DE2617350A1

DE2617350A1 - Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische funktionen tragen, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung zur herstellung von oligonukleotiden und polynukleotiden mit spezifischen terminierungen

Info

Publication number: DE2617350A1
Application number: DE19762617350
Authority: DE
Inventors: Geb Trachtenberg Anni Guissani; Minh-Nguy Thang
Original assignee: Choay SA
Current assignee: Choay SA
Priority date: 1975-04-23
Filing date: 1976-04-21
Publication date: 1976-11-04
Also published as: FR2308636B1; US4039382A; FR2308636A1; JPS51136884A

Description

Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen tragen, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden mit spezifischen Terminierungen

Die vorliegende Erfindung betrifft Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen tragen, insbesondere Komplexe, bestehend aus irreversibel auf unlöslichen Trägern fixierten Enzymen, ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Matrizen sowie ihre Verwendung zur Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden mit spezifischen Terminierungen.

Es ist bekannt, daß man Polyribunukleotide unter der Einwirkung von Enzymen fraktionieren kann, wobei man verschiedene Polynukleotide und Oligonukleotide erhält, insbesondere Oligo U (oder Uridin-Oligonukleotide) und Oligo G (oder Guanosin-Oligonukleotide). Diese enzymatischen Reaktionen bestehen im wesentlichen aus zwei

ORrGiNAL INSPECTED

Stufen, wobei man in der ersten Stufe die umzusetzenden Polyribonukleotide einer enzymatisehen Hydrolyse unterwirft, wobei man entweder die Ribonuklease aus Hammelnieren (K.KASAI und M.GRUN-BERG-MANAGO: Eur.J.Biochem. I (1967), 152) oder die Ribonuklease von Rinderpankreas (G.SCHMIDT - The nucleic Acids I (1955), S.555, Chargaff und Davidson Ed.) verwendet, wenn man Uridin-Oligonukleotide erhalten will (d.h.Oligonukleotide, die mit einem Pyrimidin terminiert sind); will man Guanosin-Oligonukleotide erhalten (d.h. Oligonukleotide, die durch ein Purin terminiert sind), so verwendet man die Ribonuklease T^, die von der Takadiastase des Aspergillus orizae abgetrennt wurde (Egami TAKAHASHI und UCHIDA - Progress in nucleic Acids and Research an Molecular Biology XII, 1964, 59)· Diese enzymatische Hydrolyse schneidet die Polymerenkette an der 5'-Phosphatbindung ab, wobei eine 3'-Phosphatgruppe entsteht. Anschließend folgt eine zweite Stufe, nämlich eine Dephosphorisierung durch alkalische Phosphatase aus Escherichia CoIi.

Die sukzessiv eingesetzten Enzyme befinden sich in Lösung, so daß es im Anschluß an die im Folgenden beschriebenen Verfahren erforderlich ist, die erhaltenen Produkte von den verwendeten Enzymen zu trennen, die häufig sehr resistent sind, so daß diese Verfahren schwierig anzuwenden sind und die Ausbeute an den erhaltenen Oligonukleotiden sehr gering ist.

Zur Vermeidung dieser schwierig durchzuführenden, komplizierten und kostspieligen Abtrennverfahren hat man vorgeschlagen, die im Verlauf der beiden im Folgenden beschriebenen Verfahrensstufen verwendeten in Lösung befindlichen Enzyme durch Enzyme zu ersetzen, die durch Fixierung auf einen Träger unlöslich gemacht wurden.

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_ 3 —

Durch die Arbeiten von PORATH und KRISTIANSEN ("The Proteins" Band I, 3.Ed., Academic Press) sind die Enzyme bekannt geworden, die durch Fixierung auf einer Matrix aus Glas oder Agarose unlöslich gemacht wurden. Die vorgeschlagenen Verfahren, welche sukzessiv unlösliche Enzyme einsetzen, lösen zwar teilweise die Schwierigkeiten der Abtrennung von löslichen Enzymen; jedoch umfassen sie noch eine beträchtliche Anzahl von Verfahren, wobei es sich in jedem Falle um sehr langwierige und komplizierte, im industriellen Maßstab wenig praktikable Verfahren handelt.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Beschaffung von Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen tragen, welche besser den Anforderungen der Praxis entsprechen als die bislang bekannten, individuell an einen unlöslichen Träger gebundenen Enzyme, so daß sie insbesondere eine Fraktionierung von Polyribonukleotiden in Copolymere oder Oligonukleotide in einer einzigen Reaktion unter söhr befriedigenden kinetischen Bedingungen und mit ausgezeichneten Ausbeuten unter gleichzeitiger Wirkung der spezifischen Enzyme erlauben, wobei man die Fraktionierung im Hinblick auf die Gewinnung der^gewünschten spezifischen Copolymere oder Oligonukleotide kontrollieren kann.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Matrix, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen trägt, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer gemeinsamen Assoziation einer Nuklease und einer alkalischen Phosphatase sowie einer unlöslichen festen Matrix besteht, die die genannten Enzyme irreversibel fixiert hält.

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Nach einer "bevorzugten Aus führungs form der erfindungs gemäß en Matrix, welche mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen trägt, wird die Nuklease aus der Gruppe der Ribonucleasen ausgewählt, insbesondere der Ribonukleasen A, T.., T₂ und Up.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der unlösliche Träger, auf dem die Enzyme fixiert sind, ein nicht denaturierender Träger, der eine physikalisch irreversible Adsorption der Enzyme bewirkt, z.B.ein Träger aus Glas oder Quarz, Kügelchen, stark vernetzte Gele vom Typ der Agarose, insbesondere Zellulose.

