DE2617350A1 - Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische funktionen tragen, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung zur herstellung von oligonukleotiden und polynukleotiden mit spezifischen terminierungen - Google Patents
Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische funktionen tragen, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung zur herstellung von oligonukleotiden und polynukleotiden mit spezifischen terminierungenInfo
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Description
Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^
Funktionen tragen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden
mit spezifischen Terminierungen
Die vorliegende Erfindung betrifft Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen tragen, insbesondere
Komplexe, bestehend aus irreversibel auf unlöslichen Trägern fixierten Enzymen, ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser
Matrizen sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden mit spezifischen Terminierungen.
Es ist bekannt, daß man Polyribunukleotide unter der Einwirkung von Enzymen fraktionieren kann, wobei man verschiedene Polynukleotide
und Oligonukleotide erhält, insbesondere Oligo U (oder Uridin-Oligonukleotide)
und Oligo G (oder Guanosin-Oligonukleotide). Diese enzymatischen Reaktionen bestehen im wesentlichen aus zwei
ORrGiNAL INSPECTED
Stufen, wobei man in der ersten Stufe die umzusetzenden Polyribonukleotide
einer enzymatisehen Hydrolyse unterwirft, wobei man
entweder die Ribonuklease aus Hammelnieren (K.KASAI und M.GRUN-BERG-MANAGO:
Eur.J.Biochem. I (1967), 152) oder die Ribonuklease von Rinderpankreas (G.SCHMIDT - The nucleic Acids I (1955), S.555,
Chargaff und Davidson Ed.) verwendet, wenn man Uridin-Oligonukleotide erhalten will (d.h.Oligonukleotide, die mit einem Pyrimidin
terminiert sind); will man Guanosin-Oligonukleotide erhalten (d.h. Oligonukleotide, die durch ein Purin terminiert sind), so verwendet
man die Ribonuklease T^, die von der Takadiastase des Aspergillus
orizae abgetrennt wurde (Egami TAKAHASHI und UCHIDA - Progress in nucleic Acids and Research an Molecular Biology XII, 1964,
59)· Diese enzymatische Hydrolyse schneidet die Polymerenkette an der 5'-Phosphatbindung ab, wobei eine 3'-Phosphatgruppe entsteht.
Anschließend folgt eine zweite Stufe, nämlich eine Dephosphorisierung durch alkalische Phosphatase aus Escherichia CoIi.
Die sukzessiv eingesetzten Enzyme befinden sich in Lösung, so daß es im Anschluß an die im Folgenden beschriebenen Verfahren erforderlich
ist, die erhaltenen Produkte von den verwendeten Enzymen zu trennen, die häufig sehr resistent sind, so daß diese Verfahren
schwierig anzuwenden sind und die Ausbeute an den erhaltenen Oligonukleotiden
sehr gering ist.
Zur Vermeidung dieser schwierig durchzuführenden, komplizierten und kostspieligen Abtrennverfahren hat man vorgeschlagen, die im
Verlauf der beiden im Folgenden beschriebenen Verfahrensstufen
verwendeten in Lösung befindlichen Enzyme durch Enzyme zu ersetzen, die durch Fixierung auf einen Träger unlöslich gemacht wurden.
8096*5/1096
_ 3 —
Durch die Arbeiten von PORATH und KRISTIANSEN ("The Proteins"
Band I, 3.Ed., Academic Press) sind die Enzyme bekannt geworden, die durch Fixierung auf einer Matrix aus Glas oder Agarose unlöslich
gemacht wurden. Die vorgeschlagenen Verfahren, welche sukzessiv unlösliche Enzyme einsetzen, lösen zwar teilweise die
Schwierigkeiten der Abtrennung von löslichen Enzymen; jedoch umfassen sie noch eine beträchtliche Anzahl von Verfahren, wobei es
sich in jedem Falle um sehr langwierige und komplizierte, im industriellen Maßstab wenig praktikable Verfahren handelt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Beschaffung von Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen
tragen, welche besser den Anforderungen der Praxis entsprechen als die bislang bekannten, individuell an einen unlöslichen
Träger gebundenen Enzyme, so daß sie insbesondere eine Fraktionierung von Polyribonukleotiden in Copolymere oder Oligonukleotide in
einer einzigen Reaktion unter söhr befriedigenden kinetischen Bedingungen
und mit ausgezeichneten Ausbeuten unter gleichzeitiger Wirkung der spezifischen Enzyme erlauben, wobei man die Fraktionierung
im Hinblick auf die Gewinnung der^gewünschten spezifischen
Copolymere oder Oligonukleotide kontrollieren kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Matrix, die gleichzeitig
mehrere verschiedene enzymatische Funktionen trägt, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer gemeinsamen Assoziation einer
Nuklease und einer alkalischen Phosphatase sowie einer unlöslichen festen Matrix besteht, die die genannten Enzyme irreversibel fixiert
hält.
$09845/10
Nach einer "bevorzugten Aus führungs form der erfindungs gemäß en Matrix,
welche mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen trägt, wird die Nuklease aus der Gruppe der Ribonucleasen ausgewählt,
insbesondere der Ribonukleasen A, T.., T2 und Up.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist der unlösliche Träger, auf dem die Enzyme fixiert sind, ein nicht denaturierender Träger, der eine physikalisch
irreversible Adsorption der Enzyme bewirkt, z.B.ein Träger aus Glas oder Quarz, Kügelchen, stark vernetzte Gele vom Typ der
Agarose, insbesondere Zellulose.
