CN114736942A - 一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α‑甘油葡萄糖苷的制备方法，提供一种生产甘油葡萄糖苷方法，在所提供的生产甘油葡萄糖苷方法中，以蔗糖和甘油作为直接底物，通过蔗糖磷酸合成酶催化糖基转移反应获得α‑甘油葡萄糖苷与果糖，然后通过进一步添加D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶催化果糖的异构化反应，使得产物中的果糖进一步形成阿洛酮糖。本发明的方法大幅降低了反应产物中的果糖含量。相对于甘油葡萄糖苷制备形成的高果糖产物，阿洛酮糖与甘油葡萄糖苷的色谱分离度要远远高于果糖与甘油葡萄糖苷的分离度，因此大幅降低了产物后处理的难度，从而大幅降低了产物中与甘油葡萄苷分难度及分离成本。

Description

一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法

技术领域

本发明涉及甘油葡萄糖苷，具体为α-甘油葡萄糖苷的制备方法。

背景技术

甘油葡萄糖苷(Glucopyranosyl glycerol，简写为GG)，是最早发现于沙漠卷柏或耐盐蓝藻的一种纯天然小分子物质。甘油葡萄糖苷根据糖苷键类型不同，以及甘油上的糖基化位点不同有6种立体结构，包括2-αGG，2S-1-αGG，2R-1-αGG，2-βGG，2S-1-βGG和2R-1-βGG，其中仅有2-αGG及2-βGG为天然构型。研究发现，甘油葡萄糖苷拥有优异的保湿能力。

现有技术中甘油葡萄糖苷的主要通过蔗糖磷酸酶制备，例如专利文件US20090318372A1中公开了一种甘油葡萄糖苷的制备技术方案，其以蔗糖作为糖基供体底物，以甘油作为糖基受体底物，通过蔗糖磷酸酶(EC 2.4.1.7)催化的转糖基反应，将蔗糖中的葡萄糖基转移至甘油上形成产物甘油糖苷及其副产物果糖。

现有生物转化法生产制备α-甘油葡萄糖苷(α-GG)大都以蔗糖为糖基供体，在反应过程中会不断大量生成果糖副产物，由于多羟基的甘油糖苷与多羟基的果糖其极性较为接近，这使果糖含量较越高得两者之间的分离成本较高。甘油糖苷的分离工艺中果糖分离工序成本占到了总生产成本的35-45％。此外，果糖本身是一种生物资源，但由于甘油糖苷与果糖的分离通常采用柱分离模式，其由于极性接近，柱分离所需的流动相的体积较大，流出的产物浓度低，同时果糖由于其自身价值较低，因此通常被直接丢弃，而无法回收利用，这照成了资源的浪费。此外，果糖的大量残存也增加了产品的微生物污染风险。专利申请CN201811353153.9公开了一种利用酵母菌发酵的方式消耗反应后含有大量果糖、葡萄糖的甘油葡萄糖苷的混合物，通过酵母菌株的糖代谢将残余的果糖进行大量的消耗，从而提高产物中的甘油糖苷含量。

发明内容

基于上述情况，我们公开了α-甘油葡萄糖苷的制备方法，解决上述技术问题。

本发明结合现有技术中提供一种同时生产甘油葡萄糖苷方法，在所提供的生产甘油葡萄糖苷方法中，以蔗糖和甘油作为直接底物，通过蔗糖磷酸合成酶催化糖基转移反应获得α-甘油葡萄糖苷(立体结构为：2-αGG)与果糖，然后通过进一步添加D-阿洛酮糖3-差向异构酶催化果糖的异构化反应，使得产物中的果糖进一步形成阿洛酮糖。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：

一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、以蔗糖和甘油为原料，使用蔗糖磷酸酶催化获得主要为α-甘油葡萄糖苷与果糖的中间产物一；

步骤2、以步骤1中的中间产物一为基础，使用阿洛酮糖差向异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖获得中间产物二；

步骤3、以步骤2中的中间产物二为基础，将α-甘油葡萄糖糖苷分离与提纯。

优选的，包含将阿洛酮糖分离回收的步骤。

优选的，所述蔗糖磷酸酶通过原核表达系统一表达获得，所述蔗糖磷酸酶目的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述原核表达系统一表达收集获得的菌体作为蔗糖磷酸酶粗酶；

