oder eine sekundäre Amingruppe, z.B. Proteine oder andere Verbindungen, die eine Peptidstruktur aufweisen, oder andere Biomoleküle und andere organische Verbindungen, die diesen Typ von Amingruppen zeigen.
  • Der Erfinder hat nun überraschenderweise erkannt, dass ein Träger wie oben definiert, der Amingruppen umfasst, die mit einem elektrophilen Quadratsäurederivat aktiviert sind, in wässrigen Medien stabil sein kann. Unerwarteterweise wurde erkannt, dass die Geschwindigkeit der Hydrolyse von reaktiven Quadratsäuregruppen, die an Träger gebunden sind, ausreichend langsam ist, um eine Lagerung der aktivierten Träger in wässrigen Medien zu ermöglichen.
  • So wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine lagerungsstabile Zusammensetzung bereitgestellt, umfassend einen Träger wie oben definiert und nutzbar für die Immobilisierung nukleophiler Verbindungen. Der Träger umfasst primäre oder sekundäre Aminogruppen, die aktiviert worden sind, um reaktive, von Quadratsäure abgeleitete Gruppen zu tragen, die an die primären oder sekundären Aminstellen auf dem Träger gebunden sind, wobei der Träger in Kontakt mit einem wässrigen Medium steht, z.B. eine wässrige Flüssigkeit.
  • In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Herstellen einer derartigen Verbindung bereitgestellt. Dieses Verfahren ist in Anspruch 9 definiert.
  • Außerdem wird gemäß der vorliegenden Erfindung ein Kit zum Lagern der Zusammensetzung über verlängerte Zeitdauern bereitgestellt, wobei dieses in Anspruch 10 definiert ist.
  • Die Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung ist stabil für eine verlängerte Zeitdauer wie oben definiert, z.B. eine Woche, einen Monat oder sogar längere Zeitdauern wie 2, 3 oder mehr Monate.
  • Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die Quadratsäure-Derivate, die zum Erzeugen der aktivierten Träger nützlich sind, können ausgewählt werden unter bifunktionellen elektrophilen Quadratsäure-Derivaten, wie Dialkoxyester (z.B. Dimethylester, Diethylester, Dibutylester und auch entsprechende gemischte Diester (Squarate)), Dihalogenide und Diimidazolide. Andere reaktive Derivate können auch verwendet werden. Die Aktivierungsreaktion wird normalerweise in inerten Medien ausgeführt. Siehe Glüsenkamp WO9515983. Im Falle, dass die auf dem Träger gebildete reaktive Gruppe zu reaktiv ist, um in den in Betracht gezogenen wässrigen Medien gelagert zu werden, kann sie leicht in eine Gruppe niedrigerer Reaktivität umgewandelt werden. Zum Beispiel kann, im Falle dass ein Quadratsäuredihalogenid verwendet wird, um die aktivierten Träger herzustellen, die gebildete Monohalogenidgruppe in die entsprechende Esterfunktion umgewandelt werden, z.B. durch Ausführen der Reaktion bei Vorhandensein eines Alkohols.
  • Eine reaktive Zwischenstufe gemäß der Erfindung kann durch die allgemeine Formel repräsentiert sein
    Figure 00060001
    wobei
    • • P eine Matrix (einen Träger) repräsentiert, die (der) primäre und/oder sekundäre Amingruppen enthält, die an die von Quadratsäure abgeleitete Struktur (Quadratsäuregruppe, z.B. Squarat-Struktur) bindet, welche wiederum die reaktive Gruppe in der Formel oben bildet. Es gibt oft mehrere reaktive, von Quadratsäure abgeleitete Gruppen (z.B. Squaratgruppen) auf ein und derselben Matrix P.
    • • A und B unabhängig voneinander für O oder S stehen können;
    • • X für O oder S stehen kann; und
    • • R eine inerte organische Gruppe repräsentiert, die zusammen mit X und der Quadratsäuregruppe eine elektrophile Struktur bildet.