Nach einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Matrix
betragen die Mengen der auf dem Träger fixierten aktiven Enzyme vorzugsweise 0,001 bis 0,15 Gew.-% alkalische Phosphatase und
0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung
der Matrizen, welche mehrere verschiedene enzymatische Funktionen tragen, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger, welcher
vorher mit Hilfe einer geeigneten aktivierenden Substanz, wie z.B.Bromcyan, aktiviert wurde, in einer geeigneten Pufferlösung
mit den auf dem Träger zu fixierenden Enzymen, d.h.einer Nuklease und einer alkalischen Phosphatase, in Kontakt gebracht wird, wobei
die Reaktionszeit und die Temperatur in gegenseitiger Abhängigkeit stehen, worauf man die nicht fixierten Mengen der Enzyme
durch Waschen mit der gleichen Pufferlösungs wie sie für die Fixierung
verwendet wurde, entfärbt und die freien aktiven Gruppen
des Trägers mit Hilfe einer organischen B_ase mit freien Aminogruppen
wie z.B.Lysin, Arginin, Äthanolamin, Anilin neutralisiert.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
hat die verwendete Pufferlösung einen pH - Wert von 8,1 bis 8,6.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens hat die organische Base , die zur Neutralisation der freien aktiven Gruppen des Trägers nach der Fixierung der Enzyme
verwendet wird, einen pH - Wert von 8 bis 10.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Verfahrens ist die Eontaktdauer zwischen den zu fixierenden
Enzymen und dem Fixierungsträger 1 bis 16 Stunden bei Temperaturen
von 200C bis 40C
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens
besteht darin, daß man in einer Pufferlösung von einem pH -Wert von 8,1 bis 8,6 den Träger mit den Enzymen in einer Menge
von 0,001 bis 0,15 Gew.-% alkalischer Phosphatase und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers) in
Kontakt bringt.
Erfindungsgemäß beträgt die Menge der aktiven, auf dem Träger fixierten
Enzyme (gemessen nach dem Waschen und der Neutralisation) 43 bis 85% der ursprünglich eingesetzten alkalischen Phosphatase
und 47 bis 95% der ursprünglich eingesetzten Nuklease.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung der Po-
6 0 9 8 4 5 / 1D 9 $
lymeren AnU0n, AnG0n, An&QH und / oder der Oligonukleotiden U, C,
A oder G mit bestimmten Kettenlängen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polyribonukleotide durch Inkubierung mit einer unlöslichen
festen Matrix, welche gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen trägt, fraktioniert.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform dieses Fraktionierungsverfahrens
trägt die verwendete Matrix eine Nuklease und eine alkalische Phosphatase.
Erfindungsgemäß verwendet man als Polyribonukleotiden solche der
Gruppe PoIy(A1nU1 )n, PoIy(An^Oj)n, Poly(Am, G1 )n, wenn man die Polymeren
AnU0J1, AnC0J1 und A Gqjj erhalten will, bzw. die Homopolynukleotiden
Poly U, Poly C, Poly A und Poly G oder ihre Copolymer en, wenn man Oligonukleotide erhalten will.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße
Fraktionierung der Polynukleotiden kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt, indem man die zu fraktionierenden Polynucleotide
durch Kolonnen leitet, welche die erfindungsgemäße Matrix
enthalten.
Bei Herstellung der Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene
enzymatisch^ Funktionen tragen,sowie der Fraktionierung der
Polynukleotiden mit Hilfe dieser Matrizen arbeitet man entsprechend den vorstehenden Ausführungen vorzugsweise unter folgenden
Bedingungen:
I. Herstellung von festen unlöslichen Matrizen, die gleichzeitig
mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen tragen
S0984S/1Q96
26Π350
1. Auswahl und Behandlung der Matrixi
Man verwendet als feste Matrix entweder vorbehandelte G-laskügelchen
oder Zellulose oder Agarose-Gel, welche nach der Methode von Axen, Porath und Ernback ("NATURE", 214, (1967),
1302) aktiviert wurden, wobei man wie folgt vorgeht: Die
Zellulose oder Agarose (z.B.das HändeIsprodukt "SEPHAROSE")
wird zunächst über einer G-lasfritte mit destilliertem Wasser
gewaschen. Dann versetzt man mit Wasser und einer frischen Lösung von 2% Bromcyan, so daß die Endkonzentration 1,5%
Bromcyan beträgt (bzw. 50 mg Bromcyan pro Gramm der getrockneten Matrix). Man rührt bei 40C, wobei der pH - Wert auf 11
gehalten wird, indem man der Reihe nach 4N-Natronlauge zugibt (das Verfahren dauert etwa 10 Minuten); anschließend
filtriert man über einer Glasfritte und wäscht 3mal mit insgesamt 10 Volumenteilen Natriumbikarbonat.
Mir die sofortige Verwendung wäscht man 5mal bis 6mal zusätzlich mit Bikarbonat.
Für eine spätere Verwendung ist die Aktivierung nicht sehr stabil, wenn die Zellulose oder Agarose sich in Suspension
befindet. Man wäscht daher die letztere durch Mischungen aus Wasser und Aceton (mit steigenden Mengen Aceton) und trocknet
die erhaltene Paste im Exsikkator. Unmittelbar vor der Verwendung wäscht man sorgfältig mit Natriumbikarbonat, um
jede Spur von Aceton zu entfernen.
2. Fixierung der Enzyme:
Nun wird die Fixierung der Enzyme auf der behandelten Matrix
6 0 9 8 U 5 / TO 9 6
nach dem später beschriebenen Verfahren bewirkt.
Die auf der Matrix fixierten Enzyme wählt man einerseits aus
den Nuklease, andererseits aus den alkalischen Phosphatasen. Die verwendeten alkalischen Phosphatasen können tierischen
oder pflanzlichen Ursprungs sein; man bevorzugt jedoch alkalische Phosphatasen bakteriellen Ursprungs, insbesondere die
alkalische Phosphatase von Escherichia CoIi wegen ihrer besonders großen Aktivität.