Nach einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Matrix betragen die Mengen der auf dem Träger fixierten aktiven Enzyme vorzugsweise 0,001 bis 0,15 Gew.-% alkalische Phosphatase und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der Matrizen, welche mehrere verschiedene enzymatische Funktionen tragen, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger, welcher vorher mit Hilfe einer geeigneten aktivierenden Substanz, wie z.B.Bromcyan, aktiviert wurde, in einer geeigneten Pufferlösung mit den auf dem Träger zu fixierenden Enzymen, d.h.einer Nuklease und einer alkalischen Phosphatase, in Kontakt gebracht wird, wobei die Reaktionszeit und die Temperatur in gegenseitiger Abhängigkeit stehen, worauf man die nicht fixierten Mengen der Enzyme durch Waschen mit der gleichen Pufferlösung_s wie sie für die Fixierung verwendet wurde, entfärbt und die freien aktiven Gruppen

des Trägers mit Hilfe einer organischen B_ase mit freien Aminogruppen wie z.B.Lysin, Arginin, Äthanolamin, Anilin neutralisiert.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat die verwendete Pufferlösung einen pH - Wert von 8,1 bis 8,6.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens hat die organische Base , die zur Neutralisation der freien aktiven Gruppen des Trägers nach der Fixierung der Enzyme verwendet wird, einen pH - Wert von 8 bis 10.

Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Eontaktdauer zwischen den zu fixierenden Enzymen und dem Fixierungsträger 1 bis 16 Stunden bei Temperaturen von 20⁰C bis 4⁰C

Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß man in einer Pufferlösung von einem pH -Wert von 8,1 bis 8,6 den Träger mit den Enzymen in einer Menge von 0,001 bis 0,15 Gew.-% alkalischer Phosphatase und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers) in Kontakt bringt.

Erfindungsgemäß beträgt die Menge der aktiven, auf dem Träger fixierten Enzyme (gemessen nach dem Waschen und der Neutralisation) 43 bis 85% der ursprünglich eingesetzten alkalischen Phosphatase und 47 bis 95% der ursprünglich eingesetzten Nuklease.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Herstellung der Po-

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lymeren A_nU_0n, A_nG_0n, A_n&_QH und / oder der Oligonukleotiden U, C, A oder G mit bestimmten Kettenlängen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polyribonukleotide durch Inkubierung mit einer unlöslichen festen Matrix, welche gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Funktionen trägt, fraktioniert.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform dieses Fraktionierungsverfahrens trägt die verwendete Matrix eine Nuklease und eine alkalische Phosphatase.

Erfindungsgemäß verwendet man als Polyribonukleotiden solche der Gruppe PoIy(A_1nU₁ )_n, PoIy(A_n^Oj)_n, Poly(A_m, G₁ )_n, wenn man die Polymeren A_nU₀J₁, A_nC₀J₁ und A Gqjj erhalten will, bzw. die Homopolynukleotiden Poly U, Poly C, Poly A und Poly G oder ihre Copolymer en, wenn man Oligonukleotide erhalten will.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Fraktionierung der Polynukleotiden kontinuierlich oder halbkontinuierlich durchgeführt, indem man die zu fraktionierenden Polynucleotide durch Kolonnen leitet, welche die erfindungsgemäße Matrix enthalten.

Bei Herstellung der Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen tragen,sowie der Fraktionierung der Polynukleotiden mit Hilfe dieser Matrizen arbeitet man entsprechend den vorstehenden Ausführungen vorzugsweise unter folgenden Bedingungen:

I. Herstellung von festen unlöslichen Matrizen, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen tragen

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1. Auswahl und Behandlung der Matrixi

Man verwendet als feste Matrix entweder vorbehandelte G-laskügelchen oder Zellulose oder Agarose-Gel, welche nach der Methode von Axen, Porath und Ernback ("NATURE", 214, (1967), 1302) aktiviert wurden, wobei man wie folgt vorgeht: Die Zellulose oder Agarose (z.B.das HändeIsprodukt "SEPHAROSE") wird zunächst über einer G-lasfritte mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann versetzt man mit Wasser und einer frischen Lösung von 2% Bromcyan, so daß die Endkonzentration 1,5% Bromcyan beträgt (bzw. 50 mg Bromcyan pro Gramm der getrockneten Matrix). Man rührt bei 4⁰C, wobei der pH - Wert auf 11 gehalten wird, indem man der Reihe nach 4N-Natronlauge zugibt (das Verfahren dauert etwa 10 Minuten); anschließend filtriert man über einer Glasfritte und wäscht 3mal mit insgesamt 10 Volumenteilen Natriumbikarbonat.

Mir die sofortige Verwendung wäscht man 5mal bis 6mal zusätzlich mit Bikarbonat.

Für eine spätere Verwendung ist die Aktivierung nicht sehr stabil, wenn die Zellulose oder Agarose sich in Suspension befindet. Man wäscht daher die letztere durch Mischungen aus Wasser und Aceton (mit steigenden Mengen Aceton) und trocknet die erhaltene Paste im Exsikkator. Unmittelbar vor der Verwendung wäscht man sorgfältig mit Natriumbikarbonat, um jede Spur von Aceton zu entfernen.

2. Fixierung der Enzyme:

Nun wird die Fixierung der Enzyme auf der behandelten Matrix

6 0 9 8 U 5 / TO 9 6

nach dem später beschriebenen Verfahren bewirkt.

Die auf der Matrix fixierten Enzyme wählt man einerseits aus den Nuklease, andererseits aus den alkalischen Phosphatasen. Die verwendeten alkalischen Phosphatasen können tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein; man bevorzugt jedoch alkalische Phosphatasen bakteriellen Ursprungs, insbesondere die alkalische Phosphatase von Escherichia CoIi wegen ihrer besonders großen Aktivität.

