DD220969B1 - Verfahren zur herstellung von traeger-ligand-komplexen - Google Patents
Verfahren zur herstellung von traeger-ligand-komplexenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Träger-Ligand-Komplexen durch Umsetzung von nucleophilen Komponenten mit aktivierten polymeren Trägermaterialien. Anwendungsgebiet sind die Biotechnologie, die chemische und die pharmazeutische Industrie.
Trägerfixierte Reagenzien finden immer weitere Anwendung bei der Durchführung von Stoffwandlungen oder analytischen präparativen Stofftrennungen (A.Wisemann [Edtr.] Handbook of Enzyme Chemistry, New York 1975, D. R. Lowe, An Introduction to Affinity Chromatography, Amsterdam 1979). Das trägerfixierte System besteht aus der polymeren Matrix, dem Träger, an den durch kovalente adsorptive Bindung Stoffe mit der gewünschten spezifischen Wirkung (Liganden) gebunden sind. Als Liganden werden natürliche oder synthetische Verbindungen mit bestimmten chemischen oder biologischen Wirkungen verwendet, z. B.
Enzyme als Katalysatoren für Stoffwandlungen, Proteine und Peptide mit der Wirkung von Lectinen, Inhibitoren, Antigenen oder Anti-Körpern, Nukleinsäuren, Polysaccharide, Zuckerderivate usw. Die für die Bindung der Liganden verwendeten Polymeren sind natürliche Polysaccharide, wie z. B. Cellulose, Stärke, Dextrane, Agarose und deren Derivate oder synthetische hydroxylgruppenhaltige Polymere, hydrophile Vinyl polymere (Fractogel TIK) oder Phenol-Formaldehydkondensate (Duolite) sowie aminogruppenhaltige Polymere, wie Polyacrylamid, modifizierte Polysaccharide (z. B. Aminohexyl-Sepharose) oder auch Proteine.
Die Art der Knüpfung kovalenter Bindungen zwischen Trägern und Liganden übt einen wesentlichen Einfluß auf die Eigenschaften des entstehenden Produktes aus und ist daher immer wieder Gegenstand erneuter Untersuchungen.
Am häufigsten erfolgt die Bindung peptidartiger Liganden über deren zugängliche α- und ε-Aminogruppen, obwohl auch die Möglichkeit zur Reaktion der Carboxylgruppen oder SH-Gruppen besteht. Voraussetzung für die Bindung der Liganden ist die Aktivierung der chemisch wenig reaktiven Hydroxylgruppen der Träger.
Die für die Immobilisierung unterschiedlichster Liganden an polymere Träger anwendbaren Methoden sind in Übersichtsarbeiten und Monographien dargestellt (Chemical Analysis, Vol. 59, P. J.EIving, J.D.Winefordner [Edtrs.], New York 1981; E.A.Hill, M. D. Hirtenstein, in Advances in Biotechnological Processes 1, S. 31-66, New York, 1983).
Für die Erläuterung der beanspruchten Erfindung sollten lediglich Kopplungsreaktionen betrachtet werden, die den Einsatz von stabilen aktivierten Trägern beinhalten, d. h. die spontane Reaktion von aktivierten Estern, wie N-Hydroxysuccinimidestern (A) oder epoxidgruppenhaltigen Trägern (B) mit nucleophilen Liganden.
Einige N-Hydroxysuccinimidester und epoxygruppenhaltige Trägermaterialien sind kommerziell erhältlich und finden bereits breite Anwendung.
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Vorteile dieser genannten Klassen aktivierter Träger sind in ihrer Haltbarkeit und der damit verbundenen leichten Handhabung zu sehen. Es entfällt die bei anderen Methoden zur Herstellung trägerfixierter Systeme erforderliche Aktivierung der Matrix, der Umgang mit z.T. hochtoxischen Substanzen und die geringe Stabilität der aktivierten Zwischenprodukte. Weiterhin zeichnen sich diese Träger dadurch aus, daß sehr stabile chemische Bindungen zwischen den Trägern und dem Liganden entstehen, wodurch die Qualität des trägerfixierten Systems wesentlich mitbestimmt wird. Der Einsatz von epoxiaktivierten Trägern wird durch den für die Kopplung erforderlichen hohen pH-Wert beträchtlich eingeschränkt. Alkaliempfindliche Enzyme und Proteine sowe Saccharide mit reduzierenden Gruppen können nur bedingt den für die Knüpfung der chemischen Bindung erforderlichen pH-Werten und Temperaturen ausgesetzt werden.
