DE4304558A1

DE4304558A1 - Gereinigte Saccharose-Synthase, Verfahren zur Herstellung derselben und deren Verwendung

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Publication number: DE4304558A1
Application number: DE4304558A
Authority: DE
Inventors: Lothar Elling; Maria-Regina Kula
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1993-02-16
Publication date: 1994-08-18

Description

Saccharose-Synthase (Glycosyltransferase EC 2.4.1.13 UDPG:D-Fructose 2-glucosyltransferase) ist ein insbesondere in Pflanzen (z. B. Weizen, Reis, Mais, Zuckerrüben, etc.) weit verbreitetes, seit langem bekanntes Enzym (siehe z. B. Y. Milner u. a. in "Nature"206 (1965), S. 825), dessen Funktion als Katalysator zur Bildung aktivierter Zucker innerhalb des Stoffwechsels der Pflanze bereits umfänglich untersucht und zusammenfassend dargestellt worden ist (Avigad, G. in: Loewus, F.A. et al. (eds.) Encyclopedeia of Plant Physiology New Series Vol. 13A, Carbohydrates I, Intraacellular Carbohydrates, Springer-Verlag, Berlin 1982, 217-347). Danach katalysiert das Enzym in vivo die Spaltung von Saccharose gemäß folgender Gleichung

Saccharose + NDP ⇄ NDP-Glucose + Fructose (I),

in der N für Nukleoside, wie Uridin, Thymidin, Cytidin, Guanin und Adenin steht.

Reinigung und Eigenschaften des Enzyms wurden u. a. von T. Nomura u. a. in Arch. Biochem. Biophysics 156 (1973) Seiten 644-52 beschrieben, die eine Ausbeute von 8,8% bei 11,4-facher Aufreinigung durch Ammonsulfat- Fällung und Säulenchromatographie an DEAE-Cellulose und
Neusilin (MgO·Al₂O₃·2SiO₂) erreichten und Kam-Werte für Synthese- und Spaltungsreaktion angeben.

Über eine im wesentlichen auf Ammonsulfat-Fällungen basierend gereinigte Saccharose-Synthase und deren Anwendung für die Saccharosesynthese durch Umsetzung von UDP-Glucose und Fructose berichten auch jüngst S.L.Haynie & G.M.Whitesides in Appl. Biochem. & Biotechnol. 23 (1990) Seiten 155ff. Dabei wird auf die geringe Stabilität des Enzyms (S. 158), insb. von hoch gereinigten Enzympräparaten hingewiesen (S.160) sowie auf den Nachteil weit stabilerer Enzym-Präparate von minderer Reinheit auf Grund begleitender Aktivitäten, ins. von Phosphogluco mutasen und der infolge niedriger Aktivität bestehenden Notwen digkeit der Anwendung großer Gelvolumina (des gel-immobilisier ten Enzyms).

R.H. Juang u. a. beschreiben im J. Chinese Biochem. Soc. 17 (1988) 42-51 eine Saccharose-Synthase-Reinigung durch Säulenchromatographie und Elektrophorese mit 38facher Aufreinigung, die im Hinblick auf die Proteinzusammensetzung durchgeführt wurde.

Trotz der seit langem bekannten Funktionsweise der Saccharose-Synthase und Aufreinigungsverfahren ist die Herstellung aktivierter Zucker gemäß obiger Gleichung (I) wirtschaftlich bislang nicht angewandt worden, obwohl die Saccharose-Synthase im Handel erhältlich ist und aktivierte Zucker sowie darüber erhältliche Di- und Oligosaccharide in der Zuckerchemie erhebliche Bedeutung besitzen.

Mono-, Oligo- und Polysaccharide haben vielfältige Funktionen als antigene Determinanten, bei der Zell- Zell-Erkennung, bei der Zelldifferenzierung und als Bindungsstellen für Toxine, Bakterien und Viren.

Eine zusammenfassende Darstellung von Herstellung und Anwendung findet sich bei S. David u. a. in Advances in Carbohydrate Chem. a. Biochem. 149 (1991) 175-237. Y. Ichikawa u. a. geben in Anal. Biochem. 202 (1992) 215-238 unterschied liche Umsetzungsmechanismen an. Als "Large Scale Synthese" wird jedoch insbesondere auf die Umsetzung von Zucker- 1-Phosphat (insbesondere Glucose-1-Phosphat) mit Nucleosidtriphosphat, insbesondere mit UTP, in Gegenwart von Pyrophosphorylase nach C.H. Wong u. a. (J.Org. Chem. 47 (1982) 5416-18) hingewiesen, die eine mehrstufige enzymatische Synthese von Nucleotidzuckern beschreiben. Diese Synthese nach C.H. Wong wird auch von Toone & Whiteside in Am. Chem. Soc. Sympos. Ser. 466 (1991) 1-22 als Methode der Wahl genannt.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, daß Saccharose-Synthase-Isolate (insbesondere das im Handel erhältliche Enzym) allgemein mehr oder minder hohe Anteile an Nucleotidphosphatasen enthalten und daß deren Anwesenheit - auch in nur geringer Menge - die Synthese von NDP-Glucose und homologen Verbindungen so weit stört, daß die überzeugen de Synthesetauglichkeit von Saccharose-Synthase bislang nicht erkannt werden konnte.

