DE3211279C2

DE3211279C2 -

Info

Publication number: DE3211279C2
Application number: DE19823211279
Authority: DE
Inventors: Mitko Stojtschev Dr.Med. Popov; Fidanko Stilijanov Sretenov; Rossen Haralanov Ratschev; Galina Michajlovna Dipl.-Ing. Djejeva; Sebastijana Valtschanova Sofia/Sofija Bg Bojkova
Original assignee: INSTITUT PO MIKROBIOLOGIA SOFIA/SOFIJA BG
Current assignee: INSTITUT PO MIKROBIOLOGIA SOFIA/SOFIJA BG
Priority date: 1982-03-26
Filing date: 1982-03-26
Publication date: 1987-09-03
Also published as: DE3211279A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit einer Glucose-Isomerase-Aktivität, wobei die von Glutaraldehyd induzierte Polymerisation in Anwesenheit eines Eiweißträgers erfolgt.

Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit Glucose- Isomerase-Aktivität sind bekannt.

Nach der US-PS 14 01 946 wird die Polymerisation der Zellen auf der Basis der Querverbindung in Anwesenheit einer diazotierten einen bis drei Hetero(atom)ringe enthaltenden Diaminoverbindung, wie 2,6-Diaminopyridin, 3,6-Diaminoacridin u.a. durchgeführt.

Nach der US-PS 36 94 319 werden thermisch behandelte ganze Arthrobacter-Zellen für die Isomerisation der Glucose in Fructose in einem kontinuierlichen Verfahren benutzt.

Nach der US-PS 39 80 521 (Spalte 1, Z. 49-63) werden ganze Zellen von Bacillus sp. NRLL 5656 mit Glutaraldehyd behandelt, wonach das so erhaltene Präparat zur Isomerisierung von Glucose in Fructose verwendet wird; indem die Isomerisierung in einem kontinuierlich arbeitenden Reaktor erfolgt. Wegen der geringen Konzentration der Enzyme ist dieses Verfahren ungeeignet zum Erhalt genügender Mengen an aktiven Mitteln.

Ganze Actinomycetes-Zellen können durch Ionenaustauscher, wie DEAE-Zellulose oder ECTEOLA-Zellulose mittels Ionenbindungen immobilisiert werden (US-PS 37 88 945 und US-PS 37 08 397). Eine Immobilisierung kann auch auf Collagen-Gel mit anschließender Oberflächenbehandlung des Gemisches mit Glutaraldehyd (M.J. Kolarik, B.J. Chen, A.H. Jr. Emmery, H.C. Lin, "Immobilized Enzymes in Food and Microbial Processes", Pergamon Press, 71-83, 1974) durchgeführt werden, wobei das Gemisch in einen unlösbaren Zustand versetzt wird.

Die direkte thermische Behandlung der Zellen, durchgeführt, um die Durchlässigkeit der Zellenmembrane zu vermindern, führt gewöhnlich zur Herstellung von Präparaten mit niedriger Aktivität und einer kurzen Lebensdauer während der Isomerisation. Die Immobilisierung der Zellen mittels Ionenaustauschern (wie z. B. DEAE-Zellulose) führt zu allmählichem Abwaschen der enzymatischen Aktivität von der Substratlösung. Dasselbe wird auch bei der Immobilisierung von Zellen in einer Gel-Struktur wie Polyacrylamid oder Collagen beobachtet.

Für gewöhnlich werden die dauerhaftesten Präparate von immobilisierten Enzymen bei einer kovalenten Bindung der an der Oberfläche der Zellenmembrane befindlichen Reaktivgruppen hergestellt. Ähnliche Verfahren werden ebenso für die Immobilisierung von Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität angewandt. Die Polymerisation mittels Reaktion diazotierter Diamine führt zu einer guten Rückgewinnung der Zellenaktivität. Doch wegen der hohen Toxizität und canzerogenen Eigenschaften der eingesetzten Reaktionsteilnehmer (Reagenzien) (2,6-Diaminopyridin, 3,6-Diaminoacridin) ist sie beschränkt. Die direkte Zellenpolymerisation mittels Behandlung mit Glutaraldehyd führt zu einem niedrigen Polymerisationsgrad, was durch die ungenügende Anzahl freier Reaktivgruppen auf der Zellenoberfläche bedingt ist. Demzufolge ist es nicht möglich, eine Netzstruktur in ausreichendem Ausmaß zu erhalten, welche einen besseren Kontakt zwischen dem benutzten Substrat und dem immobilisierten Enzym sichert. Das bekannte Verfahren bietet keine Möglichkeit für die Standardisierung des Endproduktes. Es wurden Versuche zur Bindung (Immobilisierung) von Zellen mit Glucose-Isomerase-Aktivität auf Blutfraktionen (z. B. die Fraktion fünf nach Kon, Fibrin u. a.) gemacht, doch wurden dabei keine Präparate mit guter Aktivität hergestellt.