Als Nuklease kann man vorzugsweise Ribonukleasen, insbesondere
die Ribonukleasen A, T^, Tp und Up wählen.
Die Aktivität der verwendeten Enzyme wird vorher gemessen und im Verlauf des Verfahrens nach den folgenden Methoden
kontrolliert:
Aktivität der Ribonukle_as_en:
Aktivität der Pankreas-Ribonuklease.
Aktivität der Pankreas-Ribonuklease.
Sie wird gemessen, indem man den Abbau von Poly U verfolgt; eine Einheit = 1 D.O. (optische Dichte) von Poly U, freigesetzt
innerhalb einer Minute bei 570G in dem säure-löslichen
Überstehenden.
Aktivität der
Sie trennt speziell die Guanosinbindungen und liefert Oligonukleotide,
die durch G-3'-P terminiert sind.
Ihre Aktivität wird gemessen, indem man in Gegenwart von EDTA den Abbau von t-ARN aus Escherichia GoIi bestimmt.
0,1 Einheiten ='1 D.O., freigesetzt innerhalb von 15 Minuten
0098/- 5/1096
bei 37°G im säure-löslichen Überstehenden.
Aktivität der alkalischen Ph_os£hatas_e:
Man verfolgt im Spektrophotometer die Umwandlung von para-Nitrophenylphosphat
in para-Nitrophenol "bei einer Absorption von 340 mm. Eine Einheit = 1 D.O. para-Nitrophenol, freigesetzt
innerhalb von 1 Minute bei Raumtemperatur.
Zur Fixierung der Enzyme auf der behandelten Matrix rührt man eine Mischung dieser Matrix mit Phosphatase und Nuklease
eine bestimmte Zeit bei einer bestimmten Temperatur in einer Pufferlösung von einem pH - Wert von 8,1 bis 8,6 , vorzugsweise
in 0,02 M Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 8,3. Zur Entfernung der nicht fixierten Enzyme wäscht man auf dem Filter
mehrmals mit Hilfe der gleichen Pufferlösung wie oben und suspendiert die Mischung erneut in dem gleichen Puffer.
Anschließend sättigt man die auf der aktivierten Matrix vorhandenen
freien Gruppen mit einer organischen Aminobase bei einem pH- Wert von 8 bis 10. Als organische Aminobase kann
man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren z.B. Lysin, Arginin,
Äthanolamin und vorzugsweise Anilin in einer 0,1 M - Lösung, vorzugsweise in einer Pufferlösung (z.B.0,1 M Tris-Puffer
bei einem pH-Wert von 8,1 bis 8,6) verwenden. Dieses Neutralisationsverfahren
der freien Gruppen durch Sättigung wird 3 bis 20 Stunden bei Temperaturen von 4°C bis 220C durchgeführt,
worauf man die überschüssige organische Base durch Filtrieren und wiederholtes Waschen mit Hilfe des oben genannten
Puffers entfernt und die erhaltene Paste in der gleichen Pufferlösung wieder in Suspension bringt (z.B. 0,02 M
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iris-Puffer bei einem pH-Wert von 8,3).
Es sei erwähnt, daß in keinem EaIl die Gesamtmenge der eingesetzten
Enzyme auf der vorher behandelten Matrix fixiert wird und daß die Aktivität der effektiv fixierten Enzyme
in keinem Falle mit der Menge der auf der Matrix fixierten Enzyme übereinstimmt.
Was die auf einer Matrix aus aktivierter Zellulose fixierten Enzyme anbelangt (vergleiche das folgende Beispiel 1)
so sind 92,5% der eingesetzten alkalischen Phosphate an die Celulose gebunden; jedoch ist die Aktivität des
fixierten Enzyms offensichtlich 7o% von derjenigen des gesamten eingesetzen Ezyms. Desgleichen beträgt die Menge
der effektiv auf der Cellulose fixierten Ribonuklease nur 66?6 des eingesetzen Enzyms und die enzymatische Aktivität
des fixierten Enzyms beträgt nur 47% der Aktivität der gesamten eingesetzen Ribonuklease.
Die Fixierung einer alkalischen Phosphatase und der Ribinuklease T.. auf einem Agarose-Träger (vergleiche das
folgende Beispiel 2) liefert eine bifunktionelle Matrix,
bei der 85% der eingesetzen Phosphatase und 94% der eingesetzen Ribonuklease T. fixiert sind, wobei die enzymatische
Aktivität der Phosphatase 65% derjenigen des fixierten Enzyms entspricht, während sie bei der Ribonuklease T^
total vorhanden ist, d.h. im letzteren Fall 94% bezogen auf das ursprünglich-.eingesetzte Enzym beträgt.
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Die aufeiner festen Matrix gemäß vorliegender Erfindung
fixierten Enzyme sind gegenüber in Aktivierung besser geschützt, als die löslichen Enzyme und daher stabiler.
Die Fixierung der Enzyme auf der Matrix ist praktisch iTfeversibel, so daß die er findungs gemäße bi funkt ioneile
Matrix ohne Aktivitätsverlust und ohne Freigabe der Enzyme an das Milieu sahr häufig verwendet werden kann.
Die Menge der fixierten Phosphatase und Nuklease ist nicht
kritisch und wird so ausgewählt, daß die Phosphatase während der Inkubationszeit gegenüber der Nuklease im Überschuß
vorliegt. Ein Überschuß an Phosphatase ist nämlich nicht hinderlich und erlaubt vielmehr eine sichere vollständige
Dephosphorilierung, während die Anwesenheit von überschüssiger Nuklease dazu führen würde, daß eine stärkere
Fraktionierung der Polynucleotide einträte, als sie erfindungsgemäß gewünscht ist.
