DE1271117B

DE1271117B - Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Pyrimidin-Nucleinsaeurebausteinen

Info

Publication number: DE1271117B
Application number: DEP1271A
Authority: DE
Inventors: Kazuo Kimura; Shukuo Kinoshita; Kazuo Oshima; Katsunobu Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1961-05-13
Filing date: 1962-05-12
Publication date: 1968-06-27
Also published as: CA697205A; US3214344A; GB963079A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND DEUTSCHES W7TW> PATENTAMT Int. Cl.:

C07d

AUSLEGESCHRIFT

	A61k
	C12d
Deutsche Kl.:	12 ρ-7/01
	30 h-2/36
	6b-16/03
Nummer:	1271117
Aktenzeichen:	P 12 71 117.0-44
Anmeldetag:	12. Mai 1962
Ausleeetae:	27.Juni 1968

Die Erfindung betrifft ein Verfahren biotechnischer Herstellung von Pyrimidin-Nucleinsäurebausteinen durch Züchtung von unten! näher angegebenen Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das Orotsäure bzw. ein Orotat, d. h. ein Salz der Orotsäure, enthält. Die Orotsäure und ihre Salze sind wichtige Stoffwechselzwischenprodukte ί bei der Biosynthese der Nucleinsäuren. Die Gegenwart von Orotsäure bzw. ihrer Salze in einem Kulturmedium während der Fermentation trägt meßbar zur Bildung und An-Sammlung der Nucleinsäurebausteine bei.

Unter dem Begriff »Nucleinsäurebausteine«, wie er in der Beschreibung und dem Anspruch verwendet wird, werden diejenigen Substanzen verstanden, die in bestimmter Weise ultraviolettes Licht absorbieren. Dazu gehören Pyrimidinbasen, die in Nucleinsäure vorkommen, deren Nucleoside und deren Nucleotide. Im einzelnen fallen unter den; Begriff die folgenden Substanzen:

	Mole kular gewicht	Schmelzpunkt	Löslichkeit in Wasser (g/100 ecm)
Orotsäure .....	156,1	^;345	kaum löslich
Thymin	126,1	318 bis 321	0,404
Uracil	112,1	335	0,358
Base
Cytosin	111,1	320 bis 325	0,775
Orotidin	306,1		leicht löslich
Ribosid
Thymidin	242,2	186
Uridin	244,2	163 bis 165
Cytidin	243,2	212 bis 215	leicht löslich
5'-Orotidin- phosphat ..	385,1
5'-Thymidin- phosphat	322,2
5'-Uridylsäure	324,2		leicht löslich
Ribotid
5'-Cytidylsäure	323,2	232 bis 234	löslich

Verfahren zur biotechnischen Herstellung
vonPyrimidin-Nucleinsäurebausteinen

Anmelder:

Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio

Vertreter:

Dr.-Ing. H. Ruschke, Patentanwalt,

8000 München 27, Pienzenauer Str. 2

Als Erfinder benannt:

Shukuo Kinoshita,

Katsunobu Tanaka,

Kazuo Oshima, Tokio;

Kazuo Kimura, Sagamihara-shi (Japan)

Beanspruchte Priorität:

Japan vom 13. Mai 1961 (16 418)

Bei Züchtung eines der weiter unten angegebenen Mikroorganismen in einem Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, organische Nährstoffe und Orotsäure bzw. ein Orotat enthaltendem Kulturmedium können sich diese Nucleinsäurebausteine mikrobiologisch bilden und in reichlicher Menge in dem Kulturmedium ansammeln. Die während der Fermentation in dem Medium vorhandene Orotsäure bzw. das Orotat wird zur Synthese der Pyridmidinbasen, ihrer Nucleoside oder ihrer Nucleotide verwendet, ohne jedoch in die Biosynthese der Nucleinsäuren in den Zellkörpern einbezogen zu werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Pyridimin-Nucleinsäurebausteinen be-

50' steht daher darin, daß man in einem Orotsäure oder Orotat enthaltenden Nährmedium einen der in Tabelle I aufgezählten Mikroorganismen züchtet.

