DE1795481C - Verfahren zur Herstellung von 8 Azapunnnucieosiden Ausscheidung aus 1470360 - Google Patents

Description

N ^N ίο R,

N I

r/^{n N}

R ^N!

K₃ N

¹⁵ R ^N

in der R₁ ein WasserstofFatom oder eine Amino- ' r

gruppe. R₂ ein Wasserstoff- oder Halogenatom,
eine Hydroxy-, Mercapto-, Amino- oder Furfuryl-

aminogruppe, einen Alkylaminorest mit bis zu worin R₁ ein Wasserstoffatom oder eine A minogrup,v

6 Kohlenstoffatomen oder einen Acylaminorest 20 R.,ein Wasserstoff- oder Halogenatom, eine Hydro-,

mit bis zu 7 Kohlenstoffatomen und R₃ den Ribo- Mercapto-, Amino- oder Furfurylaminogruppe. eiiu ■

syl- oder Desoxyribosylrest bedeuten, dadurch Alkylaminorest m.c bis zu 6 Kohlenstoffatomen υ<<

gekennzeichnet, daß man ein 8-Azapurin einen Acylaminorest mit bis zu 7 Kohlenstoffatom·:·,

der allgemeinen Formel und R₃ den Ribosyl- oder Desoxyribosylrest bedeute;

25 8-Azapurinnudeoside sind bekanntlich nützliehe

R und wertvolle chemische oder biochemische Agentin.

in enzymatischen und biochemischen Untersuchungen. Während die natürlich vorkommenden Purinnuclc·.·-

N ^N side, wie / denosin, Guanosin, Xanthosin und Inosi;:

_N ^N " 3c sich leicht herstellen lassen, z. B. durch Hydrolyse \r,;

■,· N 1 Ribonucleinsäuren oder Desoxyribonucleinsäuren up.

^Κ· ■ ter Bildung eines Gemisches von Nucleosiden und Ab

trennung der einzelnen Nucleoside mit oder ohne Dev aminierung oder durch Dephosphorlyierung von Pur

mit Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin, Cytidin 35 innucleotiden mit Hilfe von Phosphatase, können die

oder den entsprechenden 2'-, 3'-, 5'-. 2',3'- oder obengenannten 8-Azapuriiinucleoside nicht aus Nu-

3',5'-Ribonucleotiden oder Adenindesoxyribosid, cleinsäuren hergestellt werden, vielmehr ist dies nur

Hypoxanthindesoxyribosid, Guanir.Jesoxyribosid, mit chemischen Synthesen möglich, die viele Reaktions-

Cytosindesoxyribosid, Thymindesoxyribosid oder stufen und genaue Einhaltung der Reaktionsbeding'in-

den entsprechenden 3'-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribo- 40 gen erfordern. Bei allen bisher bekannten chemischen

nucleotiden oder Gemischen derselben in einem Verfahren zur Herstellung dieser Nucleoside ist es

wässrigen Medium vom pH-Wert 4 bis 10 bei schwierig, die Reaktion so zu führen, daß sie an den

Temperaturen zwischen 20 und 50°C in Gegenwart gewünschten Stellungen der Base und der Ribosc oder

eines anorganischen Phosphats und in Anwesenheit Desoxyribose stattfindet. Ferner ist die Handhabung

eines der folgenden aeroben Bakterienstämme: 45 der labilen Ribose bzw. der noch labiLven Desoxyribose

. , , „*„■■-, schwierig. Ein zufriedenstellendes Syntheseverfahren

iT^lCC^aN^Cr96^C-)^r|^{)BeneS Be}'Jerinck _zur Großherstellung von S-Azapurindcsoxyribonucleo-

. ⁿ ,",' . .. „, , ο · siden ist bisher nicht entwickelt und bekannt geworden.

NRRTSr" E!-9OT * ^{Es WUrde nun} B^erunden· ^{daß sich dic} Verbindungen

_u ... , ' . ,..' , . _. . 50 der allgemeinen Formel I leicht in technischem Mali-

BaciHus brevii; M.gula emend. Ford _{s(ab Jadureh hersleI}|_cn |_{asselli da(J man ein 8}._Azapurill

u Ii ι -Ki-I ,„.,μ κι -,λλ der allgemeinen lormel

Bacillus shaericus Neide USDA-Nr. 344,

Bacterium cadaveris CJaIe et Epps

ATCC-Nr. 9760, ^R2 ·

Corynebacterium sepedoniciim (Spiek.et Kott.)