Durch angepaßte Reinigungsmethoden und empfindlichen Phosphatase-Nachweis wurde nunmehr eine Saccharose- Synthase entwickelt, die ausreichend stabil ist und eine glatte einstufige Synthesereaktion nach (I) ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist mithin eine aufgereinigte Saccharose-Synthase, in deren HPLC-Chromatogramm Nucleotid phosphatasen nicht mehr nachweisbar (0,1%) sind.

Weitere Besonderheiten der Erfindung ergeben sich aus den Patentansprüchen und der nachfolgenden Beschreibung.

Als Quelle für die Saccharose-Synthase dienen insbesondere Reis, Mais oder Weizenkörner, die angequollen und mechanisch aufgeschlossen werden. Der dabei gewonnene wäßrige Rohextrakt wird entweder einer PEG-Fällung (A) oder einer Verteilung im wäßrigen 2-Phasen system (B) unterworfen. Bei (A) kann eine fraktionierte Fällung vorgesehen werden, indem zunächst (A1) mit relativ niedermolekularem PEG (Polyethylenglykol; M≳1000) und min deren PEG-Konzentrationen für die Ausfällung begleitender Proteine gesorgt wird (z. B. mit 5% PEG 4000), während die Saccharose-Synthase im Überstand verbleibt, die dann in einem zweiten Schritt (A2) mit erhöhter PEG-Konzentration ausgefällt und aus dem Niederschlag mit 200 mM Hepes Puffer (pH 7,2) wieder herausgelöst wird. Die Fällung (A2) ist nicht unbe dingt erforderlich und kann zur Vereinfachung des Verfahrens und Ausbeutesteigerung weggelassen werden, wie weiter unten gezeigt wird.

Das Molekulargewicht des PEGs bei den PEG-Fällungen kann mit entsprechender Änderung des PEG-Prozentsatzes variiert werden.

Die wieder in Lösung gebrachte Saccharose-Synthase bzw. der Überstand oder die enzymhaltige Phase der Ex traktion wird zweckmäßigerweise nach einer Adsorption an Sephadex A50 und Stufenelution bei pH 7,2 (eingestellt mit Hepes-NaOH) mit 100 mM KCl und 300 mM KCl und Umpuffern sowie Ultrafiltration auf eine Sepharose-Q-Säule geladen und einer linearen Gradienten-Elution mit 50-500 mM KCl bei pH 8 (200mM Hepes-NaOH) unterworfen und auf einer Gel filtrationssäule chromatographiert.

Besonders wichtig ist dabei der Behandlungsschritt auf der Sepharose-Q-Säule mit Gradienten-Elution, wie angegeben. Auf diese Weise erhält man aufgereinigte Saccharose-Synthase, deren Nucleotidphosphatasegehalt < 0,1%, d. h. im Phosphatase-Test der Enzym-Präparation nicht mehr nachweisbar ist.

Die erfindungsgemäße aufgereinigte Saccharose-Synthase läßt sich insbesondere zur enzymatischen Synthese von aktivierter Glucose und aktivierten Glucoseabkömmlingen durch Spaltung eines Di- Tri-, Oligosaccharids oder deren Abkömmlingen mit Nukleosiddiphosphaten nutzen. Daraus resultierende Produkte, z. B. UDP-Glucose, TDP-Glucose und CDP-Glucose, sind wichtige Ausgangssubstrate für die enzymatische und/oder chemische Darstellung von aktivierten Desoxyzuckern und deren Abkömmlingen. Ein weiteres Beispiel für die oben genannten Anwendung ist die enzymatische Spaltung von 2-Desoxysaccharose mit Saccharose- Synthase unter Verwendung von Nukleosiddiphosphaten, z. B. UDP oder TDP.

In Kombination mit anderen Enzymen, z. B. UDP-Glucose Epimerase und Galaktosyltransferase, wird Saccharose-Synthase zur zyklischen Regenerierung von z. B. UDP-Glucose eingesetzt. So wird eine enzyma tische Synthese eines Disaccharid-Abkömmlings wie z. B. N-Acetyl lactosamin (LacNAc) mit 3 Enzymen durchgeführt. Im Vergleich zur publizierten enzymatischen Synthese von LacNAc (Wong u. a. J. Org. Chem. 47 (1982) 5416-5418) ergeben sich durch Reduktion der Anzahl der Enzyme wirtschaftliche Vorteile.