809 567/585

Tabelle I

	Uracfl	Produkte	andere Pyrimidinfaasen alsUracil	Pyrimidin- nucleoside	Pyrimidin nucleotide
			₊
Bacillus megaterium de Bary IAM Bact 1-12	t I		I
Bacillus natto IAM-1-3	++	—	4-	—
Bacillus cadaveris NCTC 6578	-4-	—	4-	—
Bacillus succinicum IAM-B-5-1	—		4_	—
Bacillus subtilis NRRL 558 IAM		—	4-	—
Bacillus subtilis PC 1 219 Yoken	4-	—	4-	—
Bacillus subtilis Nr. 2IAM 3 (ATCC 15244)	—	4-	4-	—
Bacillus subtilis Nr. 3 IAM 3 (ATCC 19062)		—	4-	—
Bacillus subtilis Nr. 4 IAM 3	—	—	4-	—
Bacillus subtilis Nr. 5 IAM 3	-\|—L.	—	4-	—
Bacillus subtilis Nr. 6 IAM 3	++	—	4-	—
Bacillus subtilis IFO Nr. 3026	—	4-	4-	—
Bacillus subtilis IFO Nr. 3027	—	—	4-	—,
Bacillus subtilis IFO Nr. 3033	—	—	4-	—
Bacillus subtilis IFO Nr. 3035	—	—	4_	—
Bacillus subtilis IFO Nr. 3036			_\|_	*JL.*
Bacillus subtilis 13 IAM	_	_	_j_	_j_
Bacillus subtilis 14 IAM	4.		4-
Bacillus subtilis, Threoninfreier Stamm 23 IAM-2 ...	++	—	4-	—
Bacillus subtilis, Threoninfreier Stamm 115 IAM-2 ...	—	—	±	—
Bacillus firmus B-206-6 IAM	—	—	±	—
Bacillus firmus Werner Nr. 3330 IFO	—	—		4-
Bacillus roseus B-206-10 IAM	±	4-	—	—
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871	—	—	±	4-
Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872	4-	—	±	—
Bacillus circulans Jordans Nr. 3342 IFO	±	—	±	—
Bacillus circulans IAM B-206-3	±	—	±	—
Bacillus circulans Jordans Nr. 3329 IFO	±	—	±	—
Bacillus coagulans ATCC 7050	—	—	±	—
Bacillus coagulans Hammer Nr. 3557 IFO	—	—	±	—
Bacillus macerans ATCC 3483	-j-	—	±	—
Bacillus macerans Schardinger IFO Nr. 3482	—	—	±	—
Bacillus macerans Schardinger IFO Nr. 3483	—	—	±	—
Bacillus macerans Schardinger IFO Nr. 3490	±	—	±	—
Bacillus pumilus Gottheil IFO Nr. 3028		—	±	—
Bacillus pumilus B-205-9 IAM	—	—	±	—
Bacillus pumilus Gottheil IFO Nr. 3030	—	—	±	—
Bacillus sphaericus B-205-8 IAM	—	—	±	—
Bacillus sphaericus Nieide IFO Nr. 3341	-J-	—		—
Brevibacterium acetylicum ATCC 953	—	—	±	—
Brevibacterium acetylicum ATCC 954	4-	—	—	—
Corynebacterium michiganese ATCC 10 202	4-	—	—	4-
Corynebacterium rathayi ATCC 13 659	4-	—	—	—
Brevibacterium helvolum ATCC 11 822	4-	—	—	—
Brevibacterium vitarumen ATCC 10 234	±	4-	—	—
Escherichia coli 15-75(15)his-, ade-, IAM-2	±	—	—	—
Escherichia coli 15-30(15)his-, IAM-2	—	—	4-	—
Alcaligenes faecalis IAM-Bact 3-8	4-	—	+	—
Alcaligenes faecalis ACC-104	—	—	4-	—
Alcaligenes faecalis ACC-105	—	—	4-	—
Azotobacter indicus Starkey et De ATCC 9037	—	—	4-	—
Azotobacter indicus Starkey et De ATCC 9540	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes ATCC 8308	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes AGTU (108)	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes AGTU (109)	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes AGTU (100)	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes AGTU (112)	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes AGTU (530)	—	—	4-	—
Aerobacter aerogenes AGTU (531)	—	—	±
Bacillus cereus ATCC 7483	±	4-	±	—
Bacillus cereus ATCC 7004

Tabelle I (Fortsetzung)