所述步骤1中的初始反应配方按质量比为：水100份、蔗糖250份、蔗糖磷酸酶粗酶25份、pH 7.0的PB磷酸缓冲液(0.2mol/L)50份、甘油100份、0.25份的Tween 80；

所述反应条件为：35℃搅拌反应24h，向反应体系内补加10份LPP粗酶，50份甘油，50份水和50份蔗糖，继续反应24h。

优选的，所述阿洛酮糖差向异构酶通过原核表达系统二表达获得，所述阿洛酮糖差向异构酶目的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，所述原核表达系统二表达收集获得的菌体作为阿洛酮糖差向异构酶，

所述步骤2为：阿洛酮糖差向异构酶30份，硼砂118份，之后调整反应温度至55℃，搅拌反应60h，之后使用50％硫酸将反应体系酸至pH 3.0终止反应。

优选的，所述步骤3具体包括：

(1)酸化所述的中间产物二，然后利用离心或过滤去除中间产物二中的菌体、酶及沉淀的蛋白等固态杂质；

(2)使用活性炭对去除固态杂质的中间产物二进行脱色，之后采用离心或过滤去除活性炭；

(3)通过层析分离α-甘油葡萄糖苷：采用活性炭层析柱进行分离，先以脱色后的中间产物二进行上样吸附，然后以纯水洗脱各糖，至流出液中无检出后，采用6％w/w的乙醇水溶液进行α-甘油葡萄糖苷的分段洗脱，最后合并α-甘油葡萄糖苷纯度高于99％(色谱纯)的洗脱液分段；

(4)对步骤(3)合并的含α-甘油葡萄糖苷的洗脱液在真空浓缩釜内60℃减压浓缩，至α-甘油葡萄糖苷含量约50％w/w，采用冷冻干燥法干燥获得纯度99％的α-甘油葡萄糖苷。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：

相比现有甘油葡萄糖苷的生产方法，本发明的方法大幅降低了反应产物中的果糖含量。相对于甘油葡萄糖苷制备形成的高果糖产物，阿洛酮糖与甘油葡萄糖苷的色谱分离度要远远高于果糖与甘油葡萄糖苷的分离度，因此大幅降低了产物后处理的难度，从而大幅降低了产物中与甘油葡萄苷分难度及分离成本。其次，相比于现有技术，本发明所述的技术方案可以利用产物中废弃的果糖，同步生产了阿洛酮糖。另外，通过两种酶所形成的α-甘油葡萄糖苷和D-阿洛酮糖为主要成分的催化产物，其被发现具有超过D-阿洛酮糖或α-甘油葡萄糖苷(α-GG)其单独各自的生理生化功效，该催化产物混合物本身就可以成为新的功效成分原料。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是实施例2中初始反应24h，甘油糖苷反应物谱图，其中保留时间RT4.5 min的峰为蔗糖，RT 5.3min峰为甘油葡萄糖苷，RT 6.4min的峰为果糖；

图2是实施例2的双酶工艺反应液色谱图；

图3是实施例3的双酶工艺反应过程中产物含量的变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1蔗糖磷酸酶与阿洛酮糖差向异构酶的获取与表达。

本实施例中所使用的蔗糖磷酸酶(LPP)来源于Leuconostocpseudomesenteroides，其基因序列如序列1所列，该基因被亚克隆至公开的商业化表达载体pET-30a(+)中(采购自优宝生物，货号VT1212)，构建成LLP酶的表达质粒pET-30a-LPP。

本实施例中所实用的阿洛酮糖差向异构酶(NTDAE)基因来自于Novibacillusthermophilus，其基因序列如序列2所列，所述的NTDAE酶的基因也被亚克隆至表达载体pET-30a(+)中，构建成NTDAE酶的表达质粒pET-30a-NTDAE。

本实施例中的表达质粒pET-30a-LPP与表达质粒pET-30a-NTDAE委托金唯智生物科技有限公司完成基因合成并完成亚克隆的构建，制备与纯化。表达质粒DNA使用前，按照金唯智生物科技有限公司的质粒产品说明书上所标注的说明，加入指定体积含量的缓冲液，溶解表达质粒DNA冻干粉末，获得表达质粒DNA溶液。

