DE19537217A1 - Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Synthese von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen, ausgehend von einem Nukleosidmonophosphat (NMP).
Enzymatische Synthesen von Oligosacchariden, z. B. von N-Acetyllactosamin (LacNAc) und seinen Derivaten mittels Glycosyltransferasen, z. B. der β-1.4 Galactosyltransferase (GaIT) [EC 2.4.1.38], und Nukleosidphosphatglycoside (Nukleotidzuckern) als Glycosyldonoren sind seit langem bekannt (Wong, C.-H., Ichikawa, Y., Krach, T., Gautheron-Le Narver, Ch., Dumas, D. P., Look, G. C., J. Am. Chem. Soc. 118, 8137-8145, 1991). Wong et al. (Wong, C.-H., Haynie, S. L., Whitesides, G. M., J. Org. Chem. 47, 5416-5418, 1982; Wong, C.-H., Wang, R., Ichikawa, Y., J. Org. Chem. 57, 4343-4344, 1992) entwickelten LacNAc-Synthesen bei welchen der Nukleotidzucker, die Uridindiphosphatglucose (UDP-GIc) in situ regeneriert wird. Infolgedessen ist es bei diesem Reaktionen nicht mehr notwendig, die relativ teuren Nukleotidzucker in stöchiometrischem Mengen einzusetzen.
Der von Elling und Kula (DE P 42 21 595 C1; Elling, L., Grothus, M., Kula, M.-R., Glycobiol. 3, 349-355, (1993)) entwickelte LacNAc-Zyklus (Fig. 1) stellt gegenüber den bisher bekannten Zyklen insofern eine Verbesserung dar, daß nur drei anstelle von sechs Enzymen zur Synthese eingesetzt werden müssen. Die synthetisierten Disaccharide können als Edukte für weitere Umsetzungen mit unterschiedlichen Transferasen z. B. Sialytransferasen oder Fucosyltransferasen verwendet werden.
Ein Zielprodukt dieser enzymatischen Synthesen ist beispielsweise das Tetrasaccharid Sialyl LewisX oder dessen Derivate (Ichikawa, Y., Lin, Y.-C., Dumas, D. P., Shen, G.-J.,Gracia-Junceda, E., Williams, M. A., Bayer, R., Ketcham, C., Walker, L. E., Paulson, J. C., Wong, C.-H., J. Am. Chem. Soc. 114, 9283-9298, 1992), dessen Bedeutung bei der Zell-Zell-Erkennung Gegenstand einer intensiven Forschung ist (DeFrees, S., Kosch, W., Way, W., Paulson, J. C., Sabesan, S., Halcomb, R. L., Huang, D.-H., Ichikawa, Y., Wong, C.-H., J. Am. Chem. Soc. 117, 66-79, 1995).
Die Saccharose-Synthase [EC 2.4.1.13] ist eine insbesondere in Pflanzen weit verbreitete Glycosyltransferase, deren Funktion als Katalysator zur Bildung von Nukleotidzuckern innerhalb des Stoffwechsels der Pflanze (Avigad, G., Encyclopedeia of Plant Physiology New Series Vol. 13A, Carbohydrates I, Intracellular Carbohydrates, Springer Verlag, Berlin, 217-347, 1982) zusammenfassend dargestellt wurde. Das Enzym ist zur Synthese von Nukleotidzuckern, z. B. UDP-, dTDP-, ADP-, CDP- und GDP-GIc, geeignet (Elling, L., Grothus, M., Kula, M.-R., Glycobiol. 3, 349-355, 1993). Die Aufreinigung der Saccharose Synthase aus Reis (Elling, L., Kula, M.-R., J. Biotechnol. 29, 277-286, 1993), und ihr Einsatz zur in situ-Regeneration von UDP-GIc wurde von Elling et al. (DE P 42 21 595 C1; Elling, L., Grothus, M. and Kula, M.-R., Glycobiol. 3, 349-355, 1993) beschrieben. Das Reisenzym ist ein homotetrameres Protein mit einem Molekulargewicht von 362 kDa. Das Enzym wurde bereits zur präparativen Synthese von dTDP-GIc ausgehend von dTDP im Enzymmembranreaktor (EMR) eingesetzt (Zervosen, A., Elling, L., Kula, M.-R., Angew. Chem. 106, 592-593,1994).