Die erfindungsgemäß aufgereinigte Saccharose-Synthase ist auch für die Synthese von Glucosiden sowie deren Abkömmlinge nützlich. So werden UDP-Glucose oder aktivierte Glucoseabkömmlinge auf Akzeptormoleküle mit mindestens einer Hydroxylgruppe übertragen. Beispiele für Zuckermoleküle als Akzeptoren sind bei den Ketosen die Isomeren der D-Fructose, z. B. D-Psicose, D- Tagatose und L-Sorbose sowie deren Abkömmlinge, z. B. 5,6-Didesoxy- 5-keto-D-Fructose und 6-Desoxy-L-Sorbose. Beispiele für Zuckermoleküle als Akzeptoren bei den Aldosen sind L-Arabinose, D- Lyxose, D-Mannose sowie deren Abkömmlinge, z. B. 1,6- Anhydroglucose.

Di-, Tri- und Oligosaccharide sind ebenfalls Akzeptormoleküle, z. B. Lactulose, Isomaltulose und Raffinose. Andere hydroxylgrup pen-haltige Akzeptormoleküle, die nicht zu der Substanzklasse der Zucker gehören, sind insbesondere heterocyclische Verbindungen mit mindestens einer Hydroxylgruppe am heterocyclischen Ring und/oder in einer daran befindlichen Seitenkette, z. B. 1-Ethyl-3-hydroxy-pyrollidin oder N-(2- Hydroxyethyl)piperidin.

Die nachfolgenden Beispiele zeige die erfindungsgemäße Arbeitsweise im einzelnen. Dabei wird Bezug genommen auf die angefügten Zeichnungen; es zeigen:

Fig. 1 das Chromatogramm der Sepharose Q Trennung;

Fig. 2 die NDP-Glucose-Bildung mit unterschiedlichen Nucleotiden;

Fig. 3 u. 4 Die Bildung von TDP- und UDP-Glucose mit mit Saccharose-Synthase;

Fig. 5 u. 6 Reaktionsschemata für die enzymatische Synthese von N-Acetyllactosamin (nach Wong; Fig. 5 bzw. erfindungsgemäß; Fig. 6)

Fig. 7 u. 8 Nucleotid-Chromatogramme der Produktmischung (Schritt 1 u. 2 gemäß Fig. 6) nach Hitzeinakti vierung des Enzyms;

Fig. 9 das HPLC-Chromatogramm der Produktmischung (voll ständiger Zyklus gemäß Fig. 6),

Fig. 10-12 Kurven zur Kinetik der Synthese-Reaktion (I),.

Fig. 13 den Einfluß von Metallionen auf die Enzymaktivität; und

Fig. 14 ein Diagramm für die Bildung von TDP-Glucose im EMR Enzymmembranreaktor (EMR).

Beispiel 1 Isolierung der Saccharose-Synthase

800 g Reiskörner werden über Nacht in Hepes-NaOH Puffer pH 7,2 gequollen und anschließend im Waring Blender für 1,5 Min. aufge schlossen. Nachdem mit einem Handmixer weitere 3 min. homogeni siert worden ist, wird das Pellet abzentrifugiert (Sorvall GS3, 20 min. 5000 rpm 4°C). Anschließend wird das Protein im Überstand mit PEG 4000 fraktioniert gefällt (5 und 20% PEG). Das Pellet nach der 20%igen PEG Fällung wird in Puffer aufgelöst und in einer Batch Adsorption an Sephadex A50 gebunden. 200 ml Sephadex A50 Gel werden mit ca. 4 g Protein beladen. Die Stufenelution startet mit 300 ml Hepes-NaOH pH 7,2 und 300 ml Hepes-NaOH pH 7,2 mit 100 mM KCl. Das Enzym wird mit zwei Volumina (100 ml) Hepes-NaOH pH 7,2 mit 300 mM KCl eluiert. Nach Umpufferung und Ultrafiltration wird diese Fraktion auf eine Sepharose-Q-Säule (Hepes-NaOH pH 8,0 mit 50 mM KCl) geladen und mit einem linearen Gradienten (50 mM-500 mM KCl in Hepes-NaOH 200 mM pH 8,0) eluiert. Die gesammelten Enzymfraktionen werden abschließend in einer Gelfiltrationssäule (Superdex 200 prep grade) chromatographiert.

Saccharose-Synthase aus Reis wurde 151-fach mit einer Ausbeute von 5,4% angereichert (Tabelle 1A). Ein großer Verlust entsteht bei der Fällung mit Polyethylenglykol 4000 (ca. 80% Verlust bei der 5-20% Fällung). Alternativ kann eine Enzymanreicherung aus dem Rohextrakt mit Hilfe eines wäßrigen 2-Phasensystems (PEG/Salz) vorgesehen werden. Sehr effektiv sind die Batch Adsorption an Sephadex A50 u. die anschließende Anionenchromatographie an Sepharose Q FastFlow mit einem Aufreinigungsfaktor von insgesamt 43. Außerdem wird die Nukleotiddi- und -monophosphatase-Aktivität vollständig abgetrennt (Fig. 1), was für den Einsatz der Saccharose- Synthase in enzymatischen Synthesen sehr wichtig ist.

