DE1268622B - Verfahren zur fermentativen Herstellung von 5'-Ribosylphosphaten von 2-Aminopurinbasen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

Nummer:
Aktenzeichen:
Anmeldetag:
Auslegetag:

C07d

A 61k

12 ρ-7/10
30 h-2/36

1 268 622
P 12 68 622.5-44 24. November 1964 22. Mai 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von 5'-Ribosylphosphaten(Monophosphaten, Diphosphaten und Triphosphaten) von 2-Aminopurinbasen der allgemeinen Formel

H₇N-C

(D

15 worin R eine Amino- oder Mercaptogruppe bedeutet.

2,6-Diaminopurin-5'-ribonucleotide und 2-Amino-6-mercapto-5'-ribonucleotide sind bereits bekannt. So wird in »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 228, 1957, S. 325 bis 338, gezeigt, daß 2,6-Diaminopurin durch Escherichia coli in Form der 5'-Nucleotide aufgenommen wird. Die enzymatische in-vitro-Synthese der 5'-Nucleotide von 6-Mercaptopurin und 2,6-Diaminopurin und ihr spektrophotometrischer Nachweis werden in »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 231, 1958, S. 467 bis 480, beschrieben. Im Rahmen von Untersuchungen über die Hemmung der Aminosäurenaufnahme wird in »Journal of Biological Chemistry«, Bd. 236, 1961, S. 1158 bis 1162, die mehrstufige chemische Synthese von 2-Amino-6-mercapto-5^/-ribonucleotiden erwähnt. In diesem Zusammenhang wäre noch die Veröffentlichung in »Journal of Biochemistry«, Tokyo, Bd. 53 (3), 1963, S. 214 bis 218 (referiert in Chemical Abstracts, Bd. 61, 1964, Spalte 16 636 e) zu nennen. Es ist ferner aus den Unterlagen der belgischen Patentschrift 621 122 bekannt, durch Züchten von Mikroorganismen in einem purinfreien Medium 5'-Guanosinmonophosphat, 5'-Adenosinmonophosphat, 5'-Cytidinmonophosphat, 5'-Uridinmonophosphat und 5'-Xanthosinmonophosphat herzustellen, wobei jedoch nur geringfügige Ausbeuten erhalten wurden.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist es demgegenüber, 5'-Ribosylphosphate von 2,6-Diaminopurin und 2-Amino-6-mercaptopurin auf fermentativem Wege in wirtschaftlicher Weise und in industriellem Maßstab herzustellen.

Erfindungsgemäß werden die 5'-Ribosylphosphate von 2-Aminopurinbasen der Obigen allgemeinen F'ormel I dadurch hergestellt, daß man die Stämme ATCC Nr. 6872, 6871, 15 750 oder 15 751 von Verfahren zur fermentativen Herstellung von 5'-Ribosylphosphaten von 2-Aminopurinbasen

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke und Dipl.-Ing. H. Agular, Patentanwälte,

8000 München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:
Kiyoshi Nakayama, Sagamihara-shi; Zenroku Sato, Machida-shi;
Haruo Tanaka, Tokio (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 27. November 1963 (63 231)

Brevibacterium ammoniagenes in einem Fermentationsmedium züchtet, das außer den üblichen Bestandteilen eine Purinbase der allgemeinen Formel I, ein Salz oder ein Ribosid einer solchen Verbindung enthält.

Den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen kommt die allgemeine Formel

H₇N-C

X-O-CH,

OH

zu. worin R die oben angegebene Bedeutung hai

S(Kt fc*0 479

3 4

und X eines der folgenden Reste ist: Die 5'-Ribosylphosphate der Purinbasen können Q OO ^nac^ ^^er B^eendigung des Züchtens nach an sich bell π ν kannten Verfahren, z. B. durch Behandlung mit Hilfe ρ Qpj ρ Q ρ Qj_j von Ionenaustauscherharzen, durch Adsorption,

I Ii 5 durch Fällung oder durch Extraktion, aus dem Me-OjLj OJj oh dium isoliert werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Er-

°der läuterung der Erfindung. Prozentangaben beziehen

0 ο O ^s'^cn'^wenn nicht anders angegeben, auf das Gewicht.