Skaptason et Burkholdcr ATCC-Nr. 15 391, _N N

Erwinia aroideae (Townsend) Holland N Il

ATCC-Nr. 15 390, N

Pseudomonas putrefaciens (Derby et Hammer) , R,'

Long et Hammer ATCC-Nr. 8071 und ° H

Vibrio percolans Mudd et Warren

NRRL-Nr. S 31 ., _A ■ . . . ,. .......... .

mit Adenosin, Inosin, Guanosin, Uridin. Cytidin oder

oder in Anwesenheit des die Pentosylgruppc über- d'Mi entsprechenden 2'-, .V-, 5'-, 2',3'- oder 3',5'-Ribo-

tragenden Enzymsystems der genannten Bakterien- 65 nucleotiden oder Adenindesoxyribosid, Hypoxanthin-

stämme umsetzt. desoxyribosid, Guanindesoxyribosid, Cytosindesoxy-

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekenn- ribosid, Thymindesoxyribosid oder den entsprechenden

zeichnet, daß mit Konzentralionen eines anorgii- .V-, 5'- oder 3',5'-Desoxyribonucleotiden oder Gemi-

sehen derselben in einem wässrigen Medium vom pH-Wert 4 bis IO bei Temperaturen zwischen 20 und 50¹C in Gegenwart eines anorganischen Phosphats und in Anwesenheit eines der folgenden aeroben Bakteriens»ämme:

Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck
ATCC-Nr. 9621,

Aeromonas hydrophila (Chester) Stanier
NRRL-Nr. B-909,
Bacillus brevis Migula emend. Ford
ATCC-Nr. 9999,

Bacillus sphaericus Neide USDA-Nr. 344,
Bacterium cadaveris GaIe et Epps ATCC-Nr. 9760, Corynebacterium sepedonicuni (Spiek. et Kott.) Skaptason et Burkliolder ATCC-Nr. 1.5 391,
Erwinia aroideae (Townsend) Holland
ATCC Nr. 15 39t.,

Pseudomonas piitrefaciens (Derby et Hammer) Long et Hammer ATCC-Nr. 807! und
' Vibrio percolans Mudd et Warren NRRL-Nr. S 31

oder in Anwesenheit des die Pentosylgruppe übertragenden Enzymsystems der genannten Bakterienstämme umsetzt.

Als Ausgangsstoffe geeignete 8-Azapurine der allgemeinen Formel !1 sind beispielsweise 8-Azahypoxantliiiv, 8-Azaguanin, ö-Mercapto-S-azapurin und 6-Butyroylamino-^'-azapurin.

Die als Lieferanten der R-bosyl- oder Desoxyribosylgruppe genannten Nucleoside und Nucleotide lassen sich leicht durch Hydrolyse ν m Nucleinsäuren herstellen.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren kann die Kulturbrühe der Bakterien unmittelbar als Enzymquelle gebraucht werden, oder die Zellen können in Form einer Suspension in Wasser, einer Pufferlösung oder einer Salzlösung verwendet werden. Die abgetrennten Zellen können ferner vor der Reaktion einer Vorbehandlung unterworfen werden, z. B. einer Zerstörung durch Beschallen, Mahlen mit Glaskugeln, Behandlung mit einem die Zellen zerstörenden Mittel, wie Phenol oder Natriumdesoxycholat, oder Waschen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Äthylacetat. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch so durchgeführt werden, daß man die genannten aeroben Bakterien unter aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium züchtet, das beide Ausgangsstoffe enthält.

