DE2510327C2

DE2510327C2 - Verfahren zur Herstellung von Purinnukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'-(2')-diphosphaten

Info

Publication number: DE2510327C2
Application number: DE2510327A
Authority: DE
Inventors: Yasutaro Hamagishi; Sawao Sakai Osaka Murao; Toyokazu Osaka Nishino; Toshikazu Kamakura Kanagawa Oki
Original assignee: SANRAKU-OCEAN Co Ltd TOKYO JP; Sanraku Ocean Co Ltd Tokyo
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1974-03-29
Filing date: 1975-03-10
Publication date: 1983-05-05
Also published as: FR2274312A1; FR2274312B1; GB1507175A; US4059487A; NL171910B; NL171910C; DE2510327A1; NL7503238A

Description

50

Die Erfindung betrifft das Im Patentanspruch 1 angegebene Verfahren. Die Patentansprüche 2 und 3 nennen Ausgestaltungen der Erfindung.

In der die erfindungsgemäß hergestellten Diphosphate wiedergebenden Formel mXpp stellt ρ einen Phosphairest dar, der auch als Phosphorylgruppe bezeichnet wird. Die Angabe »3'(2')<< In der chemischen Bezeichnung der Diphosphate zeigt an, daß die Position der Phosporylgruppe, die mit der Ribose verküpft Ist. entweder die 3'- oder die 2'-Posltion der Ribose ist. Es Ist nämlich ein reversibler Austausch der Phosphorylgruppe zwischen der .V- und der 2'-Stellung der Ribose In dem Nukleosld unter bestimmten Bedingungen möglich. Beispielswelse gibt pppApp an. daß es sich um Adenosln-.V-irlphosphat-3'(2')-diphosphai handelt. p(CH;)ppGpp bedeutet β,γ-Mcthylenguanosin-5'-trlphosphat-3'(2')-dlphosphat.

Ferner werden folgende (übliche) Abkürzungen verwendet:

AMP: Adenosin-5'-monophosphat

ADP: Adenosin-5'-diphosphat

GMP: Guanos!n-5'-monophosphat

IMP: Inosln-5'-monophosphat

IDP: Inosin-5'-diphosphat

ITP: Inosin-5'-triphosphat

p(CH₂)ppA: /),y-Methylenadenosin-5'-triphosphat

p(CH₂)ppG: /),y-Methylenguanosin-5'-triphosphat

ppApp: Adenos!n-5'-diphosphat-3'-(2')-diphosphat

Es ist bekannt, daß Adenosintetraphosphat (ppppA), Cuanosintetraphosphat (ppGpp) sowie Guanosinpentaphosphat (pppGpp) in der Natur, Insbesondere in Mikroorganismen und Tieren, als seltene Nukleosidphosphate verteilt sind. Das ppGpp und das pppGpp werden mit besonderem Interesse bei der Regulierung von Protein- und Ribonukleinsäuresynthesen in E. coli beobachtet, wobei man annimmt, daß sie eine wichtige Rolle bei der Glykolyse, Lipidsynthese, dem Energiestoffwechsel sowie der Phosphorylierung von verschiedenen Mikroorganismen spielen.

Es ist schwierig, seltene Purinnukleosidphosphate, wie ppGpp und pppGpp, aus Mikroorganismen wegen der sehr geringen Verteih-ng darin zu extrahieren. Die chemische Synthese dieser Nukleosidphosphate ist bis jetzt noch nicht gelungen. Biochemische Synthesen von ppGpp sowie pppGpp sind unter Einsatz von E. coli-Ribosomen, ATP und GDP oder GTP möglich, dieses Verfahren ist jedoch nicht für eine industrielle Produktion in großen Mengen infolge der komplizierten Verfahrensstufen sowie der extrem niedrigen Ausbeute geeignet. Andere neue Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, dioder tri-)3'-(2')-diphosphate, wie pppApp, ppApp, ppplpp etc. können nicht von E. coli erzeugt werden. Um gründlich die physiologische Rolle dieser Nukleotide in Organismen zu untersuchen, besteht ein Bedarf an der Entwicklung eines einfachen und wirtschaftlichen Verfahrens zu ihrer Herstellung. ATP ist tile wichtigste Substanz bei der Phosphorylierung und dem Energiestoffwechsel von Organismen. Es konnte gezeigt werden, daß E. coil und B. subtills enzymatisch die charakteristische Nukleotide, und zwar ppGpp sowie pppGpp, welche an Nukleinsäure- und Proteinsynthesen teilnehmen, aus ATP und GDP oder GTP zu synthetisieren vermögen. Jedoch hat die Reinigung des Enzyms, das eine Rolle bei der Bildung von ppGpp und pppGpp spielt, fehlgeschlagen. Eine Vielzahl von Phosphortransferasen und Nukleotld-abbauenden Enzymen wurde aus Mikroorganismen Isoliert und charakterisiert, das Enzym, welches die Bildung der vorstehend erwähnten Nukleosidphosphate bewirkt. 1st jedoch bisher nicht bekanntgeworden.

Der Erfindung liegen Untersuchungen über Purinnukleosidphosphatverblndungen als biochemische Reagentien, hochenergetische Phosphatadditive und Arzneimittel zugrunde. Es wurden viele natürliche Quellen für Mikroorganismen, die eine potentielle Nukletoldpyrophosphotransferase-Aktivität besitzen, untersucht. Dabei wurde die Erkenntnis gewonnen, daß eine neue Spezies, die zu Streptomyces, und zwar Streptomyces adephospholyticus nov. sp. A4668 gehört, eine potentielle Nukleotldpyrophosphotransfcrase-Aktlvltiit besitzt und Isoliert werden kann, wobei das Enzym, das pppGpp, ppApp, ppplpp etc. durch Katalysieren der Übertragung der Pyrophosphorylgruppe von ATP. dATP und pppApp auf ATP. GTP. GDP, IDP, AMP etc. erzeugt, aus dem Kulturfilttat erhalten und zu einem Im wesentlichen

homogenen Ganzen gereinigt werden kann. Die Erfindung beruht ferner auf der Erkenntnis, daß Nukleotldpyrophosphotransferase in einigen bekannten Spezies von Strahlenpilzen auftritt, wobei es ohne weiteres gelang, die Nukleosld-5'-phosphat-(mono-, di-. oder tri-)3'-(2')-dlphosphate durch die charakteristische Übertragung der Pyrophosphorylgruppe in der 5'-Stellung von ATP, dATP und pppApp auf Purinnukleosidphosphate, wie AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, IDP, ITP etc. unter Einsatz der Kulturbruhe sowie von Myzeln von Nukleotidpyrophosphotransferase-erzeugenden Mikroorganismen herzustellen.

Untersuchungen der physiologischen Rolle von Nukleotiden in Organismen sowie der Verteilung sowie der Biochemie des Enzyms haben die Erkenntnis ergeben, is daß die Nukleotidpyrophosphotransferase das Wachstum von verschiedenen Tumorzellen in Kulturen stimuliert oder inhibiert und auch eine ausgeprägte Antitumoraktivität zeig·.. Ferner inhibieren die neuen Nukleosid-5'-phoshat-(mono-, di- oder tri-)3'(2')-diphosphate d=is Wachstum von leukämlschen L1210-ZeIlen in Mäusen und verhindern eine Thrombusbildung, beispielsweise nach Operationen sowie unter Bedingungen, unter denen eine starke Blutplättchen-Zusammenballung auftritt.

Diese Nukleotide können daher für medizinische Zwecke eingesetzt werden, z. B. als Chemotherapeutika und Diagnostiziermittel.

Die Erfindung wird durch die Zeichnungen näher veranschaulicht, in der darstellen

Fig. 1 bis 3 UV-Absorptionsspektren von Adenosin- y 5'-triphosphat-3'-diphosphat, Guanosln-5'-dlphosphat-3'-diphosphat und Inosin-5'-triphosphat-3'-diphosphat in H₂O, wobei auf der vertikalen Achse die optische Dichte aufgetragen ist;

Fig. 4 und 5 NMR-Spektren von Guanosin-S'-diphosphat-3'-diphosphat bzw. Inosin-5'-triphosphat-3'-diphosphat;

Fig. 6 ein ¹³C NMR-Spektrum von Adenosln-5'-triphosphat-3'-dlphosphat in D₂O (100 MHz);

Fig. 7 den Zeitverlauf der Enzymproduktion durch «o (A) Streptomyces morookaensis ATCC 19166 und (B) Streptomyces aspergllloides ATCC 14808, wobei auf der vertikalen Achse das Zellwachstum als ml des Volumens der gepackten Zelle (P.V.C.) und der sH-Wert (rechts) sowie die Enzymaktivität als Einheit/ml, bestimmt « durch Bildung von pppAp oder Pl (anorganisches Phosphat) (links), und auf der horizontalen Achse die Stunden aufgetragen sind;

Flg. 8 die Beziehung zwischen der Enzymkonzentration und der Wärmestabilität des aus Streptomyces morookaensls ATCC 19166 erhaltenen Enzyms, wobei auf der vertikalen Achse der Prozentsatz der Restaktivität aufgetragen Ist;

Fig. 9 das Molekulargewicht der Enzyme, die aus den Mikroorganismen erfindungsgemäß erhalten werden, und zwar berechnet unter Anwendung einer Sephadex G-75-Gelflltratlon sowie von Standardproteinen als Vergleichsproben, wobei auf der vertikalen Achse das Molekulargewicht (x IO⁴) und auf der horizontalen Achse die Bruch= zahl aufgetragen Ist. Mikroorganismen sowie Methoden zu Ihrer Züchtung:

Mikroorganismen:

Streptomyces adephospholytlcus ATCC 31112,
Streptomyces aspe.gllloldes ATCC 14808,
Streptomyces morookaensis ATCC 19166.