II Il Il ^I0 B e i s ρ i e 1 1 ρ /~\ ρ . . ο ρ OH

1 ι ι Zunächst wird eine Impfkultur hergestellt, indem Of^ OH OH Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6872 in

einem Medium, das 2% Glucose, 1% Pepton,

Purinbasen, wie 6-Mercaptopurin, haben in letzter 15 l°/o Hefeextrakt, O,3^ü/o Natriumflorid und 30 ij.g je

Zeit für Untersuchungen im Hinblick auf die Be- Liter Biotin enthält, 24 Stunden bei 30 C ange-

handlung von Leukämie Bedeutung gewonnen. Die züchtet wird. Das Fermentationsmedium wird mit

Ribosylphosphate dieser Purinbasen sind kürzlich 10 Volumprozent dieser Impfkultur angeimpft. Beide

ebenfalls Gegenstand ähnlicher Untersuchungen ge- Medien wurden verwendet, nachdem 20-ccm-Anteile

worden. 20 in 250-ccm-Erlenmeyerkolben gebracht und sodann

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich sterilisiert worden waren. Die Züchtung wird bei 30 C

dadurch aus, daß es mit seiner Hilfe zum erstenmal in einer Schüttelkultur durchgeführt. Das Fermen-

gelang, 5'-Ribonucleotide von 2,6-Diaminopiirin und tationsmedium hat die folgende Zusammensetzung:

2-Amino-6-mercaptopurin auf fermentativem Wege .-,, <qq

in hohen Ausbeuten auf einfache, rasche und wirt- 25 „ J , *[

schaftliche Weise herzustellen. Kh"pO 1Oe

Als Nährmedium kann errindiingsgemäß jedes K>HPo' 1Oe

Medium verwendet werden, das eine Kohlenstoff- λΛςη ' 7Wη in?

quelle, z. B. Kohlenhydrate, wie Glucose, Starke- γό/-μ -> tr η η Τ ,-,

ι,, j, jw, · ,-.-,α· LaLl' · 1 H)(J U, I ίϊ

hydrolyseprodukte und Melassen, eine Stickstoff- 30 Hefeextrakt 1Oe"

quelle, wie Harnstoff, Ammoniumchlorid und Ammo- n:_n4.;„ in ~

'. . . . „ , -XJ- ,· Biotin iv 'ie.

niumnitrat, anorganische Substanzen, wie Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid, Die obigen Bestandteile werden in Wasser unter und stickstoffhaltige Naturprodukte, wie Maisquell- Auffüllen auf 1 1 gelöst. Sodann wird die Lösung flüssigkeit, Hefeextrakt, Pepton und Fischmehl, in 35 nach Einstellen des pH-Wertes auf 8,0 — was mit geeignetem Mengenverhältnis enthält. Derartige Nähr- Hilfe von Natriumhydroxyd erfolgt — in den obenmedien sind für die Bakterienzüchtung allgemein be- genannten Volumanteilen in die Kolben gegeben und kannt. in einem Autoklav unter einem Druck von 1 kg cm-

Erfindungsgemäß kann die Purinbase I bzw. ihr 10 Minuten sterilisiert.

Salz, z. B. ihr Sulfat, oder Ribosid vom Anfang der 40 Nach 72stündiger Züchtung wird dem Fermen-

Fermentation an in dem Medium enthalten sein oder tationsmedium 2,6-Diaminopurinsulfat in einer Menge

dem Fermentationsmedium während des Verlaufs der von 2 mg/ccm Fermentationsmedium zugesetzt, und

Fermentation zugesetzt werden. Wenn sie während es wird weitere 24 Stunden gezüchtet, wonach sich

des Verlaufs der Fermentation zugesetzt wird, kann 2,3 mg/ccm 2,6-Diaminopurin-ribosyl-5'-triphosphat

die Zugabe in einem Ansatz oder in mehreren An- 45 sowie geringe Mengen des entsprechenden Diphos-

teilen erfolgen. phats (0,15 mg/ml) und Monophosphats (0,17 mg ml)

Die erfindungsgemäß dem Nährmedium zugesetzte gebildet und in dem Fermentationsmedium ange-

Menge an Purinbase I kann innerhalb eines breiten sammelt haben.

Bereichs variieren. Sie ist etwas von dem speziell Die gebildeten 5'-Ribosylphosphate des 2.6-Di-

verwendeten Bakterienstamm abhängig. Im allge- 5° aminopurins werden durch Behandlung mit Ionen-

meinen wird sie innerhalb des Bereichs von etwa 0.1 austauscherharzen in der folgenden Weise isoliert:

bis etwa 10 g je Liter Medium liegen. Vorzugsweise Das durch Entfernen der Zellen aus der Züchtungs-

beträgt die verwendete Menge 1 bis 5 g je Liter flüssigkeit erhaltene Filtrat( 1.2 1) wird mit Aktivkohle

Fermentationsmedium. Bei Verwendung eines Salzes behandelt, und die an der Aktivkohle adsorbierten

oder Ribosids der Purinbase I wird die Menge dieser 55 5'-Ribosylphosphate des 2,6-Diaminopurins werden

Verbindung so gewählt, daß in dem Medium während mit 50^u/₀igem wäßrigem Äthanol, das 3° 0 Ammoniak

der Fermentation die geeignete Menge an freier enthält, eluiert. Das im Eluat enthaltene Ammoniak