Das Molekulargewicht des nativen Enzyms beträgt 362000 ± 7000 Da, es besteht aus 4 Untereinheiten zu je 90000 Da und besitzt keine inter- oder intramolekularen Disulfidbrücken. Die N-terminale Aminosäuresequenzierung durch automatisierten Edman-Abbau in einem Pulsed Liquid Protein Seguencer erbrachte, daß der N-Terminus der Untereinheit blockiert ist. Der isoelektrische Punkt des nativen Enzyms liegt bei pH 6,16.

Die Reinigung der Saccharose-Synthase wurde hinsichtlich der eingesetzten Menge Reis und der Anzahl der Reinigungsschritte optimiert. Tabelle 1B zeigt, daß die Ausbeute bei nur geringfügig geringerer Reinheit auf 21% gesteigert wurde. Die Reinigung umfaßt statt sechs nur noch vier Schritte, wobei die Fällung bei 20% PEG 4000 und die Batch Adsorption auf Sephadex A50 entfallen. Das gereinigte Enzym ist auch nach dieser Reinigung frei von Nukleotidmono- und -diphosphatasen.

Die Untersuchung der Spalt- und Synthese-Reaktion mit Saccharose- Synthase läßt erkennen, daß

1. Saccharose-Synthase zur enzymatischen Synthese von UDP- Glucose, TDP-Glucose, GDP-Glucose und CDP-Glucose aus Saccharose geeignet ist.
2. die Kombination der Saccharose-Synthase mit anderen Enzymen (siehe oben) zur enzymatischen Synthese von sekundären Nukleotidzuckern (UDP-Galactose, UDP-Glucuronsäure) genutzt werden kann.
3. bei der enzymatischen Synthese von Oligosacchariden im Enzymmembranreaktor der Einsatz der Saccharose-Synthase zur "Kofaktorregenierung" eine erhebliche Vereinfachung der kinetischen Kontrolle darstellt.
4. das Substratspektrum der Saccharose-Synthase für Di-, Tri- und Oligosaccharide sowie Glykoside zu bisher noch nicht zugänglichen aktivierten Mono-, Di- und Oligosacchariden führt.
5. andere Nukleotidzucker als UDP-Glucose in der Synthesereak tion mit Fructose eingesetzt werden können.
6. Fructose durch andere Zucker mit β-Furanosekonfiguration, sowie durch Zuckeralkohole und andere chemische Verbindun gen mit strukturellen Ähnlichkeiten zur β-Furanose, ersetzt werden kann.

Nachfolgend werden Beispiele für die Wirkungsweise und Anwendung der Saccharose-Synthase beschrieben:

1. Substratspektrum der Nukleosiddiphosphate

Es wurden UDP, TDP, CDP, ADP und GDP untersucht. Die Reaktionsan sätze enthielten:

550 µl Hepes-NaOH (200 mM, pH 7,2)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl Nukleosiddiphosphat (15-90 mM)
100 µl gereinigte Saccharose Synthase (21,1 mU/ml).

Die Reaktionsansätze wurden bei 30°C inkubiert und zu verschie denen Zeiten abgestoppt (5 min. bei 95°C). Nach Filtration der Probe durch einen 0,22 µm Filter wurden die entstandenen Nukleo tidzucker mittels Ionenpaar HPLC analysiert.

Die Bildung von UDP- und TDP-Glucose wurde an Hand von Eichkurven für die HPLC Chromatogramme (Peak Area/Konzentration) quantifi ziert.

Fig. 2 zeigt, daß die Nukleosiddiphosphate in der Reihenfolge UDP, TDP, ADP, CDP und GDP akzeptiert werden. Das gereinigte Enzym war frei von Nukleotidphosphatasen (NPasen, Kontrolle ohne Saccha rose), die Nukleosiddiphosphate zu den -monophosphaten oder auch Basen abbauen. Im HPLC Chromatogramm konnten die auftretenden Peaks für UMP, TMP, Uridin und Thymidin durch geeignete Kontroll versuche auf Verunreinigungen im Substrat und auf die Zersetzung der Nukleosiddiphosphate durch die Hitzebehandlung zurückgeführt werden. Nach Hitzebehandlung von 1,57 mM UDP entstanden 0,123 mM UMP; davon waren 0,082 mM (5%) als Verunreinigungen im UDP Sub strat bereits vorhanden.

Aus einer Untersuchung des zeitlichen Konzentrationsver lauf der Synthese von UDP- und TDP-Glucose wird deutlich, daß durch steigende Mengen des Enzyms die nahezu vollständige Umsetzung der Nukleosiddiphosphate zu Nukleotidzucker in kurzen Reaktionszeiten erreicht werden kann.

