DE1570022B1

DE1570022B1 - Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation von Mikroorganismen in einem waessrigen Naehrmedium

Info

Publication number: DE1570022B1
Application number: DE1965K0055489
Authority: DE
Inventors: Toshio Komuro; Masanaru Misawa; Takashi Nara
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1964-03-09
Filing date: 1965-03-09
Publication date: 1972-02-03
Also published as: CH434270A; ES310296A1; NL6502983A; DE1695329B1; FR1451267A

Description

Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium sind zwar z. B. aus den französischen 849 519 und 1301052 bekannt, jedoch werden hierbei nur geringe Ausbeuten erhalten.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit einem in guten Ausbeuten und-im-Industriemaßstab durchführbaren Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden, wie 5'-Inosinsäure, 5'-Xanthylsäure; 5'-Guanylsäure oder 5'-Adenylsäure aus den entsprechenden Purinbasen.
Geeignete Basen sind z. B. Hypoxanthin, Guanin, Adenin. Die Basen können als solche oder als Nucleoside oder in Naturprodukten, die Basen bzw. Nucleoside enthalten, vorliegen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium, das übliche Mengen an Kohlenstofflieferanten, Stickstoffquellen, ohne übermäßigen Gehalt an wachstumsfördernden Substanzen, anorganischen Salzen und Vitamin H enthält, dem jedoch keine Eisen- oder Mangansalze zugesetzt werden, in Gegenwart einer dem 5'-Purinnucleotid entsprechenden Purinbase als Vorläufer ist dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 verwendet.
Micrococcus sodonensis. besitzt nicht die Fähigkeit, fermentativ Glutaminsäure in einem Fermentationsmedium beim Fehlen von- Vitamin H zu erzeugen und anzureichern, sondern benutzt viehmehr Glutaminsäure dann als einzige,Kohlenstoffquelle und Energiequelle. Das Züchten v-Qn Mierococcus sodonensis erfolgt deshalb in einem°Kültürmediüm, das Vitamin H, welches dieses Bakterium in passenden Mengen braucht, enthält und folgende Zusammensetzung besitzt: Kohlenhydrate oder sonstige Kohlenstoffquellen (Glucose, Stärkehydrolysate, Glutaminsäure), Stickstoffquellen (Harnstoff, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat), stickstoffhaltige Naturstoffe (Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Caseinaminosäuren), anorganische Verbindungen (Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Calciumchlorid): Pantothensäure und Thiamin sind brauchbare Beschleuniger des Fermentationsvorgangs in Verbindung mit Kohlenstoff- und Energiequellen, einer Quelle für anorganischen Stickstoff, mit anorganischen Verbindungen und kleinen Mengen an Verhältnismäßig hohe Konzentrationen von Kahumphosphat und Magnesiumsulfat (z. B. 0,60/,) als anorganische Verbindungen steigern die Anreicherung des gewünschten 5'-Purinnucleotids. Diese Bestandteile sollten neben der Purinbase in dem Fermentationsmedium vorhanden sein.
Die Fermentation findet bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C unter aeroben Bedingungen in Form einer Schüttelkultur oder aeroben Submerskultur statt. Im allgemeinen treten nach 2- bis 8tägiger Fermentation bemerkenswerte Mengen 5'-Purinnucleotid im Fermentationsmedium oder in den Bakterienzellen auf. Jedoch verursacht die übermäßige Zugabe beispielsweise von Aminosäuren oder die Zufügung kleinerer Mengen von Mangansalzen oder Eisensalzen zum Fermentationsmedium ungewöhnlich starkes Bakterienwachstum und geringe Bildung des 5'-Purinnucleotids. Diese Erscheinung- wird vor allem beobachtet, wenn natürliche Substanzen mit großem Gehalt an den erwähnten Komponenten verwendet werden. Zu derartigen Substanzen gehören Maisquellwasser, Reiskleie oder Fischextrakte, die demnach für das erfindungsgemäße Verfahren weniger geeignet sind.