  • R ist z.B. eine C1-C30-Kohlenwasserstoffgruppe, die eine oder mehrere geradkettige, verzweigte oder zyklische Kohlenwasserstoffketten umfasst, die an einer oder mehreren Stellen durch einen Thioetherschwefel oder einen Ethersauerstoff unterbrochen sein können und/oder mit einer oder mehreren R'O-Gruppen substituiert ist, wobei R' für Wasserstoff und/oder C1-C6-Alklyl oder entsprechende Schwefelanaloga (R'S-) steht. Die bevorzugten Rs sind C1-C6-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl und möglicherweise auch Isoformen von Butyl. Bevorzugt gibt es höchstens ein O- oder S-Atom auf jedem Kohlenstoffatom in R.
  • R kann auch eine Imidazolid-Gruppe oder eine andere Gruppe sein, die zu der Squaratstruktur in der allgemeinen Formel führt, wobei sie eine reaktive elektrophile Squaratgruppe auf dem Träger ist. In diesem Fall soll die Stabilität des aktivierten Trägers vergleichbar sein zur Stabilität der Quadratsäure-Monoamid-Monoalkylestergruppen, die oben definiert sind (R = Alkyl).
  • Mit dem Begriff „inert" ist gemeint, dass R keinerlei Gruppen enthält, die nachteilig die Reaktivität der aktivierten gezeigten Quadratsäuregruppe beeinflusst. Destabilisierende Gruppen in R können z.B. die primären und sekundären Amine sein.
  • Mit dem Begriff „stabil" ist gemeint, dass die Fähigkeit, mit primären und sekundären Aminen zu reagieren, für eine verlängerte Zeit beibehalten wird, ohne beträchtlich oder nicht reproduzierbar abzunehmen. Dies wiederum bedeutet, dass die aktivierte Zwischenstufe stabil sein kann, sogar falls die aktivierte Zwischenstufe an Umesterungen mit Alkoholgruppen teilnimmt, die im Lagerungsmedium, dem Träger oder der inerten Gruppe R vorhanden sind.
  • Als mit oben definierten Quadratsäurederivaten zu aktivierende Träger können Matrizen verwendet werden, die primäre und/oder sekundäre Amingruppen zeigen.
  • Der Begriff „Matrix" soll verstanden werden, dass er eine beliebige physikalische Form umfasst, wie Teilchen, Monolithen, Fasern, Membrane, Röhrchenwände, Kapillaren, Oberflächen etc. Die Matrix kann porös oder nicht-porös und löslich, unlöslich oder nicht löslich zu machend in wässrigem Medium oder anderen Flüssigkeiten sein.
  • In den bevorzugten Modi der Erfindung basiert die Matrix auf einem Polymer, das eine hydrophile Oberfläche gegenüber dem verwendeten wässrigen Medium freigelegt hat, d.h. freigelegte Hydroxy-(OH)-, Carboxy-(-COOH), Carboxamido-(-CONH2, möglicherweise in N-substituierten Formen), Amino-(-NH2, möglicherweise in substituierter Form), Oligo- oder Polyethylenoxy-Gruppen auf ihren äußeren und, falls vorhanden, auch auf inneren Oberflächen. Typischerweise ist die Matrix von derselben Art wie jene, die normalerweise als chromatographische Matrizen verwendet werden. Das Polymer kann z.B. basieren auf Polysacchariden, wie Dextran, Stärke, Zellulose, Pullulan, Agarose etc., welche, falls nötig, vernetzt worden sind, z.B. mit Bisepoxiden, Epihalohydrinen, 1,2,3-Trihalo-substituierten niederen Kohlenwasserstoffen, um eine geeignete Porosität und Starrheit bereitzustellen. Die Matrix kann auch auf synthetischen Polymeren basieren, wie Polyvinylaklohol, Polyhydroxyalkylacrylate, Polyhydroxyalkylmethacrylate, Polyacrylamide, Polymethacrylamide etc. Im Falle von hydrophoben Polymeren, wie jene, die auf Divinyl- und Monovinyl-substituierten Benzolen basieren, sind die Oberflächen der Matrix oft hydrophilisiert, um hydrophile Gruppen wie oben definiert gegenüber einer umgebenden wässrigen Flüssigkeit freizulegen.
  • Die Matrizen können auch von anorganischer Natur sein, z.B. Silika, Zirkonoxid etc.
  • Falls die Matrizen als solche keine Aminfunktionalität zeigen, können sie durch dem Fachmann bekannte Verfahren derivatisiert werden, um dies durchzuführen.