Purinbase I enthalten ist. wird durch Abdampfen unter Vakuum entfernt. Die

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen. erhaltene Lösung wird auf eine Säule gegeben, die

z. B. in einer Schüttelkultur oder einer Submerskultur 60 mit dem unter der Handelsbezeichnung »Dowex

unter Belüften und Rühren, bei einer Temperatur 1 \ 2« (Cl-Form) bekannten stark basischen PoIy-

von 20 bis 4O⁰C und bei einem pH-Wert von 5.5 styrol-Anionenaustauscherharz beschickt ist. Die

bis 9,0 durchgeführt. Die Züchtungsdauer beträgt Harzsäule, die die 5'-Ribosylphosphate des 2.6-Di-

im allgemeinen 2 bis 8 Tage. Bei der Züchtung bilden aminopurins adsorbiert enthält, wird mit Wasser

sich bemerkenswerte Mengen der 5'-Ribosylphos- ⁶5 gewaschen und sodann gradientenmäßig in der an-

phate von 2-Aminopurinbasen der allgemeinen gegebenen Reihenfolge mit 0.0In-. 0.05 n-. 0.1 n-

Formel I, die sich in dem Medium und in den und 0,5 η-Salzsäure efuiert. Die Eluatfraktionen. die

Zellen ansammeln. das 2,6-Diaminopurin-ribosyl-5'-triphosphat. das

2,6-Diaminopurin-ribosyl-5'-diphosphat und das 2,6-Diaminopurin-ribosyl-5'-monophosphat enthalten, werden eingeengt und nach der Zugabe von Äthanol gekühlt. Die abgeschiedenen 5'-Ribosylphosphate des 2,6-Diaminopurins werden abzentrifugiert und getrocknet. Die Ausbeute an 2,6-Diaminopurin-5'-triphosphat beträgt 0,9 g.

Beispiel 2

0,84 mg/ccm 2-Amino-6-mercaptopurin-ribosyl-5'-diphosphat und eine kleine Menge des entsprechenden Triphosphats (0,17 mg/ml) werden gebildet und in dem Fermentationsmedium angesammelt, wenn die Fermentation in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 durchgeführt, nach 72 Stunden Züchten jedoch 2-Amino-6-mercaptopurin zugesetzt wird.

Beispiel 3 Beispiel 5

IO

20

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 6871 verwendet, wobei sich 0,6 mg/ccm 2,6-Diaminopurin-ribosyl-5'-triphosphat und geringe Mengen des entsprechenden Diphosphats (0,16 mg, ml) und Monophosphats (0,16 mg/ml) bilden und in dem Fermentationsmedium ansammeln.

Beispiel 4

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 750 verwendet, wobei 3,1 mg ecm 2.6-Diaminopurin-ribosyl-5'-triphosphat sowie geringe Mengen des entsprechenden Diphosphats (0,17 mg/ml) und Monophosphats (0,13 mg/ml) gebildet und in dem Fermentationsmedium angesammelt werden.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur fermentativen Herstellung von 5'-Ribosylphosphaten von 2-Aminopurinbasen der allgemeinen Formel

H,N

worin R eine Amino- oder Mercaptogruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme ATCC Nr. 6872, 6871, 15 750 oder 15 751 von Brevibacterium ammoniagenes in einem Fermentationsmedium züchtet, das außer den üblichen Bestandteilen eine Purinbase der allgemeinen Formel I, ein Salz oder ein Ribosid einer solchen Verbindung enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Purinbase der allgemeinen Formel I oder ihr Salz oder Ribosid während der Züchtung der Bakterien zu dem Fermentationsmedium hinzufügt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Fermentationsmedium, das die Purinbase der allgemeinen Formel I oder ihr Salz oder Ribosid in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 10 g, berechnet auf freie Purinbase, je Liter Medium enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40 C und bei einem pH-Wert von 5,5 bis 9 durchführt.

40

Es wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 gezüchtet, nur wird Brevibacterium ammoniagenes ATCC Nr. 15 751 verwendet, wobei sich 3.2 mg ml 2.6-Diaminopurin-ribosyl-5'-triphosphat und geringe Mengen des entsprechenden Diphosphats (0,17 mg ml) und Monophosphats (0,14 mg ml) bilden und in dem Fermentationsmedium ansammeln.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Ausgelegte Unterlagen des belgischen Patents

Nr. 621 122;
The Journal of Biological Chemistry, Bd. 228

(1957). S. 325 bis 338: Bd. 231 (1958). S. 467 bis 480:

Bd. 236(1961), S. 1158 bis 1162;
Journal of Biochemistry, Tokyo, Bd. 53 (3) (1963),

S. 214 bis 218 (referiert in Chemical Abstracts. Bd. 61 (1964). Spalte 16 636 e).

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