Ferner gehören noch die GB-PS 15 16 704 sowie die GB-PS 12 57 263 zum Stand der Technik, in denen die Immobilisierung von Enzymen durch Glutaraldehyd in Anwesenheit von Albumin (Plasmaalbumin) beschrieben wird.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit einer Glucose-Isomerase-Aktivität, wobei die von einem Glutaraldehyd induzierte Polymerisation in Anwesenheit eines Eiweißträgers durchgeführt wird, und zwar erfindungsgemäß von Blutserum oder Blutplasma. Der Unterschied liegt darin, daß erfindungsgemäß nicht in Gegenwart von reinem Albumin, das Milch-, Ei- oder Blutalbumin sein kann, gearbeitet wird.

Das erfindungsgemäße Blutplasma bzw. Blutserum stellt eine biologische Flüssigkeit mit sehr komplizierter chemischer Zusammensetzung dar, während das Albumin nur ein Bestandteil unter der großen Vielfalt an organischen und anorganischen Stoffen ist, die im Plasma und im Serum enthalten sind.

Das Blutplasma und das Blutserum enthalten 6,5 bis 8,5% Proteine, in deren Zusammensetzung außer Albumin auch α, β, γ- Globuline und Fibrinogen (nur im Plasma) u. a. enthalten sind. Dabei sind die Albumine im Blutplasma und im Blutserum mit vielen organischen Stoffen und Salzen (Bilirubin, Urobilinogen, Coproporphirine I und III, Melanogen, Vitamin C, Harnsäure u. a.) komplex verbunden, was sie wesentlich vom gereinigten Albumin unterscheidet. Der Gehalt an den drei Plasmaproteinen wird gegenüber dem allgemeinen Eiweiß bei verschiedenen Tieren in der Tabelle in % dargelegt:

Die Angaben in der Tabelle zeigen, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren nur 37 bis 49% von den an der Immobilisierung beteiligten Proteinen Albumine sind und daß der Anteil der anderen Proteine (Globuline und Fibrinogen) u. a. größer ist. Außer diesen Proteinen enthalten das Blutplasma und das Blutserum in ihrer Zusammensetzung Lipoide und Lipoproteide (Cholesterin, Lecithin u. a.), Phosphatide, Nucleotide, Properdin und andere nichtproteinhaltige Stickstoffstoffe (Harnstoff, Harnsäure, Alantoin, Creatin, Creatinin, Indicanaminosäure, Peptide, Ammoniak u. a.), Carbaminsäure, Guanidin, Hypursäure, Betain, Glutamin, Glutation, Indolacetursäure, Ergotionein, Colamin, Tyramin, Adenosin, Carnosin, Cholin, Tuarin, Adrenalin, Tyroxin, Indolylessigsäure, Guanosin, Adenilsäure, Guanilsäure, Inosinsäure, einige Vitamine (B₁, B₂, B₆, PP u. a.), einige Hormone (Oxytozin, Vasopressin u. a.), eine Reihe von Enzymen und andere nichtstickstoffhaltige organische Stoffe (Glucose, Fructose, Glycogen, Milchsäure, Pyroweintraubensäure, Oxalsäure, Ameisensäure, Bernsteinsäure, Zitronensäure, Acetaldehyd, Acetonkörper u. a. - die organischen Säuren sind in Form von Salzen enthalten) und eine große Anzahl von Kationen (Kalium, Natrium, Calcium, Eisen, Kupfer, Zink u. a.) und Anionen (Chlor, Phosphor, Bicarbonat- und Sulfidanionen u. a.).

Die Verwendung des Blutplasmas und des Blutserums weist somit wesentliche Unterschiede und Vorteile im Vergleich zur Verwendung von reinem Albumin auf, die sich in folgendem äußern:

Die komplizierte chemische Zusammensetzung des Plasmas und des Serums sichert bessere Resultate bei der Immobilisierung der Zellen, die sich in höheren Erträgen und in positiver Einwirkung auf die Enzymenaktivität, auf die physikalisch- mechanischen Eigenschaften und auf die Halbwertzeit der immobilisierten Enzymenpräparate äußern (Halbwertzeit bedeutet die Zeitspanne, während der das Enzym 50% seiner Anfangsaktivität - T 1/2, bewahrt);
die Verwendung von Plasma und Serum anstatt reinen Albumins vereinfacht beträchtlich und verbilligt vielfach das Verfahren der Immobilisierung und macht es leicht anwendbar und vorteilhaft für die Industrie.