Als Nuklease kann man vorzugsweise Ribonukleasen, insbesondere die Ribonukleasen A, T^, Tp und Up wählen.

Die Aktivität der verwendeten Enzyme wird vorher gemessen und im Verlauf des Verfahrens nach den folgenden Methoden kontrolliert:

Aktivität der Ribonukle_as_en:
Aktivität der Pankreas-Ribonuklease.

Sie wird gemessen, indem man den Abbau von Poly U verfolgt; eine Einheit = 1 D.O. (optische Dichte) von Poly U, freigesetzt innerhalb einer Minute bei 57⁰G in dem säure-löslichen Überstehenden.

Aktivität der

Sie trennt speziell die Guanosinbindungen und liefert Oligonukleotide, die durch G-3'-P terminiert sind.

Ihre Aktivität wird gemessen, indem man in Gegenwart von EDTA den Abbau von t-ARN aus Escherichia GoIi bestimmt.

0,1 Einheiten ='1 D.O., freigesetzt innerhalb von 15 Minuten

0098/- 5/1096

bei 37°G im säure-löslichen Überstehenden.

Aktivität der alkalischen Ph_os£hatas_e:

Man verfolgt im Spektrophotometer die Umwandlung von para-Nitrophenylphosphat in para-Nitrophenol "bei einer Absorption von 340 mm. Eine Einheit = 1 D.O. para-Nitrophenol, freigesetzt innerhalb von 1 Minute bei Raumtemperatur.

Zur Fixierung der Enzyme auf der behandelten Matrix rührt man eine Mischung dieser Matrix mit Phosphatase und Nuklease eine bestimmte Zeit bei einer bestimmten Temperatur in einer Pufferlösung von einem pH - Wert von 8,1 bis 8,6 , vorzugsweise in 0,02 M Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 8,3. Zur Entfernung der nicht fixierten Enzyme wäscht man auf dem Filter mehrmals mit Hilfe der gleichen Pufferlösung wie oben und suspendiert die Mischung erneut in dem gleichen Puffer.

Anschließend sättigt man die auf der aktivierten Matrix vorhandenen freien Gruppen mit einer organischen Aminobase bei einem pH- Wert von 8 bis 10. Als organische Aminobase kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren z.B. Lysin, Arginin, Äthanolamin und vorzugsweise Anilin in einer 0,1 M - Lösung, vorzugsweise in einer Pufferlösung (z.B.0,1 M Tris-Puffer bei einem pH-Wert von 8,1 bis 8,6) verwenden. Dieses Neutralisationsverfahren der freien Gruppen durch Sättigung wird 3 bis 20 Stunden bei Temperaturen von 4°C bis 22⁰C durchgeführt, worauf man die überschüssige organische Base durch Filtrieren und wiederholtes Waschen mit Hilfe des oben genannten Puffers entfernt und die erhaltene Paste in der gleichen Pufferlösung wieder in Suspension bringt (z.B. 0,02 M

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iris-Puffer bei einem pH-Wert von 8,3).

Es sei erwähnt, daß in keinem EaIl die Gesamtmenge der eingesetzten Enzyme auf der vorher behandelten Matrix fixiert wird und daß die Aktivität der effektiv fixierten Enzyme in keinem Falle mit der Menge der auf der Matrix fixierten Enzyme übereinstimmt.

Was die auf einer Matrix aus aktivierter Zellulose fixierten Enzyme anbelangt (vergleiche das folgende Beispiel 1) so sind 92,5% der eingesetzten alkalischen Phosphate an die Celulose gebunden; jedoch ist die Aktivität des fixierten Enzyms offensichtlich 7o% von derjenigen des gesamten eingesetzen Ezyms. Desgleichen beträgt die Menge der effektiv auf der Cellulose fixierten Ribonuklease nur 66?6 des eingesetzen Enzyms und die enzymatische Aktivität des fixierten Enzyms beträgt nur 47% der Aktivität der gesamten eingesetzen Ribonuklease.

Die Fixierung einer alkalischen Phosphatase und der Ribinuklease T.. auf einem Agarose-Träger (vergleiche das folgende Beispiel 2) liefert eine bifunktionelle Matrix, bei der 85% der eingesetzen Phosphatase und 94% der eingesetzen Ribonuklease T. fixiert sind, wobei die enzymatische Aktivität der Phosphatase 65% derjenigen des fixierten Enzyms entspricht, während sie bei der Ribonuklease T^ total vorhanden ist, d.h. im letzteren Fall 94% bezogen auf das ursprünglich-.eingesetzte Enzym beträgt.

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Die aufeiner festen Matrix gemäß vorliegender Erfindung fixierten Enzyme sind gegenüber in Aktivierung besser geschützt, als die löslichen Enzyme und daher stabiler. Die Fixierung der Enzyme auf der Matrix ist praktisch iTfeversibel, so daß die er findungs gemäße bi funkt ioneile Matrix ohne Aktivitätsverlust und ohne Freigabe der Enzyme an das Milieu sahr häufig verwendet werden kann.

Die Menge der fixierten Phosphatase und Nuklease ist nicht kritisch und wird so ausgewählt, daß die Phosphatase während der Inkubationszeit gegenüber der Nuklease im Überschuß vorliegt. Ein Überschuß an Phosphatase ist nämlich nicht hinderlich und erlaubt vielmehr eine sichere vollständige Dephosphorilierung, während die Anwesenheit von überschüssiger Nuklease dazu führen würde, daß eine stärkere Fraktionierung der Polynucleotide einträte, als sie erfindungsgemäß gewünscht ist.