Tabelle 2 faßt die Umsatzraten für die Synthese von UDP- und TDP- Glucose zusammen. Mit 0,16 mU Enzym wird die Raum-Zeit-Ausbeute bei höheren Substratkonzentrationen nur wenig gesteigert. Mit 1,8 mU Saccharose-Synthase wird nach 3 h ein 99%iger Umsatz bezogen auf die eingesetzte UDP-Konzentration (1,57 mM) erreicht. Das entspricht einer Raum-Zeit-Ausbeute von 0,21 g/l*h. Mit einer höheren UDP-Konzentration (7,86 mM) beträgt die Raum-Zeit-Ausbeute 0,4 g/l*h.

Die Raum-Zeit-Ausbeute für die Synthese von TDP-Glucose beträgt für 0,16 mU eingesetztes Enzym 0,011 g/l*h; das entspricht einem 49%igen Umsatz nach 30 h für 0,16 mU Enzym. Ein weiteres Experi nent zeigt, daß der Umsatz von 8,2 mM TDP mit 0,2 mU Enzym nach 24 h auf 80% gesteigert werden kann.

Zum Vergleich wurde ein kommerzielles Präparat der Saccharose- Synthase aus- Weizen (spezifische Aktivität 8,15 mU/mg) getestet. Dieses Enzym zeigt ähnliche Raum-Zeit-Ausbeuten wie das gereinigte Enzym aus Reis. Allerdings zeigen die HPLC Chromatogramme die gleichzeitige Bildung relativ großer Mengen UMP und Uridin durch Nukleotidphosphatasen (Tabelle 2). Diese Enzymverunreinigungen sind im gereinigten Enzym aus Reis nicht mehr vorhanden. Die auf tretenden UMP- und Uridin-Peaks im Chromatogramm sind allein auf Erhitzung der Proben zurückzuführen.

2. Puffer Spektrum

Das Pufferspektrum für die Synthese von UDP- und TDP-Glucose mit der gereinigten Saccharose-Synthase aus Reis und dem kommerziellen Enzym aus Weizen wurde untersucht. Folgende Puffer wurden getestet (alle 200 mM und pH 7,2, angegeben sind die pH-Pufferbereiche):

Mops-NaOH-NaCl
pH 6,25-8,15
TES-NaOH-NaCl	pH 6,55-8,45
Tris-HCl	pH 7,00-9,00
Hepes-NaOH	pH 6,80-8,20
KH₂PO₄-NaOH	pH 5,80-8,00
Na₂HPO₄-NaH₂PO₄	pH 5,80-8,00
Imidazol-HCl	pH 6,20-7,80
TEA-hydrochlorid - NaOH	pH 6,80-8,80

Die Inkubationsansätze enthielten:

550 µl Puffer (200 mM, pH 7,2)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl UDP (15,7 mM) oder TDP (16,4 mM)
100 µl Enzymlösung

Inkubation und Analytik wurden wie unter 1. beschrieben durchge führt.

Es zeigt sich, daß der bisher benutzte Hepes-NaOH Puffer für die Synthese von UDP- und TDP-Glucose am besten geeignet ist. Für beide Enzyme ergeben der Mops und der TES Puffer 60-80 % Restaktivität. Das kommerzielle Enzym zeigt im Gegensatz zum Reisenzym im TEA-Puffer eine um 30-40% höhere Restaktivität. In den restlichen Puffern haben beide Enzyme eine Restaktivität von unter 50%.

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Wahl des Puffers Auswirkungen auf die Aktivität der Saccharose-Synthase hat und die Bestimmung des pH-Optimums beeinflussen kann.

3. pH-Optimum

Folgende Puffer wurden für die Bestimmung des pH-Optimums verwen det (alle 200 mM):

Na-Citrat-Citronensäure
pH 4,0-6,2
KH₂PO₄-NaOH	pH 5,8-7,2
Mops-NaOH-NaCl	pH 6,3-7,4
Hepes-NaOH	pH 6,8-8,2
TEA-hydrochlorid - NaOH	pH 7,2-8,8

Die Inkubationsansätze enthielten:

640 µl Puffer (200 mM)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl UDP (15,7 mM) oder TDP (16,4 mM)
10 µl Enzymlösung.

Inkubation und Analytik erfolgten wie unter 1. beschrieben.

Beide Enzyme zeigen in Abhängigkeit von den verwendeten Puffer unterschiedliche pH-Optima.

Mit UDP als Substrat haben beide Enzyme bei Verwendung von Citrat- oder Phosphat-Puffer ein pH-Optimum zwischen pH 5,5 und 5,7.

Bei Verwendung von Hepes- und Mops-Puffer liegt das Optimum für die UDP-Glucose-Synthese zwischen 6,7 und 7,0.

