DE2835151A1

DE2835151A1 - Verfahren zur herstellung von purin- arabinosiden

Info

Publication number: DE2835151A1
Application number: DE19782835151
Authority: DE
Inventors: Koji Mitsugi; Takeshi Miyoshi; Hirokazu Morisawa; Takashi Utagawa; Akihiro Yamazaki; Fumihiro Yoshinaga
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1977-08-10
Filing date: 1978-08-10
Publication date: 1979-02-22
Also published as: CA1120876A; FR2400033B1; GB2006185A; FR2400033A1; GB2006185B; NL7808321A; DE2835151C2

Description

SCHIFF ν. FONER STREHL SCHOBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Purin-arabinosiden, insbesondere mit Hilfe eines enzymatischen Prozesses.

Purin-arabinoside (9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-purine) besitzen Anwendungsmöglichkeit als Agrikulturchemikalien oder therapeutische Mittel. So wurde beispielsweise berichtet, daß Adenin-arabinosid, eines der Purin-arabinoside, erfolgreich zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten, die duruh Herpes-Viren verursacht werden, einschließlich Windpocken und Gürtelrose (Herpes)verv;endet werden.

Als Methoden zur Herstellung von Purin-arabinosiden wurden bereits verschiedene chemische synthetische Methoden ausgearbeitet, die in J. Org. Chem. 27, 3274, (1962); J. Org. Chea. 23, 3004 (1963); J. Org. Chem. 3g, (1976); Tetrahedron Letters 197C, 467Γ; und der japanj.3chen ausgelegten Patentanmeldung Nr. 7271/1972 beschrieben sind. Es wurde weiterhin berichtet, daß Adenin-arabinosid gebildet wird, ,venn Streptomyces antibioticus in einem üblichen Kulturmedium gezüchtet wird (ausgelegte japanische Patentanmeldung Nr. 41558/1972).

Es konnte nun gefunden werden, daß Purin-arabinoside in einem wässerigen Reaktionsmedium aus Arabinose-Donoren (Arabinose ausgebenden Verbindungen), wie Uracil-arabinosid oder D-Arabinofuranose-1-phosphat und Purinquellen, wie Adenin, Hypoxanthin, Adenosin und Adenosin-5'-monophosphat, unter der Einwirkung eines Enzyms gebildet werden können, das durch verschiedene Bakterien erzeugt wird.

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_ 1-7 _

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Purin-arabinosiden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) einen Arabinose-Donor, der D-Aratdnofuranose-1-phosphat oder eine Verbindung der Formel I

öderen Nucleotid darstellt, in der X für 0, S oder NH steht, Y eine OH-, NHp-, SH- oder SR-Gruppe bedeutet, wobei R eine niedere Alkylgruppe darstellt, und Z ein Wasserstoffatom, Halogenatom, eine NOp-> CH,- oder CHpOH-Gruppe bedeutet, und eine Purinquelle, die ein unsubstituiertes oder 2,6- und/oder 8-substituiertes Purin oder dessen Ribofuranosid, Ribofuranotid, Desoxyribofuranosid oder Desoxyribofuranotid ist,

in einem wässerigen Medium bei einer Temperatur im Bereich von 40 bis 70⁰C in Gegenwart einer wirksamen Menge eines durch ein Bakterium erzeugten Enzyms hält, das zur Übertragung der Arabinose von dem Arabinose-Donor auf das un~ substituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle befähigt ist, bis der ß-D-Arabinofuranosyl-Rest in 9-Stellung des unsubstituierten oder 2,6- und/oder 8-substituierten Purins gebunden ist, und

(b) das gebildete unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-purin gewinnt.

Die erfindungsgemäßen Arabinose-Donoren bzw. Arabinose abgebenden Verbindungen sind D-Arabinofuranose-1-phosphat, die

9s

Verbindung der Formel I oder das Phosphat der Verbindung der Formel I.

Einzelne der Arabinose-Donoren sind in den nachstehend beschriebenen Beispielen dieser Anmeldung gezeigt.

Die erfindungsgemäßen Purinquellen sind unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purine und deren Ribofuranoside, Desoxyribofuranoside oder Desoxyribofuranotide. 2,6- und/oder 8-substituierte Purine, die erfindungsgemäß als Purinquelle eingesetzt v/erden, können mit Hilfe der nachstehenden Methode nachgewiesen Werdens

Das Ribofuranosid des 2,6- und/oder 8-substituierten Purins wird mit dem erfindungsgemäß eingesetzten Enzym in einem wässerigen Medium, das 0,1 m KHpPO. enthält, 24 Stunden lang bei 60⁰C in Berührung gehalten. Wenn in dem wässerigen Medium das 2,6- und/oder 8-substituierte Purin des ursprünglich eingesetzten 2,6- und/oder 8-substituierten Purin-ribofuranosids und D-Ribofuranose-1-phosphat oder D-Ribose, die sich von dem genannten Ribofuranosid ableiten,in dem wässerigen Medium gebildet werden, so kann das 2,6- und/oder 8-substituierte Purin als Purinquelle verwendet werden.

Als Substituenten der 2,6- und/oder 8-substituierten Purine liegen beispielsweise Halogenatome, Hydroxyl-, Amino-, niedere Alkyl-, Alkoxyl-, Aryl-, Aralkyl-, Mercapto-, Alkylamino-, Alkylmercapto-, Alkylsulfonyl-, Alkylsulfenyl-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Cyan- und Nitrogruppen vor.

Die D-Arabinofuranose des Arabinose-Donors wird enzymatisch auf die 9-Stellung des unsubstituierten oder 2,6-oder 8-subsi±buierten Purins der Purinquelle übertragen und dort gebunden. Als erfindungsgemäßes Produkt wird somit das unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-Purin gebildet.

