DE1795480A1 - Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von PurinnucleosidenInfo
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Description
DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖN WALD
DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM. ALEK VON KREISLER DIPL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLDPSCH
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den-15.4.1969
Fu/Ax/Hz
27, Doshomachi 2-ohome, Higashi-ku, Osaka (Japan).
Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden
(Ausscheidung A)
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
von Purinnucleosiden, die nicht natürlich vorkommen. Die gemäß der Erfindung hergestellten Purinnucleotide haben
die Formel τ?
J3H (I)
worin Ryj eine Hydroxylgruppe oder Aminogruppe ist, H2 für
ein Wasserstoff atom, ein Halogenatom, eine Mercaptogruppe, Aminogruppe, eine niedere Alkylaminogruppe, eine Furfurylaminogruppe
oder niedere Acylaminogruppe und R^ für Ribosyl
oder Desoxyribosyl steht, wobei der niedere Alkylrest bis
zu 6 Kohlenstoffatome und der niedere Acylrest bis zu
7 Kohlenstoffatome enthält. Purinnucleoside, die gemäß der
Erfindung hergestellt werden können, sind beispielsweise 2-Aminopurinribosid, 2,6~Diaminopurinribosid, Isoguaninribosid
und die entsprechenden Desoxyriboside. Diese Purinnucleoside
kommen in der Natur nicht vor.
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Die vorstehend genannten, nicht natürlich vorkommenden Purinnucleoside sind bekanntlich nützliche und wertvolle
chemische bzw. biochemische Agentien in enzymatisehen und
biochemischen Untersuchungen. Während die natürlich vorkommenden Purinnucleoside, z.B. Adeno sin, Guano sin, Xanthosin
und Inosin, sich leicht herstellen lassen, z.B. durch Hydrolyse von Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren
unter Bildung eines Gemisches von Nucleosi<|en
und Abtrennung der einzelnen Nucleoside mit oder ohne Desaminierung
oder durch Dephosphorylierung von Purinnucleor tiden mit Hilfe von Phosphatase, können die oben genannten,
nicht natürlich vorkommenden Purinnucleoside nicht aus Nucleinsäuren hergestellt werden, vielmehr ist dies nur
mit chemischen Synthesen möglich, die viele Reaktionsstufen und genaue Einhaltung der Reaktionsbedingungen erfordern. Bei allen bisher bekannten chemischen Verfahren
zur Herstellung dieser Nucleoside ist es schwierig, die Reaktion so zu führen, daß sie an den gewünschten Stellungen
der Base und der Ribose oder Desoxyribose stattfindet.
Ferner ist die Handhabung der labilen Ribose oder der noch
labileren Desoxyribose schwierig. Ein zufriedenstellendes
Syntheseverfahren zur Großherstellung von Purindesoxyna--cleosiden
ist bisher nicht bekannt geworden* <.
Es wurde nun gefunden, daß viele aerobe Bakterien Enzym-,,
systeme bilden, die in der Lage sind, eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe eines Nucleoside in die 9· Stellung .
einer Purinbase zu überführen unter Bildung eines Purin- . nucleoside, dessen Base der verwendeten Purinbase entspricht.