Als Beispiel für die Megenverhältnisse (die aber nicht kritisch sind) seien genannt:0,oo1 bis 0,15 Gew.-% alkalische Phosphatase und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers).

II Herstellung der Copolymerßn -^_nUoH'^n^OH'^n^OH OligonukleotidenU, C, A und G

A. Zur Gewinnung der Copolymeren

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geht man wie folgt vor:

1. Man synthetisiert in bekannter Weise ausgehend von ADP, UDP, CDP und GDP in Gegenwart/Tolynukleotid-Phosphorilase Polyribonukleotide der Formel:

(Wn ' (^Am'^Ci)n ^oder <i*"^&1>_n"·

2. Das Polymere der Formel:

Vi)_n , ^(Am»^Ct>n' ^oder (V^ff1>n» ^{wie es in der} ersten Stufe erhalten wurde, wird der Wirkung der erfindungsgemäßen bifunktionellen Matrix ausgesetzt; durch die Einwirkung der Ribonuklease erfolgt ein Abbau zu einem der Polymeren der Formel A TJ-P,A C-P oder AG-P, während durch ein Einwirkung der alkalischen Phosphatase eine Dephosphorilierung des Polymeren ^{zu A}n^U0H, ^An°0H ^{oder A}n^&0H bewirkt wird. Es sei erwähnt, daß die alkalische Phosphatase nur auf die endständige Phosphat-Gruppe wirkt, so daß die Gegenwart von überschüssiger Phosphatase ohne Bedeutung ist, im Gegensatz zur Ribonuklease, deren Abbauwirkung bis zu Monomeren folgen kann, d.h. über den gewünschten Abbau hinaus, sofern ein Überschuß vorliegt.

wie__folgt

a. Durch Chromatographie auf Whatman 3MM-Papier Durch Messung der Radioaktivität stellt man keine Verunreinigung des Polymeren fest.

6 Q 9 8 £ 5 / 1Ό 9 6

b. Durch Phosphorolyse mittels Polynukleotid-Phosphorilase aus E. CoIi und Q.perfringens

Eine Ausbeute von 100% Phosphorolyse mit diesen beiden Enzymen zeigt die Abwesenheit von Phosphat am3'-Ende der Polymeren.

c. Durch alkalische Hydrolyse

Nach 18 Stunden Hydrolyse mit 0,3M Kaliumkarbonat, anschließend Papierchromatographie mit DEAE-Cellulose (=Diäthylaminoöthyl-Cellulose), in Gegenwart von 0,065 M Natriumdikarbonat, oder auf einer PEI-Platte (Polyäthylenimin) in Gegenwart von 1N Essigsäure, anschließend 0,3 M Lith'iumchlorid findet man die gesamte Radioaktivität in Form von Uridin; dies zeigt gleichzeitig die Anwesenheit von internem Uridin und die Abwesenheit von terminalem Phosphat (eine zusätzliche Wirkung der alkalischen Phosphatase).

B. Zur Gewinnung der Oligonukleotide U, 0, A oder G

verwendet man als Aus gangs sub siiat. die Homopolynukleotide Poly U, Poly C, Poly A und Poly G oder ihre Copolymeren, welche man mit der erfindungsgemäßen bifunktionellen Matrix reagieren läßt; die Wirkung der Matrix wird gestoppt, so^bald 25 bzw. 50 % Abbau (gemessen durch die optische Dichte des Säure-löslichen Überstehenden) erhalten wurden. 609845Π096

Die Matrix wird durch Zentrifugieren abgetrennt. Man erhält ein Gemisch aus Oligonukleotiden, die durch Passage über eine AnionenaustaiBcher-Kolonne getrennt werden, z.B. DEAE-Cellulose oder DEAE-Sephadex, in Gegenwart von 7M Harnstoff. Die Elution erfolgt mit einem Salz-Gradienten ( Natriumchlorid oder Hatriumdikarbonat, Iriäthylamoniumatzetat).

Bei wenig-ötrukturierten Oligonukleotiden, die nicht zur Agregation neigen, wie Oligo TJ, kann man die Oligonukleotide mit einer Größe von 9 oder geringer durch Filtration über eine Kolonne aus"Sephadex C25" in O,15M Amoniumdikarbonat-Puffer leicht abtrennen.

Um eine befriedigende Abtrennung zu erhalten, fixiert man die abzutrennenden Substanzen ,vorzugsweise in dem oberen Teil der Kolonne, nämlich 10 % des eingesetzten Volumens.

Charakterisierung der Oligonukleotide

1. Durch Chromatographie

a. Zur Identifizierung der Oligonukleotide verwendet man Whatman 3MM-Papier und als Lösungsmittel n-Propanol/konzentrierter Amoniak/Wasser (50 zu 10 zu 35 Volumenteile; vergleiche Kasai 1967)· Man kann auch die Filtration über ein Molekularsieb einsetzen, wobei die ELution in Gegenwart von 8M 609845/10 98

Harnstoff -und 0,5M Amoniumdikarbonat erfolgt.

b. !Durch. Dünnschicht Chromatographie auf einer PEI-Platte. TJm' die Zusammensetzung an Nukleosid und Nukleosid-Monophosphat nach der alkalischen Hydrolyse festzustellen, verwendet man die Technik von E. und K, Raderat hQlnal. Bi ο ehem. 12 (1965) 83} » wobei man 1N Essigsäure bis auf 4cm des Ursprungs v/andern läßt und dann durch 0,3M Lithiumchlorid ersetzt.

Nach Ortung der Flecken im UV mit Hilfe von vorher dem Hydrolysat beigemengten Schleppmitteln trennt man ab und kraTzt den entsprechenden Flecken ab, worauf man die fixierte Radioaktivität in einem Scintillations-, zähler zählt.