Das bakterielle Enzym, das zur Transarabinosylierung von dem Arabinose-Donor auf das unsubstituierte oder das 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle befähigt ist, wird hauptsächlich in den Bakterienzellen gebildet und liegt in geringem Ausmaß in dem überstehenden Anteil der Kulturflüssigkeiten vor. Die zur Bildung des Enzyms befähigten Bakterien gehören, soweit festgestellt wurde, den Genera Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Salmonella Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Aeromonas, Serratia, Erwinia, Proteus, Xanthomonas und Bacterium an.

Beispiele für diese Bakterien sind:

Pseudomonas stutzeri NRRL B-11346 (FERM-P 4170), Flavobacterium rhenanum NRRL B-11343 (CCM 298), Flavobacterium acidoficum ATCC 8366, Flavobacterium proteus ATCC 12841, Achromobacter lacticum NRRL B-11340 (CCM 69), Salmonella typhimurum NRRL B-11347 (FERM-P3735),

Citrobacter freundii Citrobacter freundii (Citrobacter intermedium) Escherichia coli Escherichia aurescens Klebsiella pneumoniae (Enterobacter aerogenes) Serratia liquefaciens (Enterobacter liquefaciens) Enterobacter aerogenes Aergmonas punctata Aeromonas salmonicida Serratia marescens Erwinia carotovora Erwinia amylovora Erwinia herbicola Proteus vulgaris

ATCC 8090, ATCC 6750,

ATCC 9637, ATCC 12814, ATCC 9621,

ATCC 14460,

ATCC 13048, ATCC 11163, ATCC 14174, IFO 3048, NRRL B-11342 (CCM 872), NRRL B-11341 (CCM 1017), ATCC 14537, NRRL B-11345 (FERM-P3394),

Proteus rettgeri NRRL B-11344 (FERM-P3395),

Bacterium cadaveris IFO 3731, und

Xanthomonas citri NRRL B-11348 (FERM-P3396).

Um unter Anwendung der vorstehend erwähnten Bakterien das Enzym zu bilden, werden die Bakterien in oder auf üblichen Kulturmedien gezüchtet. Die Kulturmedien enthalten gebräuchliche Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Spurennährstoffe, wie Vitamine und Aminosäuren„ Zur Züchtung der Bakterien in den gebräuchlichen Medien können übliche Verfahrensweisen angewendet werden, d.h., die Bakterien werden aerob vorzugsweise bei einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 9 und bei einer Temperatur im Bereich von 25 bis 40⁰C gezüchtet.

Als Enzymquelle werden vorzugsweise intakte Zellen oder die Zellen enthaltende Kulturflüssigkeiten verwendet« Außerdem können mit Aceton getrocknete Zellen, gefriergetrocknete Zellen, homogenisierte Zellen, mit Ultraschallwellen behandelte Zellen, mit Toluol, oberflächenaktiven Mitteln oder Lysozym behandelte Zellen eingesetzt v/erden, wobei wünschenswerte Ergebnisse erzielt werden. Darüberhinaus können vorteilhaft als Enzymquelle Proteinfraktionen verwendet werden, welche die enzymatische Aktivität für die Arabinoseübertragung von dem Arabinose-Donor auf das unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle haben ο Es wird angenommen, daß mehr als ein Enzym an der Bildung der Purin-arabinoside teilnimmt.

Die Bildung der Purin-arabinoside kann vorgenommen werden, indem die Purinquelle und der Arabinose-Donor in den Kulturmedien der Bakterien gehalten werden,, In diesem Fall werden der Arabinose-Donor und die Purinquelle dem Kulturmedium zugesetzt, nachdem die Bakterien ausreichend gewachsen sind, und dann wird die Temperatur bei 40 bis 70⁰C gehalten. Die Bildung der Purin-Arabinoside kann außerdem erfol-

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gen, indem die Purinquelle und der Arabinose-Donor mit den Zellen oder den vorstehend erwähnten Enzymquellen in einem anderen wässerigen Reaktionsmedium als dem Kulturmedium in Berührung gehalten werden. Für die Zwecke der Erfindung soll daher unter der Bezeichnung "wässeriges Medium" das Kulturmedium oder ein Reaktionsmedium (Reaktionsgemisch) verstanden werden. Die Reaktionsmedien werden vorzugsweise bei einer Temperatur von 40 bis 70⁰C und einem pH-Wert von 4 bis 10 während 5 bis 100 Stunden gehalten.

Die erfindungsgemäße Reaktionstemperatur (40 bis 7O⁰C) ist insofern spezifisch, als diese Temperatur höher als die übliche Temperatur für enzymatische Reaktionen ist, und ist kritisch.

Die in den Kulturmedien oder den Reaktionsmedien gebildeten Purin-arabinoside können in üblicher Weise gewonnen werden, wie durch Ionenaustausch-Methoden oder Kristallisationsmethoden.

Beispiel 1

Ein wässeriges Kulturmedium mit einem pH-Wert von 7,2 wurde hergestellt, welches pro dl 0,5 g Hefeextrakt, 1,0g Pepton, 0,5 g Bouillon und 0,5 g NaCl enthielt. 5 ml-Anteile dieses wässerigen Kulturmediums wurden in Reagenzgläser gegeben und zur Sterilisation erhitzt. Je eine Platinöse voll einer Impfkultur der in Tabelle 1 aufgeführten Bakterien wurde in jeden Anteil des wässerigen Kulturmediums eingebracht. Die Züchtung erfolgte bei 30⁰C während 36 Stunden unter Schütteln. Die in der Kulturflüssigkeit gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. Die so erhaltenen Zellen (50 mg der feuchten Zellen/ml) wurden in Proben einer 0,05 m Phosphatpufferlösung vom pH 7,0 suspendiert und 0,5 ml der Zellsuspension wurde mit 0,5 ml eines Reaktionsgemisches mit einem pH-Wert von 7,5 vermischt, welches 0,5 g/dl Ura-

^il-srabinosid, 0,2 g/dl Hypoxanthin und 50 mg/dl KHpPO, enthielt. Jedes Geraisch wurde 15 Stunden bei 6O⁰C gehalten und danach 5 Minuten lang auf 100⁰C erhitzt.