蔗糖磷酸酶与阿洛酮糖差向异构酶的重组酶表达菌株的构建按照以下步骤：

(1)制备大肠杆菌感受态细胞

从新活化的大肠杆菌BL21(DE3)(上海唯地生物技术有限公司生产)平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。将过夜培养的菌悬液按照1％w/w接种量转接到液体LB培养基中100mL，37℃振荡扩大培养2～3h，至培养液的OD600达到0.3-0.5时停止培养。将培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min(4000r/min)。之后弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。之后加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30mL，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。然后于4℃冷冻离心10min(4000r/min)，弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2mL冰浴悬浮细胞(冰上放置)片刻，作为质粒DNA转化所用的感受态细胞。

(2)质粒DNA的转化与重组菌株的构建

取步骤(1)中新鲜制备的BL21(DE3)感受态细胞200uL，加入1uL所需转化的表达质粒DNA(pET-30a-LPP或者pET-30a-NTDAE)混匀。冰浴30min，离心管放到42℃保温90s(不要摇动离心管)，然后迅速冰浴2min。向离心管加600uL LB液体培养基，37℃振荡培养1h(150rpm)。

取上步骤37℃振荡培养后的菌液，涂布在含34μg/mL氨苄抗性的选择性LB培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中培养12～16h。挑选培养皿生长的单菌落，进行双酶切验证，选择双酶切后琼脂糖凝胶电泳结果符合阳性克隆的单菌落进行发酵酶活验证。选择双酶切验证通过的单菌落挑选至摇瓶进行重组酶的表达，摇瓶培养采用LB培养基(蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L)，将原始酶重组菌株或变体酶重组菌株接种摇瓶后，在37℃培养至浊度OD600为0.6-1.0后，添加IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)的诱导重组酶(LPP或者NTDAE)的表达(摇瓶内IPTG终浓度为0.4mM)，同时降温至25℃培养8-14h。最后，离心收集菌体作为重组酶粗酶。

实施例2酶催化过程(对照组)。

以实施例1按其步骤分别获得的pET-30a-LPP表达重组菌菌体作为LPP粗酶。

甘油葡萄糖苷的生产反应过程参照现有技术中甘油葡萄糖苷的生物过程。

其反应过程如下：

按表.1所列的甘油葡萄糖苷酶促反应配方表的配方在酶反应罐内添加反应底物，然后维持35℃反应24h，向反应体系按物料质量补加10份LPP粗酶，50份甘油，50份水和50份蔗糖，继续反应24h之后，使用50％硫酸将反应体系酸至pH 3.0终止反应，反应液可用于后续甘油糖苷的分离及测试。

表.1甘油葡萄糖苷酶促反应体系的配方表(质量组成)

将反之后的反应液，取样适当稀释后采用HPLC-ELSD检测(安捷伦1290InfinityII，色谱柱为Hi-PleX Ca USP L19，250×4.0mm，流动相：水0.3mL/min，柱温：80℃)。结果如图1所示，反应之后，产物为甘油葡萄糖苷(保留时间5.3min)、残留的蔗糖(保留时间4.5min)以及生成的果糖(保留时间6.4min)。

实施例3酶催化过程(双酶工艺)。

以实施例1按其步骤分别获得的pET-30a-LPP表达重组菌菌体和pET-30a-NTDAE表达重组菌菌体分别作为LPP粗酶和NTDAE粗酶。

甘油葡萄糖苷的生产反应过程参照本发明技术方案，其反应过程如下：

按表.1所列的甘油葡萄糖苷酶促反应配方表的配方在酶反应罐内添加反应底物，然后维持35℃，搅拌反应24h，按照质量比例向反应体系内补加10份LPP粗酶，50份甘油，50份水和50份蔗糖，继续反应24h。

之后，进一步向反应体系内投NTADE粗酶30份，硼砂118份，之后调整反应罐温度至55℃，进一步搅拌反应60h，之后使用50％硫酸将反应体系酸至pH 3.0终止反应，反应液可用于后续甘油糖苷的分离及测试。

将双酶工艺催化后的反应液及过程中取样适当稀释后采用HPLC-ELSD检测(安捷伦1290Infinity II，色谱柱为Hi-PleX Ca USP L19，250×4.0mm，流动相：水0.3mL/min，柱温：80℃)。反应终点的色谱图如图2所示，反应过程中三种主要产物含量的变化如图3所示。