  • Das aktivierende Verfahren ist vollständig in der genannten WO-Veröffentlichung beschrieben und wird hier nicht diskutiert werden.
  • Das Lagerungsmedium für die in Frage stehenden Zwischenstufen ist wässrig, typischerweise in der Form einer wässrigen Flüssigkeit. Es umfasst bevorzugt eine antibakteriell wirksame Komponente. Diese Komponente ist bevorzugt ausgewählt aus organischen Lösungsmitteln, die auf geeignete Weise mit Wasser mischbar sind.
  • Eine bevorzugte Klasse von Komponenten sind Alkohle, insbesondere Alkanole, wie Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, sec-Butanol, tert-Butanol. Der am meisten bevorzugte Alkohol ist Ethanol.
  • Die Menge der benötigten antibakteriellen Komponente ist eine Menge, die ausreicht, um bakterielles oder mikrobielles Wachstum in der Zusammensetzung zu verhindern.
  • Die Zusammensetzung des wässrigen Mediums kann Wasser in einer Menge von 5–100%, bevorzugt 20–95%, bevorzugter 40–85% umfassen. Die Menge des organischen Lösungsmittels, das geeigneterweise mit Wasser mischbar ist, liegt im Intervall von 5–95%, bevorzugt 5–80%, bevorzugter 10–60% wie 25–60. Volumen-% (v/v) wird in Betracht gezogen. Das organische Lösungsmittel ist bevorzugt ein Wassermischbarer Alkohol.
  • Der pH des wässrigen Mediums kann im Bereich von 5–9 liegen. Standardpuffersysteme, die nicht die Stabilität nachteilig beeinflussen, können verwendet werden, z.B. 0,3 M Borat-Puffer. Amin-Puffer, insbesondere eingestellt auf einen pH unter 1 minus ihr kPa sollten vermieden werden.
  • Wenn er verwendet wird, wird der aktive Träger mit einer organischen Verbindung in Kontakt gebracht, die eine Amingruppe enthält, unter Bedingungen, die das Binden der Aminverbindung an den Träger über eine neu gebildete Squarat-Amidstruktur erlauben. Die Verbindung, die die Aminfunktion enthält, ist bevorzugt ein bioorganisches Molekül. Typischerweise ist die Aminverbindung ein Element eines sogenannten Affinitätspaars. Beispiele von Affinitätspaaren sind Antigen/Hapten – Antikörper, Kohlenhydratstruktur – Lektin, komplementäre Nukleinsäuresequenzen und ein beliebiges anderes natives oder synthetisches Ligand-Rezeptor-Paar, in dem der Ligand und der Rezeptor fähig sind, sich aneinander über eine Affinität zu klammern. Eine spezielle Klasse von Affinitätspaaren ist biologischen Ursprungs. Sie werden demzufolge Bioaffinitätspaare genannt.
  • Die Erfindung wird nun beschrieben im Detail mittels Beispielen und mit Bezugnahme auf Schema A und 1.
  • Schema A:
    Figure 00100001
  • In Schema A ist RNH2 die Verbindung, die auf der Matrix immobilisiert werden soll. Das Schema konzentriert sich auf eine Art von eingeführten Aminogruppen. Die Reaktion wird im Prinzip dieselbe für die anderen Aminogruppen sein.
  • 1 zeigt ein Diagramm, das die Langzeitstabilität einer Zusammensetzung gemäß der Erfindung zeigt. Die gezeigten Aminosäureanalysedaten entsprechen Kopplungsausbeuten von 75–85%. Andere Liganden wurden mit ähnlichen oder höheren Ausbeuten immobilisiert.
  • Beispiel 1 (Herstellung von Amin-enthaltenden Kügelchen)
  • Polymerkügelchen (Sephacryl S-200, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) wurden Amin-funktionalisiert auf die folgende Weise.
  • Epoxy-aktivierte Kügelchen wurden mit Wasser gewaschen und man ließ sie abtropfen und wurden dann in ein Reaktionsgefäß gegeben und ein gleiches Volumen von 1 M NH3 wurde in das Gefäß gegeben. Das Gefäß wurde versiegelt und im Kreis geschüttelt in einem Wasserbad bei 50°C 23 h lang. Die Kügelchen wurden mit Wasser (>10 × Gelvolumen) gewaschen und gelagert in 20% Ethanol im Wasser bei +2–+8°C.