Für die Synthese von TDP-Glucose gilt dies in gleicher Weise; mit Citrat- oder Phosphat-Puffer liegt das Optimum zwischen pH 5,8 und 6,2 und mit Mops-oder Hepes-Puffer zwischen pH 6,5 und 6,8.

4. pH-Stabilität

Für die Ermittlung der pH-Stabilität wurde das Reisenzym bei verschiedenen pH-Werten in Hepes-NaOH Puffer (200 mM) und Raumtem peratur verschieden lang inkubiert. Das Enzym wurde anschließend in den herkömmlichen Aktivitätstest eingesetzt:

550 µl Hepes-NaOH (200 mM, verschiedene pH-Werte)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl UDP (20 mM)
100 µl Enzymlösung.

Nach 1 h Reaktionszeit wurde die Probe wie oben beschrieben mit HPLC analysiert.

Die gereinigte Saccharose-Synthase aus Reis zeigt bei pH 7,0 und 7,9 nach 2 Tagen eine Restaktivität von < 60%, die sich für die Synthese von UDP- und TDP-Glucose ausnutzen lassen.

5. Temperaturoptimum

Zur Bestimmung des Temperaturoptimums wurde das Reisenzym 1 h bei pH 6,5 (pH Optimum) und verschiedenen Temperaturen inkubiert. Anschließend wurde das Enzym in folgenden Aktivitätstest einge setzt:

550 µl Puffer (200 mM, pH 6,5)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl UDP (20 mM)
100 µl Enzymlösung.

Nach 1 h Reaktionszeit wurde die Probe wie oben beschrieben mit HPLC analysiert. Zusätzlich wurde jeweils eine Kontrolle ohne Enzym inkubiert und analysiert.

Für die Spaltung von Saccharose mit UDP liegt das Temperaturopti mum der Saccharose-Synthase aus Reis bei pH 6,5 zwischen 50° und 60°C.

6. Temperatur-Stabilität

Das Enzym besitzt nach 5 h bei 37°C seine volle Aktivität, nach 5 h bei 56°C ist eine Restaktivität von 37% vorhanden.

8. Kinetik

Zur Bestimmung von V_max und K_m der Substrate wurden UDP oder TDP bei konstanter Saccharose-Konzentration von 500 mM zwischen 0 und 10 mM im Reaktionsansatz variiert. Bei konstanter UDP (2 mM) Konzentration wurde Saccharose zwischen 0 und 500 mM im Reaktionsansatz variiert. Alle Reaktionsansätze wurden 1 h bei 30°C und pH 6,5 (Hepes-NaOH 200 mM) inkubiert. Die Proben wurden wie oben beschrieben behandelt und mit HPLC analysiert.

Das Reisenzym zeigt für UDP eine Substratüberschußinhibition (Ki(S) = 16 mM mit 0,9 mU Enzym) bei einem Km-Wert von 0,4 mM (Fig. 10). Der Km-Wert für TDP beträgt 0,65 mM (Fig. 11). Der Substratüberschußinhibition kann durch höhere Enzymmengen entgegengewirkt werden. Der Km-Wert für Saccharose beträgt 108 mM (Fig. 12).

9. Abhängigkeit von zweiwertigen Metallionen

Fig. 13 zeigt, daß in Anwesenheit von 1 mM Metallionen, wie z. B. Mn²⁺ und Mg²⁺ die Aktivität der Saccharose-Synthase nur wenig beeinflußt wird. Eine Stimulierung der Enzymaktivität tritt durch Mn²⁺ und Ca²⁺ mit TDP als Substrat auf. In Anwesenheit von Cu²⁺ und Fe²⁺ wird das Enzym vollständig inaktiviert.

10. Enzymatische Synthese von UDP- und TDP-Glucose unter optimierten Bedingungen

Die Reaktionsansätze enthielten:

550 µl Hepes-NaOH (200 mM, pH 7,2)
250 µl Saccharose (2 M)
100 µl Nukleosiddiphosphat (UDP 100 mM oder TDP 124 mM)
100 µl gereinigte Saccharose-Synthase (15 mU/ml).

Die Reaktionsansätze wurden mit UDP bei pH 7,0 bzw. mit TDP bei pH 6,8 bei 30°C inkubiert und zu verschiedenen Zeiten abgestoppt (5 min. bei 95°C). Nach Filtration der Probe durch einen 0,22 µm Filter wurden die entstandenen Nukleotidzucker mittels Ionenpaar HPLC analysiert.

Fig. 3 und 4 zeigen, daß nach 24 h 92% des UDP′s zu UDP-Glucose und 84% des TDP′s zu TDP-Glucose umgesetzt wurden.