Jedes Produkt in dem Reaktionsgemisch wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie als 9-ß-D-Ara« binofuranosylhypoxanthin (Hypoxanthin-arabinosid) identifiziert und die Mengen des Hypoxanthin-arabinosids in dem Reaktionsgemisch wurden ebenfalls mit Hilfe der Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Verwendeter Mikroorganismus

Angereichertes Hypoxanthinarabinosid, mg/dl

NRRL	B-11343
ATCC	8366
ATCC	12841
NRRL	B-11340
NRRL	B-11347
ATCC	8090
ATCC	6750
ATCC	9637
ATCC	12814
ATCC	9621
ATCC	14460
ATCC	14174
ATCC	11163
IFO	3048
NRRL	B-11342
NRRL	B-11341
ATCC	14537
NRRL	B-11345
NRRL	B-11344

3,7 6,6 6,7 5,7 7,5

11,3 13,2 10,5 17,0

126,0 17,0 36,0 4,1

23,0 14,0 18,0 21,0 9,6 2,4

Tabelle 1 (Fortsetzung)

Verwendeter Mikroorganismus

Angereichtertes Hypoxanthinarabinosid, mg/dl

NRRL B-11348 IFO 3731 NRRL B-11346 ATCC 13048

11,0

12,0

7,5

55,7

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde nachgearbeitet, mit der Abänderung, daß Adenin anstelle von Hypoxanthin verwendet wurde. Die in dem Reak⁺ionsgemisch gebildeten Mengen an Adenin-arabinosid sind in Tabelle 2 gezeigt.

Beispiel 3

Es wurde die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise angewendet, wobei Uracil-arabir.osid durch Cytosin-arabinosid ersetzt wurde. Die in dem Reaktionsgemisch gebildeten Anteile an Hypoxanthin-arabinosid sind in Tabelle 3 gezeigt.

Beispiel 4

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde mit der Abänderung durchgeführt, daß Adenin-ribosid-5'-monophosphat anstelle von Hypoxanthin verwendet wurde. Dabei reicherte sich in dem Reaktionsgemisch die in Tabelle 4 gezeigte Menge an Adenin-arabinosid an.

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Tabelle 2

Verwendeter Angereichertes Adenin-

Mikroorganismus arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 4,5

ATCC 8366 8,2

ATCC 12341 ' 8,0

NRRL B-11340 6,5

NRRL B-11347 8,6

ATCC 8O9O 13,3

ATCC 6750 15,0

ATCC 9637 10,6

ATCC 12814 18,8

ATCC 9621 132,0

ATCC 14460 26,0

ATCC 14174 41,0

ATCC 11163 18,5

IPO 3048 32,6

NRRL B-11342 20,5

NRRL B-11341 22,5

ATCC 14537 31,5

NRRL B-11345 26,3

NRRL B-11344 28,6

NRRL B-11348 . T3,5

IFO 3731 21,2

NRRL B-11346 8,6

ATCC 13048 71,8

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Tabelle 3

Verwendeter Mikroorganismus Angereichertes Hypoxanthin-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 ATCC 3366 ATCC 12841 NRRL B-11340 WRRL B-11347 ATCC 8090 ATCC 6750 ATCC 9637 ATCC 12814 ATCC 9621 ATCC 14460 ATCC 14174 ATCC 11163 IFO 3048 NRRL B-11342 NRRL B-11341 ATCC 14537 NRRL B-11345 NRRL B-11344 NRRL B-11348 IFO 3731 NRRL B-1 ATCC 13048

4,2 5,5 8,2 2,6 4,8 6,5

10,3 6,3 3,6

82,1

15,0

20,5 0,8

13,6 2,6 8,7

15,0 8,1 0,5 0,8

10,6 3,2

40,2

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Tabelle 4

Verwendeter Mikroorganismus Angereichertes Adeninarabinosid mg/dl

NRRL B-11343 ATCC 8366 ATCC 12841 NRRL B-II34O NRRL B-II347 ATCC 8090 ATCC 6750 ATCC 9637 ATCC 12814 ATCC 9621 ATCC 14460 ATCC 14174 ATCC 11163 IFO 3048 NRRL B-11342 NRRL B-11341 ATC-: 14537 NRRL B-11345 NRRL B-11344 NRRL B-11348 IFO 3731 NRRL B-11346 ATCC 13048

3,8

5,6

7,2

3,5

8,3

10_s2

8,6

5,5

6,9

82,3

13,5

25,5

9,6

21,5

15,5

11,5

13,3

12,6

15,8

8,3

14,5

8,5

49,6

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Beispiel 5

100 ml-Anteile des in Beispiel 1 gezeigten wässerigen Kulturmediums wurden in 500 ml-Schütte!kolben gegeben und durch Erhitzen sterilisiert. In das wässerige Kulturmedium wurde Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 eingeimpft und dann unter Schütteln 36 Stunden lang bei 30⁰C gezüchtet. Die in der erhaltenen KulturflUssigkeit gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und 30 g (im feuchten Zustand) der Zellen wurden in 1 1 eines Reaktionsgemisches vom pH 7,0 gegeben, das 1,5 g 2-Methylhypoxanthin, 7,3 g Uracil-arabinosid und 3,4 g KHpPO/ enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 36 Stunden lang bei 60⁰C gehalten.