Aus wirtschaftlichen Gründen können als Stickstoffquellen zweckmäßigerweise billige Naturprodukte dem Kulturmedium zugesetzt werden,. jedoch nicht. solche Naturprodukte, die erhebliche Mengen Eisen- oder Mangansalz enthalten und somit übermäßiges Bakterienwachstum verursachen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung an Hand-.bevorzugter Ausführungsformen. Falls nicht anders angegeben, beziehen sich die Prozentangaben in den folgenden Beispielen- auf das Gewicht pro Volumen Fermentationsmedium.
Beispiel 1 10 Volumprozent Micrococcus sodonensis ATCC 15 932, die 24 Stunden bei 30'C in einem wäßrigen Kulturmedium aus 2 °/ä Glucose, 1 °/o Pepton,1 °/o Hefeextrakt, 0,25:°/o NaCl und 30 y/1 Vitamin H (Restprozente = Wasser) kultiviert worden waren, werden in ein Fermentationsmedium geimpft. Beide Kulturmedien sind vorsterilisiert. Das wäßrige Fermentationsmedium hat die nachfolgend angegebene Zusammensetzung. Die äerobe Schüttelkultur wird bei 30'C gehalten: Zusammensetzung des Fermentationsmediums 10"/, Glucose, 10/, Hefeextrakt, 0,60/,) kzHP04, 0,6`°/ä KH2P04, 0,6 °/o M9S04. 7...H20, 0,010/0 CaClz -2 H20, 30 y/1 Vitamin H, 2,5 mg/ml Hypoxanthin (Restprozente = Wässer). Vor der Sterilisation wird der pH-Wert mit 5n-NaOH auf 8,0 eingestellt. Nach der Sterilisation wird zu dem Fermentationsmedium sterilisierter -- Harnstoff mit 0,6 °/o zugefügt. Nach 96stündiger Kultivierung haben sich in der Fermentationsflüssigkeit 9,9 mg/ml 5'-Natriuminosinat gebildet.
Beispiel 2 Es wird das gleiche Impfbakterium und gleiche Kulturmedium wie im Beispiel 1 verwendet. Das Fermentation§medium besteht aus 100/,Glucose, 0,601, K,HP04, 0,60/0 M9S04. - 7H20, 30y/1 Vitamin H, 0,6 °/o Harnstoff, 0,2 °/o Casein-Aminosäuren, 10 7/ml Calciumpantothenat, 2 y/ml Thiaminhydrochlorid, 0,8 °/o CaCO3, 2,5 mg/ml Hypoxanthin (Restprozente = Wasser); vor der Sterilisierung liegt der pH-Wert bei 8,0. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1. Nach 120 Stunden sind in der Fermentationsflüssigkeit 8,8 mg/ml 5'-Natriuminosinat entstanden.
Beispiel 3 Es wird das gleiche Impfbakterium sowie das gleiche Kulturmedium wie im Beispiel 1 verwendet. Das Fermentationsmedium ist das gleiche wie im Beispiel 1, jedoch ohne Hypoxanthin. Nach 40stündiger Kultur wird Guanin mit 3,0 mg/ml zugefügt. Die übrigen Kulturbedingungen entsprechen denen des Beispiels 1. Nach 96 Stunden finden sich 5,8 mg/ml 5'-Natriumguanylat. Beispiel 4, Es wird das gleiche Impfbakterium sowie das gleiche Kulturmedium wie im Beispiel 1 verwendet. Das Fermentationsmedium entspricht dem des Beispiels 2, aber ohne Hypoxanthin. Nach 72 Kulturstunden werden 2,5 mg/ml Guanin zugegeben, im übrigen sind die Kulturbedingungen wie im Beispiel 1. Nach 120 Stunden sind 5,1 mg/ml 5'-Natriumguanylat entstanden.
Beispiel 5 Es wird das gleiche Impfbakterium sowie das gleiche Kulturmedium wie im Beispiel 1 verwendet. Das Fermentationsmedium entspricht dem des Beispiels 3. Nach 72 Kulturstunden werden 2,5 mg/ml Adenin zugegeben. Im übrigen sind die Kulturbedingungen wie im Beispiel 1. Nach 96 Stunden finden sich 5,1 mg/ml 5'-Natriumadenylat.

Claims

Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung von 5'-Purinnucleotiden durch Fermentation von Mikroorganismen in einem wäßrigen Nährmedium, das übliche Mengen an Kohlenstofflieferanten, Stickstoffquellen ohne übermäßigen Gehalt an wachstumsfördernden Substanzen, anorganischen Salzen und Vitamin H enthält, dem jedoch keine Eisen- oder Mangansalze zugesetzt werden, in Gegenwart einer: dem 5'-Purinnucleotid entsprechenden Purinbase als Vorläufer, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Micrococcus sodonensis ATCC 15 932 verwendet.