结果表明在获取LPP粗酶催化完成后，进一步加入NTADE粗酶进行果糖异构化反应，继续反应24h(从LPP酶催化反应开始时计算的总时间72h)，果糖能够大部分被异构化消耗，在最终产物中甘油葡萄糖苷含量达到425.6g/L，阿洛酮糖为240.4g/L，果糖残余浓度已经低于100g/L为80.7g/L。

其次，甘油葡萄糖苷与果糖的保留时间较为接近，分离度较低。而与之相比，甘油葡萄糖苷与阿洛酮糖的保留时间相差较远，分离度较高，更加有利于后续分离。

双酶工艺反应液色谱图见图2：双酶工艺反应液中，主要成份为保留时间(RT)5.3min的甘油葡萄糖苷，而果糖(RT 6.4min)则大量被消耗，仅余少量残留，另外的主要成分为与甘油葡萄糖苷之间的分离度更高的阿洛酮糖(RT 9.2min)。

双酶工艺反应过程中产物含量的变化如图3所示。

实施例4果糖异构化对产物分离度的影响。

分别对实施例2和实施例3所反应获得的反应液进行分离纯化。分离纯化步骤如下：(1)固液分离：取10L制备的酸化的完成反应液(pH 3.0)，加入10L纯水和1kg珍珠岩，常温搅拌1h，然后过滤，除去菌体、酶及沉淀的蛋白；(2)脱色：然后加入1kg活性炭搅(SAC-02C，福建鑫森炭业)拌脱色搅拌1h脱色，然后过滤去除活性炭，用NaOH回调pH至6.0；(3)层析：以20％乙醇再生后的活性炭层析柱(填料为活性炭SAC-02C，福建鑫森炭业)进行层析分离，填料柱床体积(BV，BedVolume)为25L。再生后的层析柱先使用纯水洗至无乙醇残留。之后将步骤(2)脱色后完成后的反应料进行上样吸附，上样流加速度为0.3BV/h，上样完成后以纯水作为洗脱剂进行清洗除糖，纯水流加速度0.3BV/h，并对流出液中的各糖含量进行检测，至流出液中果糖和阿洛酮糖含量均低于HPLC-ELSD的最小检出限(本实施例中果糖实际最小检出限0.008mg/mL，阿洛酮糖实际最小检出限为0.01mg/mL)之后，停止清洗。然后采用6％w/w乙醇水溶液进行洗脱，流速0.5BV/h，每流出0.5BV进行检测，合并甘油葡萄糖苷纯度高于99％洗脱液。(4)浓缩干燥，对步骤3合并的洗脱液在真空浓缩釜内60℃减压浓缩，至甘油葡萄糖苷含量约50％w/w，采用冷冻干燥法干燥获得纯度99％的甘油糖苷。

分离纯化结果如表2所列，其中实施例2中，反应液中的果糖含量较高，初始果糖含量超过了300g/L，层析柱在洗脱过程中需要消耗11BV(275L)的纯水，才能柱床中的果糖。而对于实施例3中，采用双酶工艺获得反应液中果糖含量较低，其次阿洛酮糖相比于果糖更容易从活性炭柱床中洗出，3.5BV之后，洗杂流出液中已经无阿洛酮糖，4.5BV后可以将洗杂流出液中无测出果糖。

相比于实施例2，实施例3所获得的反应液仅需要更少的纯水洗脱过程，就可以将糖从柱床中洗脱，大幅缩短了层析过程中需要的时间(减少21h)，同时大幅降低了纯水的消耗量(6.5BV)与相应产生的废水，降低了生产成本。同时由于层析清洗除糖过程中，纯水流经柱床也会照成部分部分甘油糖苷产量的解析流出，因此也会照成产品的损失与收率的降低。

表2甘油葡萄糖苷的分离纯化结果对比

实施例5阿洛酮糖的分离。

为回收实施例3反应液中的阿洛酮糖产品，取实施例3反应获得的反应液，按照实施例4中的分离步骤进行分离纯化。在步骤(3)层析的清洗除糖步骤中，将第0.5BV开始至3.5BV清洗除糖的洗脱液进行收集合并获得75L含糖洗脱液。含糖洗脱液中阿洛酮糖的色谱含量为82％(峰面积占比，面积归一化法)，之后将合并的洗脱液以H₂SO4调节pH至5.5，采用强酸性阳离子交换树脂(英国漂莱特