Es wurde ferner gefunden, daß die zur Überführung,
der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe fähigen Enzymsysteme
wenigstens eine Art von Phosphorylase enthalten, weil: d?.e
Anwesenheit eines Phosphats für die Wirkung der Enzymsysteme notwendig ist. , -ks */-,'
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Auf der Grundlagt dieser Erkenntnisse werden gemäß der Erfindung die oben genannten, nicht natürlich vorkommenden
Purinnucleoside, insbesondere Purindesoxyribonucleoside, der Formel (I) aus der entsprechenden Purinbase durch die
Wirkung des Enzycsyctess von aeroben Bakterien hergestellt,
wobei reichlich und billig erhältliche Nucleoside oaer Nucleotide als Lieferant der Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe, d.h. der Pentoeylgruppe, für die ßynthetisierung
der gewünschten wertvollen Nucleoside eingesetzt werden. Die Erfindung ermöglicht leicht unter milden enzymaticchen
Bedingungen die Großherstellung der nicht natürlich vorkommenden Purindesoxyribonucleoside, die nach den bisher
bekannten Verfahren schwierig im technischen Maßstab herzustellen waren·
Natürlich vorkommende Nucleoside oder Nucleotide lassen
sich leicht durch Hydrolyse von Nucleinsäuren herstelle: . Einige Purin-51-nucleotide werden beispielsweise als WU^;an
verwendet, während die Pyrimidinnucleotide bei weitem nicht
das Interesse gefunden haben wie die wertvollen Purinnucleotide. Diese weniger wertvollen Pyrimidinnuolecac
eignen sich natürlich gut als Ausgangematerial für ab :rfahren gemäß der Erfindung, d.h. als Lieferant der Hibo blöder Deeoxyribosylgruppe· Ale Lieferant der Ribosylgruppu
kommen beispielsweise Ribonucleoside (z.B. Adenoain, Inosin, Guanoein, Uridin und Cytidin) und die diesen Ribonucleoeiden entsprechenden 21-, 3'-» 5'-» 2',3'~ oder
3',5'-Hibonucleotide in Frage, während als Lieferanten
einer Decoxyriboaylgruppe beispielsweise Desoxyribonucleoside (z.B. Adenindesoxyribosid, Hypoxanthin^Desoxyribosid,
Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxyribosid und Thymindesoxyribosid) und die diesen Desoxyribonucleosiden entsprechenden 3'-i 5'- oder 3't^'-Desoxyribonucleotide geeignet
sind. Diese Nucleoside und/oder Nucleotide können natürlich auch als Getnisoh eingesetzt werden und brauchen nicht
rein zu sein·
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Das andere Ausgangsmaterial ist die Purinbase, die der Basenkomponente des gewünschten Purinnucleoside entspricht,
und auf die eine Ribosyl- oder Desoxyribosylgruppe übertragen wird. Diese Purinbase hat die allgemeine Formel
GH (II)
in der R,- und Rp d-ie gleiche Bedeutung wie in der Formel
(I) haben· Geeignete Purinbasen sind beispielsweise 2,6-Diaminopurin,
2-Aminopurin, 2-Amino-6-acetylaminopurin und Isoguanin.
Die aeroben Bakterien, die das gewünschte Enzymsystem zu bilden vermögen, sind ohne Rücksicht auf die Klassifizierung
weit verbreitet und kommen beispielsweise in den Gattungen Aerobacter, Aeromonas, Bacillus, Bacterium, Corynebacterium,
Erwinia, Escherichia, Proteus,Pseudomonas,
Salmonella, Serratia und Vibrio vor. Für die Zwecke der Erfindung werden beispielsweise die folgenden Spezies bevorzugt:
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck; Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier;
Bacillus brevis Migula emend. Ford; Bacillus sphaericus Neide;
Bacterium cadaver!s Gale et Epps;
Bacterium cadaver!s Gale et Epps;
Qorynebacterium sepedonicum (Spiek. et Kott) Skaptason et
Burkholder;
Erwinia aeroideae (Townsend) Holland;
Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer) Long et Hammer;■
Vibrio percolans Mudd et Warren.
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Bei» Vorfahren gesuü dor Erfindung kann die Kulturbrühe
der Bakterien unmittelbar als Enzymquelle gebraucht werden, oder die Zellen können in Form einer Suspension in Wasser,
einer Pufferlösung oder einer Salzlösung verwendet werden· Die abgetrennten Zellen können ferner vor der Keaktion
einer Vorbehandlung unterworfen werden, z.B. einer Zerstörung durch Beschallen, Mahlen mit Glaskugeln, Behandlung
nut einea die Zellen zerstörenden Mittel wie Phenol, Natriuxdesoxycholat
usw. oder Waschen mit einem organischen ■ Lööungsxittel wie Aceton oder Äthylacetat. Das Verfahren
geaiiß der Erfindung kann auch so durchgeführt werden, daß can die genannten aerouen Bakterien unter aeroben Bedingungen
in einem geeigneten Kulturmedium züchtet, das beide AuGgangsaaterialien enthält·
Die Kultivierung der Bakterien erfolgt in einem geeigneten
Kulturmedium unter aeroben Bedingungen. Das Kulturmedium muß assimilierbare Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen
für die verwendeten Bakterien enthalten. Zweckmäßig ist
der Zuß-atz von anorganischen Salzen und Spurenelement i..