Die Zellen wurden durch Zentrifugieren aus dem Reaktionsgemisch entfernt, die überstehende Flüssigkeit wurde durch ein Kationenaustauscherharz (Amberlite CG-120) geleitet und das Harz wurde mit 0,1 η Ammoniumacetat (pH 6,8) gewaschen. Nach der Elution mit 0,1 η Ammoniumhydroxid wurde das Eluat eingedampft und abgekühlt, wobei 710 mg einer kristallinen Substanz erhalten wurden.

Das kristalline Produkt wurde durch das NMR-Spektrum, UV-Spektrum, IR-Spektrum und durch Elementaranalyse als 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-2-methylhypoxanthin (2-Methylhypoxanthin-arabinosid) identifiziert.

Elementaranalyse:

berechnet: C 46,8 %, H 5,0 %, N 19,8 % gefunden: C 46,5 %, H 5,1 %, N 19,5 %.

NMR-Spektrum: in Figur 1 gezeigt UV-Spektrum : in Figur 2 gezeigt IR-Spektrum : in Figur 3 gezeigt.

Beispiel 6

30 g der in Beispiel 4 erhaltenen Zellen wurden in 1 1 eines Reaktionsgemisches gegeben, das 1,7 g 2-Chlor-hypoxanthin, 7,3 g Uracil-arabinosid und 3,4 g KHpPO/ enthielt und das Reaktionsgemisch wurde 36 Stunden bei 60⁰C gehalten. Nach dem Entfernen der Zellen aus dem Reaktionsgemisch wurde die überstehende Flüssigkeit durch ein Anionenaustauscherharz (Dowex 1X4) geleitet und das Harz wurde mit 0,1 η Ammoniumacetat vom pH 6,8 gewaschen. Nach der Elution mit 0,1 η Ammoniumacetat vom pH 4,0 wurde das Eluat eingedampft und auf Sephadex G-10 aufgegeben und mit V/asser entwickelt. Die Anteile des Eluats, die das erste der beiden UV-Absorptionsmaxima zeigten, wurden gewonnen, eingedampft und abgekühlt. Dabei wurden 326 mg einer kristallinen Substanz erhalten .

Das kristalline Produkt wurde durch das NMR-Spektrum, UV-Spektrum, IR-Spektrum, durch Elementaranalyse und den Beilstein-Test als 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-2-chlorhypoxanthin (2-Chlorhypoxanthin-arabinosid) identifiziert.

Elementaranalyse:

berechnet: C 39,68, H 3,66, N 18,51 gefunden: C 39,42, H 3,72, N 18,25.

NMR-Spektrum : in Figur 4 gezeigt

UV-Spektrum : in Figur 5 gezeigt

IR-Spektrum : in Figur 6 gezeigt

Beilstein-Test: positiv (grün).

Beispiel 7

Die Verfahrensweise des Beispiels 1 wurde durchgeführt, wobei aber Hypoxanthin durch 2-Methylhypoxanthin oder 2-Chlorhypoxanthin ersetzt wurde. Die dabei gebildeten Mengen an 2-Methylhypoxanthin-arabinosid bzw«, 2-Chlorhypoxanthin-arabinosid, die in dem Reaktionsgemisch angereichert wurden, sind in Tabelle 5 gezeigt.

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Beispiel 8

Die in Beispiel 1 beschriebene Verfahrensweise wurde durchgeführt, wobei anstelle der 0,2 g/dl Hypoxanthin 0,4 g/dl Inosin verwendet wurde. Die in dem Reaktionsgemisch gebildeten Mengen an Hypoxanthin-arabinosid sind in Tabelle 6 gezeigt.

Beispiel 9

100 ml des in Beispiel 1 beschriebenen wässerigen Kulturmediums wurden in einen 500 ml-Schüttelkolben gegeben, durch Erhitzen sterilisiert und dann mit Aeromonas salnonicida ATCC 14174 beimpft. Die Züchtung erfolge 36 Stunden lang unter Schütteln bei 30⁰C.

Die in der erhaltenen Kulturflüssigkeit gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen und 2,0 g {Naßgewicht) der Zellen wurden in 100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5 gegeben, das 100 mg Hypoxanthin, 300 mg Uracil-arabinosid und 50 mg KHpPO^ enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Stunden lang bei 60⁰C gehalten.

Aus dem Reaktionsgemisch wurden 25 mg kristallines Hypoxanthin-arabinosid erhalten.

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Tabelle 5

Mikroorganismus	angereichertes 2-Methylhypo- xanthin-arab ino- sid., mg/dl	angere ichertes 2-Chlorhypo- xanthin-arabino- sid, rag/dl
NRRL B-"¹1343	2,1	0,5
ATCC 8366	3,4	0,8
ATCC 128^1	4,0	2,1
NRRL B-11340	5,5	2,5
NRRL B-11347	4,8	2,8
ATCC 8090	8,7	3,6
ATCC 6750	9,5	8,2
ATCC 9637	4,7	5,1
ATCC 12814	12,0	10,5
ATCC 9621	80,5	51,6
ATCC 14460	18,5	11,3
ATCC 14174	21,6	10,0
ATCC 11163	0,8	0,05
IFO 3048	15,4	10,8
NRRL B-11342	2,5	0,1
NRRL B-11341	12,0	10,5
ATCC 14537	15,5	12,1
NRRL B-11345	0,6	0,05
NRRL B-11344	8,2	0,5
NRRL B-11348	12,5	0 ,8
IFO 3731	21,6	2,1
NRRL B-11346	15,3	10,3
ATCC 13048	40,2	28,7