Streptomyces hachljoensls ATCC 19769.
Streptoverticilllum septatum ATCC 27464 und
Actlnomyces vlolascer« ATCC 23968.

Kulturen dieser Stämme wurden bei üer American Type Culture Collection, Rockville, Md., hinterlegt.

Einer der Stamme, der erfindungsgemä3 verwendet wird, zunächst als Streptomyces adephospholytlcus nov. sp. A4668 bezeichnet, wurde von einer Bodenprobe isoliert, die bei Sakai-clty, Osaka, Japan, gesammelt wurde. Er besitzt folgende morphologische, makroskopische, mikroskopische sowie biochemische Eigenschaften:

a) Morphologische Eigenschaften (inkubiert auf einem Malzhefeextrakt-Agarmedium bei 28° C während einer Zeitspanne von 10 bis 20 Tagen).

Das Luftmyzel ist einfach verzweigt, wobei sich an den Spitzen der Myzelfäden-Sporenträger lange offene Spiralen bilden. Die reife Sporenkette ist lang und trägt mehr als 10 Sporen pro Kette.

Die Sporen sind oval und besitzen eine stachelige Oberfläche. Ihre Abmessungen betragen 0,4 bis 0,6 χ 0,6 bis 0,8 μ. Ein Auftreten von Geiseln, Sporenträgern oder Sklerotia wird nicht beobachtet.

Die Inkubation wird bei 28" C durcng' führt, sofern nichts anderes angegeben ist.

b) Züchtungseigenschaften auf verschiedenen Medien:

1) Auf einem Rohrzucker/Nitrat-Agar:
Wachstum: langsam oder mäßig

Luftmyzel: teilweise samtig weiß mit einem purpurnen Stich

Substratmyzel: weiß bis hellgelb, teilweise hellgelborange
Lösliches Pigment: keines

2) auf einem Glukose/Asparagin-Agar:
Wachstum: mäßig. Oberfläche faltig

Luftmyzel: teilweise samtig weiß mit einem purpurnen Stich

Substratmyzel: leicht gelblich
Lösliches Pigment: keines

3) auf einem Glyzerin/Asparagin-Agar:
Wachstum: mäßig

Luftmyzel: teilweise samtig, zuerst weiß mit grüngelbem Stich, nach 2wöchigem Züchten leicht gräulich-purpur

Substratmyzel: zuerst leicht gelb-orange, später leicht grau-rötlich-braun

Lösliches Pigment: gewöhnlich keines, manchmal ein hellgelbes nach 2wöchlgem Züchten

4) auf einem Stärkeagar (Agar aus Stärke und anorganischen Salzen):

Wachstum: mäßig

Luftmyzel: teilweise gepunktet, weiß bis gräulichpurpur oder purpur oder purpur-weiß auf einer alten Kultur

Substratmyzel: weiß bis hellgelb in einer jungen Ku'.tur. hellgelb-orange In einer alten Kultur

Lösliches Pigment: keines

5) auf einem Tyrosinagar:
Wachstum: mäßig

Luftmyzel: reichlich, weiß, sehr leicht purpur In einer alten Kultur

Substratmyzel: gräulich-gelb bis rosa-belge oder mäßig gelblich bis gelblich-braun, hellbraun In einer alten Kultur

Lösliches Pigment: gelb bis gräulich-gelb-braun, verschwindet in einer alten Kultur

6) auf e'r^m Nähragsr:
Wachstum: mäßig, Oberfläche faltig
Luftmyzel: keines

Substratmyzel: leicht grau-rötllch-braun

Lösliches Pigment: leicht braun, verschwindet in einer alten Kultur

20

7) auf einem Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar:

Wachstum: reichlich, faltige Oberfläche

Luftmyzel: samtig weiß bis hellgelb

Substratmyzel: hellgelb bis gräulich-gelb, mäßig gelblich bis grün-gelblich bis leicht grau-rötlichbraun In einer alten Kultur

Lösliches Pigment: keines
S) auf einem Hafermehlagar:

Wachstum: reichlich, faltige Oberfläche

Luftmyzel: weiß, verändert sich In gräulich-gelblich to bis grünlich-gelb oder purpur-grünllch-gelb In einer alten Kultur

Substratmyzel: gräulich-gelb In einer jungen Kultur.

leicht gräulich-gelbbraun bis hellbraun In einer alten Kultur Lösliches Pigment: keines

c) Physiologische Eigenschaften:

1' Wachstumstemperatur: die optimale Temperatur liegt bei 25 his 30° C. Bei IO^C C erfolgt ein spärliches Wachsen, oberhalb 37⁼ C wird kein Wachsen festgestellt.

2) GelatineverflUssigung auf einem Glukose/Pepton/Gelatlne-Medium bei 20° C: positiv

3; Stärkehydrolyse auf einem Agar aus Stärke und anorganischen Salzen: positiv

4) Peptonlslerung und Koagulation von abgerahmter Milch: positiv

5) Melamlnb'.ldung auf einem Tyrosinagar. einem Pepton/Hefeextrakt/Fe"-Agar sowie einer Trypton/ Hefeextraktbrühe: positiv

6) Nitratreduktion: positiv

⁷i Verbrauch %on Kohlehydraten auf einem Prldham-Gottlieb-Grunt'medium: reichliches Wachstum mit L-Arabinose. D-Xylose. D-Glukose, D-Fruktose. Inosit. Raffinose und D-Mannit. leichtes Wachstum mit Rohzucker, kein Wachstum oder sehr geringes Wachstum mit L-Rhamnose.

Nimmt man eine Klassifizierung auf der Basis der morphologischen und physiologischen Eigenschaften des Stammes gemäß »The Actinomycetes«, Band II. 1961 von S A. Waksman. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 7. Auflage, 1957 sowie International Journal of Systematic Bacteriology. Band 18 (1968) Nr. 2 und und Band 19 Π969) Nr. 4 vor. dann gehört der Stamm 7u dem Genus Streptomyces. da vegetatives Myzel nicht in den flüssigen Medien zu bazillären Fragmenten getrennt wurde und Luf'myzel einfach verzweigt war. Aobei die Spornphoren lange offene Spiralen an den Myzelfäden bilden.

Vergleicht man diese mikrobiologischen Eigenschaften mit denjenigen bekannter Spezies von Streptomyces. dann ähnelt dieser Stamm offensichtlich der Lavendulae-Reihe. und /war Streptomyces lavendulae und St. venezualae. unterscheidet sich jedoch von diesen Stämmen in Details.

Die Züchtungseigenschaften sowie die physiologischen Eigenschaften der erfindungsgemäß eingesetzten Streptomyces-Stärnme sind im Vergleich zu bekannten Spezies denjenigen vor. Actinomyces violascens se'ir ähnlich. Aus den Ergebnissen von parallelen Züchtungen des erfip.dungsgemäß eingesetzten Actinomyces-Stammes und des Standardstammes von Act. violascens ISP gehen einige Unterschiede bezüglich der Züchtungseigenschaften hervor, beispielsweise der Farbe des Luft- und Substratmyzels sowie des Aussehens auf Hefeexirakt/Malzexxrakt-Agar. Tyrosinagar. Pep-

35 ton/Hefeextrakt/Fe"-Agar sowie Nahragarniedlum. ferner werden Unterschiede bezüglich des Kohlenstoffasslmlllerungsverhalicns festgestellt. Der erfindungsgemäß eingesetzte Actlnomyces-Stamm vermag D-Mannlt, Inosit und Fruktose zu assimilieren, während Act. violascens nicht zur Assimilation von D-Mannlt In der Lage Ist und nur schwach die zwei anderen Zucker zu verbrauchen vermag.

Züchten der erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen:

Diese Stämme, die eine Nukleotidpyrophosphotransferase-Aktlvltät besitzen, enthalten das F.nzym als solches und zeichnen sich dadurch aus. daß sie das Enzym In dem Kulturfiltrat extrazellular unter den allgemeinen Gärungsbedingungen, die zum Züchten von anderen Strahlenpilzen angewendet werden, ausscheiden. Wenn auch das Züchten auf einem fesien Medium sowie ein Abtrennen von Myzeln zur Herstellung des Enzyms möglich sind, so Ist dennoch die Gewinnung des Enzyms, das aktiv in dem Kulturfiltrat durch eine aerobe Submerskultur ausgeschieden worden ist. besonders vorteilhaft bei der Industriellen Erzeugung großer Mengen der reinen Enzymzubereitung.