Das Blutplasma und das Blutserum unterscheiden sich untereinander dadurch, daß das Plasma erhalten wird, indem zu frisch entnommenem Blut vor dem Gerinnen Antikoagulantien (Zitrate, Oxalate u. a.) hinzugefügt werden, wonach sich durch Zentrifugieren die Formelemente absondern. Das Serum wird nach der Absonderung des Fibrins und der Formelemente aus dem frisch entnommenen Blut erhalten.

Das Plasma enthält Fibrinogen, Thrombin fehlt jedoch darin, während es im Serum umgekehrt ist - dort ist Thrombin enthalten und Fibrinogen fehlt. Alle anderen Bestandteile des Plasmas und des Serums sind analog, was den Gehalt an organischen und anorganischen Stoffen anbelangt.

Die angegebene Zusammensetzung des Blutplasmas und des Blutserums zeigt den großen Unterschied zwischen dem bekannten Einsatz von Albumin und dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Blutplasma und Blutserum. Die Zusammensetzung des reinen Plasmaalbumins unterscheidet sich grundlegend von der Zusammensetzung des Blutplasmas und -serums.

Aufgrund der obigen Ausführungen müßte überzeugend nachgewiesen sein, daß es sich beim Austausch von Albumin gegen Blutserum bzw. Blutplasma nicht um eine naheliegende Arbeitsweise handelt. Durch die Kompliziertheit der Zusammensetzung von Blutserum bzw. Blutplasma war vielmehr anzunehmen, daß die Immobilisierung negativ beeinflußt wird.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren für die Immobilisierung von Bakterienzellen (Mikrobenzellen) mit Glucose- Isomerase-Aktivität bei Verwendung eines leicht erhältlichen Eiweißträgers zu schaffen, mit dem Ziel ein hochaktives und stabiles Präparat zu erhalten, welches die Herstellung hochfructoser Sirupe in einem kontinuierlichen technologischen Verfahren gewährleistet. Diese Aufgabe wird wie aus den vorstehenden Ansprüchen ersichtlich gelöst.

Bei der Ausarbeitung des Verfahrens wurde die mittels Glutaraldehyd induzierte Polymerisation der Zellen mit Glucose- Isomerase-Aktivität angewandt. Es wurde festgestellt, daß die Glucose-Isomerase-Aktivität erhalten bleibt, wenn die Polymerisation mit Glutaraldehyd in Anwesenheit von Blutserum oder Blutplasma als Eiweißträger durchgeführt wird. Das Blutserum oder Blutplasma, welches von gesunden Schlachttieren (Rind- und Kleinvieh, Schweinen u. a.) entnommen wird, muß den Veterinär-Sanitätserfordernissen entsprechen und wird in gekühltem, eingefrorenem oder getrocknetem Zustand verwendet. Bei den letzteren zwei Fällen muß das Blutserum oder das Blutplasma in Wasser bis zu einer Konzentration von 10 bis 12% Trockensubstanz aufgelöst werden. Das nach der Polymerisation erhaltene Produkt wird mit Wasser gespült. In diesem Zustand oder nach dem Einfrieren bei -5 bis -10°C während 12 Stunden wird das Produkt gepreßt, danach granuliert und bei Temperaturen nicht höher als 50°C unter Vakuum oder im Trockenluftstrom getrocknet. Außer in granulierter Form kann das trockene Präparat auch gemahlen und dann gesiebt benutzt werden, indem man die Fraktion mit einer Korngröße von 0,3 bis 1 mm wählt.

Das hergestellte immobilisierte Präparat wird zum Füllen einer Reaktionskolonne oder Kolonnenbatterie benutzt, durch welche eine Aktivatoren enthaltende 2 bis 3 M Glucose-Lösung (Magnesium- und Cobaltionen in für das gegebene Enzym optimalen Konzentrationen) bei Temperaturen von 45 bis 75°C durchgelassen wird. Die Strömungsgeschwindigkeit des Substrats ist so eingestellt, daß eine 40 bis 50%-ige Umwandlung der Glucose in Fructose gewährleistet ist.