Tabelle 6

Verwendeter Mikroorganismus Angereichertes Hyροxanthinarabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 ATCC 8366 ATCC 12841 NRRL B-11340 NRRL B-11347 ATCC 8090 ATCC 6750 ATCC 9637 ATCC 12814 ATCC 9621 ATCC 14460 ATCC 14174 ATCC 11163 IFO 3043 NRRL B-11342 NRRL B-11341 ATCC 14537 NRRL B-11345 NRRL B-11344 NRRL B-11348 IFO 3731 NRRL B-11346 ATCC 13048

2,8 3,6 5,5

'4,3 6,2 3,8 7,4 1,6

13,6

83,3 6,2

16,8 0,9

15,3 6,8

10,2 8,9 8,5 0,8 7,2 5,3

3,3 40,4

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Beispiel 10

Klebsiella pneunoniae ATCC 9621 wurde in der in Beispiel 9 beschriebenen Weise gezüchtet. Die Zellen in der resultierenden KuIturflüssigkeit wurden durch Zentrifugieren gewonnen und 2 g (Naßgewicht) der Zellen wurden in 100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5 suspendiert, das 100 mg Hypoxanthin, 300 mg Cytosin-arabinosid, 50 mg KHpPO- enthielt und das Reaktionsgemisch wurde dann 15 Stunden lang bei 60⁰C gehalten.

Die Zellen in dem Reaktionsgemisch wurden durch Zentrifugieren entfernt und ein Konzentrat der überstehenden Flüssigkeit wurde durch ein Anionenaustauscherharz geleitet (Dowex-1, OH-Form, pH 6,8). Nach der Elution mit 0,1 η Ameisensäure vom pH 4,0 wurde das erhaltene Eluat durch Sephadex G-10 geleitet. Das durch Elution mit Wasser erhaltene Eluat (250 ml) wurde konzentriert und dem Konzentrat wurde Methanol zugesetzt und durch Kühlung wurden daraus Kristalle des gewünschten Produkts erhalten. Nach der Umkristallisation aus V/asser wurden 35 mg der gereinigten Kristalle erhalten.

Das kristalline Produkt wurde durch Vergleich mit authentischem Hypoxanthin-arabinosid mit Hilfe des NI-IIl-Spektrums, IR-Spektrums und UV-Jpektrums identifiziert..

Beispiel 11

Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurde in gleicher V/eise wie in Beispiel 9 gezüchtet und die Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen.

In iem Reaktionsgemisch gemäß Beispiel 9 wurde Hypoxanthin durch Adenin ersetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60⁰C gehalten. Die überstehende Flüssigkeit des Reaktionsgemisches wurde auf 20 ml konzentriert. Nach

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den Abkühlen des Konzentrats wurden 80 mg der kristallinen Substanz erhalten.

Das kristalline Produkt wurde im Vergleich mit authentischem Adenin-arabinosid durch das NMR-Spektrun, IR-Spei:trim und UV-Spektrum identifiziert.

Beispiel 12

Erwinia hervicola ATCC 14537 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 gezüchtet und die gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen.

Die in einer Menge von 2 g/dl (Naßgewicht) erhaltenen Zellen wurden in 100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5 suspendiert, das 100 ml/dl Adenin, 300 mg/dl Cytosin-arabinosid und 50 mg KHpPO. enthielt, und das Gemisch wurde 15 Stunden bei 60⁰C gehalten.

Nach dem Entfernen der Zellen aus dem Reaktionsgemisch wurde dieses auf 20 ml konzentriert und abgekühlt. Die dabei erhaltenen Kristalle wurden aus Wasser umkristallisiert_} wobei 55 mg gereinigte Kristalle erhalten wurden. Das kristalline Produkt wurde im Vergleich mit Adenin-arabinosid durch das NMR-Spektrum, IR-Spektrum und UV-Spektrum identifiziert.

Beispiel 13

5 g (Naßgewicht)/dl Zellen von Aeromonas salmonicida ATCC 14174 wurden in 100 ml-Anteilen eines Reaktionsgemisches suspendiert, das 30 mM Cytosin-arabinosid, 25 mM KH₂PO^ und 10 mM eines der in Tabelle 7 gezeigten Purine enthielt. Die Reaktionsgemische wurden in Reagenzgläser gegeben und 15 Stunden bei 60⁰C gehalten.

Das in dem erhaltenen Reaktionsgemisch neu gebildete Produkt, das UV-Absorption zeigte, wurde durch Flüssigphasen-

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ORIGiNAL INSPECTED

Chromatographie abgetrennt. Das bei der Chromatographie erhaltene Eluat wurde konzentriert und mit Äthanol versetzt, v/odurch in dem Eluat Kristalle ausgebildet wurden.

Die erhaltenen gereinigten kristallinen Produkte wurlen durch ihre NMR-Spektren und UV-Spektren als Arabinoside der jeweiligen als Ausgangsmaterialien verwendeten Purine identifiziert«

Die Umwandlungsrate, in der die Purin-arabinoside aus der entsprechenden Purinquelle erhalten wurden, wurde durch Messung des molekularen Extinktionskoeffizienten bestimmt. Diese Werte sind in Tabelle 7 gezeigt.

Tabelle 7

Ausgangsmaterial

Produkt

Umwandlungsrate

Xanthin

Guanin

Pur in

6-Mercaptopurin 2,6-Diaminopurin 6-Mercaptoguanin 2-Methylhypoxanthin 2-Chlorhypoxanthin

Xanthin-arabinosid 15

Guanin-arabinosid 8

Purin-arabinosid 23

6-Mercaptopurin-arabinosid 8

2,6-Diaminopurin-arabinosid 38

6-Mercaptoguanin-arabinosid 7

2-Methylhypoxanthin-arabinosid 35

2-Chlorhypoxanthin-arabinosid 18

Beispiel 14-

5 g (Naßgewicht)/dl Zellen von Klebsiella pneumoniae ATCC 9621 wurden in 100 ml-Anteilen eines in Reagenzgläsern befindlichen Reaktionsgemisches suspendiert, das 30 mM Uracilarabinosid, 25 mM KHpPO^ und eine der in Tabelle 8 angegebenen Purinquellen (10 mM) enthielt, und das Gemisch wurde 15

309808/0988

Stunden lang bei 6O⁰C gehalten.