Die Kopplung von Reaktionen einer Kinase mit der Saccharose-Synthase ermöglicht eine wirtschaftlich günstigere Synthese von Nukleotidzuckern, da Nukleosidmonophosphate (NMP) gegenüber -Nukleosiddiphosphaten (NDP) deutlich preisgünstiger zu erhalten sind.
Präparative Synthesen von Nukleotidzuckern, ausgehend von einem Nukleosidmonophosphat (NMP) wurden bereits beschrieben (Heidlas J. E., Williams K. W., Whitesides G. M., Acc. Chem. Res., 25., 307-314, 1992). Hier setzte man das NMP zunächst unter Einsatz von Myokinase und Pyruvat-Kinase zum Nukleosidtriphosphat um, das dann mit dem jeweiligen Zucker-1-phosphat unter Katalyse einer spezifischen Pyrophosphorylase zum Nukleotidzucker reagierte.
Im Gegensatz zu den sehr spezifischen Pyrophosphorylasen kommt mit der Saccharose Synthase. ein Enzym zum Einsatz, mit dem verschieden aktivierte Glucosedonoren hergestellt werden können.
Es wurde nun festgestellt, daß die Saccharose-Synthase neben den Nukleotiddiphospaten (NDP) auch Desoxy-Nukleotiddiphosphate (dNDP) als Substrat akzeptieren kann. So kann z. B. dUDP-Glucose ausgehend von Saccharose als Glycosyl-Donor und UDP präparativ hergestellt werden.
Es wurde ferner festgestellt, daß die Saccharose-Synthase mit anderen Enzymen gleichzeitig inkubiert werden kann und sich somit einfache und neuartige Herstellmöglichkeiten für aktivierte Zucker eröffnen. Diese Erkenntnis ist erst durch eine verbesserte und damit vergrößerte Verfügbarkeit der Saccharose- Synthase ermöglicht worden, wie sie in den Arbeiten von Elling beschrieben wurde (DE P 42 21 595 C1; Elling, L., Kula, M.-R., J. Biotechnol. 29, 277-286, 1993; Elling, L., Grothus, M. and Kula, M.-R., Glycobiol. 3, 349-355, 1993). Das Enzym selbst ist seit mehreren Jahren bekannt, konnte jedoch mangels Menge bisher nicht auf proteinchemische Eigenschaften hin untersucht werden. So ist erst seit kurzem das pH-Optimum, sowie die für die Reaktion erforderlichen Ionen (Ionenstärke, Anwesenheit von für die Reaktion unverzichtbaren Ionen) und auch die Regulation (Endprodukt-Hemmung) bekannt (L. Elling, Glycobiology 5, 201-206, 1995). Das Enzym ist zudem nicht kommerziell verfügbar, was eine Kombination mit den o. a. Enzymen nicht vereinfachte. Der Bedarf an Nukleotidzuckern als Substrate ist in den vergangenen Jahren durch die Entdeckung und Nutzung von Glycosyltransferasen gewachsen. Erst durch diese parallele Entwicklung entstand ein Bedarf, diese teuren Substrate möglichst kostengünstig herzustellen, um so leichter an definierte Glycosylstrukturen zu kommen. So können ausgehend von NMP oder dNMP teure NDP-Zucker bzw. dNDP-Zucker hergestellt werden. Ausgehend von NMP oder dNMP läßt sich, unter Zusatz einer Pyruvat-Kinase, NDP bzw. dNDP herstellen, welches von der Saccharose Synthase als Substrat erkannt und mit Glucose zu NDP-Glucose bzw. dNDP-Glucose verknüpft wird.