Dagegen kann die Umsetzung von N-Hydroxysuccinimidester- oder Chlorameisensäureester-aktivierten Trägern im pH-Bereich von 6 bis 9 unter sehr schonenden Bedingungen erfolgen. Ein wesentliches Kriterium für die praktische Anwendbarkeit von N-Hydroxysuccinimidestern für die Kopplung von Liganden ist deren geringe Hydrolysebeständigkeit. Die durch Hydrolyse entstehenden Carboxylgruppen beeinträchtigen in starkem Maße die Bindung von Proteinen mit einem isoelektrischem Punkt unterhalb 7.0. Durch die Einführung einer positiv geladenen Gruppe in das Spacermolekül des aktivierten Esters kann die entstehende negative Ladung weitgehend kompensiert werden. Jedoch ist bei derartigen Produkten die Bindungsfähigkeit für basische Proteine stark herabgesetzt. Die Hydrolyseempfindlichkeit des N-Hydroxysuccinimidesters bedingt somit eine limitierte Anwendbarkeit des Trägers für die Kopplung von Proteinen und eine Herabsetzung der theoretisch durch die Zahl der eingeführten funktioneilen Gruppen erreichbaren Beladung des Trägers mit Liganden.
Das Ziel der Erfindung ist es, stabile Träger-Ligand-Komplexe zur Verfügung zu stellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und ökonomisches Verfahren zur Herstellung stabiler Träger-Ligand-Komplexe zu entwickeln. Die Aufgabe wird dadurch gelöst, daß nucleophile Liganden an Träger kovalent gebunden werden, deren Hydroxylgruppen mit N-IChlorcarbonyloxyJ-S-norbornen^.S-dicarboximid (I) aktiviert wurden.
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Als hydroxylgruppenhaltige Träger können natürliche Polysaccharide, wie Agarosen, Dextrane, Cellulosen in den unterschiedlichsten Formen, Stärke, SHP (Stärke-Hydrolyse-Produkt), PVA (Polyvinylalkohole, Duolite, Spheron usw. verwendet werden. Die Vorteile bestehen in der leichten Zugänglichkeit des verwendeten Chlorameisensäureesters I und der guten Lagerfähigkeit des aktivierten Trägers, der auch Umsetzungen in größerem Maßstab gestattet. Die bei der Umsetzung mit Nucleophilen entstehenden Träger-Ligand-Komplexe zeichnen sich durch hohe Stabilität aus. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet eine schnelle Kopplung der Liganden mit einer hohen Kopplungsausbeute.
Vergleichende Untersuchung zur Kopplung von Concanavalin A zeigen, daß bei der Kopplung an Trägern, die mit dem Chlorameisensäureester des N-Hydroxysuccinimides aktiviert wurden, nur 25% des an N-(Chlorcarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dicarboximid-aktivierten Trägern gekoppelten Concanavalin A gebunden werden. Hohe Kopplungsausbeuten sind insbesondere für kostenintensive Liganden erforderlich.
Gegenüberden bisher verwendeten Chlorameisensäureestern, wiez. B. N-Hydroxysuccinimidester, ist die Hydrolyse der mit der Verbindung I aktivierten Träger wenig ausgeprägt.
Die erfindungsgemäß aktivierten Träger ermöglichen die Kopplung der Liganden bei pH-Werten zwischen 4 und 10, wodurch das Verfahren auch für alkaliempfindliche Liganden anwendbar ist.
Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß keine toxischen und schwer abtrennbaren Nebenprodukte entstehen. Das bei der Kopplung entstehende N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid (HONB) kann infolge seiner sehr guten Wasserlöslichkeit in einfacher Weise vollständig entfernt werden, so daß der gewonnene Träger-Ligand-Komplex auch kein adsorptiv an den Träger gebundenes HONB enthält.
Vorteilhaft ist auch, daß bei der Hydrolyse der aktivierten Träger keine geladenen Gruppen entstehen, sondern die ursprünglich vorhandenen Hydroxylgruppen des Trägers zurückgebildet werden.
Auf diese Weise ist es gelungen, die Nachteile bisher bekannter Methoden zur Herstellung von Träger-Ligand-Komplexen weitgehend zu beseitigen.