C100E)进行脱盐(阳离子交换柱床体积20L，流速为1BV/h，45℃)。之后,采用阴离子交换树脂(D301大孔弱碱性阴离子交换树脂，天津允开树脂科技有限公司)进一步脱盐(阴离子柱床体积20L，流速1BV/h，45℃)，流出液pH值为6.8。之后采用真空浓缩结晶釜对其进行减压浓缩(相对真空压力-0.085Mpa,60℃)，待阿洛酮糖含量浓缩至75-80％w/w,缓慢降温至40℃，添加釜内阿洛酮糖质量1％w/w阿洛酮糖粉末作为晶种，搅拌，逐步降温，降温幅度约为2℃/h至温度20℃。之后将4000rpm离心，获得阿洛酮糖晶体，之后真空干燥、粉碎后即获得阿洛酮糖晶体(色谱纯度98％)。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海龙殷生物科技有限公司

波顿（上海）生物技术有限公司

<120> 一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggaaattc aaaataaggc gatgttaatt acttatgctg attcacttgg caagaattta 60

aaggacgtac atcaggttct taaagaagat attggcgatg ctattggcgg cgttcatctt 120

cttcctttct tcccttcgac gggcgatcgc ggctttgctc ctgctgacta caccagggtg 180

gacgctgctt tcggtgactg ggctgatgtc gaggccttag gtgaagaata ctacttaatg 240

ttcgacttta tgataaacca tatttcaagg gagtctgtaa tgtaccaaga ctttaagaag 300

aaccatgacg actctaaata taaagacttc ttcataaggt gggagaagtt ctgggcgaaa 360

gcaggtgaga ataggccaac acaggcggat gtcgatctca tttataaacg caaagataaa 420

gctcctacac aggaaattac atttgatgat ggcacaacag agaatttgtg gaacacattt 480

ggcgaagagc aaatcgacat agacgtaaat tccgcaatcg cgaaggagtt catcaagacc 540

acgcttgaag atatggttaa acatggcgct aaccttattc gccttgatgc tttcgcatac 600

gctgttaaga aggtcgacac aaacgatttc ttcgtagagc ctgaaatttg ggatacactt 660

aacgaagttc gcgaaattct tacaccactc aaggccgaga tcctgccaga gatccacgag 720

cactacagta taccgaagaa gatcaatgat catggctatt tcacgtacga tttcgcctta 780

cctatgacaa cactttatac actttattca ggcaagacga atcagcttgc taaatggctt 840

aagatgtctc ccatgaaaca gtttacaaca cttgatacac atgatggcat tggcgttgtt 900

gatgctcgcg atattcttac agatgatgaa attgattatg cttcagaaca gctttataaa 960

gttggcgcca acgtgaagaa gacatactcg tccgcatcgt acaataatct cgacatctac 1020

cagattaact caacatatta ttcagctctt ggcaacgatg atgctgctta tcttctttca 1080

cgcgtcttcc aagtattcgc gcctggcatt cctcagattt attatgttgg ccttcttgcc 1140

ggtgagaatg atatcgctct tcttgaatca acaaaggagg gacgcaacat taaccgccat 1200

tactacacga gggaggaggt taaatcagaa gttaaacgcc ctgttgttgc taaccttctt 1260

aaacttcttt catggcgcaa cgaatcacct gctttcgact tagctggctc aattacagtt 1320

gatacaccta cagatacaac aattgttgtt acacgccagg atgagaatgg gcaaaataag 1380

gcggtgctta cagctgatgc tgctaacaag actttcgaaa ttgttgagaa tggccaaact 1440

gtgatgtcat cagataacct tacacagaac tga 1473

<210> 2

<211> 870

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaatatggcg tgtattttgc gtattgggaa agcagctgga acgtgaactt tgaaaaatat 60