Die Kultivierung der Bakterien erfolgt in einem geeigneten Kulturmedium unter aeroben Bedingungen. Das Kulturmedium muß assimilierbare Kohlcnstoffquellen und Stickstoffquellcn für die verwendeten Bakterien enthalten. Zweckmäßig ist der Zusatz von unorganischen Salzen und Spurenelementen. Als Nährstoffe für die Kultivierung kommen die allgemein zu diesem Zweck verwendeten Stoffe in Frage. Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose und Glycerin. Geeignete Stickstoffquellen sind beispielsweise Pcpton, Fleischextrakt, Hefeextrakte, Sojabohnenniehl, Maisquellwasser, Gluten, Natriumglutamat, Harnstoff, Ammoniumsalze, z. I). Animoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und Ammoniumlactat, und Nitrate, z. B. Natriumnitrat und Kaliumnitrat. Weitere anorganische Salze sind beispielsweise Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Calciumchlorid. Als Spurenelemene, können Borsäure, Kupfersulfat, Eisend I I)-chloritd Mangansulfat, Natriummolybdat und Zinksulfat verwendet werden.

Die Bedingungen, unter denen die aeroben Bakterien bebrütet werden, werden vorteilhaft auf die verwendeten Bakterienspezies und/oder das Kulturmedium abgestimmt. Gewöhnlich wird die Kultivierung bei einer Temperatur von 20 bis 40 C für eine Dauer von 6 Tagen durchgeführt.

Die genannten Stämme von aeroben Bakterien sind

ίο bei der American Type Culture Collection (ATCC), Washington, D.C, USA, beim Northern Utilization Research Branch, US. Dept. of Agriculture (NRRL), Peoria, III.. USA. und beim US. Department of Agriculture (USDA) hinterlegt.

Für die Pentosylübertragungsreaktion ist die Anwesenheit eines Phosphats erforderlich. In den Fällen, in denen beispielsweise die Enzymquelle mit dem Phosphat verunreinigt ist oder in denen Nucleotide als Pentosyllieferant zusammen mit Phosphomonoesterase oder Pyrophosphatase verwendet werden, ist ein Phosphatzusatz unnötig. Die Phosphatkonzentration im Reaktionsgemisch beträgt zweckmäßig 0,1 bis 100 mMol, jedoch kann sich ein zu hoher Phosphatüberschuß nachteilig auf die Bildung der gewünschten 8-Azapurinpenloside auswirken.

Die im Reaktionsmedium angereicherten gewünschten 8-Azapiirinnucleoside der allgemeinen Formel I werden nach beliebigen bekannten Methoden, die zur Abtrennung des Produkts von fermentative!! Reaktionen aus dem Reaktionsgemisch oder zur Trennung mehrerer ähnlicher chemischer Verbindungen in die Einzelverbindungen angewendet werdeü, isoliert. Beispielsweise kann die Abtrennung durch Ausnutzung ' des Unterschiedes in der Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln zwischen der gewünschten Verbindung und den Verunreinigungen, des Unterschiedes in den Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Lösungsmittelschichten, des Unterschiedes in der Adsorbierbarkeit an Adsorptionsmitteln, wie Aktivkohle oder Ionenaustauschharz^!, des Unterschiedes in der Dialysierbarkeit durch eine halbdurchlässige Membran oder des Unterschiedes in der Kristallisierbarkcit aus einem Lösungsmittel sowie durch Filtration oder Zentrifugieren des Reaktionsgemisches mit oder ohne Zusatz von Filterhilfsstoffen erfolgen. In der Praxis werden diese Methoden zur Trennung oder Isolierung je nach der gewünschten Reinheit und dem Zustand der Produkte in Kombination oder wiederholt durchgeführt.

In den folgenden Beispielen beziehen sich die Prozentsätze auf das Gewicht.

Beispiel I

200 ml einer wie unten angegeben hergestellten Zellsuspensiün wurden IO Minuten beschallt (10 kil/, 100 W) und anschließend zur Entfernung von Feststoffen zentrifugiert. Der Überstand wurde zu einer Lösung von 1,52 g 8-Azaguanin und 7,32 g Uridin in 4 Liter einer 0,05molaren Kaliumdihydrogenphosphal-Puffcrlosung gegeben. Das Gemisch wurde 180 Minuten bei 37"C stehengelassen und dann 10 Minuten auf 90 C erhitzt. Es wurde dann zur Entfernung der gebildeten Fällung filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde mit Salzsäure auf den pH-Wert 2 eingestellt und durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Nach dem Waschen mit 0,01 η-Salzsäure wurde die Aktivkohlesäule mit Äthanol, das 4% Ammoniak enthielt, eluiert.