2. Durch Phosphorolyse

Um sicherzustellen, daß die Dephosphorilierung vollständig ist, unterwirft man die erhaltenen Oligonukleotide der Phosphorolyse durch Polynukleotid-Phosphorylase aus Escherichict CoIi. Die erhaltenen Resultate sind wie folgt:

a. Bei 25% Abbau (gemessen im säurelöslichen Substrat) des als Substrat verwendeten Polymeren,zeigt die Chromatographie auf Whatman-Papier, daß etwas Substrat übrig ist, d.h. Polymeres oder Oligonukleotide von größerer Länge als 8n, und daß keine sehr kurzen Oligonukleotide vorjmnden ^4¹IiA* ifUⁿ· ^von ei-E·^ Länge gleich

oder kleiner als 3n j man findet überwiegend Oligonukleotide τοη einer Größe βη oder mehr.

Die Phosphorolyse dieser Oligonukleotide zeigt einerseits, daß sie kein Phosphat an dem 3'-Ende haben und andererseits,daß sie frei von sehr kurzen Oligonukleotiden sind (bekanntlich müssen die Oligonukleotide eine Länge τοη mehr als 2« haben, um der Phosphorolyse unterworfen werden zu können).

b. Bei 50% Abbau der als Substrat verwendeten Polymeren zeigt die Chromatographie auf Whatman-Papier dagegen ein überwiegendes Vorliegen von kurzen Oligonukleotiden; dies wird durch Phosphorolyse bestätigt, welche in Übereinstimmung die Abwesenheit von Phos-. phat an 3'-Ende zeigt.

3. Längenmessung der Oligonukleotide Die mittlere Länge der Oligonukleotide wird im säurelöslichen Überstehenden in Funktion zur Inkubationszeit untersucht: Alioüote Teile des säurelöslichen Überstehenden werden zu folgenden Zeiten entnommen: 0,2,16,26,23, 49 und 51 Stunden; die Gesamtdauer der Inkubation beträgt 51 Stunden. Man fällt in saurem Milieu aus und neutralisiert anschließend vor der alkalischen Hydrolyse. !Für die alkalische Hydrolyse verwendet man eine Endkonzentration von 0,3M Kaliumhydroxyd 18 Stunden bei 34 C,

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anschließend 1 Stunde "bei 50 C (um die eventuell bei der Hydrolyse durch die Ribonuklease T^ gebildeten zyklischen Ester zu entfernen).

Man führt eine Chromatographie der Hydrolysate auf PEI-Platten durch, um das Mengenverhältnis GMP und G in jedem Hj^drolysat festzustellen.

Die Hydrolyse wird durch Messung der optischen Dichte und der Radioaktivität des säurelöslichen Überstehenden kontrolliert, wobei die letzte Inkubationszeit (51 Stunden) 50% Abbau entspricht.

In Anbetracht der Gleichung

GN G ^ΝΗ4°^Η ^ n(GMP) + G, beträgt die Länge des Oligonukleotids bei η + 1:

GMP + 1;

G
dies bedeutet, daß ein konstantes Verhältnis GPM eine

konstante mittlere Länge der Oligonukleotide bedingt.

Es sei erwähnt, daß die Affinität der Nukleasen zu den Polymeren viel größer ist, als zu den Oligonukle-'-otiden, so^daß bei Anwesenheit von Polymeren im Milieu diese bevorzugt abgebaut}/ dies erklärt in gewissem Ausmaß die Konstant der mittleren Länge der Oligonukleotide in säurelöslichen Überstehenden, wie aus der folgenden Tabelle ersUhW'hi

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Zeitkontrolle GMP G GMP/G

(in Stunden)

O	1932	351	2,7
16	15656	2286	6,85
26	17872	2879	6,25
33	31411	5635	5,6
49	38125	4876	7,85
51	30519	4403	6,95

Es sei betont, daß die durchgeführten Kontrollen zeigen, daß praktisch kein Verlust des ursprünglich eingesetzten Materials vorliegt.

Außer den vorstehend beschriebenen Gegenständen umfasst die vorliegende Erfindung auch weitere Ausführungsformen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen.

Die Erfindung betrifft insbesondere Matritzen,die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ !Punktionen tragen, sowie ihre Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Oligonukleotiden und Polynukleotiden mit spezifischen Terminierungen, ferner geeignete Mittel zur Durchführung dieser Verfahren und zur Realisierung dieser Matritzen, sowie die nach diesem Verfahrem erhaltenen Polynucleotide und Oligonukleotide.

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In den folgenden Beispielen ist die Erfindung näher erläutert; diese sollen jetzt jedoch in keiner Weise zur Beschränkung dienen.

Beisp iele;

Beispiel 1; Herstellung einer erfindungsgemäßen Matrix durch Fixierung von alkalischer Phosphatase und Ribonuklease auf Cellulose

Die Cellulose wird auf einer Matritze mit destilliertem Wasser gewaschen, dann versetzt man mit V/asser und einer frischen Lösung von 2% Bromcyan, so daß man eine Endkonzentration von 1,5% Bromcyan erhält ("beziehungsweise 50 Miligramm pro Gramm getrockneter Cellulose). Man rührt bei 4⁰C, wobei der pH-Wert durch allmähliche Zugabe von 4N Natronlauge auf 11 gehalten wird ( das Verfahren dauert etwa 10 Minuten); anschließend filtriert man auf der Glasfritte und führt drei Wäschen mit insgesamt 10 Volumenteilen Hatrondikarbonat durch.