In Zellen werden einige primäre Nukleotidzucker enzymatisch in andere, sog. sekundäre Nukleotidzucker, umgewandelt. So entsteht aus GDP-Mannose beispielsweise GDP-Fucose in drei aufeinanderfolgenden Schritten. Einige neuere Erkenntnisse auf diesem Gebiet sind von Chang et al. am Beispiel der Schweine-Speicheldrüsen erarbeitet worden (J. Biol. Chem., 263, 1693-1697, 1988). Die Autoren beschreiben hier die Umwandlung von GDP-Mannose erst in GDP-4-Keto-6-Desoxy-Mannose mittels einer spezifischen Dehydratase, anschließend eine Epimerase- und Reduktase-Aktivität zu GDP-Fucose. Die direkte Herstellung von Fucose ausgehend von Mannose kann im Stoffwechsel ohne Anwesenheit der Nukleotidgruppe nicht vollzogen werden. Diese Enzyme sind daher auf eine Aktivierung, d. h. den Nukleotidteil, angewiesen. Es ist vom derzeitigen Stand der Forschungen anzunehmen, daß die Bildung von anderen sekundären Nukleotidzuckern vergleichbar abläuft. Die Nukleotidzucker dUDP- und dTDP-6-Desoxy-D-Xylo-4-Hexulose werden unter Katalyse der dTDP-GIc-4,6-Dehydratase [EC 4.2.1.46] aus dUDP- und dTDP-GIc gebildet (Zarkowsky, H., Glaser, L., J. Biol. Chem. 222, 4750-4756, 1969). dTDP-6-Desoxy-D-Xylo-4-Hexulose ist ein Zwischenprodukt auf dem Biosyntheseweg der dTDP-L-Rhamnose. Die enzymatische Synthese und Isolierung dieser Substanz wurde beschrieben (Marumo, K., Lindqvist, L., Verma, N., Weintraub, A., Reeves, P. R., Lindberg, A. A., Eur. J. Biochem. 204, 539-545, 1992). dUDP-GIc ist nicht käuflich erhältlich, wurde jedoch mittels der dTDP-GIc-Pyrophosphorylase aus Pseudomonas aeruginosa in analytischen Mengen synthetisiert (Melo, A., Glaser, L., J. Biol. Chem. 240, 398-405, 1965). Unter Nutzung des Synthesepotentials der Saccharose Synthase können dUDP- und dTDP-6-Desoxy-D-Xylo-4-Hexulose ausgehend von dUMP bzw. dTDP hergestellt werden (Fig. 2) (Stein, A., Dissertation, Heinriche Heine-Universität Düsseldorf, 1995).
Es wurde außerdem gefunden, daß die Saccharose Synthase zusammen mit weiteren Enzymen, die dUDP-GIc als Substrat benötigen, inkubiert werden kann. So kann z. B. eine NOP- bzw. eine dNDP-4,6-Dehydratase gleichzeitig zur Saccharose Synthase inkubiert werden, die dessen Produkte weiter zu sekundären Nukleotidzuckern umsetzt. Die NDP- bzw. dNDP-4,6-Dehydratasen sind wichtige Enzyme für die Herstellung aktivierter Desoxyzucker, wie z. B. dTDP-L-Rhamnose.
Demnach betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Nukleosiddiphosphat-6-desoxy-D-xylo-4-hexulosen, welches sich dadurch auszeichnet, daß ein Nukleosidmonophosphat, Phosphoenol­ pyruvat, Adenosintriphosphat und Saccharose als Substrate sowie Pyruvatkinase, Nukleosidmonophosphatkinase, Saccharose-Synthase und Desoxythymidin-D-Glucose-4,6-Dehydratase als Enzyme in einer geeigneten Pufferlösung gleichzeitig inkubiert werden.
Als Nukleosidmonophosphat werden bevorzugt Desoxythymidinmonophosphat, Desoxyuridinmonophosphat oder Uridinmonophosphat eingesetzt. Gleichermaßen eignen sich die Monophosphate des Adenosins, des Cytidins sowie des Inosins.
Die Reaktion läuft in einer wäßrigen, gepufferten Lösung (beispielsweise Hepes, Tris, etc.) bei einem pH-Wert von 6-8, bevorzugt bei pH 7,2-7,5 ab. Die Temperatur beträgt 10 bis 40°C, bevorzugt 25°C, die Laufzeit beträgt 0-24h, bevorzugt 4 h.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann sowohl im Batch-Verfahren als auch kontinuierlich in einem Enzym-Membran-Reaktor (EMR) durchgeführt werden. Dabei ist der EMR vorzugsweise mit einer Ultrafiltrationsmembran mit einem Ausschlußvolumen kleiner als 30.000 D ausgestattet, so daß die im Reaktionsgemisch enthaltenen Enzyme zurückgehalten werden, während die niedermolekularen Produkte (aktivierte Zucker) und nicht umgesetzte Edukte die Membran passieren und das Produkt im Auslauf detektiert werden kann. Vorzugsweise wird der Reaktor vor Gebrauch sterilisiert, so daß auf den Zusatz von antibakteriellen Substanzen (z. B. Azid), die möglicherweise auch die Enzymaktivität beeinträchtigen, verzichtet werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch durch Perkolation der auf einen geeigneten pH-Wert eingestellten Lösung, enthaltend die Edukte dNMP oder NMP, bzw. dNDP oder NDP sowie Saccharose, über ein festes Trägermaterial, an das die entsprechenden Enzyme immobilisiert wurden, kontinuierlich durchgeführt werden. Als Trägermaterialien kommen dabei handelsübliche und dem Fachmann bekannte Träger (Eupergit, CnBr-aktivierte Sepharose, etc.) in Frage.