Die Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Ausführungsbeispiele
Als Beispiel für Ligandenbindung wurden die Kopplung von Ovomucoid, Concanavalin A (Con A) und Glycin dargestellt, wobei die gebundene Proteinmenge nach 18stündiger Behandlung der Träger mit 1 N NaOH nach Lowry et al. (J. Biol. Chem. [1951 ] 265) bestimmt und die gebundene Glycinmenge aus dem Verbrauch (an zugesetztem Glycin) nach der TNBS-Methode ermittelt wurde.
In 1 ml wasserfreiem Dioxan sedimentierter Perlcellulose (IPOC Teltow, Charge M83/18) wurden 14ml Esterlösung I (Konz. 38 mg/ml) zugegeben. Die Suspension wurde 3 h bei 600C geschüttelt. Der abfiltrierte Träger wurde mit wasserfreiem Dioxan gewaschen und mit 1,2ml Ovomucoidlösung in 0,1 M Na-Tetraboratpuffer pH 8 (Konz. des Ovomucoid 8,33 mg/ml Träger) versetzt. Die Kopplung wurde 2 h bei Raumtemperatur unter Schütteln durchgeführt. Ergebnis 1,24mg Ovomucoid/ml Träger.
Der gleiche Versuch wie im Beispiel 1 wurde mit Sepharose Cl durchgeführt. Ergebnis: 2,48mg Ovomucoid/ml Träger.
Der gleiche Versuch wie im Beispiel 1 wurde mit Spheron P1000 durchgeführt. Ergebnis: 1,45mg Ovomucoid/ml Träger.
DerVersuch wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, nur wurde eine Ovomucoidkonzentration von 83,3 mg/ml = 100mg/ml Träger angewendet.
Ergebnis: 18,6mg Ovomucoid/ml Träger.
Der Versuch wurde wie im Beispiel 1 durchgeführt, nur erfolgte die Ovomucoidkopplung 2 h bei Raumtemperatur und anschließend noch 24h bei 4°C. Ergebnis: 7 mg Ovomucoid/ml Träger.
Die Aktivierungsbedingungen wurden wie folgt geändert: 6h bei 800C mit 3,5ml Esterlösung (Konz. 200 mg/ml) pro ml Perlcellulose. Die Kopplung erfolgte durch Zugabe von 1,2 ml Ovomucoidlösung (Konz. 41,66 mg Ovomucoid/ml) und Schütteln 2 h bei Raumtemperatur und 22 h bei 40C. Ergebnis: 13,8mg Ovomucoid/ml Träger.
Die Aktivierung von 1 ml Perlcellulose erfolgt wie im Beispiel 1. Zur Kopplung wurden 1,3ml Concanavalin A-Lösung = 10mg Concanavalin A in 0,1 M Na-Tetraboratpuffer pH 8 zugegeben. Geschüttelt wurde 5 h bei Raumtemperatur. Ergebnis: 6,7mg ConA/ml Träger.
Zu 1 ml in wasserfreiem Dioxan sedimentierter Perlcellulose (IPOC Teltow, Charge M 83/18) wurden 14ml Esterlösung I (38mg l/ml) zugegeben. Die Suspension wurde 3 h bei 600C geschüttelt. Der abfiltrierte Träger wurde mit wasserfreiem Dioxan gewaschen und mit 5ml Glycinlösung (Konz. 4mg/ml = 53,4μΜοΙ/ΓηΙ) in 0,1 Na-Tetraboratpuffer pH 8 versetzt. Nach 2stündigem Schütteln bei Raumtemperatur wurde der Träger abgesaugt, und im Überstand wurde der Glycinverbrauch ermittelt.
Ergebnis: 49,3μΜοΙ/ml Träger.
1 ml Perlcellulose, suspendiert in wasserfreiem Dioxan, wird 3 h bei 700C mit 1,7ml Esterlösung (Konz.: 300mg/ml) geschüttelt, mit Aceton gewaschen, abgesaugt und in trockenem Aceton suspendiert.
1 ml der acetonfeuchten aktivierten Cellulose wird mit 5 ml einer acetonischen Lösung von Hexamethylendiamin (8 mg Am in/m I Aceton) 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Durch Waschen mit Aceton wird die Reaktion beendet. Die gebundene Aminmenge wird nach G.Antoni et al. (Anal. Biochem. 129 [1983/60]) bestimmt.
Ergebnis: 14,4μΜοΙ Amin/ml Perlcellulose.