Die Glucose-Isomerase-Aktivität in der Reaktionskolonne oder in der Kolonnenbatterie und die Lebenszeitdauer des enzymatischen Präparats sind eine Funktion der Berührungsdauer des Enzyms mit dem Substrat (Strömungsgeschwindigkeit der Kolonne), der angewandten Temperatur, der Aktivität und der Menge des angelegten Präparats und des Vorhandenseins von Aktivatoren (Magnesium- und Cobaltionen). Die Glucose-Isomerase-Aktivität wird in einem Reaktionsapparat nach dem von Thompson et al (US-PS 37 88 945) beschriebenen Verfahren bestimmt.

Das in Fructose umgewandelte Glucosequantum wird kalorimetrisch nach dem Dische et al.-Verfahren oder anhand der Polarimetrie bestimmt. Diese Festsetzung wird in bestimmten sich wiederholenden Zeitintervallen während der Arbeit der Kolonne vorgenommen. Der Aktivitätsindex der Kolonne wird nach der nachstehend angeführten Formel bestimmt:

A = RIE × log [0,504 (0,505-1) ] (I)

in der A die Effektivität der Kolonne ist. I das in Fructose umgewandelte Glucosequantum (in g), R die Strömungsgeschwindigkeit (in cm³ pro Minute), E die Anzahl der internationalen Einheiten Glucose-Isomerase-Aktivität, welche sich in der Kolonne oder Kolonnenbatterie befinden.

Das Gleichgewicht der Isomerisationsreaktion kann beim Vorhandensein von Minimum 2.000 internationalen Glucose-Isomerase- Einheiten erlangt werden.

Die Nebenprodukte der Reaktion und die Cobalt- und Magnesiumionen können mittels Behandlung mit Aktivkohle und Kationenaustauscherharz, wie z. B. Wofatit, Duolit, Amberlite, Dowex u. a. entfernt werden. Der Farbindex des Hoch-Fructose-Sirups wird spektrophotometrisch in einer spektralphotometrischen Küvette von 1 cm³ bei einer Wellenlänge von 450 und 600 nm bestimmt. Die Farbeinheiten des Hoch-Fructose-Sirups werden mit Hilfe folgender Formel berechnet:

in der B den Farbindex bedeutet, A₄₅₀ und A₆₀₀ die Lichtabsorption bei einer Wellenlänge von 450 und 600 nm, C die Konzentration der Lösung (in g/100 cm³).

Die hergestellten immobilisierten enzymatischen Präparate weisen im Vergleich mit den bisher bekannten Präparaten folgende Vorteile auf: Hohe Aktivität pro Gramm immobilisiertes Präparat (150 bis 200 GIU/g), günstiges pH-Optimum (7,0), hohes Temperaturoptimum (70 bis 75°C) und eine wesentliche Wärmestandfestigkeit (Thermostabilität bei Temperaturen von 45 bis 65°C). Die Produktivität (der Umwandlungseffekt) des hergestellten Präparats ist 1,5 GIU für 1 g Glucose bei einer Konvertierungsstufe von 45 bis 50%.

Anhand der nachstehend angeführten Beispiele wird die Erfindung näher erläutert:

Beispiel 1

Die nach einer Fermentation von Mikrobenzellen erhaltene Kulturflüssigkeit wird zentrifugiert oder filtriert. Die abfiltrierte Biomasse wird nur einmal mit Wasser gespült. Die nach dem Zentrifugieren oder Filtrieren erhaltenen feuchten Zellen müssen 10 bis 12% trockene Substanz enthalten. Bei einer Abweichung von diesen Werten wird eine entsprechende Korrektion der Menge des benutzten Blutserums oder Blutplasmas vorgenommen. Die frische Biomasse wird mit frisch erhaltenem Blutserum oder Blutplasma in einem Verhältnis 1 : 1 bis 1 : 10 Gewicht/Volumen vermischt, so daß das Präparat nach der Polymerisation von 150 bis 200 GIU/g Trockensubstanz enthält. Es werden 380 bis 400 cm³ 25%-ige wässerige Glutaraldehyd-Lösung pro Kilogramm Trockensubstanz im Reaktionsgemisch zugegeben, wonach es ca. eine Stunde mit einem mechanischen Rührer bei Zimmertemperatur gerührt wird. Das erhaltene polymerisierte Produkt wird filtriert und mehrfach mit Wasser gespült, bis das Spülwasser keine gelbe Färbung mehr aufweist. Das überschüssige Wasser wird mittels Pressen ausgeschieden, wonach das Präparat während 12 Stunden und bei einer Temperatur von -5 bis -10°C eingefroren wird. Nach diesem Arbeitsgang wird das Präparat entfrostet, das ausgeschiedene Wasser mittels Pressen abgetrennt und die entstandene poröse Masse einer Granulation unterzogen, wonach sie bei einer Temperatur nicht höher als 50°C unter Vakuum oder im Trockenluftstrom getrocknet wird. Außer in granulierter Form kann das Präparat auch, nachdem es bis zu einer Korngröße von 0,3 bis 1 mm gemahlen und gesiebt wird, gebraucht werden.