Medien, die aus bekannten Nährquellen für das Wachstum von Strahlenpilzen bestehen, können zur Herstellung -.'jr Nukleotidpyrophosphotransferase verwendet werden. Als Kohlenstoffquelle enthält das Medium am besten Glukose, Rohrzucker, Maltose. Fruktose. Stärke. Stärkehydrolysat. Glyzerin, Glycin Alanin. Glutaminsäure. Melassen, Dextrin. Öl, Fette oder dergleichen. Als Stickstoffquelle enthält das Medium am besten organische Materialien, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt. Sojabohnenmehl, Fischmehl, Kaseinhydrolysat oder Harnstoff. Als anorganische Quellen für Stickstoff kommen Nitrate und Ammoniumsalze in Frage, beispielsweise Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid. Das Medium enthält ferner andere anorganische Salze, beispielsweise Natriumchlorid. Kaliumchlorid. Kaüumphosphat. Magnesiumsulfat sowie K.iizlumcarbonat. sowie Spurenmengen an Schwermetallen, wie Mangan. Eisen. Zink und dergleichen. Bei der Durchführung von belüfteten Submerskulturen wird ein Antischaummittel, wie beispielsweise ein flüssiges Paraffin. Sojabohnenöl. ein Fettöl oder ein Silikon, verwendet.

Die Züchtungstemperatur liegt gewöhnlich zwischen 20 und 40° C, wobei der beste Temperaturbereich zwischen 25 und 30° C schwankt. Es 1st nicht notwendig, den pH-Wert des Kulturmediums während des Züchtens zu steuern. Die Enzymaktivität In dem Kultu-'iltrat erreicht ein Maximum nach einer Inkubationszelt von 42 bis 72 Stunden.

Enzym und Methode zu seiner Reinigung:
Reinigung:

Ein Beispiel für die Herstellung des Enzyms wird nachfolgend beschrieben:

100 ml eines Mediums aus 2% Glyzerin. 4% Polype ton. 0.1% KH₂PO₁, 0.1% K₂HPO₁. 0.04% MgSO₄ ■ 7H₂O und jeweils 2 ppm Mn" und Fe" wird in 500 ml Sakaguchi-Schüttelkolben gegeben und bei 120^c C während einer Zeitspanne von 15 Minuten sterilisiert. Auf dieses sterilisierte Medium werden Streptomyces aspergllloides ATCC 14808 und St. morookaensis ATCC 19166 in getrennten Kolben aus einer Agarschrägkultur mittels einer Platinschlaufe aufgeimpft, worauf auf einem sich hin- und herbewegenden Schüttler bei 28'C inkubiert wird. Der Zeitverlauf der Enzymerzeugung in dem Kulturfiltrat. der aus Fig. 7 hervorgeht, wird nach der später beschriebenen Methode bestimmt.

Die Flg. 7A zeigt den Zeltverlauf der Enzymaktivität von St. morookaensls ATCC 19166 und die Flg. 7B denjenigen von St. aspergllloldes ATCC 14808. Dabei wird die Enzymaktiviiät als Elnhelt/ml ausgedrückt, und zwar bestimmt durch die Bildung von pppApp oder Pl (anorganisches Phosphat). Das Zellwachstum wird als P.C.V. wiedt.igegeben (gepacktes Zellenvolumen).

Nach der Gärung kann das Enzym gereinigt und nach üblichen Methoden gewonnen werden, beispielsweise durch Aussalzen mit Animonlunisuirat, durch Lösungsmlttelausfällung, durch Extraktion, durch Adsorption, durch Elektrophorese, durch Elektrofokusierung, durch Gelfiltration, durch Verwendung von lonenaustauscherharzen oder dergleichen oder durch eine Kombination von Methoden, wobei In diesem Falle wenigstens eine oder mehrere der angegebenen ausgewählt werden.

Tabelle I

Unter Züchtungsbedingungen, die ein Wachsenlassen der Mikroorganismen gestatten, findet man das Enzym hauptsächlich In dem flüssigen Teil der Kulturbrühe nach dem Entfernen des Myzels. Die Gewinnung des Enzyms In reiner Form aus dem Kulturflltrat, In welchem es sich In hoher Konzentration angereichert hat, ist bei der Durchführung In industriellem Maßstab vorteilhaft.

Relnlgungs- und Herstellungsverfahren des Enzyms aus St. morookaensls ATCC 19166 wird als Beispiel In Tabelle I angegeben.

Die Reinheit der fertigen Enzymzubereltung wird durch Polyacrylamid- und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese untersucht. Die gereinigte Enzymzubereltung wandert als einzige Bande auf den Gelen, woraus hervorgeht, daß das Enzym elektrophoretisch homogen Ist.

Reinigungsverfahren von Nukleotidpyrophosphotransferase aus Streptomyces morookaensis ATCC 19166

Verfahren

Kulturfiltrat

Volumen	Gesamt	Gesamt	Spezifische	Ausbeute
	aktivität,	protein	Aktivität
ml	Einheiten	(OD_{280 mm})		%

20000

77190 1218420

0.63

100

(NH₄)₂SO₄-Nieder- 9789 471811 256220 1,84 61,1

schlag. 60°/oige

Sättigung

DÄAÄ-Zellulose- 11200 436800 146940 2,98 56,6

Säule (pH 5,6)

CM-Sephadex C-50- 1660 72422

Säule (pH 5,6)

CM-Sephadex C-25- 910 16244

Säule (pH 5,5)

DÄAÄ-Sephadex 159 6298

A-25 (pH 8,7)

Sephadex G-75 14 6019

(pH 8,7)

Die sehr geringe Ausbeute an gereinigtem Enzym in dem Beispiel wird durch einen beträchtlichen Verlust an Enzymaktivität bei der Entfernung von unreinem Protein während des Reinigungsverfahrens sowie durch die schnelle Inaktivierung durch Verdünnung verursacht.

Die Zugabe von Proteinen, wie Kasein sowie Rinderserumalbumin und nicht-ionischen grenzflächenaktiven Mitteln handelsüblichen Typs zu der Enzymlösung schützt das Enzym gegenüber einer Inaktivierung, verbessert die Ausbeute an gereinigtem Enzym und macht es möglich, das Enzym während einer langen Zeitspanne zu lagern.

Die Enzymuntersuchungen werden unter Anwendung einer der folgenden Methoden durchgeführt:

1) Anorganische Phosphatbestimmung durch eine Modifizierung der Nakamura-Methode: Die Standard-Reaktionsmischung enthält 0,2 ml eines 0,25 m Glycin-NaOH-Puffers (pH 10,0), 0,05 ml einer 0,05 m MgCl₂-Lösung, 0,05 ml eines 0,05m-ATP, 0,1 ml der Enzymlösung (die durch den Puffer erforderlichenfalls verdünnt wird) und 0,1 ml destilliertes Wasser in einem Endvolumen von 0,5 ml. Nach einer Inkubation, bei 37° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml einer 0,2n-Essigsäure beendet, worauf auf Eis abgeschreckt wird. Sofort danach werden 3 ml eines Entwicklungsreagenses (Amidolmolyb-16384

309

20

4,42

52,6

315

6,7 903

9,4

2,1

0,8

dat) zugesetzt, worauf die Mischung während einer Zeitspanne von 10 Minuten bei 37° C stehen gelassen wird. Die optische Dichte wird bei 750 nm gemessen. Die Anzahl der Mole an freigesetztem Pi wird berechnet, wobei die Pi-Standardkurve verwendet wird. Eine Einheit der Enzymaktivität wird als die Menge Enzym definiert, weiche 1 μΜοΙ Pl pro Minute unter Standardbedingungen zu bilden vermag.

Z) Bestimmung von bei der Reaktion gebildetem pppApp und AMP unter Anwendung von radioaktivem ATP.

Die Reaktionsmischung enthält 20 mM Adenosin-8-3H-triphosphat (2 mCi/mMol), 5 mM MgCl₂, 62,5 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0) sowie 0,1 ml der Enzymlösung. Das Gesamtvolumen beträgt 0,2 ml. Die Mischung wird bei 37° C während einer Zeitspanne von 10 Minuten inkubiert. Die Inkubation wird durch Zugabe von 0,01 ml ln-Essigsäure beendet. 20 μΐ der Reaktionsmischung werden dann auf eine Polyäthylenimin (PAI)-Zellulose-F-Dünnschichtplatte (E. Merck AG) fleckweise aufgebracht, worauf getrocknet und in einer 0,75 m KHiPO₄-Lösung mit einem pH-Wert von 3,4 während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei Zimmertemperatur entwickelt wird. Nach der Chromatographie werden die Platten getrocknet und mit UV-Licht bestrahlt, das von einer Manasul-UV-Lampe ausgeschickt wird, um das

ίο

gebildete pppApp und AMP zu lokalisieren. Die Flecken auf den Chromatogrammen. die pppApp und AMP entsprechen, werden ausgeschnitten und In eine Szlntlllatlonsampulle gegeben, die 0,5 ml einer 0,1 η HCI enthält. Die Ampullen werden während einer Zeltspanne von 15 Minuten eine' Siedebehandlung unterzogen, um die Nukleotlde zu e'uieren, die an der PÄI-Zellulose adsorbiert sind. Die Radioaktivität wird mittels 10 ml einer BRAY-Lösung In einem Flüsslgkeltsszlntlllatlonszähler gemessen. Eine Einheit der EnzymaktWltät wird als die Menge des Enzyms definiert, die I μΜοΙ pppApp oder AMP pro Minute unter den vorstehend geschilderten Bedingungen bildet.

