DE1795481B1 - Verfahren zur Herstellung von 8-Azapurinnucleosiden - Google Patents

Description

ν r-% ! » R₂

/ N ~^N-Ri' N" —N

¹⁵ R ^N

in der R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Amino- ^x „

gruppe, R₂ ein Wasserstoff- oder Halogenatom, ³

eine Hydroxy-, Mercapto-, Amino- oder Furfuryl-

aminogruppe, einen Alkylaminorest mit bis zu worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine Aminogruppe, 6 Kohlenstoffatomen oder einen Acylaminorest 20 R₂ ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydroxy-, mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen und R₃ den Ribo- Mercapto-, Amino- oder Furfurylaminogruppe, einen syl- oder Desoxyribosylrest bedeuten, dadurch Alkylaminorest mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen oder gekennzeichnet, daß man ein 8-Azapurin einen Acylaminorest mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen der allgemeinen Formel und R₃ den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest bedeuten.

25 8-Azapurinnucleoside sind bekanntlich nützliche

R₂ und wertvolle chemische oder biochemische Agentien

in enzymatischen und biochemischen Untersuchungen.

Während die natürlich vorkommenden Purinnucleo-

N N side^ _wj_e Adenosin, Guanosin, Xanthosin und Inosin,

-XT 3c sich leicht herstellen lassen, z. B. durch Hydrolyse von

/ N 1 Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren un-

¹ ' ter Bildung eines Gemisches von Nucleosiden und Ab-

trennung der einzelnen Nucleoside mit oder ohne Desaminierung oder durch Dephosphorlyierung von Pur-

mit Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin 35 innucleotiden mit Hilfe von Phosphatase, können die oder den entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-, 2',3'- oder obengenannten 8-Azapurinnucleoside nicht aus Nu-3',5'-Ribonucleotiden oder Adenindesoxyribosid, cleinsäuren hergestellt werden, vielmehr ist dies nur Hypoxanthindesoxyribosid, Guanindesoxyribosid, mit chemischen Synthesen möglich, die viele Reaktions-Cytosindesoxyribosid, Thymindesoxyribosid oder stufen und genaue Einhaltung der Reaktionsbedingunden entsprechenden 3'-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribo- 40 gen erfordern. Bei allen bisher bekannten chemischen nucleotiden oder Gemischen derselben in einem Verfahren zur Herstellung dieser Nucleoside ist es wässrigen Medium vom pH-Wert 4 bis 10 bei schwierig, die Reaktion so zu führen, daß sie an den Temperaturen zwischen 20 und 50⁰C in Gegenwart gewünschten Stellungen der Base und der Ribose oder eines anorganischen Phosphats und in Anwesenheit Desoxyribose stattfindet. Ferner ist die Handhabung eines der folgenden aeroben Bakterienstämme: 45 der labilen Ribose bzw. der noch labileren Desoxyribose . , „ „ .. . , schwierig. Ein zufriedenstellendes Syntheseverfahren

^robacteraerogenes (Kruse) Beijennck _zur Großherstellung von S-Azapurindesoxyribonucleo-

-JNr. bl , . siden ist bisher nicht entwickelt und bekannt geworden.

Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier _{Es wurde nun gefunden? daß sich die} Verbindungen

WKKLJNr. b-yuy, 50 der allgemeinen Formel I leicht in technischem Maß-

9?99 ^em ' ^{Stab dadurch herstellen lassen}'^{daß man ein} 8-Azapurin

Bacillus shaericus Neide USDA-Nr. 344, ^{der alI}S™^{en Formel}

Bacterium cadaveris GaIe et Epps

ATCC-Nr. 9760, ^Rs

Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kott.)

Skaptason et Burkholder ATCC-Nr. 15 391, _N _n

Erwinia aroideae (Townsend) Holland N II

ATCC-Nr. 15 390, _N ~ ^N

Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer) ₅ R₁'

Long et Hammer ATCC-Nr. 8071 und H

Vibrio percolans Mudd et Warren

NRRL-Nr. S 31 _{mit Adenosin;} i_nosin, Guanosin, Uridin, Cytidin oder

oder in Anwesenheit des die Pentosylgruppe über- den entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-, 2',3'- oder 3',5'-Ribotragenden Enzymsystems der genannten Bakterien- 65 nucleotiden oder Adenindesoxyribosid, Hypoxanthinstämme umsetzt. desoxyribosid, Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxy-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- ribosid, Thymindesoxyribosid oder den entsprechenden zeichnet, daß mit Konzentrationen eines anorga- 3'-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribonucleotiden oder Gemi-

3 4

sehen derselben in einem wässrigen Medium vom pH- Mangansulfat, Natriummolybdat und Zinksulfat ver-Wert 4 bis 10 bei Temperaturen zwischen 20 und 50⁰C wendet werden.

in Gegenwart eines anorganischen Phosphats und in Die Bedingungen, unter denen die aeroben Bakterien Anwesenheit eines der folgenden aeroben Bakterien- bebrütet werden, werden vorteilhaft auf die verwende-

s'amme: 5 ten Bakterienspezies und/oder das Kulturmedium ab-

Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck gestimmt. Gewöhnlich wird die Kultivierung bei einer