Für eine sofortige Verwendung wäscht man 5 bis 6 mal zusätzlich mit Natrondikarbonat.

Für eine spätere Verwendung wäscht man mit Mischungen

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aus Wasser und Azeton (mit zunehmenden Mengen Azeton) und trocknet anschließend die erhaltene Paste im Exikator. Unmittelbar vor Verwendung wäscht man sorgfältig mit Natriumdikarbonat, um jede Spur Azeton zu entfernen.

2. Fixierung_der Enzyme

Man rührt leicht 16 Stunden bei 4 C eine Lösung, die 2,5 Mililiter aktivierter Cellulose (entsprechend etwa 0,4 Gramm getrockneter Cellulose), 350 }ijalkalischer Phosphatase (entsprechend 100 Einheiten) und 40 p.g Ribonuklease aus Rinderpankreas (entsprechend 80 Einheiten) in einem 0,02 M Tris-Puffer bei pH 8,3 enthält.

Man eliminiert die nicht fixierten Enzyme, in dem man fünmal hintereinander wäscht und jeweils filtriert, wobei man fünfmal 5 Mililiter o,o2 M Tris-Puffer verwendet, worauf man anschließend im gleichen Puffer wieder susbendiert,

Die Menge der fixierten Enzyme beträgt 92,5 Einheiten ( von 100) der alkalischen Phosphatase und 53 Einheiten ( von 80) der Ribonuklease; das sind 92,5% beziehungsweise 66% Ausbeute der Fixierung.

Anschließend sättigt man die freien Gruppen, die in der Cellulose vorhanden sind, in^dem man 0,1 M Anilin in 0,1 M Tris-Puffer bei pH 8,3 siifiigt und anschließend

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6 Stunden "bei 4°C rührt.

Dann entfernt amn das nicht gebundene Anilin, in dem man 5 aufeinander folgende Wäschen durchführt (jeweils gefolgt von einer Filtration) und zwar 5 mal fünf Milliliter 0,1 M Tris-Puffer vom pH 8,3.

Man suspendiert anschließend die auf der Cellulose fixierten Enzyme wieder in 0,02 M Tris-Puffer von pH 8,3 und mißt die Aktivität der fixierten Enzyme durch Filtration der Suspension und des Piltrats; auf diese Weise findet man:

- Alkalische Phosphatase: 40 Einheiten in der

Suspension und 25 Einheiten im Filtrat,entsprechend einer Endaus-"beute von A-3% des aktiven fixierten Enzyms

- Ribonuklease aus Rinder-

pankreas : 25 Einheiten in der

Suspension und 16 Einheiten im Filtrat, entsprechend einer Endaasbeute von 47% an aktiven fixierten Enzym.

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Beispiel 2; Herstellung einer erfindungsgemäßen Matrix durch !Fixieren von alkalischer Phosphatase und Ribonuklease Tf auf einem Agarose-Träger

Man verfährt wie bei Beispiel 1 "bei der Aktivierung der Cellulose beschrieben und verwendet als Träger Agarose-Kügelchen (Handelsbezeichnung "Sepharose 4B". 2.!Fixierung der Enzyme;

Man rührt 16 Stunden bei 4 O ein Gramm der aktivierten "Sepharose4B" mit 20 Einheiten (=54 Jig ) alkalischer Phosphatase und 7000 Einheiten (=59,2 jig) Ribonuklease Τ., und verfährt anschließend wie im Beispiel 1 beschrieben.

Man fixiert 85% der alkalischen Phosphatase (=17 Einheiten, von denen 11 ausgedrückt sind, entsprechend einer 65%igen Wirksamkeit bezogen auf das fixierte Enzym) und 94% Ribonuklease (entsprechend 6600 Einheiten, die total ausgedrückt sind, entsprechend einer Wirksamkeit von 94%.

Beispiel 3: Verwendung der erfindungsgemäßen bifunktionellen Moritzen zur Herstellung eines Polymeren der For- VOH

Erste Stufe: Herstellung des polymeren Poly AnC1 durch Einwirkung der Polynukleotid-Phosphorjlase aus Escherichia Coii.

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Man stellt folgende Inkubationsmischung her: Tris 100 mM Na01 18,75 mM, ADP 62,5 mM, CDP 0,62mM un<^gegebenenfalls 20 Microcurie von CDP, das in Alpha-Stellung oder gleichmäßig mit 6 markiert ist, so daß man ein radioaktives Copolymeres erhält, dessen Eigenschaften leicht getestet werden können und das als Versuchsmaterial zur Verfügung steht), sowie 35 Polymerisationseinheiten fixierte PoIyribonukleotid-Phosphorylase, insgesamt 2,6 Mililiter.

Die Inkubation wird bei 45⁰C durchgeführt. Man verfolgt das Fortschreiten der Polymerisation mit Hilfe des Prozentsatzes des freigesetzten Phosphats und stoppt die Reaktion, so bald der letztere 50% erreicht (8 Stunden Inkubation).

Auf diese Weise erhält man ein Poly (A^qqCj) Man führt eine Zentrifugierung durch, um das Polymere von unlöslichen Enzym zu trennen. Die Abtrennung des Polymeren und der nicht verwendeten Nukleosid-Diphosphate erhält man durch eine vorhergehende Chromatographie des Gewichts über eine Kolonne aus "Sephadex G-50" (1,2 χ 11) die mit 0,02 M Tris-Puffer und 0,1M Natriumchlorid äquilibriert wurde; man eluiert. ." mit dem gleichen Puffer und gewinnt in dieser Stufe 600 D.O. des Polymeren in 5MULiUter.

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Zweite Stufe; Herstellung des Polymeren A C_nfl.