Beispiel 2

Bei der Polymerisation von ganzen Zellen mit Glucose-Isomerase- Aktivität mit Blutserum oder Blutplasma wird wie im Beispiel 1 verfahren. Nach dem Pressen wird das hergestellte Produkt nicht eingefroren, sondern direkt einer Granulation unterzogen, wonach es, wie im Beispiel 1 angegeben, getrocknet wird.

Beispiel 3

Die Polymerisation von Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisenden Zellen wird unter Verwendung von mittels Zerstäubung getrocknetem oder lyophilisiertem Blutserum oder Blutplasma durchgeführt. Das Blutserum oder Blutplasma wird vorher in Wasser gelöst, bis der Trockensubstanzgehalt auf 8 bis 12% eingestellt ist. Die nachfolgenden Arbeitsgänge werden wie in den Beispielen 1 und 2 durchgeführt.

Beispiel 4

Bei der Polymerisierung von Glucose-Isomerase-Aktivität aufweisenden ganzen Mikrobenzellen wird wie in den Beispielen 1, 2 und 3 verfahren mit der Ausnahme, daß man eingefrorenes Blutplasma oder Blutserum benutzt. In diesem Fall werden die eingefrorenen Blutserum- oder Blutplasma-Blöcke bei einer Temperatur nicht höher als 55°C entfrostet. Danach wird die Trockensubstanz bestimmt, die entsprechende Korrektur vorgenommen und wie in den Beispielen 1 und 2 verfahren.

Beispiel 5

Das hergestellte Trockenpräparat wird während 12 Stunden in einem eine Konzentration von 2 bis 3 M aufweisenden Glucose- Sirup eingeweicht, welcher die für das gegebene Enzym optimale Konzentration an Cobalt- und Magnesiumionen enthält, oder in Wasser in einem Verhältnis von 1 : 10 Gewicht/Volumen. Mit dem gequollenen Präparat wird eine Kolonne oder eine Kolonnenbatterie gefüllt, wobei zu beachten ist, daß die letzteren richtig und gleichmäßig gefüllt werden, ohne daß Luft mit eingeschlossen wird. Die Menge des enzymatischen Präparats, das für die Durchführung der Reaktion erforderlich ist, wird nach der Formel I bestimmt.

Durch die Kolonne passiert ununterbrochen ein Glucose-Sirup mit einer Konzentration von 2 bis 3 M. Die Fructose-Konzentration am Ausgang der Kolonne wird kolorimetrisch oder polarimetrisch bestimmt. Die Umwandlung des Glucose-Sirups wird auf dem Niveau von 40 bis 50% mittels einer Kolonnenbatterie aufrechterhalten, wobei die Kolonne, deren Aktivität unter 20% fällt, ausgewechselt wird. Um eine Mikrobenverschmutzung der Kolonne zu vermeiden, ist es empfehlenswert, die Temperatur der Isomerisation von 60 bis 65% aufrechtzuerhalten und ebenso soll der Sirup bis auf die Arbeitstemperatur vorgewärmt sein. Die Strömungsgeschwindigkeit durch die Kolonne oder durch die Kolonnenbatterie wird mittels einer geeigneten Pumpe gesteuert und hängt von der Menge und der Aktivität des benutzten Präparats gemäß Formel I für A ab.

Die Arbeitszeit einer einzelnen Kolonne (d. h. einer Kolonne, die nicht in einer Batterie eingeschlossen ist) hängt von der Anfangsaktivität des immobilisierten Präparats und der Wärmestandfestigkeit des benutzten Enzyms sowie von der Strömungsgeschwindigkeit des Substrats ab.

Claims

1. Verfahren zur Immobilisierung von Mikrobenzellen mit einer Glucose-Isomerase-Aktivität, wobei die von einem Glutaraldehyd induzierte Polymerisation in Anwesenheit eines Eiweißträgers durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man als Eiweißträger Blutserum oder Blutplasma verwendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Blutserum und das Blutplasma in einem durch Zerstäubung getrockneten, lyophilisierten oder eingefrorenen Zustand verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verhältnis zwischen der Gewichtsmenge der Mikrobenzellen und der Volumenmenge Blutserum oder Blutplasma von 1 : 1 bis 1 : 10 einhält.