Ferner kann sowohl bei der Durchführung des Verfahrens in einem EMR, als auch bei der Perkolation der Lösung über die immobilisierten Enzyme die die Substrate enthaltende Pufferlösung zum wiederholten Kontakt mit den Enzymen in mehrfachen Zyklen zurückgeführt werden.
Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches und die Reinigung der erfindungsgemäß hergestellten dNDP- bzw. NDP-aktivierten Zucker erfolgt mit üblichen, aus dem Stand der Technik bekannten, Verfahren. Beispielsweise kann die Reaktionsmischung durch Filtration bzw. Zentrifugation geklärt und danach durch Ultrafiltration (Membran mit Ausschlußvolumen kleiner als 30.000D) das Enzym abgetrennt und restliches Produkt durch Diafiltration ausgewaschen werden. Die eigentliche Aufreinigung erfolgt dann z. B. mit gelchromatographischen Methoden, z. B. Gelchromatographie (z. B. Sephadex oder Biogel), Ionenaustausch- oder Dünnschichtchromatographie sowie HPLC oder dergleichen.
Die verfahrensgemäß verwendeten Ausgangsmaterialien, wie z. B. dNMP oder NMP sowie dNDP oder NDP und Saccharose und die verwendeten Enzyme sind im Handel erhältlich oder können nach in der Literatur beschriebenen Verfahren in an sich bekannter Weise hergestellt bzw. isoliert werden.
Die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten aktivierten Zucker können in an sich bekannter Weise als Bausteine für Glykokonjugate verwendet werden. Solche Glykokonjugate sind insbesondere im Pharma- und Agrobereich von Bedeutung. Hierbei dient der Nukleotid aktivierte Zucker als Substrat für eine geeignete Glykosyltransferase, welche den Zucker auf einen geeigneten Akzeptor übertragen. Die dNDP-aktivierten Zucker sind auch als Hemmstoffe für Glycosyltransferasen bekannt und können z. B. als Tumor- oder Virustatikum eingesetzt werden.
In folgenden wird das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben.
Die HPLC-Einrichtung zur Analyse der Nukleotide und Nukleotidzucker besteht aus einer Hochpräzisionspumpe Modell 300 C, einem UV-Spektrophotometer SP-6V, einem automatischen Probensammler Modell CINA und einem Integrator Chromapac C-R GA (Gynkotek, München, BRD). Säulen: 2 × Aminex HPX-87H (300 × 7,8 mm) mit Kationen-H⁺-Austauscher Kartusche (30 × 4,6 mm); Eluens: 0,006M H₂SO₄. Fluß: 0,8 ml/min; Detektion: 205 nm.
Beispiel 1: Präparative Synthese von dUDP-Glucose
Syntheseansatz:
247 mg dUMP (Na-Salz, 4 mM, Sigma), 310 mg PEP (Na-Salz, 6 mM, Sigma), 27.3 mg MgCl₂, 13,6 mg ATP (Na-Salz, 0,12 mM, Sigma), 25,7 g Saccharose (500 mM), Gesamtvolumen 150 ml.
Puffer: Tris-HCl (100 mM, pH 7,2, 3 mM DTT, 1 mg/ml BSA)
Enzyme: 40 U Saccharose-Synthase (2 U/ml), 400 U Pyruvatkinase (20 U/ml), 20 U NMPK (1 U/ml).
Reaktor: 50 ml Amicon-Zelle mit YM30-Membran
Reaktionsvolumen: 20 ml Lauf 1-6, 50 ml Lauf 7
Inkubationstemperatur: 37°C.