Enzym:

Die Nukleotldpyrophosphotransferase-Zubereltung. die von den erfindungsgemäß verwendbaren Mikroorganismen durch eine Kombination der verschiedenen vuimchend erwähnten Methoden erhalten wird, hat sich als neues Enzym erwiesen, das folgende physikalisch-chemische Eigenschaften besitzt:

a) Enzymreaktion und Substratspezlfltät:

Die aus den vorstehend erwähnten 6 Mikroorganismen erhaltenen Enzyme katalysleren die Übertragungsreaktion einer Phosphorylgruppe von ATP. dATP und pppApp auf die 3'-(2')-Stellung von AMP. ADP. ATP. GMP, GDP, G. P, IMP. IDP. ITP. p(CH,)ppA. p(CH₂)ppG oder dergleichen. Die neuen Reaktionsprodukte sind pApp, ppApp, pppApp, pGpp. ppGpp. pppGpp. plpp. pplpp, PPplpp. piC^lppApp, p(Chj)ppGpp oder dergleichen.

Andere Pyrimldinnukleotlde, p-Nltrophenylphosphat, Pyrophosphat, Glukose-1-phosphat, Glycerln-3-phosphat. Tripolyphosphat. Nukleoslde sowie Basen können nicht eine Phosphorylgruppe annehmen oder abgeben. Es gibt

ίο einige Unterschiede bezüglich der Pyrophosphatakzeptor- und -donatoraktlvitälen. und zwar je nach dem pH-Wert, den Metallionen sowie den Mikroorganismen, Im allgemeinen verläuft jedoch die Donaloraktivität über die Reihenfolge ATP, pppApp und dATP, während diejenige der Phosphatakzeptoraktivität über Adenosinnho^hat, Guanosinphosphat und Inoslnphosphat in der angegebenen Reihenfolge festzustellen Ist.

b) pH-Optimum und ivietaiibeiiaif.

Das Enzym, das die Bildung von pppApp aus ΛΤΡ zu katalysleren vermag, zeigt einen absoluten Bedarf an zweiwertigen Metailionen. Es wird keine Aktivität in der Reaktionsmischung festgestellt, falls zweiwertige Metailionen fehlen. Das pH-Optimum sowie die optimalen Konzentrationen an zweiwertigen Ionen hängen von den jeweiligen Metallionen sowie den Enzymquellen ab. wie aus der Tabelle II hervorgeht.

Tabelle II

Beziehung zwischen dem pH-Wert und den Metallionen auf die Enzymaktivität

Enzymquellen	Metallionen	Optimale	Optimaler	Relative
		Konzentration.	ph-Wert	Aktivität.
		m		%
Actinomyces	Mg⁺⁺	5 X ΙΟ"³	10-10,5	100
violascens	Mn«	3 X 10-³	9,5-10	45
ATCC 23968	Co⁺-	5 X ΙΟ"³	9	43
	Zn⁺-	5 X 10-³	9.5	15
	Fe⁺⁺	5 X 10"³	9	30
Streptoverticillium	Mg⁺⁺	10^2 5 X ΙΟ"³	9,5-10	100
septatum	Mn⁺⁺	10-²	10-10,5	40
ATCC 27464	Co⁺⁺	7 X ΙΟ"³	8-8,5	35
	Zn⁺⁺	5 X ΙΟ"³	8,5-9	20
	Fe⁺⁺	5 X ΙΟ"³	7,5-8	20
Streptomyces	Mg⁺-	10=i 5 x ΙΟ"³	10-11	100
morookaensis	Mn⁺-	3 X 10-3	11	60
ATCC 19166	Co⁺⁺	7 X ΙΟ-³	9-9,5	65
	Zn⁺⁺	5 X ΙΟ-³	9,5	15
	Fe⁺⁺	5 x ΙΟ-³	8-9	25
Streptomyces	Mg⁺-	5 x 1(B	10-11	100
aspergilloides	Mn-⁺	7 x ΙΟ-³	10,5	50
ATCC 14808
	Co⁺⁺	7 x 10-³	8,5-9	60
	Zn⁺⁺	5 X ΙΟ-³	9-10	20
	Fe⁺⁺	5 X ΙΟ-³	8,5	55
Streptomyces	Mr⁺	1O=-²- 5 x ΙΟ-³	9,5	100
hachijoensis	Ml!⁺⁺	5 X ΙΟ-³	9-9,5	35
ATCC 19769	Co⁺^	7 x 10-³	8-8,5	75
	Zn⁺⁺	2 X ΙΟ"³	8,5-9	20
	Fe⁺+	5 X 10-³	7,5	25

c) Optimale Temperatur:

10

Bezüglich der optimalen Temperatur der Enzymreaktion treten unabhängig von der Art der eingesetzten Mikroorganismen keine Unterschiede auf. Die Temperatur von 40 bis 45° C ist bei einem optimalen pH-Wert in Gegenwart von Magnesiumionen optimal.

d) Stabilität:

Das von den sechs Strahlenpilzstammen isolierte Enzym ist In ähnlicher Weise bei einem pH-Wert stabil, der zwischen 7 und 11 schwankt und bei einem sauren pH-Wert unterrnlb 6 instabil. Ist die Enzymlösung bei 37° C während einer Zeitspanne von 2 Stunden gestanden, dann beträgt die Restaktivität 10 bis 20% bei einem pH-Wert von 4. 30 bis 50% bei einem pH-Wert von 5 und 60 bis 70% bei einem pH-Wert von 6. Wenn auch die Wärmestabllitüi durch das Ausmaß der Verdünnung der Enzymlösrng sowie durch das Vorliegen von unreinem Protein beeinflußt wird, so ist es dennoch Im allgemeinen oberhalb 60" C instabil. Wird beispielsweise das Enzym, das von St. morookaensis ATCC 19166 erhalten wird, auf verschiedene Enzymproteinkonzentrationen verdünnt und während einer Zeitspanne von 10 Minuten in einem 0,05m-Glycin-NaOH-Puffer (pH 10). der 5xl0-'m Magnesiumionen enthält, erhitzt, dann kann keine thermische Inaktivierung sogar bei 90° C beobach- et werden, wenn die EnzymprotJnkonzentration hoch st; bei einer geringen Enzymproteinkonzentration erfolgt edoch eine schnelle Inaktivierung sogar bei 30= C, wie aus Fig. 8 hervorgeht.

Die thermische Inaktivierung sowie die Inaktivierung bei einem sauren pH-Wert kann durch Zugabe von 20 bis 300 ng an Proteinen, wie Serumalbumin, Kasein oder dergleichen, pro ml oder von 0,001 bis 0,01% an nichtionischen grenzflächenaktiven Mitteln, bei denen es sich ζ B. um handelsübliche Polyoxyäthylenderivate von Sorbltanhydriden. die teilweise mit Fettsäure verestert sind, oder um handelsübliche Tenside auf der Basis von Estern aus Fettsäuren und Sorbitan handeln kann, verhindert werden

e) Inhibitoren:

Inhibierende Wirkungen von 40 Substanzen, die allgemeine Enzyminhibitoren sind, wie Nukleoside. Nukleotide sowie ihre Basen, wurden auf ihre Wirkung auf die Enzyme, die aus den sechs Strahlenpilzen gewonnen wurden, untersucht.

Von den getesteten Nichtsubstrat-Nukleinsäuren bewirken Guanin, Guanosln, d-GDP und d-GTP (jeweils 10 mMol) eine merkliche Inhibierung, während andere Nukleinsäuren, wie Adenin, Adenosin, 2'-(3')-AMP. Hypoxanthln, Inosin, Xanthin, Uracll, Uridin, Cytosin. Cytidin, CMP und NAD nicht inhibierend sind. Bestimmte Konzentrationen an Natriumborat, 5 mMo! Quecksilberacetat, 5 mMol Jodacetat sowie 0,1 mMol N-Bromsucclnimid inhibieren 50 bis 80% der Enzymaktivität.

ner dadurch erhöht, daß das Enzym mit diesen Aktivatoren bs! 30 bis 0°C wä'ir >itl einer Zeitspanne von 10 bis 60 Minuten vor der Enzymreaktion inkubiert wird.

g) Enzymunlersuchung: wie vorstehend beschrieben

h) Molekulargewicht:

Werden die gereinigten Enzyme, die aus jedem Strahlenpilzstiimm Isoliert worden sind, auf geeichte Sephadex-G-75-Säulen, die mit 0,05 ni Glycln-NaOH-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 ins Gleichgewicht gebracht biW. aquillbrlert worden sind, dann läßt sich die Enzymaktivität als einziger symmetrischer Peak eluieren.

Das scheinbare Molekulargewicht des Enzyms wird unter Verwendung von Bezugsproteinen, und zwar Chymotrypsin. Eialbumln, RNase sowie Kalbserumalbumin, berechnei (vgl. die Fig. 9).

In Fig. 9 zeigt (1) das Molekulargewicht des St. morookaensis ATCC 19166-Enzyms. (2) das Molekulargewicht von St. aspergllloldes ATCC 14808 und Streptoverticilllum septatum ATCC 27464, (3) das Molekulargewicht von St. hachljoensls ATCC 19769, (4) das Molekulargewicht von Actinomyces vlolascens ATCC 23968 und (5) das Molekulargewicht von St. adephospholyticus A 4688.