Die gereinigte Saccharose-Synthase wurde zur enzymatischen Synthese von TDP-Glucose im Enzymmembranreaktor (10 ml Reaktorvolumen) eingesetzt. Fig. 14 zeigt den Umsatz von TDP zu TDP-Glucose und die Konzentrationen von TDP, TDP-Glucose und Fructose bei 5 mM TDP, 350 mM Saccharose, 40 Minuten Verweilzeit und 990 mU Saccharose-Synthase. Der Umsatz beträgt 89,6% bezogen auf das eingesetzte TDP. Die theoretische Raum-Zeit-Ausbeute für ein Liter Reaktorvolumen ergibt 98,1 g TDP-Glucose pro Liter und Tag.

11. Substratspektrum der Saccharose-Synthase für die Spaltreaktion (1)

Für die Spaltreaktion der Saccharose-Synthase wurde Saccharose gegen andere Di- oder Trisaccharide ausgetauscht:

α Glc 1-2 β-Fruc + UDP (TDP) ⇄ UDP-Glc (TDP-Glc) + Fruc

Die Konzentration der Saccharide betrug 75 bis 500 mM im Reaktionsansatz. Es wurden 2 mM UDP oder TDP und in der Regel 10-80 mU Enzym eingesetzt. Nach 3 h bei 30°C und pH 7,2 (200 mM Hepes-NaOH) wurde die Reaktion bei 95°C 5 min. abgestoppt. Die Bildung von Nukleotidzuckern wurde mit HPLC verfolgt und mit einer Kontrolle (ohne Enzym) verglichen.

Tabelle 3 zeigt, daß das Disaccharid Isomaltulose (Palatinose) und die Trisaccharide Raffinose und Melezitose anstelle der Saccharose umgesetzt werden können.

12. Substratspektrum der Saccharose-Synthase aus Reis für die Synthese von Disacchaariden A: Variation der Nukleotidzucker

Für die Synthesereaktion wurden die Nukleotidzucker variiert:

UDP-Glucose + Fructose ⇄ Saccharose + UDP

Es wurden zunächst nur UDP-aktivierte Zucker eingesetzt: UDP-Galactose, UDP-N-Acetylglucosamin, UDP-Glucuronsäure, UDP-N- Acetylgalactosamin.

Die Ansätze enthielten:

550 µl Puffer (200 mM, pH 7,5)
250 µl Fructose (40 mM)
100 µl UDP-Zucker (20 mM)
100 µl Enzymlösung.

Die Ansätze wurden 2 h bei 30°C inkubiert und 5 min. bei 95°C gestoppt. Mit HPLC wurde nach Vergleich mit einer Kontrolle (ohne Enzym) die Entstehung von UDP verfolgt.

Neben UDP-Glucose kann auch UDP-N-Acetylglucosamin und UDP-Xylose vom Reisenzym umgesetzt werden (Tabelle 4).

Tabelle 3

Überprüfung der Substratspaltung mit gereinigter Saccharose-Synthase aus Reis und UDP zur Synthese von aktivierten Zuckern

Tabelle 4

Substratspektrum der gereinigten Saccharose-Synthase aus Reis

Es wurden verschiedene UDP-Zucker mit Fructose als Akzeptor eingesetzt

12. Substratspektrum der Saccharose-Synthase aus Reis für die Synthese von Disacchaariden B: Variation des Akzeptors

Für die Synthesereaktion wurde der Akzeptor variiert. Neben dem natürlichen Akzeptor wurden andere Diastereomere der D-Fructose, wie D-Psicose, D-Tagatose, D-Sorbose eingesetzt. Weiterhin wurden systematisch einige Ketosen getestet. Neben Aldosen wurden auch Nichtzuckerakzeptoren untersucht.

Tabelle 5 verdeutlicht, daß die untersuchten Diastereomere der D- Fructose bis auf D-Sorbose alle akzeptiert werden. L-Sorbose, D- Xylulose und die aufgeführten Desoxyketosen sind ebenfalls Akzeptoren der Saccharose Synthase. Von den Aldosen werden D- Mannose, D-Lyxose und L-Arabinose akzeptiert. Als Akzeptoren können auch Derivate der Glucose fungieren, z. B. 1,6 Anhydro-β-D- Glucose oder Octyl-β-D-Glucopyranosid.

Di- und Trisaccharide (z. B. Lactulose oder Raffinose) können ebenfalls als Akzeptoren dienen. Von den Nichtzuckerakzeptoren können Derivate des Pyrrolidins in der Synthesereaktion der Saccharose Synthase eingesetzt werden.

Tabelle 5

Substratspektrum der gereinigten Saccharose-Synthase aus Reis

Es wurden verschiedene Akzeptorsubstrate mit UDP- Glucose umgesetzt

13. Enzymatische Synthese von UDP-Galaktose und N-Acetyllactosamin nach Schema gemäß Fig. 6

UDP-Galaktose und N-Acetyllactosamin wurden gemäß Fig. 6 hergestellt (Fig. 5 zeigt Synthesezyklus nach Wong)

Ansatz:
677 µl Hepes Puffer (50 mM, pH 7)
100 µl UDP (100 mM)
100 µl Saccharose
123 µl Enzym (10 mU im Ansatz).