ATCC-Nr 9621 Temperatur von 20 bis 40 C fur eine Dauer von 6 Ta-

Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier gen durchgeführt _ ,.„,··,

NRRL Nr B 909 ^e §^enannten Stamme von aeroben Bakterien sind

Bacillus brevis Mi^uIa emend. Ford ¹⁰ ** J^r American Type Culture Collection (ATCC)₄

ATCC Nr 9999 Washington, D.C., USA, beim Northern Utilization

Bacillus sphaericus Neide USDA-Nr. 344, Research Branch US. Dept. of Agriculture (NRRL)

Bacterium cadaveris Gale et Epps ATCC-Nr. 9760, ^^0T.^ia' ^m->™£:™^{d b},^{eim US}· ^DeP^{artment of}

Corynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kott.) Agriculture (USDA) hinterlegt.

Skaptason et Burkholder ATCC-Nr. 15 391, ^{15 Fur} _u ^die Pentosylubertragungsreaktion ist die An-

Erwinia aroideae (Townsend) Holland Wesenheit eines Phosphats erforderlich. In den Fallen,

ATCC-Nr 15 390 ⁱⁿ "^enen beispielsweise die Enzymquelle mit dem

Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer) Phosphat verunreinigt ist oder in denen Nucleotide

Long et Hammer ATCC-Nr. 8071 und ^als Pentosyllieferant zusammen mit Phosphomono-

VibriopercolansMudd et Warren NRRL-Nr. S 31 ^{20 esterase} °^^Γ Pyrophosphatase verwendet werden, ist

ein Phosphatzusatz unnötig. Die Phosphatkonzentra-

oder in Anwesenheit des die Pentosylgruppe übertra- tion im Reaktionsgemisch beträgt zweckmäßig 0,1 bis genden Enzymsystems der genannten Bakterienstämme 100 mMol, jedoch kann sich ein zu hoher Phosphatumsetzt. Überschuß nachteilig auf die Bildung der gewünschten

Als Ausgangsstoffe geeignete 8-Azapurine der allge- 25 8-Azapurinpentoside auswirken.

meinen Formel II sind beispielsweise 8-Azahypoxan- Die im Reaktionsmedium angereicherten gewünschthin, 8-Azaguanin, 6-Mercapto-8-azapurin und 6-Bu- ten 8-Azapurinnucleoside der allgemeinen Formel I tyroylamino-8-azapurin. werden nach beliebigen bekannten Methoden, die zur Die als Lieferanten der Ribosyl- oder Desoxyribo- Abtrennung des Produkts von fermentativen Reaksylgruppe genannten Nucleoside und Nucleotide lassen 3° tionen aus dem Reaktionsgemisch oder zur Trennung sich leicht durch Hydrolyse von Nucleinsäuren her- mehrerer ähnlicher chemischer Verbindungen in die stellen. Einzelverbindungen angewendet werden, isoliert. Bei-Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die Kultur- spielsweise kann die Abtrennung durch Ausnutzung brühe der Bakterien unmittelbar als Enzymquelle ge- des Unterschiedes in der Löslichkeit in verschiedenen braucht werden, oder die Zellen können in Form einer 35 Lösungsmitteln zwischen der gewünschten Verbindung Suspension in Wasser, einer Pufferlösung oder einer und den Verunreinigungen, des Unterschiedes in den Salzlösung verwendet werden. Die abgetrennten Zellen Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Lösungskönnen ferner vor der Reaktion einer Vorbehandlung mittelschichten, des Unterschiedes in der Adsorbierbarunterworfen werden, z. B. einer Zerstörung durch keit an Adsorptionsmitteln, wie Aktivkohle oder Beschallen, Mahlen mit Glaskugeln, Behandlung mit 40 Ionenaustauschharzen, des Unterschiedes in der Diaeinem die Zellen zerstörenden Mittel, wie Phenol oder lysierbarkeit durch eine halbdurchlässige Membran Natriumdesoxycholat, oder Waschen mit einem orga- oder des Unterschiedes in der Kristallisierbarkeit aus nischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthylacetat. einem Lösungsmittel sowie durch Filtration oder Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch so durch- Zentrifugieren des Reaktionsgemisches mit oder ohne geführt werden, daß man die genannten aeroben Bak- 45 Zusatz von Filterhilfsstoffen erfolgen. In der Praxis terien unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten werden diese Methoden zur Trennung oder Isolierung Kulturmedium züchtet, das beide Ausgangsstoffe ent- je nach der gewünschten Reinheit und dem Zustand hält. der Produkte in Kombination oder wiederholt durch-

Die Kultivierung der Bakterien erfolgt in einem geführt.

geeigneten Kulturmedium unter aeroben Bedingungen. 50 In den folgenden Beispielen beziehen sich die Pro-

Das Kulturmedium muß assimilierbare Kohlenstoff- zentsätze auf das Gewicht,
quellen und Stickstoffquellen für die verwendeten