'Als Nährstoffe für die Kultivierung kommen die allgemein
zu diecea Zweck verwendeten Stoffe in Frage. Goeign- *.e
Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Stärke, lö0l:c..t
Starke, Dextrin, Glucose, Saccharose, Lactose, ^altcn*. und
Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakte, Sojabohnenmqhl, Iwaisquellwasser,
Gluten, ICatriumglutamat, Harnstoff, Ammoniumsalze (z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat
und Ammoniumlactat) und Nitrate (z.B. Natriumnitrat und Kaliumnitrat). Weitere geeignete anorganische S?.l»e
sind beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, .natriumchlorid
und Calciumchlorid. Als Spurenelemente können Borsäure, Kupfersulfat, Eisen(III)-chlorid, Mangansulfat,
Natriummolybdat und Zinksulfat verwendet werden.
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Di« Bedingungen, unter denen die aeroben Bakterien bebrütet
werden, werden vorteilhaft auf die verwendeten Bakterienspezies und/oder das Kulturmedium abgestimmt· Gewöhnlich
wird die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40°G
1 bis
f^r eine Dauer von/6 Tagen durchgeführt.
f^r eine Dauer von/6 Tagen durchgeführt.
Beim Verfahren gemäß der Erfindung werden die gewünschte
Purinbase der allgemeinen Formel (II) einerseits und ein
oder mehrere Nucleoside und/oder Nucleotide als Lieferant
einer iübosyl- bzw. Desoxyriboaylgruppe andererseits mit
den Bujcterienzellen oder dem durch die Bakterien gebildeten
ilnzyasystem zusammengeführt. Bei dieser Reaktion wird der
p..-V.'ert des Mediums vorzugsweise zwischen etwa 4 und 10
gehaltent jedoch kann in einigen Fällen ein p^-Wert von
5|0 bis 8,0 erforderlich sein. Die Temperaturen liegen i-rewöhnlich
im Bereich von etwa 20 bis 500C.
Ks ist zu betonen, daß für die Pentosylübertragungsreaktidn
die Anwesenheit eines Phosphats erforderlich ist. In einigen
Fällen, in denen beispielsweise die Enzymquelle mit de» Phosphat verunreinigt ist, oder in denen Nucleotide ala
Pentosyllieferant zusammen mit Phosphomonoeateraae oder
Pyrophoephatase verwendet werden, ist jedoch der Phosphatzusatz
unnötig. Die l'hosphatkonzentration im Beaktionr.?emisch
beträgt zweckmäßig 0,1 bis 100 mliol, jedoch kanr. sich
ein zu hoher Phosphatüberschuß nachteilig auf die Bildung der gewünschten Purinpentoside auswirken·
Die im'Reaktionsmodium angereicherten gewünschten Purinnucleoside
werden nach beliebigen bekannten Methoden, die zur Abtrennung des Produkts von fermentativen Reaktionen
aus dem Reaktionsgemisch oder zur Trennung mehrerer ähnlicher chemischer Verbindungen in die Einzelverbindungen angewendet
werden, isoliert. Beispielsweise kann die Abtrennung durch Ausnutzung des Unterschiedes in der Löslichkeit
in verschiedenen Lösiingsmitteln zwischen, der gewünschten
Verbindung und den Verunreinigungen, des Unter-
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; -»<
8AD ORIGINAL
cchiedes in den Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Löcun;-:3=it.telEChichi;en, des Unterschiedes in der Adsorbierbarkeit
an Adsorptionsmittel wie Aktivkohle oder lonenaußtauschharzen, des Unterschiedes in der Dialysierbarkeit
durch eine halbdurchläcsige Membran oder des Unternchiedes
in der Kristallisierbarkeit aus einem Lösungsmittel
rowie durch Filtration oder Zentrifugieren des Reaktionc^e^isches
mit oder ohne Zusatz von Filterhilfsstoffen erfolgen. In der Praxis werden diese Methoden zur Trennung