Bei dem Verfahren nach Beispiel 9 wurde anstelle von Hexamethylendiamin Thiophenol an Percellulose gekoppelt. Die gebundene Menge betrug 37μΜοΙ/ιτιΙ.
Bei dem Verfahren nach Beispiel 6 wurde anstelle von Ovomucoid die Protease Trypsin gekoppelt. Dazu wurde 1 ml der aktivierten Cellulose mit 1 ml 0,1 Mol Na-Tetraboratpuffer, pH 8,2,1OmM CaCI2, der 5ml Trypsin (55 Einheiten/ml) enthält, umgesetzt. Nach Waschen mit 0,05M Phosphatpuffer, pH 7,2, wurde eine Aktivität von 63 Einheiten/ml Träger ermittelt.
Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstelle von OvomucoidGlucoseoxidase aus Penicillinum notatum,250 Einheiten/mg (Hersteller: VEB Arzneimittelwerk Dresden, DDR) an aktivierte Perlcellulose gekoppelt. Nach der Kopplung wurde derTräger mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,5 gewaschen und in einem 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,0 überführt. Die ermittelte Aktivität betrug 132 Einheiten/ml.
Bei dem Verfahren nach Beispiel 1 wurde anstelle von Ovomucoid Humanserumalbumin gekoppelt. Dazu wurden 10ml Träger mit 10ml 0,1 M Na-Tetraboratpuffer, pH*8,2 (10mg Humanserumalbumin/ml [HSA]) umgesetzt. Es wurden 6,2mg HSA/ml Cellulose gebunden. Die so erhaltene HSA-Cellulose wurde für die Reinigung von HSA-Antikörpern aus Kaninchenserum eingesetzt.
Die nach Beispiel 14 erhaltenen HSA-Antikörper wurden entsprechend dem Verfahren nach Beispiel 6 an aktivierte Cellulose gekoppelt. Die gebundene IgG-Menge betrug 4,2 mg/ml Träger. Der so erhaltene Träger ist für die affinitätschromatographische Reinigung von HSA geeignet.
10ml entsprechend Beispiel 6 aktivierte Cellulose (1,13mMol aktivierte Gruppen) wurde mit 10ml eines 0,2M Na-Tetraboratpuffers, pH 8,3 versetzt, der 2mg Kalbsthymus-DNA/ml Puffer enthält. Die Umsetzung wird 20 Stunden unter Schütteln bei Raumtemperatur vorgenommen. Durch Waschen des Trägers mit 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,3 wird die Reaktion beendet. Die chemisch gebundene DNA-Menge wurde nach Hydrolyse der DNA-Cellulose mit 70%iger Perchlorsäure durch DNA-Bestimmung mittels Diphenylamin nach Dische ermittelt.
Ergebnis: 0,1 mg DNA/ml. Die so erhaltene Cellulose wurde für die affinitätschromatographische Reinigung des Enzyms Terminale Transferase eingesetzt.
Beispiel 17
Bei dem Verfahren nach Beispiel 16 wurde anstelle von Kalbsthymus-DNA das Nukleotid Polyuridylsäure [poly(U)] gekoppelt. Es wurden 0,5 mg poly(U)/ml Träger eingesetzt. Nach der Reaktion wird die Cellulose mit 20%igem Formamid in 0,01 M Phosphatpuffer, pH 7,5 und darauffolgend mit25%igem Formamid in 50mMTris-HCI, pH 7,5, 0,7M NaCI, 1OmM EDTA gewaschen. Die gebundene poly(U)-Menge beträgt 0,43mg poly(U)/ml.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von Träger-Ligand-Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß an durch N-iChlorcarbonyloxyJ-S-norbornen^.S-dicarboximid I aktivierte hydroxylgruppenhaltige Verbindungen nucleophile Liganden kovalent gebunden werden.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als hydroxylgruppenhaltige Verbindungen natürliche Polysaccharide, wie Agarosen, Dextrane, Cellulosen, z. B. Papier, Zellstoff, Cellulosepulver und -perlen, Stärke und Stärkehydrolyseprodukte (SHP), chemisch modifizierte Polysaccharide und synthetische Polymere, wie Polyvinylalkohole, Duolite, Spherone usw. und Oligomere verwendet werden.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß nucleophile Liganden, wie Proteine, Enzyme, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Nukleotide, Antigene und Antikörper, Hormone, Rezeptoren, SH-gruppenhaltige Verbindungen, NH3 oder Amine Verwendung finden.
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