Als Beispiel für die Megenverhältnisse (die aber nicht
kritisch sind) seien genannt:0,oo1 bis 0,15 Gew.-% alkalische
Phosphatase und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers).
II Herstellung der Copolymerßn -^nUoH'^n^OH'^n^OH
OligonukleotidenU, C, A und G
A. Zur Gewinnung der Copolymeren
603845/1096
geht man wie folgt vor:
1. Man synthetisiert in bekannter Weise ausgehend von
ADP, UDP, CDP und GDP in Gegenwart/Tolynukleotid-Phosphorilase
Polyribonukleotide der Formel:
(Wn ' (Am'Ci)n oder <i*"&1>n"·
2. Das Polymere der Formel:
Vi)n , (Am»Ct>n' oder (Vff1>n» wie es in der
ersten Stufe erhalten wurde, wird der Wirkung der erfindungsgemäßen bifunktionellen Matrix ausgesetzt;
durch die Einwirkung der Ribonuklease erfolgt ein Abbau zu einem der Polymeren der Formel A TJ-P,A C-P oder
AG-P, während durch ein Einwirkung der alkalischen Phosphatase eine Dephosphorilierung des Polymeren
zu AnU0H, An°0H oder An&0H bewirkt wird.
Es sei erwähnt, daß die alkalische Phosphatase nur auf die endständige Phosphat-Gruppe wirkt, so daß
die Gegenwart von überschüssiger Phosphatase ohne Bedeutung ist, im Gegensatz zur Ribonuklease, deren
Abbauwirkung bis zu Monomeren folgen kann, d.h. über den gewünschten Abbau hinaus, sofern ein Überschuß vorliegt.
wie__folgt
a. Durch Chromatographie auf Whatman 3MM-Papier
Durch Messung der Radioaktivität stellt man keine Verunreinigung des Polymeren fest.
6 Q 9 8 £ 5 / 1Ό 9 6
b. Durch Phosphorolyse mittels Polynukleotid-Phosphorilase aus
E. CoIi und Q.perfringens
Eine Ausbeute von 100% Phosphorolyse mit diesen beiden Enzymen zeigt die Abwesenheit von Phosphat
am3'-Ende der Polymeren.
c. Durch alkalische Hydrolyse
Nach 18 Stunden Hydrolyse mit 0,3M Kaliumkarbonat, anschließend Papierchromatographie mit DEAE-Cellulose
(=Diäthylaminoöthyl-Cellulose), in Gegenwart von
0,065 M Natriumdikarbonat, oder auf einer PEI-Platte
(Polyäthylenimin) in Gegenwart von 1N Essigsäure, anschließend 0,3 M Lith'iumchlorid findet man die
gesamte Radioaktivität in Form von Uridin; dies
zeigt gleichzeitig die Anwesenheit von internem Uridin und die Abwesenheit von terminalem Phosphat
(eine zusätzliche Wirkung der alkalischen Phosphatase).
B. Zur Gewinnung der Oligonukleotide U, 0, A oder G
verwendet man als Aus gangs sub siiat. die Homopolynukleotide
Poly U, Poly C, Poly A und Poly G oder ihre Copolymeren, welche man mit der erfindungsgemäßen
bifunktionellen Matrix reagieren läßt; die Wirkung der Matrix wird gestoppt, so^bald 25 bzw. 50 % Abbau
(gemessen durch die optische Dichte des Säure-löslichen Überstehenden) erhalten wurden.
609845Π096
Die Matrix wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Man erhält ein Gemisch aus Oligonukleotiden, die durch
Passage über eine AnionenaustaiBcher-Kolonne getrennt
werden, z.B. DEAE-Cellulose oder DEAE-Sephadex, in Gegenwart
von 7M Harnstoff. Die Elution erfolgt mit
einem Salz-Gradienten ( Natriumchlorid oder Hatriumdikarbonat,
Iriäthylamoniumatzetat).
Bei wenig-ötrukturierten Oligonukleotiden, die nicht
zur Agregation neigen, wie Oligo TJ, kann man die Oligonukleotide
mit einer Größe von 9 oder geringer durch Filtration über eine Kolonne aus"Sephadex C25" in O,15M
Amoniumdikarbonat-Puffer leicht abtrennen.
Um eine befriedigende Abtrennung zu erhalten, fixiert man die abzutrennenden Substanzen ,vorzugsweise in
dem oberen Teil der Kolonne, nämlich 10 % des eingesetzten Volumens.
Charakterisierung der Oligonukleotide
1. Durch Chromatographie
a. Zur Identifizierung der Oligonukleotide verwendet man Whatman 3MM-Papier und als Lösungsmittel n-Propanol/konzentrierter
Amoniak/Wasser (50 zu 10 zu 35 Volumenteile; vergleiche Kasai 1967)· Man
kann auch die Filtration über ein Molekularsieb einsetzen, wobei die ELution in Gegenwart von 8M
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Harnstoff -und 0,5M Amoniumdikarbonat erfolgt.
b. !Durch. Dünnschicht Chromatographie auf einer PEI-Platte.
TJm' die Zusammensetzung an Nukleosid und Nukleosid-Monophosphat nach der alkalischen Hydrolyse
festzustellen, verwendet man die Technik von E. und K, Raderat hQlnal. Bi ο ehem. 12 (1965) 83} » wobei
man 1N Essigsäure bis auf 4cm des Ursprungs v/andern
läßt und dann durch 0,3M Lithiumchlorid ersetzt.
Nach Ortung der Flecken im UV mit Hilfe von vorher dem Hydrolysat beigemengten Schleppmitteln trennt man ab
und kraTzt den entsprechenden Flecken ab, worauf man die fixierte Radioaktivität in einem Scintillations-,
zähler zählt.