oder Isolierung ^e nach der gewünschten Reinheit und dem
Zuntand der Produkte in Kombination oder wiederholt durch-
In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze
auf das Gewicht. Die bei den Versuchen verwendeten S^ ...me
von aeroben Bakterien sind bei der American Type CuI;..re
Collection (ATCC), '.Vashington, D.C, USA1 beim Northern
utilization Research Branch, U.S.Dopt.of Agriculture (KIiHL),
Peoria, 111., USA, und beim U.S.Department of Agriculture
(USDA) hinterlegt und tragen die HinterlegungBnummern, die
aus den oben genannten Abkürzungen mit einer Zahl bestehen·
Aorobacter aerogeneB (Kruse) Beijerinck (ATCC-9621) wurde
über Kacht bei 280C auf einer Bouillon-Agar-^chrugku"; iur
kultiviert, die 1;v Glucose enthielt. Fünfundzwanzig kOO ml-Kolben,
die je 40 ml eines wässrigen Kulturmediums enthielten,
wurden mit den Zellen beimpft, wobei jeweils eine übertragung mit einer öse vorgenommen wurde. Das I/.edium
bestand aus Dextrin (20,0 g), Polypepton (10,0 g), F'oischextrakt
(10,0 g), DikaliumhydrogenphOBphat (1,0 g), natriumchlorid
(5»0 g) und sterilisiertem Leitungswasser (1 1) und war auf p^. 7,2 eingestellt. Das beimpfte I/.edium
wurde 2 Tage bei 28 C unter Schütteln bebrütet. Koch der Bebrütung wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung
der Zellen zentrifugiert. Die Zollen wurden mit 0,8%iger
wässriger Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der
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- ^JC =^ BAD
Enzymquelle in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus einer wässrigen Lösung (0,2 ml, die 5 der in Tabelle 1 genannten Base enthielt, einer wässrigen
Lösung (0,5 ml), die 10 mMol 5I-Thymidylsäure enthielt,
einer 1,0-molaren Acetatpufferlösung (0,1. ml) vom pH 5»75j
der in der beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle (0,05 ml) und Wasser (0,15 ml) wurde 60 bzw. 120 Minuten
| Tabelle | 1 | Umsatz | 2 | 120 Minuten |
| Minuten | 9 | 74,2 | ||
| 60 | 68, | 76,0 | ||
| 68, | ||||
| 2 | ||||
| Beispiel |
bei 37°G gehalten, worauf der Umsatz der Basen zu den entsprechenden
Desoxyribosiden in Prozent ermittelt wurde.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 genannte
Base
2,6-Diaminopurin
2-Aminopurin
Vibrio percolans Mudd et Warren (NEEL, S-31) wurde über
iecht bei 280C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden
kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Mit den Bakterienzellen wurde 1 1 eines Kulturmediums geimpft, das die gleiche
Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium hatte. Anschließend wurde 2 Tage bei 280G unter Schütteln
kultiviert. Danach wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit
einer 0,8%igen wässrigen Kochsalzlösung gewaschen und in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert, um die Enzymquelle
herzustellen.
Ein Gemisch von 10 ml einer wässrigen Lösung, die 20 mMol 2-Aminopurin bzw. 2,6-Diaminopurin enthielt, 10 ml einer
wässrigen Lösung, die 50 mMol Thymidin enthielt, 2 ml einer
wässrigen Lösung, die 0,5 Mol Dikaliumhydrogenphoephat enthielt,
8 ml einer 0,5-molaren tris-Pufferlösung vom p^-Wert
8,0 und 10 ml der oben genannten Enzymquelle wurde 2 Stunden bei 37°G gehalten, wobei 90% des 2-Aminopurins bzw.
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82% des 2,6-Diaminopurins in die entsprechenden Desoxyribonucleoside
umgewandelt wurden.