I 795 481

Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt, auf den pH-Wert 9,6 eingestellt und durch eine Säule geleitet, die mit einem stark basischen loncnaustauscherharz (Polyslyrol-Divinylbenzol-Copolymeres, fonnialfonn) gefüllt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Säule mit 0,1 n-Ameisensäureeluiert. Das Eluat wurde durch eine Kolonne geleitet, die mit Aktivkohle gefüllt war. Nach dem Waschen mit Wasser wurde die Aktivkohlcsäule mit 50%igem Äthanol, das 4"/„ Ammoniak enthielt, eluiert. Das F.luat wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde aus ' :isser kristallisiert, wobei 960 mg 8-Azaguaninrobosid (Schmelzpunkt 250 bis 252"C, Zersetzung) erhalten wurden.

Die benötigte Zellsuspension wurde folgendermaßen hergestellt:

Aerobacter aerogenes (Kruse) Beijerinck ATCC-Nr. 9621 wurde über Nacht bei 28°C auf einer Bouillon-Agar-Schrägkultur kultiviert, die 1 % Glucose enthielt. Fünfundzwanzig 200-ml-Kolben, die je 40 ml eines wäßrigen Kulturmediums enthielten, wurden mit den Zellen beimpft, wobei jeweils eine Übertragung mit einer Öse vorgenommen wurde. Das Medium bestand aus Dextrin (20,0 g), Polypepton (10,0 g), Fleischextrakt (10,0 g), Dikaliumhydrogenphosphat (1,0 g), Natriumchlorid (5,0 g) und sterilisiertem Leitungswasser (1 1) und war auf den pH-Wert 7,2 eingestellt. Das beimpfte Medium wurde 2 Tage bei 28°C unter Schütteln bebrütet. Nach der Bebrütung wurde die gesamte Kulturbrühe zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden mit 0,8%iger wäßriger Kochsalzlösung gewaschen und zur Herstellung der Enzymquelle in destilliertem Wasser (200 ml) suspendiert.

Beispiel 2
5

Ein Gemisch aus 200 ml einer 0,005molaren wäßrigen Lösung von 8-Azaguanin bzw. 8-Azahypoxanthin, 500 ml einer 0,01 molaren wäßrigen Lösung von 5'-Thymidylsäure, 100 ml einer I.Omolaren Acetatpufferlösung vom ph-Wert 5,75, 50 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Zellsuspension und 150 ml Wasser wurden 120 Minuten bei 37"C gehalten. Die Isolierung des 8-Azaguanin-desoxyribosids bzw. des 8-Azahypoxanthin-desoxyribosids aus dem Reaktionsgemisch erfolgt analog zu der Verfahrensweise des Beispiels I. Es wurden 21 mg 8-Azaguanin-desoxyribosid bzw. 20 mg 8-Azahypoxanthin-desoxyribosid erhalten.

Die erhaltenen Dcsoxyriiw-idc zeigten die typische blaue Farbreaktion mit Diphenylamin gemäß einer Untersuchungsmethode für Nucleinsäuren (s. »The Nucleic Acids, Chemistry and Biology«, Bd. 1, S. 287 bis 289). Die molaren Absorptionskoeffizienten der entsprechenden Reaktionsprodukte werden wie folgt angegeben:

8-Azaguanin-dcsoxyribosid

250 m/i = 12,5 · 10³M ' ■ cm > (0,0i n-HCl)
278 m/i - 6,5 ■ 10³M¹ · cm · (0,01 n-NaOH)

8-Azahypoxanthin-desoxyribosid

255 m/i 9,6 ■ 10³M"¹ ■ cm-¹ (0,01 n-HCl)
275 m/i 10,5 · 10³M"¹ · cm¹ (0,01 n-NaOH)

Claims (1)

1 2 nischen Phosphats im Reaktionsmedium zwiseh, Patentansprüche: etwa 0.1 und 500 mMol gearbeitet wird.

1. Verfahren zur Herstellung von 8-Azapurinnucleosiden der allgemeinen Formel

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellu
von 8-Azapurinnucleosiden der allgemeinen Forme!