2. Durch Phosphorolyse
Um sicherzustellen, daß die Dephosphorilierung vollständig ist, unterwirft man die erhaltenen Oligonukleotide
der Phosphorolyse durch Polynukleotid-Phosphorylase aus Escherichict CoIi. Die erhaltenen Resultate
sind wie folgt:
a. Bei 25% Abbau (gemessen im säurelöslichen Substrat) des als Substrat verwendeten Polymeren,zeigt die Chromatographie
auf Whatman-Papier, daß etwas Substrat übrig ist, d.h. Polymeres oder Oligonukleotide von
größerer Länge als 8n, und daß keine sehr kurzen Oligonukleotide vorjmnden ^41IiA* ifUn· von ei-E·^ Länge gleich
oder kleiner als 3n j man findet überwiegend Oligonukleotide
τοη einer Größe βη oder mehr.
Die Phosphorolyse dieser Oligonukleotide zeigt einerseits,
daß sie kein Phosphat an dem 3'-Ende haben und andererseits,daß sie frei von sehr kurzen Oligonukleotiden
sind (bekanntlich müssen die Oligonukleotide eine Länge τοη mehr als 2« haben, um der Phosphorolyse
unterworfen werden zu können).
b. Bei 50% Abbau der als Substrat verwendeten Polymeren
zeigt die Chromatographie auf Whatman-Papier dagegen
ein überwiegendes Vorliegen von kurzen Oligonukleotiden; dies wird durch Phosphorolyse bestätigt,
welche in Übereinstimmung die Abwesenheit von Phos-. phat an 3'-Ende zeigt.
3. Längenmessung der Oligonukleotide Die mittlere Länge der Oligonukleotide wird im säurelöslichen
Überstehenden in Funktion zur Inkubationszeit untersucht: Alioüote Teile des säurelöslichen Überstehenden
werden zu folgenden Zeiten entnommen: 0,2,16,26,23, 49 und 51 Stunden; die Gesamtdauer der Inkubation beträgt
51 Stunden. Man fällt in saurem Milieu aus und neutralisiert anschließend vor der alkalischen Hydrolyse.
!Für die alkalische Hydrolyse verwendet man eine Endkonzentration von 0,3M Kaliumhydroxyd 18 Stunden bei 34 C,
6 0 9845/1096
anschließend 1 Stunde "bei 50 C (um die eventuell bei
der Hydrolyse durch die Ribonuklease T^ gebildeten
zyklischen Ester zu entfernen).
Man führt eine Chromatographie der Hydrolysate auf PEI-Platten durch, um das Mengenverhältnis GMP und
G in jedem Hj^drolysat festzustellen.
Die Hydrolyse wird durch Messung der optischen Dichte und der Radioaktivität des säurelöslichen Überstehenden
kontrolliert, wobei die letzte Inkubationszeit (51 Stunden) 50% Abbau entspricht.
In Anbetracht der Gleichung
GN G ΝΗ4°Η ^ n(GMP) + G,
beträgt die Länge des Oligonukleotids bei η + 1:
GMP + 1;
G
dies bedeutet, daß ein konstantes Verhältnis GPM eine
dies bedeutet, daß ein konstantes Verhältnis GPM eine
konstante mittlere Länge der Oligonukleotide bedingt.
Es sei erwähnt, daß die Affinität der Nukleasen zu den
Polymeren viel größer ist, als zu den Oligonukle-'-otiden,
so^daß bei Anwesenheit von Polymeren im Milieu diese bevorzugt abgebaut}/ dies erklärt in gewissem Ausmaß
die Konstant der mittleren Länge der Oligonukleotide in säurelöslichen Überstehenden, wie aus der folgenden
Tabelle ersUhW'hi
609845/109S
Zeitkontrolle GMP G GMP/G
(in Stunden)
O | 1932 | 351 | 2,7 |
16 | 15656 | 2286 | 6,85 |
26 | 17872 | 2879 | 6,25 |
33 | 31411 | 5635 | 5,6 |
49 | 38125 | 4876 | 7,85 |
51 | 30519 | 4403 | 6,95 |
Es sei betont, daß die durchgeführten Kontrollen
zeigen, daß praktisch kein Verlust des ursprünglich eingesetzten Materials vorliegt.
Außer den vorstehend beschriebenen Gegenständen umfasst die vorliegende Erfindung auch weitere Ausführungsformen,
die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.
Die Erfindung betrifft insbesondere Matritzen,die gleichzeitig
mehrere verschiedene enzymatisch^ !Punktionen tragen, sowie ihre Herstellung und ihre Verwendung zur
Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden mit spezifischen Terminierungen, ferner geeignete Mittel zur
Durchführung dieser Verfahren und zur Realisierung dieser Matritzen, sowie die nach diesem Verfahrem erhaltenen
Polynucleotide und Oligonukleotide.
609845/1Ö9S
In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher erläutert; diese sollen jetzt jedoch in keiner Weise
zur Beschränkung dienen.
Beisp iele;
Beispiel 1; Herstellung einer erfindungsgemäßen Matrix
durch Fixierung von alkalischer Phosphatase und Ribonuklease auf Cellulose
Die Cellulose wird auf einer Matritze mit destilliertem Wasser gewaschen, dann versetzt man mit V/asser und einer
frischen Lösung von 2% Bromcyan, so daß man eine Endkonzentration von 1,5% Bromcyan erhält ("beziehungsweise
50 Miligramm pro Gramm getrockneter Cellulose). Man rührt bei 40C, wobei der pH-Wert durch allmähliche Zugabe
von 4N Natronlauge auf 11 gehalten wird ( das Verfahren
dauert etwa 10 Minuten); anschließend filtriert man auf der Glasfritte und führt drei Wäschen mit insgesamt
10 Volumenteilen Hatrondikarbonat durch.
Für eine sofortige Verwendung wäscht man 5 bis 6 mal zusätzlich mit Natrondikarbonat.