Erwinia aeroideae (Townsend) Holland (ATCC-15390) wurde
2 Tage bei 280C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden
kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium (250 ml) in einem 1 1-Kolben wurde mit den Zellen geimpft
(7ösen). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium. Anschließend wurde
4- Tage bei 280O unter Schütteln bebrütet. Danach wurden
200 ml der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einer 0,8%igen Kochsalzlösung
gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert»
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die 5 mMol
der in Tabelle 2 genannten Basen enthielt, 0,5 ml einer
wässrigen Lösung, die 5 mMol Inosin enthielt, 0,1 ml einer 1-molaren Acetatpufferlösung vom pjr-Wert 5»75 (die 10 mMol
Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde
120 Minuten bzw. 60 Minuten bei 37°C gehalten, worauf der Umsatz der Basen zu den entsprechenden Ribosiden ermittelt
wurde. Die in Tabelle 2 genannten Ergebnisse wurden erhalten.
Tabelle 2
Base Umsatz, %
60 Minuten 120 Minuten
2,6-Diaminopurin 62 90
2-Aminopurin 49 54-
Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wurde eine Enzymquelle
aus Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck (ATCC-9621
hergestellt.
Ein Gemisch aus 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die 5 mMol
der in Tabelle 3 genannten Basen enthielt, 0,5 ml einer
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wässrigen Lösung, die 5 mMol Guanosin enthielt, 0,2 ml
einer 1-molaren Acetatpufferlösung vom p^-Wert 5»9 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat enthielt) und 0,1 ml der
in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 80 Minuten bei 37°O gehalten, worauf der Umsatz der
Basen zu den entsprechenden Ribosiden halbquantitativ durch Papierchromatographie bestimmt wurde. Die Ergebnisse
sind nachstehend in Tabelle 3 genannt·
Tabelle 3
Base Umsatz*
2,6-Diaminopurin
2-Aminopurin
2-Aminopurin
* Der Umsatz ist mit +++ bezeichnet, wenn er in der gleichen Höhe lag wie bei der Umwandlung von Adenin in Adenosin
(etwa 78%). Ein geringerer Umsatz ist $e nach der
visuellen Dichte der Farbe unter UV-Licht auf dem Chromatogramm mit ++ oder + ausgedrückt·
Erwinia aroideae (Townsend) Holland (ATCO-15390) wurde über
Nacht bei 280G auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährbodeii
kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium (250 ml) in einem 1 1 -Kolben wurde mit den Zellen (1 öse)
geimpft. Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium. Die Kultivierung wurde
4 Tage bei 280O auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung
durchgeführt. Dann wurden 200 ml der Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit
einer 0,8%igen wässrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung einer Enzymquelle in 50 ml destilliertem Wasser
suspendiert·
Ein Gemisch aus 50 ml einer wässrigen Lösung, die 5 »Mol
2,6-Diaminopurin enthielt, 10 ml einer wässrigen Lösung,
die 10 mMol 5'-Cytidylsäure enthielt, 10 ml einer wässrigen
Lösung, die 10 mMol 5LUridylsäure enthielt, 100 ml einer
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BAD
0,2-molaren Έτιs-Maleat-Pufferlösung vom pH-Wert 5,6 und
50 ml der oben genannten Enzymquelle wurden 15 Minuten bei 37°C gehalten, wobei 38,8% des 2,6-Diaminopurins in 2,6-Diaminopurinribonucleosid
umgewandelt wurden.
Die gemäß Beispiel 5 hergestellte Enzymquelle wurde verwendet.
Ein Gemisch aus 0,5 ml einer wässrigen Lösung, die 5 mMol
Uridin enthielt, 0,2 ml einer wässrigen Lösung,die 5 mMol
2-Aminopurin enthielt, 0,1 ml einer 1-molaren Acetatpufferlösung vom pH~Wert 5»75 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat
enthielt) und 0,2 ml der Enzymquelle wurde 120 Minuten bei 37°C gehalten, wobei 5^% des 2 Aminopurins
in 2-Aminopurinribosid umgewandelt wurden.