gtgcagaaag ttaaagaact gggctttgat attctggaag tggcggcgct gggcctggtg 120

aacctgccgg atgaaaaact ggaacgcctg aaacagctgg cggaacagca taacgtgatt 180

ctgaccgcgg gcattggcct gccgaaagaa tatgatgtga gcagtagcga tgcgaccgtg 240

cgccgcaacg gcattgcgtt tatgaaaaaa gtgatggatg cgatgtatca agcgggcatt 300

gatcgcgtgg gcggcaccgt gtatagctat tggccggcgg attatagcca tccgtttgat 360

aaaccgaccg cgcgcaaaca tagcattgaa agcgtgaaag aactggcgga atatgcgcgt 420

cagtatgata ttaccctgct gattgaaacc ctgaaccgct ttgaacagtt tctgctgaac 480

gatgcggaag aagcggtgag ctatgtgaaa gaagtggatg aaccgaacgt gaaagtgatg 540

ctggatacct ttcacatgaa cattgaagaa gataacattg cggatgcgat tcgctatacc 600

ggcgatcatc tgggccatct gcatattggc gaagcgaacc gcaaagtgcc gggcaaaggc 660

agcatgccgt ggaaagaaat tggccaagcg ctgaaagata ttcattatga tggctatgtg 720

gtgatggaac cgtttgtgaa aaccggcggc caagtgggcc aagatattaa agtgtggcgc 780

gatctgagcg gcaacgcgac cgaagaacag ctggatcgcg aattagcgga gagcctggtg 840

tttgtgaaac aagcgtttgg cgaactgtaa 870

Claims (7)

1.一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1、以蔗糖和甘油为原料，使用蔗糖磷酸酶催化获得主要为α-甘油葡萄糖苷与果糖的中间产物一；

步骤2、以步骤1中的中间产物一为基础，使用阿洛酮糖差向异构酶催化果糖转化为阿洛酮糖获得中间产物二；

步骤3、以步骤2中的中间产物二为基础，将α-甘油葡萄糖糖苷分离与提纯。

2.如权利要求1所述的一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，包含将阿洛酮糖分离回收的步骤。

3.如权利要求1或2所述的一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述蔗糖磷酸酶通过原核表达系统一表达获得，所述蔗糖磷酸酶目的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述的一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，

所述原核表达系统一表达收集获得的菌体作为蔗糖磷酸酶粗酶；

所述步骤1中的初始反应配方按质量比为：水100份、蔗糖250份、蔗糖磷酸酶粗酶25份、pH 7.0的PB磷酸缓冲液(0.2mol/L)50份、甘油100份、0.25份的Tween 80；

所述反应条件为：35℃搅拌反应24h，向反应体系内补加10份LPP粗酶，50份甘油，50份水和50份蔗糖，继续反应24h。

5.如权利要求1或2所述的一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述阿洛酮糖差向异构酶通过原核表达系统二表达获得，所述阿洛酮糖差向异构酶目的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

6.如权利要求5所述的一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，

所述原核表达系统二表达收集获得的菌体作为阿洛酮糖差向异构酶，

所述步骤2为：阿洛酮糖差向异构酶30份，硼砂118份，之后调整反应温度至55℃，搅拌反应60h，之后使用50％硫酸将反应体系酸至pH 3.0终止反应。

7.如权利要求1或2，所述的一种α-甘油葡萄糖苷的制备方法，其特征在于，所述步骤3具体包括：

(1)酸化所述的中间产物二，然后利用离心或过滤去除中间产物二中的菌体、酶及沉淀的蛋白等固态杂质；

(2)使用活性炭对去除固态杂质的中间产物二进行脱色，之后采用离心或过滤去除活性炭；

(3)通过层析分离α-甘油葡萄糖苷：采用活性炭层析柱进行分离，先以脱色后的中间产物二进行上样吸附，然后以纯水洗脱各糖，至流出液中无检出后，采用6％w/w的乙醇水溶液进行α-甘油葡萄糖苷的分段洗脱，最后合并α-甘油葡萄糖苷纯度高于99％(色谱纯)的洗脱液分段；

(4)对步骤(3)合并的含α-甘油葡萄糖苷的洗脱液在真空浓缩釜内60℃减压浓缩，至α-甘油葡萄糖苷含量约50％w/w，采用冷冻干燥法干燥获得纯度99％的α-甘油葡萄糖苷。

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