Für eine spätere Verwendung wäscht man mit Mischungen
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aus Wasser und Azeton (mit zunehmenden Mengen Azeton) und trocknet anschließend die erhaltene Paste im Exikator.
Unmittelbar vor Verwendung wäscht man sorgfältig mit Natriumdikarbonat, um jede Spur Azeton zu entfernen.
2. Fixierung_der Enzyme
Man rührt leicht 16 Stunden bei 4 C eine Lösung, die
2,5 Mililiter aktivierter Cellulose (entsprechend etwa 0,4 Gramm getrockneter Cellulose), 350 }ijalkalischer
Phosphatase (entsprechend 100 Einheiten) und 40 p.g Ribonuklease
aus Rinderpankreas (entsprechend 80 Einheiten) in einem 0,02 M Tris-Puffer bei pH 8,3 enthält.
Man eliminiert die nicht fixierten Enzyme, in dem man
fünmal hintereinander wäscht und jeweils filtriert, wobei man fünfmal 5 Mililiter o,o2 M Tris-Puffer verwendet, worauf
man anschließend im gleichen Puffer wieder susbendiert,
Die Menge der fixierten Enzyme beträgt 92,5 Einheiten ( von 100) der alkalischen Phosphatase und 53 Einheiten
( von 80) der Ribonuklease; das sind 92,5% beziehungsweise
66% Ausbeute der Fixierung.
Anschließend sättigt man die freien Gruppen, die in der Cellulose vorhanden sind, in^dem man 0,1 M Anilin
in 0,1 M Tris-Puffer bei pH 8,3 siifiigt und anschließend
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6 Stunden "bei 4°C rührt.
Dann entfernt amn das nicht gebundene Anilin, in dem
man 5 aufeinander folgende Wäschen durchführt (jeweils gefolgt von einer Filtration) und zwar 5 mal fünf Milliliter
0,1 M Tris-Puffer vom pH 8,3.
Man suspendiert anschließend die auf der Cellulose fixierten Enzyme wieder in 0,02 M Tris-Puffer von pH 8,3
und mißt die Aktivität der fixierten Enzyme durch Filtration der Suspension und des Piltrats; auf diese Weise
findet man:
- Alkalische Phosphatase: 40 Einheiten in der
Suspension und 25 Einheiten im Filtrat,entsprechend
einer Endaus-"beute von A-3% des aktiven
fixierten Enzyms
- Ribonuklease aus Rinder-
pankreas : 25 Einheiten in der
Suspension und 16 Einheiten im Filtrat, entsprechend
einer Endaasbeute von 47% an aktiven fixierten Enzym.
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Beispiel 2; Herstellung einer erfindungsgemäßen Matrix
durch !Fixieren von alkalischer Phosphatase und Ribonuklease Tf auf einem Agarose-Träger
Man verfährt wie bei Beispiel 1 "bei der Aktivierung
der Cellulose beschrieben und verwendet als Träger Agarose-Kügelchen
(Handelsbezeichnung "Sepharose 4B". 2.!Fixierung der Enzyme;
Man rührt 16 Stunden bei 4 O ein Gramm der aktivierten
"Sepharose4B" mit 20 Einheiten (=54 Jig ) alkalischer
Phosphatase und 7000 Einheiten (=59,2 jig) Ribonuklease
Τ., und verfährt anschließend wie im Beispiel 1 beschrieben.
Man fixiert 85% der alkalischen Phosphatase (=17 Einheiten,
von denen 11 ausgedrückt sind, entsprechend einer 65%igen Wirksamkeit bezogen auf das fixierte Enzym) und
94% Ribonuklease (entsprechend 6600 Einheiten, die total
ausgedrückt sind, entsprechend einer Wirksamkeit von 94%.
Beispiel 3: Verwendung der erfindungsgemäßen bifunktionellen Moritzen zur Herstellung eines Polymeren der For-
VOH
Erste Stufe: Herstellung des polymeren Poly AnC1 durch Einwirkung der Polynukleotid-Phosphorjlase aus Escherichia
Coii.
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Man stellt folgende Inkubationsmischung her: Tris 100 mM
Na01 18,75 mM, ADP 62,5 mM, CDP 0,62mM un<^gegebenenfalls
20 Microcurie von CDP, das in Alpha-Stellung oder gleichmäßig mit 6 markiert ist, so daß man ein radioaktives
Copolymeres erhält, dessen Eigenschaften leicht getestet werden können und das als Versuchsmaterial zur Verfügung
steht), sowie 35 Polymerisationseinheiten fixierte PoIyribonukleotid-Phosphorylase,
insgesamt 2,6 Mililiter.
Die Inkubation wird bei 450C durchgeführt. Man verfolgt
das Fortschreiten der Polymerisation mit Hilfe des Prozentsatzes des freigesetzten Phosphats und stoppt
die Reaktion, so bald der letztere 50% erreicht (8 Stunden Inkubation).
Auf diese Weise erhält man ein Poly (A^qqCj)
Man führt eine Zentrifugierung durch, um das Polymere
von unlöslichen Enzym zu trennen. Die Abtrennung des Polymeren und der nicht verwendeten Nukleosid-Diphosphate
erhält man durch eine vorhergehende Chromatographie des Gewichts über eine Kolonne aus "Sephadex G-50"
(1,2 χ 11) die mit 0,02 M Tris-Puffer und 0,1M Natriumchlorid
äquilibriert wurde; man eluiert. ." mit dem gleichen
Puffer und gewinnt in dieser Stufe 600 D.O. des Polymeren in 5MULiUter.