Das in dem resultierenden Reaktionsgemisch neu gebildete Produkt, das UV-Absorption zeigte, wurde durch Flüssigkeit3-chromatographie abgetrennt. Das bei der Chromatographie erhaltene Eluat wurde konzentriert und mit Äthanol versetzt, wobei in dem Eluat Kristalle ausgebildet wurden.

Durch die NMR-Spektren der gereinigten kristallinen Produkte wurden die Produkte als Arabinoside der jeweiligen, als Ausgangsmaterialien verwendeten Purinquellen identifiziert.

Die Umwandlungsrate, in der die Purin-arabinoside aus den verwendeten Purinquellen erhalten wurden, wurde durch Messung der molekularen Extinktionskoeffizienten bestimmt. Sie sind in Tabelle 8 gezeigt.

Tabelle 8

Ausgangs material

Produkt

Umwandlungs ■ rate (%)

Xanthin

Guanin

Purin

6-Mercaptopurin 2,6-Diaminopurin 6-Mercaptoguanin

Xanthin-arabinosid

Guanin-arabinosid

Purin-arabinos id

6-Mercaptopurin-arabinosid

2,6-Diaminopurin-arabinosid

6-Mercaptoguanin-arabinosid

65 20 36

8 52

Beispiel 15

Bei der in Beispiel 5 beschriebenen Methode wurde 2-Methvlhypoxanthin durch 2-Äthylhypoxanthin ersetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde an Silicagel der Dünnschichtchromatographie unterworfen und das Chromatogramm wurde mit was-

909808/0986

sergesüttijtem Butanol entwickelt. Der Teil mit einem Rf-Wert von 0,4 im DünnschichtchromatograrajB, der eine Absorption bei 260 nm zeigte, wurde gewonnen und in 0,1 η HCl suspendiert und das oilicagel wurde aus der Suspension entfernt .

Die überstehende Flüssigkeit der Suspension wurde .nit HCl auf 6 η eingestellt und 10 Minuten .rekocht. Die gekochte Suspension zeigte eine positive Orcin-Ferrichlorid-Reaktion und 2-Äthylhypoxanthin wurde in der gekochten Suspension durch Papierchromatographie nachgewiesen. Somit zeigte sich, daß in dem Reaktionsgemisch 2-Äthylhypoxanthin-arabinosid gebildet worden war.

Beispiel 16

Zellen von Klebsiella pneumoniae ATCC 962I wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 9 erhalten, in 0,5 m Phosphatpuffer vom pH 7,5 suspendiert, so daß eine Suspension von 100 g (Naßgewicht)/! erhalten wurde, die dann mit Ultraschallwellen behandelt wurde.

100 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,5, das 50 ml/dl der vorstehend erhaltenen überstehenden Flüssigkeit, 500 mg/ dl Uracil-arabinosid-5-monophosphat, 100 mg/dl Hypoxanthin und 30 mg/dl KH₂PC₄ enthielt, wurde 15 Stunden bei 6O⁰C gehalten. Dann wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen, und die überstehende Flüssigkeit wurde durch ein Kationenaustauscherharz (Chromobead C-2) geleitet.

Die Elution erfolgte mit 0,3 η Ameisensäure und das Sluat v/urde auf ein Anionenaustauscherharz (Dowex 1 χ 4) aufgegeben.

Hypoxanthin-arabinosid wurde durch Gradientenelution mit Ammoniumformiat vom pH-Wert 9 bis 3 eluiert, wonach aus dem

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Eluat 3 mg der kristallinen Substanz erhalten wurden.

Beispiel 17

1 ml eines Reaktionsgemisches, welches pro ml 0,2 ml der in Beispiel 16 beschriebenen überstehenden Flüssigkeit, 10 r.g Uracil-arabinosid, 2 mg KHpPO/. 2 mg einer der nachstehenden Purinquellen enthielt, wurde 15 Stunden lang bei 60⁰C in einem Reagenzglas gehalten und 5 Minuten auf 100⁰C erhitzt»

Nach dem Entfernen des Niederschlags aus dem Reaktionsgemisch wurde dieses der Papierchromatographie unterworfen und der FleDken,der UV-Absorption zeigte und dessen Rf-Viert verschieden von dem der als Ausgangsmaterialien verwendeten Purinquellen war, wurde herausgeschnitten und in 0,1 η HCi gegeben.

Nach dem Entfernen des Filterpapiers wurde dann die 0,1 η HCl-Lösung durch Zugabe von konzentrierter HCl 6 η gemacht und 10 Minuten gekocht, wonach Arabinose mit Hilfe der Orcin-Ferrichlorid-Reaktion in der gekochten 6 η HCl-Lösung nachgewiesen wurde. Es wird daraus gefolgert, daß in den Reaktionsgemischen lie Arabinoside der folgenden als Ausgangsmaterialien verwendeten Purinquellen gebildet worden sind:

6-Chlorpurin 6-Mercaptopurin

2-Chlorhypoxanthin 6-Methylthiopurin

2-Aminopurin 2-Amino-6-mercaptcpurin

2-Methylthiohypoxanthin 6-Carboxypurin

8-Chloradenin 8-Bromadenin

Beispiel 18"

Bei der in Beispiel 16 beschriebenen Verfahrensweise wurde Uracil-arabinosid-S'-monophosphat durch Cytosin-arabinosic-5'-monophosphat ersetzt. In dem gebildeten Reaktionsgemisch .wurde Hypoxanthin-arabinosid aufgefunden.