Nach 3 h Inkubation bei 30°C waren 80% des UDP zu UDP-Glucose laut HPLC-Analyse umgesetzt. Anschließend wurden 100 mU UDP- Galaktose Epimerase zugegeben und über Nacht bei 30°C inkubiert. Fig. 7 zeigt, daß UDP-Galaktose aus UDP-Glucose entstanden ist. Da das Gleichgewicht der UDP-Galaktose Epimerase stark auf der Seite von UDP-Glucose liegt, können UDP-Glucose/UDP-Galaktose Verhältnisse von 0.3 erwartet werden (siehe Peakhöhenverhältnisse von UDP-Glucose/UDP-Galaktose in Fig. 7).

UDP-Galaktose kann auch enzymatisch hergestellt werden, indem die benötigten Enzyme gleichzeitig im Ansatz inkubiert werden.

Ansatz:
500 mM Saccharose
1-10 mM UDP
3-30 mU Saccharose-Synthase
200 mU UDP-Gal-Epimerase
alles in 200 mM Hepes Puffer pH 7,2.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dokumentiert.

Zur enzymatischen Synthese von N-Acetyllactosamin wurde folgender Versuch durchgeführt.

1 mM UDP
1 mM MnCl₂
5 mM N-Acetylglucosamin
500 mM Saccharose
200 mU UDP-Gal-Epimerase
100 mU β1,4 Galaktosyltransferase
120 mU Saccharose Synthase
alles in 200 mM Hepes-NaOH Puffer pH 7,2 bei 30°C über Nacht inkubiert.

Fig. 9 zeigt, daß N-Acetyllactosamin mit Hilfe von drei Enzymen (Fig. 6) gebildet wird. Der Umsatz beträgt 80% bezogen auf die eingesetzte Konzentration an N-Acetylglucosamin.

Im Rahmen der vorliegenden Untersuchungen wurde aus Reiskörnern isolierte Saccharose-Synthase verwendet, jedoch kann auch aus Weizen o.a. unter Beachtung der erfindungsgemäßen Vorschriften eine für die einstufige Bildung aktivierter Monosaccharide brauchbare Saccharose-Synthase erhalten werden.

Claims

1. Aufgereinigte Saccharose-Synthase, in deren HPLC-Chromato gramm Nukleotidphosphatasen nicht mehr nachweisbar ( 0,1%) sind.

2. Saccharose-Synthase nach Anspruch 1 vegetabilen Ursprungs, insbesondere isoliert aus Reiskörnern.

3. Verfahren zur Herstellung von Saccharose-Synthase nach An spruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Saccharose-Synthase enthaltenden Rohextrakt einer Folge von Reinigungsschritten unterwirft, die die Auf gabe eines ultrafiltrierten 50 mM KCl aufweisenden Extraktes von pH 8 auf eine Sepharose-Q-Säule und eine Gradienten-Elu tion aus der Säule bei pH 8 mit 50-500 mM KCl umfaßt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Rohextrakt aus angequollenen und mechanisch aufgeschlossenen Reiskörnern folgenden Reinigungsschritten unterwirft:

- Ausfällung begleitender Proteine mit PEG oder wäßrige 2-Phasentrennung;
- Aufgabe des auf pH 8 eingestellten Überstandes bzw. der entsprechend eingestellten, die Enzymaktivität enthaltenden Phase auf eine Sepharose-Q-Säule;
- Gradienten-Elution bei pH 8 mit 50-500 mM KCl; und
- Gelfiltrationssäulen-Chromatographie.

5. Verwendung von Saccharose Synthase nach Anspruch 1 oder 2 zur Umsetzung von Nucleosiddiphosphaten mit Di-, Tri- oder Oligosaccharide bzw. Abkömmlingen derselben unter Bildung von Nucleotidzuckern bzw. -zuckerabkömmlingen.

6. Verwendung nach Anspruch 5, bei der als Nucleosid diphosphat UDP, ADP, TDP oder CDP und als Disaccharid Saccharose vorgesehen werden.

7. Verwendung nach Anspruch 5 von Saccharose Synthase zusammen mit Epimerasen (a) und/oder Transferasen (b) zur Bildung eines aktivierten Zuckers oder Zucker abkömmlings und

(a) Abwandlung ihres Zuckeranteils; oder
(b) Übertragung des Zuckeranteils auf andere Akzep tormoleküle.

8. Verwendung nach Anspruch 7b, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zucker als Akzeptor vergesehen wird.

9. Verwendung von Saccharose-Synthase nach Anspruch 1 oder 2, zur Umsetzung von aktivierter Glucose bzw. Abkömmlingen derselben mit einem hydroxylgruppen-haltigen Akzeptor, insb. einem Zucker zur Bildung von Glucosiden bzw. Abkömmlingen derselben.