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Zweite Stufe; Herstellung des Polymeren A Cnfl.
Das vorhergehende Polymere (600 D.O.) wird 10 Stunden
bei 37°C in Gegenwart von 2 Einheiten unlöslicher Pankreas-Rib onüklease und 10 Einheiten unlöslicher alkalischer
Phosphatase, die auf den gleichen Träger fixiert sind, sowie in Gegenwart von 0,2 M Kaliumchlorid gerührt;(der
Zusatz von letzterem soll die zufälligen Spaltungen nach dem A durch die Ribonuklease verhindern);
Beers, Journ.Biol.Chem.235 (1960) 2393.
Man isoliert 520 D.O. im Überstehenden. Um die Oligonukleotide
zu entfernen, die durch Einwirkung der Ribonuklease entstanden sind, chromatographiert man das
genannte Überstehnde über eine Kolonne aus"Sephadex G50"
(0,9 x 40); die Elution wird mit 0,02M Tris-Puffer und
0,1M Natriumchlorid bewirkt. Man gewinnt 350 D.O. des Copolymeren.
Die Eigenschaften des erhaltenen Copolymeren -A-C werden
wie oben beschrieben kontrolliert.
Beispiel 4; Verwendung der erfindungsgemäßen bifunktionellen Matritzen zur Gewinnung eines Polymeren der Formel
Die Inkubationsmischung ist wie folgt zusammengesetzt: Tris 10OmM, HaC1 18,75 mM, ADP 62,5mM, UDP 1,3mM ( und
gegebenenfalls 20 Microcurie UDP, das in Alpha-Stellung oder gleichmäßig C markiert ist), 35 Polymerisations-
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einheiten fixierte PolyrilDonukleotid-Phospiiorylase,insgesamt
2,6 MiIIliliter. Die Inkubation wird bei 45°C durchgeführt.
Der Rest des Verfahrens sowie die Kontrollen werden unter den gleichen Bedingungen wie bei der Gewinnung des
Polymeren A^00Cj durchgeführt.
Das Resulatat der Kontrollen ist befriedigend hinsichtlich der Homogenität des Copolymeren, der 100%igen Phosphorolyse,
der Abwesenheit von internem Uridin und terminalem Phosphat.
Beispiel 5i Verwendung der erfindungsgemäßen Matritzen
zur Gewinnung von Oligonukleotiden U
Man läßt 50 D.O. PoIy-IJ-in 100 mM Tris-Puffer von einem
pH-Wert von 8,3 inkubieren, der 10 mM Magnesiumchlorid sowie eine Suspension von aktivierter Zellulose enthält,
die 0,4 Einheiten Ribonuklease und 1,3 Einheiten fixierter alkalischer Phosphatase enthält.
Die Inkubation wird gestoppt, sobald man 25% und schließlich 50% Abbau erhalten hat (gemessen durch die
optische Dichte bei 260 nm).
Dann ' zentrifugiert man die Suspension zur Eliminierung der fixierten Enzyme.
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Man erhält eine Mischung von Oligonukleotiden, die durch
Passage über eine Kolonne von DEAE-Zellulose mit einem
Gradient von Ammoniumdikarbonat getrennt werden.
Die Charakterisierung des Oligo TJ wird wie oben 'beschrieben
durchgeführt.
Man stellt fest, daß kein Verlust des ursprünglich eingesetzten Materials (berechnet auf Basis der D.O. bei 260
nm) stattfindet, was beweist, das in keinem Stadium der Herstellung eine irreversible Adsorption von Hukleotiden
oder Oligonukleotiden stattfindet.
Beispiel 6: Verwendung der erfindungsgemäßen Matritzen
zur Gewinnung von Oligonukleotiden G-
Die Inkubationsmischung besteht aus folgenden Bestandteilen:
50 mM Iris pH 7,5, 2 mM EDTA, 4,3 D.O./ml PoIy-G (gegebenenfalls
1,2 D.O. radioaktives PoIy-G, frei von Spuren verunreinigender Oligonukleotide, entsprechend 0,2 Mikrocurie)
sowie 40 Einheiten Ribonuklease T1 und 1 Einheit
alkalischer Phosphatase, fixiert auf "SEPHAROSE 4B", die aktiviert ist.
Man erhält eine Mischung von Oligonukleotiden, die durch Chromatographie auf einer Anionenaustauscherkolönne, z.B.
DEAE-SEPHADEX, in Gegenwart von 7 M Harnstoff getrennt werden; die Elution erfolgt mit Hilfe von Natriumbikarbonat.
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Die Charakterisierung des Oligo G- wird wie oben beschrieben
durchgeführt.
Man stellt fest, daß weniger als 10% Verlust des ursprünglich
eingesetzten Materials auftreten (Bestimmung durch Radioaktivität).
Aus der vorstehenden Beschreibung wird ersichtlich, daß man je nach der Ausführungsart und der geeigneten Verwendung
Matrizen erhält, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Punktionen tragen, bei deren Verwendung
zur Herstellung von Polynukleotiden mit speziellen Terminierungen und von Oligonukleotiden wichtige Vorteile gegenüber
dem Stand der Technik auftreten; abgesehen von den bereits oben zitierten Vorteilen seien hervorgehoben die
sehr bedeutende Verbesserung der Kinetik des Fraktionierung s ve rf ahrens der Polyribonukleotide mit der Hilfe der
alkalischen Phosphatase und der Ribonuklease, die Möglichkeit der präzisen Kontrolle des Fraktion!erungsverfahrens
zur Gewinnung der gewünschten Substanzen, die ausgezeichneten Ausbeuten sowie die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen
bifunktionellen Matrizen zur Gewinnung von Segmenten von ARN (t-AKM, r-ARN oder m-ARN) durch selektive Spaltung
unter bestimmten Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke einzusetzen.