Wird eine Gelfiltration in einer Lösung mit einer hohen lonenstärke (0,1 m KCl) durchgeführt, dann wird das scheinbare Molekulargewicht niedrig, wie aus den Klammern in der Tabelle III hervorgeht. Die Molekulargewichte der Enzyme sind in der Tabelle III zusammengefaßt, die auch die Ergebnisse der Gelfiltration sowie die Ergebnisse zeigt, die bei der Durchführung einer Polyacrylamldgelelektrophorese in 0,1% SDS unter EInsatz von Kalbserumalbumin, Lysozym und /-Globulin als Standardsubstanzen erhalten worden sind.

Tabelle III

Methoden Sephadex G-75

SDl,-Polyacrylamidelektrophorese

Stämme

f) Stimulierung:

60

Die Enzymaktivität kann merklich stimuliert werden, d. h. durch die Zugabe von 0,05 bis 0,001% an nicht-Ionischen grenzflächenaktiven Mitteln, wie Tween 20, und 60 sowie Span 20, 40 und 60 und 80 oder dergleichen, 0,005 bis 0,001% Natriumdodecylsulfat, 0,001 bis 0,01% Polyäthylenglykol 6000, 10 bis 200 μg/ml bestimmter Proteine, wie Serumalbumin und Kasein oder dergleichen erhöht werden. Die Enzymaktivität wird fer-Actinomyces
violascens
ATCC 23968
Streptomyces
morookaensis
ATCC 19166

Streptomyces
aspergilloides
ATCC 14808
Streptoverticillium
septatum
ATCC 27464

Streptomyces
hachijoensis
ATCC 19769

Streptomyces
adephophcliticus
ATCC 31122

26000

35000 (25000) 23000-24000

32000 (23000) 21000-23000

32000

18000

28000-29000 -

i) Sedimentationskoeffizient:

Unter Anwendung einer Glyzeringradienten (15 bis 55%)-Zentrifugation unter Einsatz von y-Globulin, Kalbserumalbumin sowie RNase als Innenstandards wer-

den SedimentationskoefTizienten von 2,65 für das St. morookaensls ATCC 19166-Enzym, von 2,45 für das St. aspergllloides ATCC 14808-Enzym und von 2,10 für das St. adephospholyitcus-Enzym ermittelt.

j) Isoelektrischer Punkt:

Die isoelektrischen Punkte der gereinigten Enzyme werden unter Einsau einer Eiektrofokusierungssäule mit einem Ampholln mit einem pH-Wert von 5 bis 8 ermittelt (vgl. die Tabelle IV).

Tabelle IV
Isoelektrischer Punkt

Stamme

pH-Wert

Actinomytes violascens ATCC 23968 7,5

Streptomyces morookaensis ATCC 19166 6,9

Streptomyces aspergilloldes ATCC 14808 6,8

Streptoverticillium septatum ATCC 27464 9,2

Sirepiüui>ce5 hachtjcensis ATCC 19769 8,3

Streptomyces adephospholyticus ATCC 31122 7,6

Wie vorstehend erwähnt worden ist, stimmen die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Enzyms nicht mit denjenigen bekannter Enzyme überein. Vielmehr hat sich das Enzym als neuer und charakteristischer Enzymtyp herausgestellt.

Zur Herstellung von Nukleotid-pyrophosphotransferase wird so vorgegangen, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Mikroorganismen, die zu den Genera Streptomyces. Streptoverticillium und Actlnomyces gehören, nach üblichen Methoden gezüchtet werden, worauf das Enzym von dem Kulturfiltrat und den Myzeln während eines Reinigungsverfahrens unter Anwendung eine: Ammoniumsulfatausfällung, einer Lösungsmittelausfällung, einer Extraktion, einer Chromatographie unter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes sowie einer Gelfiltration abgetrennt wird. Das gewonnene Enzym ermöglicht eine enzymatische Methode, mit deren Hilfe es leicht möglich ist, die neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, dl- oder trl-)3'-<2')-dlphosphate mit hohen Ausbeuten durch Übertragung der Pyrophosphorylgruppe aus der 5'-Stellung von ATP, dATP und pppApp auf die 3'-Stellung von Guanosin-, Adenosln- oder Inosinnukleosidphosphaten (mono, di- oder tri-) herzustellen.

Herstellung der neuen NukIeosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)3'-(2')-diphosphate:

Verschiedene Enzymzubereitungen, wie beispielsweise eine Kulturbrühe, ein Kulturflltrat, ein Zellhomogenal, ein (NH^SOvNlederschlag, Fraktionen von Ionenaustauscherharz-Chromatographien sowie Gelfiltratlonen oder dergleichen, die Nukleotldpyrophosphotransferase enthalten, können zur Herstellung der neuen Nukleosld-5'-phosphat-(mono-, dl- oder trl-)3'-(2')-dlphosphate gemäß vorliegender Erfindung verwendet werden.

Die Phosphatdonatoren sind auf ATP, dATP und pppApp beschränkt, während es sich bei den Phosphatakzeptoren um ATP, ADP, AMP. GTP, GDP. GMP, ITP. IDP, IMP oder dergleichen handelt, und zwar entsprechend dem neuen gebildeten Nukleosld-5'-phosphat-3'-(2')-diphosphat. Einer oder mehrere Phosphatdonatoren sowie einer oder mehrere Phosphatakzeptoren können zur Durchführung der Enzymreaktion eingesetzt werden.

Ein Beispiel für die Zusammensetzung der Reaktionsmischung wird nachfolgend angegeben:

250 mMol Ulyeln-NaOH-Puffer (pH 10.0) 6 ml

50 mMol ΛΤΡ-Natrlumsalz 4 ml

50 mMol Phosphatakzeptur

(Nukleosidpbosphat)
50 mMol MgCl₂
3 Einheiten/ml Enzymlösung

insgesamt 24 ml

Der Phosphatdonator und -akzeptor kann eine freie Säure oder ein Natrium-, Lithium- oder Kaliumsalz davon sein oder aus einer Kombination aus freier Säure und Salzen bestehen, wobei ferner das Verhältnis des Phosphatdonators zu dem Akzeptor in Abhängigkeit von den Reaktionsbedingungen und der Enzymaktivität verändert werden kann.
Es ist vorzuziehen, die enzymatische Reaktion unter optimalen Bedingungen bezüglich pH-Wert, Temperatur, des Vorliegens oder Fehlens von zweiwertigen Metallionen, einer entsprechenden Substraikonzentration oder dergleichen durchzuführen, damit das Enzym eine maximale Aktivität erreicht. Beispielsweise liegt der optimale pH-Bereich zwischen 6 und 11 und der optimale Temperaturbereich zwischen 25 und 4Cr C. Bei den eingesetzten zweiwertigen Metallionen handelt es sich um Fe**, Mn". Mg", Co**, Zn** und dergleichen. Im allgemeinen wird die Enzymreaktion bei einer Temperatur von 37° C während einer Zeltspanne von 2 bis 4 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Enzymreaktlon wird die Reaktionsmischung mit 0,ln Chlorwasserstoffsäure neutralisiert, worauf die neuen Purinnukleosid-S'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)3'-(2')-d!phosphate durch Adsorption an Aktivkohle, durch Chromatographie unter Verwendung von Anionen- oder Kationenaustauscherharzen und durch Losungsmittelausfiillung isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise wird die vorstehend beschriebene Reaktionsmischung bei 37° C während einer Zeitspanne von 4 Stunden inkubiert, mit 0,1 η HCI neutralisiert und auf eine lonenaustauscherharzsäule (Dowcx-I, Cl-Typ oder DÄAÄ-Sephadex A25) aufgegeben. Adsorbierte Reaktionsprodukte werden mit einem entsprechenden Puffer (verdünnter HCI oder verdünnter HCI + NaCl Irr Falle von Dowex-1, Cl-Typ zur Herstellung des Natriumsalzes, sowie tris-HCI + LiCl im Falle von DÄAÄ-Sephadex zur Herstellung des Lithiumsalzes) eluiert. Das Eluat wird an Aktivkohle adsorbiert und erneut mit Ammoniak/Alkohol (50% Äthanol/1,4% Ammoniakwasser), Ammoniak/Azeton oder 2.R%lgem Ammoniakwasser eluiert.

Nachdem der Ammonlaküberschuß In dem Eluat durch Einengen im Vakuum entfernt worden Ist. werden die Natrium- oder Lithiumsalze der neuen Nukleosid-5'-phosphat-3'-(2')-phosphate in Form eines weißen mikrokristallinen Pulvers dadurch «rhalten, daß die Lösung In der Kälte stehen gelassen wind, oder daß Lösungsmittel, wie Alkohole. Azeton oder ülergleichen, zugesetzt werden. Zur Herstellung der frei::η Säure wird das Natrlum- oder Lithiumsalz des Nukleosld-5'-phosphat-3'-(2')-phosphats In angesäuertem Wasser aufgelöst und an Aktivkohle adsorbiert. Dana wird die freie Säure mit Ammoniak/Alkohol (50% Älhanol/1.4% Ammoniakwasser) eluiert. Nachdem der Ammonlaküberschuß du-ch Eindampfen Im Vakuum ein ferrit worden Ist, wird die freie Säure mit 10 Volumina Azeton ausgefüllt.