  • Nach der Aminierung werden die Kügelchen verschiedene Aminogruppen -CH2CHOHCH2NH2 (erhalten durch Reaktion von Ammoniak mit Epoxygruppen), -NHCOCH2CHNH2 (erhalten durch Reaktion von Ammoniak mit Acrylamidogruppen und entsprechenden Vernetzungsgruppen, die über eine weitere Reaktion mit Epoxy- und Acrylamidogruppen erhalten wurden) enthalten.
  • Beispiel 2 (Aktivierung einer aktivierten Matrix mit 3,4-Diethoxysquarat)
  • Das Amin-funktionalisierte Sephacryl (100 ml aus Beispiel 1), gelagert in 20% EtOH, wurde mit absolutem Ethanol (10 × 1 Gelvolumina) gewaschen. Die Kügelchen wurden in einen Kolben mit einer Drehkappe gegeben. Ein gleiches Volumen von absolutem Ethanol wurde zugegeben, gefolgt von Benzylalkohol (ca 250 μl/50ml Ethanol) und dem Squarat (ca 1,5–2 Äquivalente, verglichen mit den Amingehalten der Kügelchen). Die Reagenzien wurden gemischt und eine kleine Probe der flüssigen Phase, die als eine Referenz für HPLC verwendet wurde, wurde sofort entnommen. Der Kolben wurde in einem Wasserbad bei 20–60°C geschüttelt. Das Fortschreiten der Reaktion wurde verfolgt durch HPLC durch Entnehmen kleiner Proben der flüssigen Phase, nach gleichmässigen Intervallen, Verdünnen 50 mal mit EtOH (30 μl in 1,5 ml) und Analyse auf einem Shimadzu HPLC. Benzylalkohol wurde als ein interner Standard in der HPLC-Analyse verwendet. Der Substitutionsgrad wurde als annähernd gleich der verbrauchten Menge des Squarat-Reagenz angenommen.
  • Die Kügelchen wurden mit Ethanol 99,5% gewaschen, gefolgt von 20% Alkohol. Die aktivierten Kügelchen wurden in 10 ml-Proben unterteilt, die in 20% Ethanol aufgeschlämmt waren und bei 2–8°C gelagert.
  • Beispiel 3 (Koppeln von Procin-Trypsin)
  • Die aktivierten Kügelchen, gelagert in 20% EtOH, wurden mit Wasser gewaschen (ca 5 × 1 Gelvolumen, gv) gefolgt von einem Boratpuffer 0,3 M Borat 1,5 M Na2SO4, pH 9. Die Enzymlösung wurde erzeugt durch Auflösen von 100 mg Porcin-Trypsin in ca 10 ml 0,5 M Na2SO4 und 0,3 M Boratpuffer pH 9, der zu den Kügelchen gegeben wurde. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 6 h lang geschüttelt. Die Kügelchen wurden mit Tris-Puffer (0,1 M, 0,5 M NaCl, pH 8), 4 × 1-Gelvolumina gewaschen. Gefolgt alternativ von 4 mal Tris- und Acetat-Puffer (0,1 M, pH 5) und schließlich mit Wasser 5 mal. Gelagert in 20% EtOH.
  • Beispiel 4 (Stabilitätstest)
  • Stabilitätstest der Zwischenstufen im Lagerungsmodus gemäß der vorliegenden Erfindung (das in den Beispielen verwendete Lagerungsmedium ist 20% Ethanol in Wasser, Temperatur 2–8°C) wurden durchgeführt durch Entnehmen von Proben der Zwischenstufen in unregelmäßigen Intervallen während 66 Wochen (Genauer bei 1, 6, 10, 12, 18, 26, 40 und 66 Wochen).
  • Diese Proben wurden verwendet für die Immobilisierung von Porcin-Trypsin auf der Matrix gemäß Beispiel 3. Der Substitutionsgrad wurde untersucht durch Aminosäureanalyse.
  • 1 zeigt die Ergebnisse des Lagerungstests. Aus dieser Figur kann geschlossen werden, dass innerhalb der experimentellen Fehler die Zwischenstufen stabil in dem wässrigen Lagerungsmedium über eine verlängerte Zeitdauer sind, d.h. mindestens ungefähr 66 Wochen.