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- 2c -

Tabelle 3

Verwendeter

Mikroorganismus Angereichertes Hypoxanthiri-arabinosid, mg/dl

NRRL B-11343 ATCC 3366 ATCC 12841 NRRL B-II34O NRRL B-II347 ATCC 8O9O ATCC 6750 ATCC 9637 ATCC 12814. ATCC 9621 ATCC 14460 ATCC 14174 ATCC 11163 IFO 3046 NRRL B-11342 NRRL B-11341 ATCC 14537 NRRL B 11345 NRRL B-II344 NRRL B-11348 IFO 3731 NRRL B-11346 ATCC 13048

2,8 5,5 6,3 6,0 5,2 8.3

10,6 3,5

12,3 103,6

12,5 29,3

4,0 24,0 15,2 17,6 22,3 15,6

3,2 10,6 18,3

8,2 48,5

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Beispiel 19

Bei der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise wurde Uracil-arabinosid durch D-Arabinofuranose-1-phosphat ersetzt und dabei wurde Hypoxanthin-arabinosid in Mengen in dem Reaktionsgemisch angereichert, die in Tabelle 9 aufgeführt sind.

Beispiel 20

Das Verfahren wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 19 durchgeführt, -wobei anstelle von Hypoxanthin jeweils eine der in Tabelle 10 angegebenen Purinquellen verwendet wurde. Die neu gebildeten Produkte in dem resultierenden Reaktionsgemisch, die UV-Absorption zeigten, wurden durch präparative Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasenchromatographie abgetrennt. Das bei der Chromatographie erhaltene Eluat wurde konzentriert und mit Äthanol versetzt, wobei in dem Eluat Kristalle ausgebildet wurden. Durch die NMR-Spektren und UV-Spektren der erhaltenen kristallinen Produkte wurden diese Produkte als Arabinoside der jeweiligen Purinquellen identifiziert, die als Ausgangsmaterialien verwendet worden waren.

Die Umwandlungsrate der verwendeten Purinquellen zu den Purin-arabinosiden wurde durch Messung des molekularen Sxtinktionskoeffizienten bestimmt und die entsprechenden Werte sind in Tabelle 10 gezeigt.

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283515

Tabelle 10

Ausgangsmaterial

Produkt

Umwandlung ■ rate (Sä)

Xanthin

Guanin

Pur in

6-Mercaptopurin

2,6-Diaminopurin 6-Mercaptoguanin 2-Methylhypoxanthin 2-Chlorhypoxanthin

Xanthin-arabinos id Guanin-arabinosid Purin-arabinos id 6-Mercaptopurin-arabinos id 2,6-Diaminopurin-arabinosid 6-Mercaptoguanin-arabinosid 2-Me thylhypoxanthin-arab ino aid 2-Chlorhypoxanthin-arabinos id

23 3

38

35

13

Beispiel 21

Klebsie 11a pneumoniae ATCC 9621 wurde in gleicher V/eise vie in Beispiel 9 gezüchtet und die gebildeten Zellen wurden durch Zentrifugieren gewonnen.

20 mg der erhaltenen Zellen wurden in 1 ml eines Reaktionsgemisches vom pH 7,0 suspendiert, das 1,5 mg Adenin, 10 mg eines der in Tabelle 11 aufgeführten Pyrimidin-arabinoside und 3,A- mg KH₂PC^, enthielt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60⁰C gehalten.

Die Zellen wurden aus dem Reaktionsgemisch durch Zentrifugieren en-fernt. Das angereicherte Adenin-arabinosid wurde durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigphasenchromarographie identifiziert.

9 093Q8/Ö98S

Tabelle 11

Arabinose-Donor

4-Thiouracil-arabinofuranosid 4-(S-Methyl-)thiouracil-arabinofuranosid 2-Thiouracil-arabinofuranosid 5-Nitrouracil-arabinofuranosid 5-Hydroxymethyluracil-arabinofuranosid Isocytosin-arabinofuranosid

5-Fluoruracil-arabinofuranosid 5-Bromuracil-arabinofuranosid 5-Joduracil-arabinofuranosid Thymin-arabinofuranos id

Beispiel 22

Bei der in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrensweise -wurde das Adenin in dem Reaktionsgemisch durch 200 mg Adenylsäure ersetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60⁰C gehalten. Die überstehende Flüssigkeit des Reaktionsgemisches wurde auf 30 ml konzentriert. Nach dem Abkühlen des Konzentrats wurden 48 mg einer kristallinen Substanz erhalten. Das kristalline Produkt wurde im Vergleich mit authentischem Adenin-arabinosid durch das NMR-Spektrum, IR-Spektrum und UV-Spektrum identifiziert.

Beispiel 23

Bei der in Beispiel 11 beschriebenen Verfahrensweise wurde das Adenin in dem Reaktionsgemisch durch 150 mg" Guanosin ersetzt und das Reaktionsgemisch wurde 15 Stunden lang bei 60⁰C gehalten»

Aus der überstehenden Flüssigkeit des resultierenden Reaktionsgemisches wurden 28 mg kristallines 2-(ß-D-Arabinofura-

909808/0988

nosyl)-guanin (Guanin-arabinosid) erhalten.

Beispiel Zk

Bei der in Beispiel 13 beschriebenen Verfahrensweise wurden anstelle von Hypoxanthin als Purinquelle Adenosin, Desoxyadenosin, Desoxyadeny!säure , Guanylsäure, Desoxyfoianylsäure, Xanthosin, Desoxyxanthosin, Desoxyinosin oder Desoxyincsinsäure verwendet. Aus der vorstehend genannten Adeninquelle wurde in dem Reaktionsgemisch Adenin-arabinosid gebildet, welches in üblicher Weise abgetrennt wurde. Aus der genannten Guaninquelle wurde Guanin-arabinosid gebildet. Aus der genannten Xanthinquelle wurde Xanthin-arabinosid gebildet» Aus der Hypoxanthinquelle wurde Hypoxanthin-arabinosid gebildet.