Struktur der neuen Nukleosidphosphate:

Die Strukturen der neuen Nukleosld-5'-phosphat-3'- ^'!-phosphate, die erfindungsgemäß anfallen, werden durch UV-Adsorptlonsspektren, eine Gesamtphosphatbestimmung. NMR-Analyse «owle einen enzymatischen Abbau in der folgenden Wehe bestimmt:

Wird beispielsweise die Reaklionsmischung, in welcher ATP mit den Enzymen in Gegenwart von Mg" inkuvieri worden ist, an DÄAÄ-Sephadex A-25 in einer Säule (Cl~) adsorbiert und mit einem Puffer eluiert, wobei die Lithlumchloridkonzentraiion von 0,1 aufO,3 m linear erhöhl wird, dann werden zwei Peaks bei OO₁₁^_n,,, durch 0,1 ni und 0,2 m Lithiumchlorid eluiert. Diese Fraktionen werden zusammengefaßt und im Vakuum konzentriert, worauf zwei Arten von Nukleotiden durch die Zugabe von 10 Volumina eines 95tigen Äthanols ausgefällt werden. Die Ergebnisse einer Perjodatoxydalion, einer Gesamtphosphatbestimmung, eines aufgenommenen UV-Spektrums, einer ^l3C-NMR-Analyse sowie eines enzymatischen Abbaus mittels einer Schlangengiftdephosphodiesterase und 3'-Nukleoiidase zeigen, daß der erste Peak ein AMP-Lithiumsalz und der zweite Peak ein neues Adenosin-5'-triphosphat-3'-(2')-diphosphat-Lithiumsalz lsi, das eine Pyrophosphatstruktur aufweist, die an der 3'-(2')-Stellung des ATP sitzt und wie neberisichcfid wiedergegeben werden kann.

Um die neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, di- oder iri-)3M2')-diphosphate. die unter Anwendung der erfindungsgemäßen Methoden erzeugt worden sind, zu charakterisieren und zu identifizieren, sind die Ergebnisse bezüglich des Lilhiumgehaltes. der spektralen Eigenschaften, ermittelt durch UV und NMR. des Molverhältnisses von Pi zu Nukleolid. berechnet anhand der Werte des Gesamtphosphats, sowie der Ribosegehalte in der Tatrille V zusammengefaßt. UV-Adsorptions- und NMR-Spektren von typischen Nukleosid-5'-phosphai-(mono-, di- oder tri-)3'-(2')-diphosphaten. erhalten gemäß vorliegender Erfindung, gehen aus den Flg. 1 bis hervor und erläutern die Eigenschaften dieser Verbindungen.

Struktur von pppApp

NH₂

HO —P—O —P—O —P—O —CH,

OH

H H

OH

(I)

O O = P-OH

I ο

0=-P—OH

OH

Tabelle V	Nuklcosid-S'-phosphatO'	ppApp	-diphosphat-Lilhiumsalz	ppGpp	pGpp	ppplpp
Eigenschaften	pppApp		pppGppp
		258		258	257,5	250
UV-Adsorption Bemerkung I	258	260	258	254.5	253,5	249.5
λ max (I)	260.5	260	254,5	258	258	254.5
(2)	260.5	230.5	258	229	229	221.5
(3)	230.5	228	229	225.5	223.5	223
λ min (1)	228	228	224	225,5	225.5	225
(2)	228		226
(3)		14.2		11.8	11.8	7.4
ε 260 nm HH	14.3	15.0	11,8	11.9	12.1	7.4
(D	15.1	15.0	12.0	11.8	11.8	12.2
(2)	15.1	1 : 4.00	11.8	1 : 3.82	1 : 3,02	1 : 4,69
(3)	1 : 4.92	1 : 6.0	1 : 4,95	1 : 6,2	1 : 5,2	1 : 7,2
Phosphatgelialt. Molverhältnis	1 : 7,1	y 3'-	1 : 6.8	C' 3'-	5- 3'-	5'- 3'-
Lithiumgehalt. Molverhältnis	5'=. 3'-		5'-
Bindeposition des Phosphats Bemerkung 4

Bemerkung I: Die UV-Adsorpllon wird In (I) 0.01 η HCI. (2) destilliertem Wasser und (J) 0.01 η NaOiI gemessen

Bemerkung 2: Die Gesamtphosphatbestlmmung wird nach der Nakamura-Methode durchgeführt, nachdem 0.5 bis i ml der Probelösung mit 0.5 ml einer oO'Mgen Perchlorsäure abgebaut, während einer Zeltspanne von 1 Stunde erhitzt und auf ein Gesamtvolumen von 10 ml mit destilliertem Wasser gebracht worden sind. Das anorganische Phosphat In einer abgebauten Probe wird anhand der optischen Dichte bei 700 nm bestimmt.

wobei eine Standard-KH₂PO₄-Kurve verwendet wird, nachdem 0,5 ml einer l,5«Igen H₂SO₄, 0,5 ml einer 3,3«lgen Ammoniummolybdatlösung und 0,5 ml eines Amldolreagenses zu 3,5 ml der abgebauten Lösung zugesetzt worden sind und die Probe während einer Zeltspanne von 20 Minuten bei 125° C stehen gelassen worden ist

Bemerkung 3: Der Llthlumgehalt wird durch Flammenpnotometrle unter Verwendung eines Jarrell Ash Flame Emission Spektrophotometers, Modell AA-780, bestimmt: C₂H₄ (0,4 kg/cm²), 1,75 1/Mlnute, Luft (U kg/cm²), 9,0 I/Mlnuie, Empfindlichkeit 3,90, Wellenlänge: 2708 A.

Bemerkung 4: Zuordnung der Struktur sowie der Bindeposition des Pyrophosphats zu dem Nukleosid durch NMR-Spektroskopie.

Die Nukleosld-5'-phosphat-3'-(2')-diphosphat-Proben werden in D₂O aufgelöst. Protongeräuschentkupplungs-■ ^l3C-NMR-Spektr*n werden bei 25,2 MHz unter Verwendung eines V arten XL-lOO-15-Spektrophotometers aufgenommen, der unter Einhaltung der Fourier-Umwandlungsmethode bei Zimmertemperatur arbeitet. Alle chemischen Verschiebungen werden unter Bezugnahme auf Dloxan als Innenstandard berechnet.

Protonen-NMR-Spektren werden unter Verwendung der gleichen Vorrichtung aufgezeichnet, die nach der Fourier-Umwandlungsmethode bei 100 MHz arbeitet. Chemische Verschiebungen werden unter Verwendung von 2,2-Dimethyl-2-siiapental-5-sulfonat als Innenstandard aufgezeichnet.

Als vorteilhaft erweist sich ferner, daß neue Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, dl- oder \ri-)3'-(2')-monophosphate zugänglich werden, die auf Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, dl- oder tri-)3'-(2'-)-dlp"nosp« ".te zurückgehen.

Werden Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, dl- oder Ui-) 3'-(2')-dlphosphate In 0,1 η HCl oder 0,1 η NaOH In Gegenwart eines Bariumsalzes während einer Zeitspanne von 1 bis 2 Stunden bei 37° C behandelt und durch eine Kombination aus Adsorption an Aktivkohle, Lösungsmlttelausfällung und Ionenaustauscherharzchromatographle gereinigt, dann lassen sich die neuen Nukleosid-5'-phosphat-(mono-, dl- oder trl-)3'-(2')-monophosphate (H> leicht in Form eines weißen mikrokristallinen Pulvers als Ergebnis der Freisetzung eines Phosphats von der Pyrophosphorylgruppe in der 3'-Stellung der Nukleosld-5'-phosphat-(mono-. dl- oder tri-)3'-(2')-diphosphate herstellen.

Beispiel 1

Ein wäßriges Medium mit der folgenden Zusammensetzung und mit dem nachstehend angegebenen pH wird hergestellt:

Glyzerin	2,0
Polypepton	4,0
KHjPO₄	0,1
K₂HPO₄	0,1
MGSO₄ ■ 7H₂O	0,05
Mn~ (als MnSO,)	2 ppm
Fe~ (als FeSO₄)	2 ppm
pH	7,0

Mono-

Phosphat —CH₂

Adenin
Guanin
Hypoxanthin

(H)

Die folgenden Beispiele erläutern Methoden zur Durchführung der Erfindung. Die Mengenangaben beziehen sich, sofern nichts anderes angegeben Ist. auf das Gewicht.

10

100 ml dieses Mediums werden bei 120° C in einem SOO-ml-Sakaguchi-Schüttelkolben sterilisiert, der mit einer Kultur von Streptomyces aspertgtiloldes ATCC

14808 beimpft wird. Die Inkubation erfolgt bei 28° C während einer Zeitspanne von 2 Tagen auf einer Schüttelvorrichtung. 10 1 dieses Mediums In einem 20-1-Gärungsgefäß aus rostfreiem Stahl werden aseptisch auf 1 Volumen-% der vorstehend beschriebenen wachsenden Kultur beimpft. Die Gärung wird bei 28° C während einer Zeitspanne von 40 Stunden unter Rühren und Belüftung durchgeführt.