Das vorhergehende Polymere (600 D.O.) wird 10 Stunden bei 37°C in Gegenwart von 2 Einheiten unlöslicher Pankreas-Rib onüklease und 10 Einheiten unlöslicher alkalischer Phosphatase, die auf den gleichen Träger fixiert sind, sowie in Gegenwart von 0,2 M Kaliumchlorid gerührt_;(der Zusatz von letzterem soll die zufälligen Spaltungen nach dem A durch die Ribonuklease verhindern); Beers, Journ.Biol.Chem.235 (1960) 2393.

Man isoliert 520 D.O. im Überstehenden. Um die Oligonukleotide zu entfernen, die durch Einwirkung der Ribonuklease entstanden sind, chromatographiert man das genannte Überstehnde über eine Kolonne aus"Sephadex G50" (0,9 x 40); die Elution wird mit 0,02M Tris-Puffer und 0,1M Natriumchlorid bewirkt. Man gewinnt 350 D.O. des Copolymeren.

Die Eigenschaften des erhaltenen Copolymeren -A-C werden wie oben beschrieben kontrolliert.

Beispiel 4; Verwendung der erfindungsgemäßen bifunktionellen Matritzen zur Gewinnung eines Polymeren der Formel

Die Inkubationsmischung ist wie folgt zusammengesetzt: Tris 10OmM, HaC1 18,75 mM, ADP 62,5mM, UDP 1,3mM ( und gegebenenfalls 20 Microcurie UDP, das in Alpha-Stellung oder gleichmäßig C markiert ist), 35 Polymerisations-

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einheiten fixierte PolyrilDonukleotid-Phospiiorylase,insgesamt 2,6 MiIIliliter. Die Inkubation wird bei 45°C durchgeführt.

Der Rest des Verfahrens sowie die Kontrollen werden unter den gleichen Bedingungen wie bei der Gewinnung des Polymeren A^₀₀Cj durchgeführt.

Das Resulatat der Kontrollen ist befriedigend hinsichtlich der Homogenität des Copolymeren, der 100%igen Phosphorolyse, der Abwesenheit von internem Uridin und terminalem Phosphat.

Beispiel 5i Verwendung der erfindungsgemäßen Matritzen zur Gewinnung von Oligonukleotiden U Man läßt 50 D.O. PoIy-IJ-in 100 mM Tris-Puffer von einem pH-Wert von 8,3 inkubieren, der 10 mM Magnesiumchlorid sowie eine Suspension von aktivierter Zellulose enthält, die 0,4 Einheiten Ribonuklease und 1,3 Einheiten fixierter alkalischer Phosphatase enthält.

Die Inkubation wird gestoppt, sobald man 25% und schließlich 50% Abbau erhalten hat (gemessen durch die optische Dichte bei 260 nm).

Dann ' zentrifugiert man die Suspension zur Eliminierung der fixierten Enzyme.

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Man erhält eine Mischung von Oligonukleotiden, die durch Passage über eine Kolonne von DEAE-Zellulose mit einem Gradient von Ammoniumdikarbonat getrennt werden.

Die Charakterisierung des Oligo TJ wird wie oben 'beschrieben durchgeführt.

Man stellt fest, daß kein Verlust des ursprünglich eingesetzten Materials (berechnet auf Basis der D.O. bei 260 nm) stattfindet, was beweist, das in keinem Stadium der Herstellung eine irreversible Adsorption von Hukleotiden oder Oligonukleotiden stattfindet.

Beispiel 6: Verwendung der erfindungsgemäßen Matritzen zur Gewinnung von Oligonukleotiden G-

Die Inkubationsmischung besteht aus folgenden Bestandteilen:

50 mM Iris pH 7,5, 2 mM EDTA, 4,3 D.O./ml PoIy-G (gegebenenfalls 1,2 D.O. radioaktives PoIy-G, frei von Spuren verunreinigender Oligonukleotide, entsprechend 0,2 Mikrocurie) sowie 40 Einheiten Ribonuklease T₁ und 1 Einheit alkalischer Phosphatase, fixiert auf "SEPHAROSE 4B", die aktiviert ist.

Man erhält eine Mischung von Oligonukleotiden, die durch Chromatographie auf einer Anionenaustauscherkolönne, z.B. DEAE-SEPHADEX, in Gegenwart von 7 M Harnstoff getrennt werden; die Elution erfolgt mit Hilfe von Natriumbikarbonat.

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Die Charakterisierung des Oligo G- wird wie oben beschrieben durchgeführt.

Man stellt fest, daß weniger als 10% Verlust des ursprünglich eingesetzten Materials auftreten (Bestimmung durch Radioaktivität).

Aus der vorstehenden Beschreibung wird ersichtlich, daß man je nach der Ausführungsart und der geeigneten Verwendung Matrizen erhält, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatische Punktionen tragen, bei deren Verwendung zur Herstellung von Polynukleotiden mit speziellen Terminierungen und von Oligonukleotiden wichtige Vorteile gegenüber dem Stand der Technik auftreten; abgesehen von den bereits oben zitierten Vorteilen seien hervorgehoben die sehr bedeutende Verbesserung der Kinetik des Fraktionierung s ve rf ahrens der Polyribonukleotide mit der Hilfe der alkalischen Phosphatase und der Ribonuklease, die Möglichkeit der präzisen Kontrolle des Fraktion!erungsverfahrens zur Gewinnung der gewünschten Substanzen, die ausgezeichneten Ausbeuten sowie die Möglichkeit, die erfindungsgemäßen bifunktionellen Matrizen zur Gewinnung von Segmenten von ARN (t-AKM, r-ARN oder m-ARN) durch selektive Spaltung unter bestimmten Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke einzusetzen.