Die Erfindung beschränkt sich natürlich nicht auf die oben im Einzelnen geschilderten Ausführungsformen; sie umfaßt
vielmehr alle Varianten, die der Fachmann der Beschreibung entnehmen kann.
6 09845/1096
Claims (17)
- PatentansprücheΊ♦ Feste, unlösliche Matrix, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen trägt, dadurch gekennzeicl ..et, daß sie aus einer gemeinsamen Assoziation einer Nuklease aus der Gruppe der Ribonucleasen A, 3L , T?, Up und einer alkalischen Phosphatase auf der vorher aktivierten Matrix durch irreversible Fixierung "besteht, wobei die freien aktiven Gruppen der Matrix nach der Fixierung dieser Enzyme durch eine organische Base mit freien Aminogruppen neutralisiert wird.
- 2. Matrix gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als unlöslichen Träger, auf dem die Enzyme fixiert sind, einen nicht^-denaturi er enden Träger wählt, der eine physikalisch irreversible Adsorption der Enzyme bewirkt, z.B.Träger aus Glasoder Quarzkügelchen, stark vernetzten Gelen vom Typ der Agarose, insbesondere Zellulose.
- 3. Matrix gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der fixierten aktiven Enzyme auf dem Träger vorzugsweise 0,315 bis 47 Einheiten alkalische Phosphatase pro mg des Trägers und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers) betragen.
- 4. Matrix gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklease - falls sie aus Pankreas-Ribonuklease besteht - auf dem Träger in einer Länge von 2 bis 100 Einheiten pro mg des Trägers fixiert ist.609845/1096
- 5. Matrix gemäß Anspruch. 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklease - falls sie aus Ribonuklease T1 besteht - auf dem Träger in einer Menge von 120 "bis 6.000 Einheiten pro mg des Trägers fixiert ist.
- 6. Verfahren zur Herstellung von Matrizen gemäß Ansprüchen 1 bis 5 unter Verwendung eines festen Trägers, der vorher mit Hilfe einer geeigneten aktivierenden Substanz (z.B.Bromcyan) aktiviert wurde, dadurch gekennzeichnet, daß der aktivierte feste Träger in einer Pufferlösung, die den Puffer tris-(Hydroymethyl)-Aminomethan oder einen analogen Puffer mit äquivalenten Elutionskoeffizienten enthält, mit den auf dem Träger zu fixierenden Enzymen (Nuklease und alkalische Phosphatase) in Kontakt gebracht wird, wobei die Temperatur und die Zeit miteinander in Beziehung stehen, anschließend die Menge der nicht fixierten Enzyme durch Waschen mit einer identischen Pufferlösung wie der für die Fixierung verwendeten entfernt und die im Träger vorhandenen aktiven freien Gruppen mit Hilfe einer organischen Base mit freien Aminogruppen aus der Gruppe Lysin, Arginin, Ethanolamin und Anilin neutralisiert.
- 7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Pufferlösung einen pH - Wert von 8,1 bis 8,6 hat.
- 8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Neutralisation der freien aktiven Gruppen des Trägers nach der Fixierung der Enzyme verwendete organische Base einen pH-Wert von 8 bis 10 hat.609845/1096
- 9. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontaktdauer zwischen den zu fixierenden Enzymen und dem Eixierungsträger 1 bis 16 Stunden bei einer Temperatur von 2O0C bis 4°C beträgt.
- 10. Verfahren gemäß Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung von einem pH - Wert von 8,1 bis 8,6 des Trägers mit solchen Mengen der Enzyme in Kontakt bringt, daß eine Fixierung von 0,315 bis 45 Gewichtseinheiten der alkalischen Phosphatase pro mg des Trägers und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers) stattfindet .
- 11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger in einer Pufferlösung von einem pH-Wert von 8,1 bis 8,6 mit einer solchen Menge Pankreas-Ribonuklease in Kontakt bringt, daß eine Fixierung von 2 bis 100 Einheiten des letztgenannten Enzyms pro mg des Trägers stattfindet.
- 12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in einer Pufferlösung von einem pH-Wert von 8,1 bis 8,6 mit einer solchen Menge Ribonuklease T.. in Kontakt gebracht wird, daß die Fixierung von 120 bis 6.000 Einheiten des letztgenannten Enzyms pro mg des Trägers stattfindet.
- 13. Verfahren zur Herstellung der Polymeren -A-^Uqjj, -^n 0QH* "^n6OH und / oder der Oligonukleotiden U, C, A oder G von bestimmter Kettenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß man Polyribonukleotide durch Inkubation mit einer unlöslichen, festen Matrix,6 0 9 8 4 5/1096die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Punktionen trägt, gemäß Ansprüchen 1 "bis 5 fraktioniert.
- 14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Matrix eine Nuklease und eine alkalische Phosphatase trägt.
- 15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyribonukleotiden PoIy(A1nU1); Poly(Am, Cj)n, JPoIy (Am„ G..)n" einsetzt und die Polymeren -A-Uq11, -A-J1Cq11 "und A GqH _hält.
- 16. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Homopolynukleotide Poly U, Poly C, Poly A und Poly G oder ihre Copolymere einsetzt und Oligonukleotide gewinnt.
- 17. Verfahren gemäß Ansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man kontinuierlich oder halbkontinuierlich verfährt, indem man die zu fraktionierenden Polynucleotide durch Kolonnen leitet, welche eine Matrix gemäß Ansprüchen 1 bis 5 enthalten.609845/1096
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- 1976-04-23 JP JP51047128A patent/JPS51136884A/ja active Pending
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