Produkte

Uracil

andere

Pyrimidinbasen
als Uracil

Pyrimidinnucleoside

Pyrimidinnucleotide

Bacillus cereus ATCC 7039

Bacillus cereus ATCC 7064

Bacillus cereus ATCC 9139

Bacillus cereus ATCC 9592

Bacillus cereus ATCC 9620

Bacillus cereus ATCC 9634

Bacillus cereus ATCC 9818

Serratia marcescens Nr. 18 IAM

Sarcina lutea IAM Bact 2-1

Micrococcus glutamicus 560 ATCC 13 761

Sake-Hefe (Kiyokai Nr. 7) NFR-1011

Brothefe-Fleischman NFR-1071

Candida tropicalis Zatsu-6-10 IAM 4924

Streptomyces albogriseolus NRRL B-1305

Streptomyces lavendulae ATCC 8664

Streptomyces rimosus NRRL 2234

Rhizopus chungkuoensis var. isofermentaricus 16-29

IAM

Aspergillus niger NRRL 337

Aspergillus candidus IAM-A-14-1

Die in der obigen Tabelle aufgeführten Hinterlegungsstellen sind nachstehend mit ihrer vollen Bezeichnung aufgeführt:

IAM: Institute of Applied Microbiology, Universität von Tokyo, Japan.

ATCC: American Type Culture Collection, Washington 7, D. C, USA.

NRRL: Northern Utilization Research Branch, US. Dept. of Agriculture, Peoria, USA.

NCTC: National Cellection of Type Cultures, London, England.

IFO: Institute for Fermentation, Osaka, Japan.

Research Institute for Microbiological Diseases, Universität Osaka, Osaka, Japan.

ACC =
RIMD
ACC:

AGTU:

NFR:

Yoken:

Agricultural Dept. der Universität Tokyo.
National Food Research, Tokyo, Japan.
National Institute of Health, Tokyo, Japan.

Aus der Tabelle geht hervor, daß sich die Mikroorganismen in drei Klassen einteilen lassen, und zwar (1) solche, die Uracil bilden, (2) solche, die andere UV-absorbierende Substanzen wie angegeben bilden, und (3) solche, die beide Substanzarten bilden. Eine Reihe von Bacillusstämmen bildet Uracil, unter ihnen am stärksten der Bacillus cereus. Zu anderen Substanzen als Uracil gehören Pyrimidinbasen, die in Nucleinsäuren vorkommen, deren Nucleoside und Nucleotide. Es steht eindeutig fest, daß durch den Bacillus roseus Orotidin und Uridylsäure und durch den Bacillus subtilis Thymidylsäure gebildet werden.

Die Orotsäure bzw. deren Salz wird dem Kulturmedium zugefügt. Das Kulturmedium enthält außerdem Kohlenhydrate (Quelle für Kohlenstoff), z. B. Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Saccharose, Pentosen, Melassen, Stärke, Stärkehydrolysate und

organische Säuren, eine Quelle für Stickstoff, z. B.

organische stickstoffhaltige Nährsubstanzen wie Sojabohnenpreßkuchen, Pepton, Fleischextrakt, Hefe, Caseinhydrolysat und Aminosäuren und/oder anorganische Stickstoffquellen wie Ammoniak und dessen Salze mit anorganischen Säuren (Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumchlorid usw.), anorganische Salze, z. B. Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisensulfat, Mangansulfat, und andere für das Wachstum des jeweilig verwendeten Mikroorganismus wesentliche Substanzen, z. B. unter anderem Vitamine.

Das Nährmedium wird vor der Fermentation neutralisiert.

Einer der in Tabelle I angegebenen Mikroorganismenstämme wird in ein solches Nährmedium eingeimpft und bei einem pH-Wert von 4,0 bis 9,0 bei der Wachstumstemperatur des Mikroorganismus unter Belüftung und Rühren oder stationär kultiviert. Zur Bildung von Uracil ist ein pH-Wert von 4,0 bis 7,0 vorzuziehen. Der in dem Medium gezüchtete Mikroorganismus verbraucht allmählich die in dem Nährmedium vorhandene Orotsäure (bzw. das Orotsäuresalz), um die Nucleinsäurebausteine zu bilden und in dem Fermentationsmedium anzureichern. Die Menge des gewünschten Produktes nimmt mit zunehmender Fermentationsdauer zu.