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck (ATCC-9621) wurde
über Nacht bei 28°C auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden kultiviert, der 1% Glucose enthielt. Ein Kulturmedium
(100 ml) in einem 500 ml-Kolben wurde mit den Zellen
geimpft (1 Öse). Das Medium hatte die gleiche Zusammensetzung wie das in Beispiel 1 verwendete Medium. Die Zellen
wurden 2 Tage bei 280G unter Schütteln bebrütet. Die Zellen
wurden abgetrennt, mit einer 0,8%igen wässrigen Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in
destilliertem Wasser suspendiert (80 ml).
Ein Gemisch aus 0,5 ml einer wässrigen Lösung, die 5 mMol
Uridin enthielt, 0,2 ml einer wässrigen Lösung, die 5 mMol 2,6-Diaminopurin enthielt, 0,1 ml einer 1-molaren Acetatpufferlösung
vom pjj-Wert 5,75 (die 10 mMol Kaliumdihydrogenphosphat
enthielt) und 0,2 ml der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Enzymquelle wurde 120 Minuten bei
57°C gehalten, worauf 87% des 2,6-Diaminopurins in 2,6-Diaminopurinribonucleosid
umgewandelt wurden.
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Die in Tabelle 4 genannten Mikroorganismen wurden über
Nacht bei 280O auf einem Bouillon-Agar-Schrägnährboden
kultiviert, der Λ% Glucose enthielt. Mit den Zellen (1 öse)
wurde ein Kulturmedium (40 ml) geimpft, dae die gleiche Zusammensetzung
wie das in Beispiel 1 verwendete Kulturmedium hatte. Die Kultivierung wurde 2 Tage bei 28°0 unter
Schütteln durchgeführt. Die Zellen wurden abgetrennt und mit einer 0,8%igen wässrigen Kochsalzlösung gewaschen und
zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (50 ml) suspendiert.
Ein Gemisch aus einer wässrigen Lösung (1,0 ml), die 5 mMol der in Tabelle 4 genannten Purinbasen enthielt, einer wässrigen Lösung (2,5 ml), die 5 mMol Oytidindesoxyribosid enthielt,
einer 0,5-molaren Tris-Pufferlösung (1 ml) vom Pjt-Wert
7,5 (die 10 mMol Phosphatpufferlösung enthielt) und der oben genannten Enzymquelle (0,5 ml) wurde 60 Minuten
bei 570O gehalten.
Nach der Reaktion wurde der p„-Wert des Gemisches mit Essigsäure
unter Kühlung mit Eis auf 5iO eingestellt. Die
gebildete Fällung wurde durch Zentrifugieren entfernt. Zur oben stehenden Flüssigkeit (2 ml) wurde Aktivkohle (500 mg)
gegeben. Das Gemisch wurde 1 Stunde mit Eis gekühlt. Die Aktivkohle wurde durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Wasser
gewaschen und mit einer 5%isen wässrigen Perchlörsäurelösung
(5 ml) zusammengegeben. Das Gemisch wurde 60 Minuten gekocht und dann zentrifugiert, wobei die oben etehende
Flüssigkeit abgetrennt wurde. Die erhaltene Fällung wurde mit einer 5%igen wässrigen PerchlorBäurelösung gewaschen·
Die Waschflüssigkeit wurde mit der in der oben beschriebenen Weise erhaltenen oben stehenden Flüssigkeit vereinigt·
Der Umsatz jeder Purinbase in das entsprechende Desoxypurinnucleosid
wurde durch Umsetzung mit Diphenylamin und anschließende Kolorimetrie bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse
sind in Tabelle 4 genannt.
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t& ...„,.,,. ^pAO QßJßUOAL
Mikroorganismen Umsatz (%) von
6-Chlor- 2-Amino- 2,6-Di- laopurin
purin amino- guanin purin
(A) Aerobacter aeropenes (Kruses Beijerinck
(ATOO-9621) 84 - - 27,5
(B) Erwinia aeroideae (TownsendJ Holland
(ATCO-15390) 10,5 - - 55
(G) Pseudomonas putre-Taciens
(Ρ·6τ Η.Long
et Hammer (ATOO-8071) 88 - - 29,5
et Hammer (ATOO-8071) 88 - - 29,5
(D) Aeromonaa hydropbila
(Chester) Stanier
(HEEL, B-909) 57,5 68 59
(Chester) Stanier
(HEEL, B-909) 57,5 68 59
Bfcillus brevis
31gula emend.Ford
(AüJGO-9999)
(F) Bacillu» aphaericus
Neide tUSDA-344;
| 27, | 5 | 42 | 42 |
| 43 | 71 | 70 | |
| 54 | 68 | 62 |
(H) Corynebacterium aepedonicuM
(Sp*et K.)