Nachdem das Myzel von der Kulturbrühe durch Filtration abgetrennt worden ist, wird Ammoniumsulfat dem

Filtrat (1) zugesetzt, wobei eine 60%ige Sättigung erzielt wird. Die Lösung wird vermischt und über Nacht in der Kälte stehen gelassen. Der erhaltene Niederschlag (2) wird durch Zentrifugieren abgetrennt. In Wasser gelöst und während einer Zeitspanne von 24 Stunden gegen

laufendes Wasser dlalysiert. Dieser Niederschlag, der während der Dialyse auftritt, wird durch Zentrifugieren entfernt. Die dlalyslerte Zubereitung wird auf eine DÄAÄ-Zellulosesäule aufgebracht, die mit einem 0,01 m Acetatpuffer (pH 5,5) äquilibrlsrt wotJen ist. Das Enzym

wird durch die Säule ohne Retention geschickt. Die aktive Fraktion (3) wird auf eine CM-Sephadex C-25-Säule aufgebracht, die mit einem 0,01 m Acetatpuffer (pH 5,5) äquilibrlert worden Ist, der 0,001 m MgCl₂ enthält. Nachdem die Säule mit dem gleichen Puffer gewasehen worden Ist, wird das Enzym linear mit dem gleichen Puffer elulert, der mit 0,1 bis 0,5 m NaCI versetzt wird. Die aktive Fraktion, die mit 0,35 bis 0,45 m NaCl (4) alulert worden Ist, wird durch die Zugabe von Ammoniumsulfat (60%ige Sättigung) konzentriert. Das ausgefällte Enzym wird in einer kleinen Menge eines 0.01 m tris-HCl-Puffers (pH 8,7), der 0,01 m NgCI₂ enthalt, aufgelöst, ausreichend gegenüber dem gleichen Puf-Ter dlalysiert und auf eine DÄAÄ-Sephadex A-50-Säule aufgebracht, die mit 0,01 m tris-HCI (pH 8,7), der 0,01 m

NaCl enthält, äqulllbriert worden Ist. Nachdem die Säule

mit dem gleichen Puffer gewaschen worden ist. wir das

Enzym stufenweise mit 0,02, 0,05 und 0.15 m NaCI

elulert.

Die mit 0.05 m NaCI eluierte Fraktion (5) wird wiederum gegen 0,01 m tris-HCl-Puffer (pH 8.7) dialysiert, auf eine Hydroxylapatlt-Saule, die mit dem gleichen Puffer äquilibrlert worden ist. aufgebracht und mit einem linearen pH-Gradienten (pH 8 bis 9) des Puffers elulert.

Die aktive Enzymfraktion, die bei einem pH-Wert von 9 bis 8,7 (6) elulert worden ist, wird dann auf eine Sephadex-G-75-Säule aufgebracht, die mit 0,05 m Glycln-NaOH-Puffer (pH 9.0). der 0.01 m MgCIj enthält, äqulllbriert warden Ist.

Eine Gelfiltration wird unter Verwendung des gleichen Puffers durchgeführt, wobei eine homogene Enzymlö-

sung (7) erhalten wird. Die Ergebnisse der Enzymreinigung sind In der Tabelle VIII zusammengefaßt:

Tabelle VIII

Aktive
Fraktion

Volumen
m!

Gesamtaktivität,
Einheiten

Gesumtproiein.
OD™

Spezifische
Aktivität

Ausbeute,

(D	10000	245000	252000	0,97	100
(2)	600	80000	32000	2,5	32,5
(3)	1500	75000	7000	10,7	30,6
(4)	800	65000	1850	35,2	26,5
(5)	600	6COO0	720	84,5	24,5
(6)	110	33000	178	186	13,5
(7)	45	19500	25	780	8,0

Falle werden 1000 ml des Kulturfilm- unter Einhaltung

Sirepiomyces morookuensis ATCC 19166 und AeU- der in Beispiel i beschriebenen Rcini'jungsmcihoderi

nomyces violascens ATCC 23968 werden getrennt unter behandelt.. Es werden die in der Tabelle IX angegebenen

den Bedingungen gemäß Beispiel I gezüchtet. In jedem gereinigten Enzyme erhalten:

Tabelle IX	Gesamtaktivitäi, Einheiten	Actinomyces violascens ATCC 23968	Streptomyces morookaensis ATCC 19166
Stamm Nr.	Spezifische Aktivität	31000	42500
Filtrat	Gesamtaktivität, Einheiten	0,81	0,58
		2050	3650
Gereinigtes Enzym		6,6	8,6
Ausbeute, %		1100	960
Spezifische Aktivität

Beispiel 3

Eine Enzymreaktionsmischung folgender Zusammensetzung wird hergestellt:

0.25 m tris-HCL-Puffer (pH 9,0) 160 ml

0.05 m MgCI; 20 ml

ATP ■ 2Na 2.5 g

destilliertes Wasser 20 ml

insgesamt 200 ml

Ein kleiner Kollodiumbeutel, der 10 ml der gereinigten Enzymlösung (spezifische Aktivität: 274. Gesamteinheiten: 465), die von Streptomyces morookaensis ATCC 19166 erhallen worden ist. enthält, wird in die vorstehend beschriebene Reaktionsmischung eingebracht, worauf bei 30⁼ C während einer Zeitspanne von 24 Stunden unter Rühren Inkubiert wird.

100 ml der Reakllonsmischung werden auf das 2fachc Volumen verdünnt, das auf einen pH-Wert von 7,8 unter Verwendung von HCl eingestellt wird. Dann erfolgt eine Adsorption an einer PÄAÄ-Sephadex A-25 (3 χ 55 cm)-Säule. die mit einem 0.01 m tris-HCI-Puffer (pH 7,8) äquilibriert worden Ie;. Die Kolonne wird mit dem gleichen Puffer gewaschen, worauf pppApp mit einem linearen Salzgradienten von 0.r5 bis 0.35 m LlCI In dem gleichen Puffer elulert wird.

Ce Fraktionen Nr. 95 bis 124 (jeweils 20 ml), die mit Salzkonzentrationen von 0,22 bis 0.25 m eluiert worden sind, werden vereinigt, bei 37 bis 42° C im Vakuum konzentriert und dann durch den Zusatz von 5 Volumina •»5 einer Mischung aus Azeton und Äthanol (1:1, bezogen ;iuf das Volumen) ausgefällt. Ein pppApp-Li-Salz wird mit 95 Vol.-"o Äthanol fünfmal gewaschen. Man erhält 1.55 g dieses Salzes nach dem Trocknen im Vakuum.

Beispiel 4

Die Reaktionsmischung besteht aus 250 niMol Glycin-NaOH-Puffer (pH 10.0) in einer Menge von 6.0 ml. 100 rMol ATP in einer Menge von 2.0 ml, 50 mMol MgCI; in einer Menge von 4.0 ml, 100 mMol des in der Tabelle X angegebenen Pyrophosphatakzepio-s in einer Menge von 2,0 ml. destilliertem Wasser in einer Menge von 4.0 ml sowie der Enzymlösung, die bei den verschiedenen Reinigungrstufen der Kulturbrühe von Streptomyces aspergilloides aTCC 14808 erhalten worden ist, in einer Mengu von 6,0 ml, Die Reaktlansmlsehung wird bei 37⁼ C wahrend einer Zeitspanne von 2 Stunden inkubiert, an einer Dowex Ix4-Säule (Cl-Typ) mit einer Abmessung von 1,7 χ 25 cm adsorbiert, wobei die Säule mit 0,01 -η NaCI in 0.01 n HCI äquilibriert worden Ist.

worauf mit einem linearen Gradienten von 0.01 bis .J.5 m NaCI in 0,01 n HCI elulert wird. Fraktionen, die bei Konzentrationen von 0.2 bis 0.25 m NaCI eluiert worden sind, werden vereinigt, mit 0,1 n NaOII auf einen pH-

W ο rt von 7 gebracht und erneut an einer DÄAÄ-Sephadex A-25-Säule (2.2 χ 25 cm) adsorbiert, die mit 0,01 m tris-HCI-Puffer (pH 7.5) äqullibriert worden ist Durch Eluieren mit 0.1 bis 0.3 m LiCI werden Fraktionen mit einer optischen Dichte von 260 nm gesammelt. Sie werden im Vakuum bei 37' C konzentriert. Nach der Zugabe von 10 Volumina eines 99 vol.-%lgen Äthanols wird ein

Tabelle X

weißer Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wird in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst, worauf 5 Volumina eines 90 vol.-%lg<:n Äthanols zur erneuten Ausfällung des Niederschlags zugesetzt werden. Nach dem Trocknen des ausgefällten Niederschlags Im Vakuum wird das In der Tabe le X angegebene Nukleotid-Lithlumsalz erhalten.