  • Die Zusammensetzung gemäß der Erfindung wird geeigneterweise hergestellt durch Ersetzen des flüssigen Reaktionsmediums aus dem aktivierten Trägermedium, z.B. durch Waschen, durch das wässrige Medium, das schließlich zum Lagern der Zusammensetzung verwendet werden wird.
  • Die Zusammensetzung wird dem Kunden als ein Kit geliefert, das einen Lagerungsbehälter umfasst, der die Zusammensetzung enthält, d.h. das aktive Medium in Kontakt mit dem wässrigen Medium. Derartige Lagerungsmittel können umfassen Fla schen, Ampullen, Kolben und andere geschlossene Gefäße, die eine Verdampfung nicht erlauben. Im Falle von Trägermedien in der Form von offenen Oberflächen (z.B. Wells für eine Mikrotiterplatte) und monolithischen porösen und nicht-porösen Matrizen, Streifen und dergleichen, kann das Medium selbst als das Lagerungsmittel dienen, vorausgesetzt, dass es ein geeignetes Abdeckmittel gibt, das die Verdampfung von der aktivierten Oberfläche verhindert.

Claims (11)

  1. Lagerungsstabile Zusammensetzung, umfassend einen Träger, der primäre und sekundäre Amingruppen aufweist und für die Immobilisierung von Amingruppen-enthaltenden Verbindungen nutzbar ist, wobei das Trägermedium aktiviert ist, um elektrophile, von Quadratsäure abgeleitete Gruppen, die an das Medium gebunden sind, aufzuweisen, wobei das Trägermedium in Kontakt mit einem wässrigen Medium steht und die Zusammensetzung in einem geschlossenen Gefäß enthalten ist, das die Verdampfung des wässrigen Mediums nicht erlaubt.
  2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das aktivierte Trägermedium durch die Formel repräsentiert ist
    Figure 00140001
    wobei • P einen Träger repräsentiert; • A und B unabhängig voneinander für O oder S stehen können; • X für O oder S stehen kann; und • R eine inerte organische Gruppe repräsentiert, die zusammen mit X und der Quadratsäuregruppe eine elektrophile Struktur bildet.
  3. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–2, weiter umfassend eine antibakteriell wirksame Komponente.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei die antibakteriell wirksame Komponente ein Lösungsmittel ist, das mischbar ist mit Wasser, bevorzugt ein Alkohol, insbesondere Methanol, Ethanol, Propanol, iso-Propanol, Butanol, sec-Butanol, tert-Butanol oder Ethylenglycol.
  5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das wässrige Medium Wasser umfasst in einer Menge von 5–100%, bevorzugt 20–95%, bevorzugter 40–85%, und/oder einen Alkohol in einer Menge von 95–5%, bevorzugt 80–5%, bevorzugter 60–25%.
  6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–4, wobei das wässrige Medium einen Alkohol umfasst in einer Menge von 5–95%, bevorzugt 5–80%, bevorzugter 10–60%, wie 25–60%.
  7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–6, die für mindestens eine Woche stabil ist, bevorzugt für mindestens 66 Wochen.
  8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–7, wobei der Träger in der Form von Kügelchen vorliegt.
  9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–8, wobei der pH des wässrigen Mediums 5–9 beträgt.
  10. Verfahren zum Herstellen einer lagerungsstabilen Zusammensetzung, umfassend eine Matrix, die reaktive elektrophile Quadratsäuregruppen trägt, wobei das Verfahren umfasst i) Umsetzen einer Matrix, die primäre und/oder sekundäre Amingruppen umfasst, mit einem bifunktionellen nukleophilen Quadratsäure-Derivat, wodurch Quadratsäuregruppen auf der Matrix eingeführt werden, um eine aktivierte Matrix zu ergeben ii) Waschen der aktivierten Matrix mit einem wässrigen Medium; und iii) Lagern der aktivierten Matrix in dem wässrigen Waschmedium für mindestens eine Woche.
  11. Kit, umfassend ein Mittel zum Lagern einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–9, und eine derartige Zusammensetzung, die in dem Lagerungsmittel enthalten ist.
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