Skaptason et Burkholder (ΑΤσσ-15391) 28 46 47
Skaptason et Burkholder (ΑΤσσ-15391) 28 46 47
Das Zeichen " - " bedeutet, daß die Verbindung nicht getestet
wurde·
Auf die in Beispiel 8 beschriebene Weise wurden verschiedene Purinbasen mit Uridin an Stelle von Oytidindesoxyribosid
umgesetzt, wobei die in Tabelle 5 genannten Ergebnisse erhalten wurden· Mit den Buchstaben sind die gleichen
Mikroorganismen wie in Tabelle 4 bezeichnet*
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Umsatz (%) von
ABGDEgGH
Isoguanin 28 52 29 -
2-Aminopurin 87 55 77 62 48
2,6-Diaminopurin - - - 78 49 72 59 45
Das Zeichen " - " bedeutet, daß die Verbindung nicht
getestet wurde.
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Claims (1)
1. Verfahren zur Herstellung von Purinnucleosiden der allgemeinen Formel I
R2
R2
in der R1 die Hydroxyl- oder Aminogruppe, R0 ein Wasserstoff-
oder ein Halogenatom, eine Mercapto-, Amino-, Niederalkylamino-, Furfurylamino- oder Niederacylaminogruppe
und R., den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest bedeuten und
hierbei der Niederalkylrest bis zu 6 Kohlenstoffatome und der Niederacylrest bis zu 7 Kohlenstoffatome enthält, dadurch
gekennzeichnet, daß man eine Purinbase der allgemeinen Formel II
R2
R2
in der R, und Rp die oben angegebene Bedeutung haben mit
Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin oder den entsprechenden 21-, y~, 51-, 2\y~ oder J5' ,5'-Ribonucleotiden
oder AdenindesöxyriBosidj Hypoxanthindesoxyribosid,
Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxyribosid, Thymindesoxyribosid oder den entsprechenden ~5X-, 51- oder 2',5'-DeS-oxyribonucleotiden
oder Gemischen derselben in einem wässrigen Medium vom p„-Wert 4-Io bei Temperaturen zwischen 2o
und 5o°C in Gegenwart eines Phosphatide ines die Pentosylgruppe
übertragenden Enzymsystems der folgenden aeroben Bakterienstämme:
20981 1/1731
Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier
Bacillus brevis Migula emend. Ford
Bacillus sphaericus Neide
Bacterium cadaveris Gale et Epps
Corynebacterium sapedonicum (Spiek. et Kott.) Skaptason et Burkholder
Erwinia aroideae (Townsend) Holland Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer) Long et Hammer
Vibrio percolans Mudd et Warren
umsetzt.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Konzentrationen eines anorganischen Phosphats im Reaktionsmedium zwischen etwa o,1 und 5oo mMol gearbeitet wird.
209811/1731
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1463463 | 1963-03-18 | ||
| JP1463563 | 1963-03-18 | ||
| JP1463563 | 1963-03-18 | ||
| JP1463463 | 1963-03-18 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1795480A1 true DE1795480A1 (de) | 1972-03-09 |
| DE1795480B2 DE1795480B2 (de) | 1976-05-13 |
| DE1795480C3 DE1795480C3 (de) | 1977-01-13 |
Family
ID=
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE1795481B1 (de) | 1972-09-07 |
| GB1063951A (en) | 1967-04-05 |
| DE1470360B2 (de) | 1976-07-15 |
| DE1470360A1 (de) | 1969-11-13 |
| DE1795480B2 (de) | 1976-05-13 |
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