Enzymquellen

Spezifische Phosphatdonator Phosphatakzeptor Hauptproclukt Aubeute. Aktivität mg als Lithiumsalz

Gereinigtes Enzym 650 ATP

Gereinigtes Fnzvrn 65Π ATP

Gereinigtes Enzym 650 pppApp

Kulturfiltrat 0,21 ATP

Aktive Fraktion bei 1,95 ATP
einer DAAÄ-Zellulose-Chromatographie

Aktive Fraktion bei 53.5 ATP

einer CM-Sephadex-

Chromatographie

Aktive Fraktion bei 182 ATP

einer DÄAÄ-Sephadex-

Chromatographie

Aktive Fraktion bei 182 dATP

einer DÄAÄ-Sephadex-

Chromatographie

Aktive Fraktion hei 182 ATP

einer DÄAA-Sephadex-

Chromatographie

Aktive Fraktion bei 182 ATP

einer DÄAÄ-Sephadex-

Chromatographie

Aktive Fraktion bei 182 pppApp

einer DAAÄ-Sephadex-

Chromatngraphie

Beispiel 5

Ein gereinigte-· Enzym wird aus dem Kulturfiltrat von Sireptomyces adeohospholyticus ATCC 31122 erhalten, wöbe: die Züchtung unter den Gärungsbedingungen von Beispiel 1 nach den dort beschriebenen Methoden durchgeführt wird. Eine 20fache volumetrische Verdünnung \on 6 ml dieses gereinigten Enzyms (spezifische Aktivität: 1500. 60 Einheiten/mi) wird mit 5 ml eines 1 m tris-HCl-Puffers 'pH 10.0). 500 mg ATP ■ 2Na. 100 mg ADP 2Na. 5.0 ml einer 0.05 m MgCb-Lösung sowie 10 ml destilliertem W"asser während einer Zeitspanne von 2 Stunden bei 3" C inkubiert. Während der Enzymreaktion wird der pH-Wert auf 8.5 durch Zugabe von 1 η NaOH eingestellt. Die Reaktionsmischung wird auf eine DAAÄ-Sephade>. A-25-Säule mit einer Abmessung von 2.2 / 25 cm aufgebracht, die mit einem 0.01 m tris-HCl-Puffer ipH 7.2) äquilibrien worden ist. Die Eluierung erfolgt mn einem linearen Gradienten eines 0.1 bis 0,3 rn LiCl in dem gleichen Puffer, wobei jeweils Fraktionen von 15 mi gesammelt werden. Die erhaltenen pppApp-

pppApp	115
PpApp	87
pppGpp	135
ppGpp	120
ppplpp	62
pApp	85
pppApp	"5
pppApp	125
pppApp	108
pppApp	132
ppGpp	86
pppGpp	125
pGpp	74
pGpp	26

ATP

ADP

GTP

GDP

ITP

AMP

ATP

GDP

GTP

GMP

und ppApp-Fraktionen werden auf '/:n ihres Volumens im Vakuum konzentriert und mit 5 Volumina einer

w Mischung aus kaltem Azeton und Äthanol (9:1, bezogen auf das Volumen) versetzt. Ungefähr 250 mg des durch Filtration erhaltenen Niederschlags weroen in 100 ml Wasser aufgelöst, an einer DÄAA-Sephadex A-25-SäuIe (1,8 χ 35 cm) adsorbiert und dann mit einer 0,15 bis 0.35 m LiCl-Lösung eluiert. D;e pppApp- und ppApp-Fraktionen werden auf Vm ihres Volumens bei 37° C im Vakuum eingeengt, worau" eine Ausfällung durch Zugabe von 5 Volumina einer Mischung aus Kaliumaceton und Äthanol (9:1. bezogen auf das Volumen)

fco erfolgt. Nach einigen Waschungen mit der gleichen Mischung sowie einem Trocknen im Vakuum erhält man 70.5 mg ppApp ■ 6Li und 142 mg ppp"ipp ■ 7Li in Form eines weißen mikrokristallinen Pulvers.

Beispiel 6

Eine Reaktior.smischung. die aus 250 mMol eines Glycin-NaOH-Puffers (pH 10.0) in einer Menge von 6.0 ml. 50 mMol ATP in einer Menge von 4.0 ml.

50 mMol GMP in einer Menge von 4,0 nil. 50 mMol MgCh in einer Menge von 4,0 ml und der Enzymlösung (spezifische Aktivität: 150. 3 Einheiten/ml), erhalten aus Streptoverticilllum septatum ATCC 27464. in einer Menge von 6.0 m! besteht, wird hei 37" C während einer Zeitspanne von 4 Stunden Inkiibiert und auf eine mit Dowc. I χ 4, Cl-Typ. gefüllte Säule mit einer Abmessung von 1,7 χ 20 cm aufgebracht. Dann wird unter Einhaltung eines linearen Gradienten mit 0,01 bis 0.5 ni NaCI In einer 0.01 η HCI eliilert. Fraktionen, die /wischen 0.21 und 0.24 ni NaCI eluieri worden sind, werden zusammengeschüttet und mit einer 0,1 η NaC)II-Lösung neutralisiert und anschließend an einer DAAA-Sephadex A-25-Säule (2.2 χ 25 cm) adsorbiert, die mil einem 0,05 m tris-tlCI-l'uffer (pll 7.5) äquilibrierl worden lsi. 200 ml der pGpp-Fraktion, die mit 0.1 bis 0.3 m LiCI eluiert u irden lsi. werden auf 10 ml im Vakuum konzen-

versetzt. Der erhaltene Niederschlag der pGpp-Lithiumsalzes wird in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und erneut mit W vol.-'Ugem Äthanol ausgefällt. Nach einem Trocknen im Vakuum erhält man 56,2 mg pGpp · 5Li in Form eines weißen mikrokristallinen Pulvers.

Beispiel 7

200 μΜοΙ ATP oder dATP sowie 200 uMol verschiedener Nukleotlde worden unter Einsat/ des gereinigten Enzyms inkubiert, wobei die Reaktionsmischung gemäß Beispiel 4 verwendet und die dort beschriebenen Reaktionsbedingungen eingehalten werden. Jedes Nukleotid wird aus tier Reaktionsmischung nach den in den Beispielen 5 und 6 beschriebenen Isolations- und Reinigungsmethoden gewonnen Die llauptreaktionsprodukte sowie ihre Ausbeute gehen aus der Tabelle Xl hervor.

UlCIl UIIM MtIt I« K WIUMtItUI CI Mt-Λ Tabelle Xl

Phosphatdonator

Phosphatakzeptor Hauptprodukt

Ausbeule,
mg als Li-salz

ATP

dATP

PPPApp

ATP

Λ DP

GTP

GDP

GMP

ITP

IDP

GTP

ADP

GMP

pppApp	132
PPApp	105
pppGpp	140
ppGpp	130
pGpp	52,5
pppipp	74,2
pplpp	25,6
pppGpp	92,5
ppApp	69,3
pGpp	22,5

Beispiel S

Jeweils 2(1 mg der gemäß Beispiel 7 erhaltenen Nukleosid-5'-phosphiit-(mono-. di- oder tri-)3'-diphosphat-Lithiumsalze werden abgewogen und in 20 mg einer 0.25 η HCI aufgelöst, worauf die Lösung bei 37^r C während einer Zeitspanne von 1 Stunde stehen gelassen wird. Nach einer Neutralisation mit einer 0,5-n-KOH-Lösung wird die Lösung durch lonenaustauscherharzsäulen-Chromatographie. Adsorption an Aktivkohle sowie Lösungsmiuelausfällung gemäß den Beispielen 1 und 2 gereinigt. Dabei werden mikrokristalline Pulver der Lithiumsalze gemäß folgender Tabelle erhalten:

Tabelle XII

Ausgangsmaterialien

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Produkte

Ausbeute,
mg als Li-salz

PPPApp	PPpAp	11,2
ppApp	ppAp	13,8
pppGpp	pppGp	9,8
ppGpp	ppGp	7,5
pGpp	pGp	6.3
pppipp	ppplp	4,6

Claims

Patentanspreche:

1. Verfahren zur Herstellung von Purinnukleosld-5'-phosphat-(mono-, di- oder tri-)-3'(2')-diphosphaten der Formel

mXpp,

worin X Adenosin (= A), Guanosin (= G) oder Inosin (= I) bedeudet, m die Anzahl der Phosphatreste in der 5'-Stellung des Nukleosids angibt und eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist, ρ einen Phosphatrest bedeutet, p(CH₂)p einen Methylendiphosphatrest darstellt und das auf X folgende ρ mit der 3'(2')-Pos1!ion von X verknüpft ist, oder von Lithium-, Kalium- oder Natriumsalzen davon, dadurch gekennzeichnet, daß eine Pyrophosphorylgruppe aus der 5'-SteIlung eines Donatornukleotids oder -desoxynukleoilds In die 3'(20-SIeIIuHg eines Akzeptornukleotids dadurch übertragen wird, daß das Donatornuk'.eotid oder -desoxynukleotld und das Akzeptomukleotid mit einer aus Streptomyces adephospholyticus nov. sp. ATCC 31122, Streptomyces aspergilloldes ATCC 14808, Streptomyces morookaensis ATCC 19166, Streptomyces hachijoenis ATCC 19769, Streptoverticililum septatum ATCC 27464 oder Actinomyces vlolascens ATCC 23968 gewonnenen reinen Nukleotidpyrophosphotransferase oder mit der Kulturbrühe eines dieser Stämme oder mit dem Mycel eines dieser Stämme in Kontakt gebracht wird, wobei die Bildung von pppApp aus ATP In Gegenwart von zweiwertigem Metallion erfolgt, und nach Beendigung der Enzymreaktion die erhaltenen PuMinukleosid-S'-phosphat-(mono-, dl- oder tri-)-3'(2')-<"phosphate durch Adsorption an Aktivkohle, Chromatographie unter Verwendung von Anlonen- oder Kationenaustauscherharzen oder Lösungsmittelausfällung isoliert und gereinigt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Doriatornukleotid oder -desoxynukleotid ATP, dATP oder pppApp eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Akzeptomukleotid AMP, ADP, ATP, GMP, GDP, IMP, IDP, ITP, _p(CH₂)ppA oder p(CH₂)ppG eingesetzt wird.