Produktreinigung:
  • 1) Spaltung von dUMP und dUDP mit der alkalischen Phosphatase [EC 3.1.3.1] aus Kälberdarm (Spezialqualität für die Molekularbiologie von Boehringer).
    Ansatz: 1 U alkalischen Phosphatase/ml Produktlösung.
    17 Stunden bei 30°C.
  • 2) Abtrennung der Proteine durch Ultrafiltration YM10.
  • 3) Ionenaustausch: Anionenaustausch an Q-Sepharose FF (2,6 * 35,4 cm, v: 4 ml/min, Gradient: 0,5 l H₂O pH 7,0, 0,5 l 300 mM LiCl pH 7,0).
  • 4) Einengen der Lösung am Rotationsverdampfer bei 20-25 mbar und 35- 40°C.
  • 5) Entsalzung der Probe über G10 (2,6 * 93 cm, Elutionsmittel: Millipore Wasser pH = 7,0).
  • 6) Gefriertrocknung.
  • 7) Aufreinigung UDP-GIc.
Für eine erneute Anionenaustauschchromatographie mit Q Sepharose FF wurde der pH-Wert der Produktlösung auf 7,0 eingestellt. Durch den Einsatz eines linearen LiCl-Gradienten (0,25 l H₂0 pH 7,0, 0,25 l 0,5 M LiCl pH 7,0) zur Elution des Produkts konnte das noch vorhandene Pyruvat abgetrennt werden (Enzymatischer Nachweis). Es folgten die Reinigungsschritte 4-6.
Beispiel 2: Synthese von dUDP-6-Desoxy-D-Xylo-4-Hexulose ausgehend von dUDP-GIc
Syntheseansatz:
20.1 mg dUDPGIc (10 mM)
1920 µl Hepes-NaOH (200 mM, pH 7.2, 1 mM DTT, 500 mM Saccharose, 25 mM KCl, 1 mg/ml BSA)
80 µl dTDP-D-GIc-4,6-Dehydratase (1.48 U, Rohextrakt)
Inkubation bei 30°C, Inkubationszeit: 4 h.
Nach 4 h konnte kein dUDP-GIc mit der HPLC nachgewiesen werden. Die Synthese von dTDP-6-Desoxy-D-Xylo-4-Hexulose erfolgte unter analogen Versuchsbedingungen. Hier konnte eine vollständige Umsetzung bereits nach 1 h beobachtet werden.
Beispiel 3: Synthese von dUDP-6-Desoxy-D-Xylo-6-Hexulose ausgehend von dUMP
Syntheseansatz:
V = 3 ml
4 mM dUMP (Na-Salz, Sigma), 4 mM PEP (CHA-Salz, Biomol), 0.8 mM MgCl₂, 0,12 mM ATP (Na-Salz, Sigma), 500 mM Saccharose, 6 U Saccharose-Synthase (2 U/ml), 60 U Pyruvatkinase (20 U/ml), 3 U NMPK (1 U/ml), 15 U dTDP-D-GIc 4,6-Dehydratase (5 U/ml),
Puffer: Tris-HCl (100 mM, pH 7.5, 3 mM DTT, 1 mg/ml BSA, 50 mM KCl)
Inkubationstemperatur: 25°C.
Nach einer Inkubationszeit von 4 h konnte die Bildung von 69.3% des Produktes beobachtet werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Nukleotid-6-desoxy-D-xylo- 4-hexulosen, dadurch gekennzeichnet, daß als Substrate ein Nukleosidmonophosphat, Phosphoenolpyruvat, Adenosintriphosphat und Saccharose sowie als Enzyme Pyruvatkinase, Nukleosidmono­ phosphatkinase, Saccharose-Synthase und Desoxythymid in-D-Glucose- 4,6-Dehyratase in einer Pufferlösung gleichzeitig inkubiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nukleosidmonophosphat Desoxythymidinmonophosphat eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nukleosidmonophosphat Desoxyuridinmonophosphat eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nukleosidmonophosphat Uridinmonophosphat eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren als Batch-Verfahren durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren in einem Enzym-Membran-Reaktor kontinuierlich durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die die Substrate enthaltende Pufferlösung über ein festes Trägermaterial kontinuierlich perkoliert wird, an welchem die Enzyme immobilisiert sind.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die die Substrate enthaltende Pufferlösung zu einem wiederholten Kontakt mit den Enzymen mehrfach zyklisch zurückgeführt wird.
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