Die Erfindung beschränkt sich natürlich nicht auf die oben im Einzelnen geschilderten Ausführungsformen; sie umfaßt vielmehr alle Varianten, die der Fachmann der Beschreibung entnehmen kann.

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Claims

Patentansprüche

Ί♦ Feste, unlösliche Matrix, die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Funktionen trägt, dadurch gekennzeicl ..et, daß sie aus einer gemeinsamen Assoziation einer Nuklease aus der Gruppe der Ribonucleasen A, 3L , T_?, Up und einer alkalischen Phosphatase auf der vorher aktivierten Matrix durch irreversible Fixierung "besteht, wobei die freien aktiven Gruppen der Matrix nach der Fixierung dieser Enzyme durch eine organische Base mit freien Aminogruppen neutralisiert wird.
2. Matrix gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als unlöslichen Träger, auf dem die Enzyme fixiert sind, einen nicht^-denaturi er enden Träger wählt, der eine physikalisch irreversible Adsorption der Enzyme bewirkt, z.B.Träger aus Glasoder Quarzkügelchen, stark vernetzten Gelen vom Typ der Agarose, insbesondere Zellulose.
3. Matrix gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der fixierten aktiven Enzyme auf dem Träger vorzugsweise 0,315 bis 47 Einheiten alkalische Phosphatase pro mg des Trägers und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers) betragen.
4. Matrix gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklease - falls sie aus Pankreas-Ribonuklease besteht - auf dem Träger in einer Länge von 2 bis 100 Einheiten pro mg des Trägers fixiert ist.

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5. Matrix gemäß Anspruch. 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nuklease - falls sie aus Ribonuklease T₁ besteht - auf dem Träger in einer Menge von 120 "bis 6.000 Einheiten pro mg des Trägers fixiert ist.
6. Verfahren zur Herstellung von Matrizen gemäß Ansprüchen 1 bis 5 unter Verwendung eines festen Trägers, der vorher mit Hilfe einer geeigneten aktivierenden Substanz (z.B.Bromcyan) aktiviert wurde, dadurch gekennzeichnet, daß der aktivierte feste Träger in einer Pufferlösung, die den Puffer tris-(Hydroymethyl)-Aminomethan oder einen analogen Puffer mit äquivalenten Elutionskoeffizienten enthält, mit den auf dem Träger zu fixierenden Enzymen (Nuklease und alkalische Phosphatase) in Kontakt gebracht wird, wobei die Temperatur und die Zeit miteinander in Beziehung stehen, anschließend die Menge der nicht fixierten Enzyme durch Waschen mit einer identischen Pufferlösung wie der für die Fixierung verwendeten entfernt und die im Träger vorhandenen aktiven freien Gruppen mit Hilfe einer organischen Base mit freien Aminogruppen aus der Gruppe Lysin, Arginin, Ethanolamin und Anilin neutralisiert.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Pufferlösung einen pH - Wert von 8,1 bis 8,6 hat.
8. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die zur Neutralisation der freien aktiven Gruppen des Trägers nach der Fixierung der Enzyme verwendete organische Base einen pH-Wert von 8 bis 10 hat.

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9. Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Kontaktdauer zwischen den zu fixierenden Enzymen und dem Eixierungsträger 1 bis 16 Stunden bei einer Temperatur von 2O⁰C bis 4°C beträgt.
10. Verfahren gemäß Ansprüchen 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Pufferlösung von einem pH - Wert von 8,1 bis 8,6 des Trägers mit solchen Mengen der Enzyme in Kontakt bringt, daß eine Fixierung von 0,315 bis 45 Gewichtseinheiten der alkalischen Phosphatase pro mg des Trägers und 0,001 bis 0,05 Gew.-% Nuklease (bezogen auf das Gewicht des Trägers) stattfindet .
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger in einer Pufferlösung von einem pH-Wert von 8,1 bis 8,6 mit einer solchen Menge Pankreas-Ribonuklease in Kontakt bringt, daß eine Fixierung von 2 bis 100 Einheiten des letztgenannten Enzyms pro mg des Trägers stattfindet.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger in einer Pufferlösung von einem pH-Wert von 8,1 bis 8,6 mit einer solchen Menge Ribonuklease T.. in Kontakt gebracht wird, daß die Fixierung von 120 bis 6.000 Einheiten des letztgenannten Enzyms pro mg des Trägers stattfindet.
13. Verfahren zur Herstellung der Polymeren -A-^Uqjj, -^_n ⁰QH* "^n⁶OH und / oder der Oligonukleotiden U, C, A oder G von bestimmter Kettenlänge, dadurch gekennzeichnet, daß man Polyribonukleotide durch Inkubation mit einer unlöslichen, festen Matrix,

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die gleichzeitig mehrere verschiedene enzymatisch^ Punktionen trägt, gemäß Ansprüchen 1 "bis 5 fraktioniert.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendete Matrix eine Nuklease und eine alkalische Phosphatase trägt.
15. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polyribonukleotiden PoIy(A_1nU₁); Poly(A_m, Cj)_n, JPoIy (A_m„ G..)n" einsetzt und die Polymeren -A-Uq₁₁, -A-J₁Cq₁₁ "und A Gq_H _

hält.
16. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man die Homopolynukleotide Poly U, Poly C, Poly A und Poly G oder ihre Copolymere einsetzt und Oligonukleotide gewinnt.
17. Verfahren gemäß Ansprüchen 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man kontinuierlich oder halbkontinuierlich verfährt, indem man die zu fraktionierenden Polynucleotide durch Kolonnen leitet, welche eine Matrix gemäß Ansprüchen 1 bis 5 enthalten.

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