Bakterien enthalten. Zweckmäßig ist der Zusatz von Beispiel 1
anorganischen Salzen und Spurenelementen. Als Nährstoffe für die Kultivierung kommen die allgemein zu 55 200 ml einer wie unten angegeben hergestellten diesem Zweck verwendeten Stoffe in Frage. Geeignete Zellsuspension wurden 10 Minuten beschallt (10 kHz, Kohlenstoff quellen sind beispielsweise Stärke, lösliche 100 W) und anschließend zur Entfernung von Fest-Stärke, Dextrin, Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose stoffen zentrifugiert. Der Überstand wurde zu einer und Glycerin. Geeignete Stickstoff quellen sind bei- Lösung von 1,52 g 8-Azaguanin und 7,32 g Uridin in spielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakte, Soja- 60 4 Liter einer 0,05molaren Kaliumdihydrogenphosphatbohnenmehl, Maisquellwasser, Gluten, Natriumgluta- Pufferlösung gegeben. Das Gemisch wurde 180 Minumat, Harnstoff, Ammoniumsalze, z. B. Ammonium- ten bei 37°C stehengelassen und dann 10 Minuten auf chlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Am- 90⁰C erhitzt. Es wurde dann zur Entfernung der gemoniumlactat, und Nitrate, z. B. Natriumnitrat und bildeten Fällung filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde Kaliumnitrat. Weitere anorganische Salze sind bei- 65 mit Salzsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt und durch spielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Na- eine Aktivkohlesäule geleitet. Nach dem Waschen mit triumchlorid und Calciumchlorid. Als Spurenelemene, 0,01 η-Salzsäure wurde die Aktivkohlesäule mit können Borsäure, Kupfersulfat, Eisen(III)-chloritd 5 %igem Äthanol, das 4 % Ammoniak enthielt, eluiert.

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Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, auf den pH-Wert 9,6 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit einem stark basischen Ionenaustauscherharz (Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymeres, fonnialfonn) gefüllt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Säule mit 0,1 n-Ameisensäure eluiert. Das Eluat wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit Aktivkohle gefüllt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Aktivkohlesäule mit 50%igem Äthanol, das 4% Ammoniak enthielt, eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde aus Wasser kristallisiert, wobei 960 mg 8-Azaguaninrobosid (Schmelzpunkt 250 bis 252°C, Zersetzung) erhalten wurden.

Die benötigte Zellsuspension wurde folgendermaßen hergestellt:

Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATCC-Nr. 9621 wurde über Nacht bei 28⁰C auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur kultiviert, die 1 % Glucose enthielt. Fünfundzwanzig 200-ml-Kolben, die je 40 ml eines wäßrigen Kulturmediums enthielten, wurden mit den Zellen beimpft, wobei jeweils eine Übertragung mit einer Öse vorgenommen wurde. Das Medium bestand aus Dextrin (20,0 g), Polypepton (10,0 g), Fleischextrakt (10,0 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,0 g), Natriumchlorid (5,0 g) und sterilisiertem Leitungswasser (1 1) und war auf den pH-Wert 7,2 eingestellt. Das beimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28⁰C unter Schütteln bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit 0,8%iger wäßriger Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert.

Beispiel 2

Ein Gemisch aus 200 ml einer 0,005molaren wäßrigen Lösung von 8-Azaguanin bzw. 8-Azahypoxanthin, 500 ml einer 0,01molaren wäßrigen Lösung von 5'-Thymidylsäure, 100 ml einer l,0molaren Acetatpufferlösung vom ph-Wert 5,75, 50 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Zellsuspension und 150 ml Wasser wurden 120 Minuten bei 37⁰C gehalten. Die Isolierung des 8-Azaguanin-desoxyribosids bzw. des 8-Azahypoxanthin-desoxyribosids aus dem Reaktionsgemisch erfolgt analog zu der Verfahrensweise des Beispiels 1. Es wurden 21 mg 8-Azaguanin-desoxyribosid bzw. 20 mg 8-Azahypoxanthin-desoxyribosid erhalten.

Die erhaltenen Desoxyriboside zeigten die typische blaue Farbreaktion mit Diphenylamin gemäß einer Untersuchungsmethode für Nucleinsäuren (s. »The Nucleic Acids, Chemistry and Biology«, Bd. 1, S. 287 bis 289). Die molaren Absorptionskoeffizienten der entsprechenden Reaktionsprodukte werden wie folgt angegeben:

8-Azaguanin-desoxyribosid
250 ταμ = 12,5
278 ταμ = 6,5

-¹ · cm-¹ (0,01 n-HCl)

-¹ · cm-¹ (0,01 n-NaOH)

8-Azahypoxanthin-desoxyribosid

255 ταμ = 9,6 · 10³M-¹ · cm-¹ (0,01 n-HCl)
275 ταμ = 10,5 · 10³M-¹ · cm"¹ (0,01 n-NaOH)

ORIGINAL INSPECTED

Claims (1)

1 2 nischen Phosphats im Reaktionsmedium zwischen Patentansprüche: etwa 0,1 und 500 mMol gearbeitet wird.

1. Verfahren zur Herstellung von 8-Azapurin-

nucleosiden der allgemeinen Formel 5

R₂ Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung

j von 8-Azapurinnucleosiden der allgemeinen Formel