905808/0986

e e r s e i t e

Claims

PATENTANWÄLTE

SCHIFF v. FÜNER STREHL SCHÜBEL-HOPF EBBINGHAUS FINCK

MARIAHILFPLATZ 2 A 3, MÖNCHEN 9O
POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OOO MÜNCHEN 95

KARL LUDWIG SCHIFF

DlPL. CHEM. DR. ALE-XANOER v. FUNt -5

DlPU. ING. PETER STREni.

DIPL. CHEM. DR. URSULA SCHÜBEL-HOF-P

DIPL. ING. DiETER ESSINOHAUS

DR. INQ. D'£^TER ^ NCK

AJINOMOTO CO., INC,

TELEFON (O89) 4B3OQ4 TELEX 0-33 565 al.RO D TELEGRAMME AURQMARCPAT

D3A-13162

10. August 1978

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON FURIN-ARABIN03ID2N

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Purin-arabinosiden, dadurch gekennzeichnet, daß nan

a) einen Arabinose-Donor, der D-Arabinofuranose-1-

phosphat oder eine Verbindung der Forrael I oder

deren Phosphat darstellt

in der X für 0, S oder NH steht,

Y eine OH-, NH₂-, SH- oder SR-Gruppe, vorin

9Ö98Ö8/G9SS

283515

R eine niedere Alkylgruppe ist, darctellt und
Z ein H- oder Halogenatorn, eine NOp-, CH--

oder CHpOH-Gruppe bedeutet,

und eine Purinquelle, die ein unsubstituiertes oder 2,6- und/oder S-substituiertes Purin oder dessen Ribofuranosid, Ribofuranotid, Desoxyribofuranosid oder Desoxyribofuranotid ist, in einem wässerigen Medium bei Temperaturen im Bereich von 40 bis 70⁰C in Gegenwart einer wirksamen Menge eines durch ein Bakterium erzeugten Enzyms hält, welches zur Arabinose-Übertragung von dem Arabinose-Donor auf das unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte Purin der Purinquelle befähigt ist, bis der ß-D-Arabinofuranosylrest in der 9-Stellung des unsubstituierten oder 2,6- und/oder S-sübstituierten Purins gebunden ist, und

b) das gebildete unsubstituierte oder 2,6- und/oder 8-substituierte 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-purin gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß als Substituenten in dem 2,6- und/oder 8-substituierten Purin Halogenatome, Hydroxyl-, Araino-5, niedere Alkyl-, Alkoxy-, Aryl-, Aralkyl-, Mercapto-, Alkylamino-, Alkylmercapto-, Alkylsulfonyl-, Alkylsulfenyl-, Carboxyl-, Alkoxycarbonyl-, Nitro- und/oder Cyan-Gruppen vorliegen ο

3° Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e -

909308/0986

kennze lehnet , daß als Substituenten in dem 2,6- und/oder S-substituierten Purin Amino-, Hydroxyl- und/ oder Mercaptogruppen vorliegen.

^. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gek.ennzeich.net, daß als Purinquelle Adenin, Adenosin, Desoxyadenosin, Desoxyadenylssure, Adenylsäure, Hypoxanthin, Inosin, Desoxyinosin, Desoxyinosinsäure, Inosinsäure, Guanin, Guanosin, Desoxyguanosin, De s oxyguanly säure, Guanylsäure, Xanthin, Xanthosin, Desoxyxanthosin oder Xanthylsäure verwendet wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Arabinose-Donor 1-ß-D-Arabinofuranosyl-C3'"tosin oder 1-ß-D-Arabinofuranosyl-uracil verwendet wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym verwendet wird, welches aus einem Bakterium des Genus pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Salmonella, Serratia, Aeromonas, Erwinia, Proteus, Bacterium, Xanthomonas, Klebsiella oder Citrobacter stammt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym verwendet wird, das aus einem Bakterium des Genus Escheri-

chia stammt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym aus einem Bakterium des Genus Enterobacter verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym aus einem Bakterium der nachstehenden Gruppe verwendet wird:

Pseudomonas stutzeri NRRL B-11346, Flavobacterium rhenanum NRRL B-11343, Flavobacterium acidoficum ATCC 8366, Flavobacterium proteus ATCC 12841, Achromobacter lacticum NRRL B-1134C, Salmonella typhimurum NRRL B-11347, Citrobacter freundii ATCC 8090, Citrobacter freundii ATCC 6750, Klebsieila pneumoniae ATCC 9621, Serratia liquefaciens ATCC 14460, Aeromonas punctata ATCC 11163» Aeromonas salmonicida ATCC 14174, Serratia marescens IFO 3048,
Erwinia carotovora NRRL B-11342, Erwinia amylovora NRRL B-11341, Erwinia herbicola ATCC 14537, Proteus vulgaris NRRL B-11345, Proteus rettgeri NRRL B-11344 Bacterium cadaveris IFO 3731, oder Xanthomonas citri NRRL B-11343.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enzym von Escherichia coli ATCC 9637, Escherichia aurescens ATCC 12314 oder Enterobacter aerogenes ATCC 1304·- verwendet wird,

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert des wässerigen Mediums "bei einem Wert von 4 bis hält.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzym die Zellen des Bakteriums verwendet.

13. 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-2-chlorhypoxanthin.

14. 9-(ß-D-Arabinofuranosyl)-2-methylhypoxanthin.