Die Löslichkeit von Ammonium- oder Natriumorotat in dem Fermentationsmedium beträgt etwa 1 bis 2 mg/ccm. Die darüber hinaus zugesetzte Menge liegt in kristalliner Form vor und löst sich in dem Maße allmählich auf, wie das Orotat verbraucht wird und die Fermentation fortschreitet. Ein Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt daher darin, daß das zur Herstellung des gewünschten Produktes notwendige Orotat in dem Medium ständig in niedriger Konzentration vorhanden ist und ihm ununterbrachen in einer zur Aufnahme durch den Mikroorganismus geeigneten Form zugeführt wird.

Die gebildeten Produkte sind Nucleinsäurebausteine und daher physiologisch bedeutsam. Sie werden seit

kurzem für medizinische Zwecke und als Testreagenzien verwendet.

Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

In einen 2-1-Erlenmeyerkolben werden 200 ecm Nährmedium gebracht. Das Nährmedium hat die folgende Zusammensetzung:

Gewichtsprozent

Glucose 5,0

Ammoniumsulfat 0,2

Dikaliumphosphat 0,1

Magnesiumsulfat-Heptahydrat ... 0,075

Harnstoff 0,2

Ammoniumorotat 1,5

Hefeextrakt 0,1

Fleischextrakt 1,0

Wasser Rest

Das Medium wird vor dem Gebrauch sterilisiert. Die Flüssigkeit wird mit Bacillus cereus ATCC 9818 angeimpft. Die Bebrütung erfolgt als Schüttelkultur bei 28°C. Nach 2 Tagen Bebrütung beträgt die Konzentration des Mediums an Uracil 8,7 g/l.

Beispiel 3

Es wurden 100 ecm der folgenden Nährflüssigkeit verwendet:
Gewichtsprozent

Glucose 5,0

Orotsäure 0,5

Ammoniumsulfat 0,2

K₂HPO₄ Dikaliumphosphat 0,1

Magnesiumsulfat-Heptahydrat ... 0,075

Fleischextrakt 1,0

Wasser Rest

Die Flüssigkeit wurde vor dem Gebrauch sterilisiert.

Es wurde mit Bacillus subtilis IFO Nr. 3027 angeimpft und 3 Tage als Schüttelkultur bei 30° C bebrütet. Nach Abfiltrieren der Zellen wurde das Filtrat in derselben Weise wie im Beispiel 2 behandelt, wobei 0,2 g 5'-Thymidinphosphat erhalten wurden. Die Identifizierung erfolgte mit Hilfe von UV-Spektrum, Elementaranalyse und des Nachweises der Bausteine — der Base, des Zuckers und der Phosphorsäure.

25

Ammoniumorotat (gelöst)
Ammoniumorotat (fest) ...

Uracil (gelöst)

Uracil (fest)

Vor der | Nach der

Kultivierung g/100 ml I g/100 ml

0,56 0,94

0,00 0,00

0,36 0,51

35

Durch Einengen von 100 ecm der abfiltrierten Fermentationsflüssigkeit auf 10 ecm und Kühlen auf Raumtemperatur werden 0,85 g rohes, kristallines Uracil erhalten. Die Rohkristalle werden abfiltriert und aus 50 ecm Wasser umkristallisiert, wobei 0,8 g Uracil erhalten werden. Das Uracil wurde durch UV-Spektrum, IR-Spektrum, Elementaranalyse und Schmelzpunkt identifiziert.

B e i s ρ i e 1 2

In einen 2-1-Erlenmeyerkolben werden 200 ecm Nährflüssigkeit gebracht. Es wird dasselbe Nährmedium wie im Beispiel 1 verwendet, mit der Ausnahme, daß die Menge des Ammoniumorotates 0,56 Gewichtsprozent beträgt. Die Nährflüssigkeit wird mit Bacillus roseus B-206-10 IAM angeimpft und 3 Tage unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 bebrütet. Die erhaltene Fermentationsflüssigkeit, die 1 g/l Orotidin und 1 g/l Uridylsäure enthält, wird filtriert. Das Filtrat (11) wird in üblicher Weise der chromatographischen Trennung an dem unter der Handelsbezeichnung »Dowex-1« bekannten, von der Dow Chemical Company, USA., hergestellten Anionenaustauscherharz unterworfen. Aus den einzelnen Fraktionen werden 0,8 g Orotidin und 0,6 g 5'-Uridylsäure erhalten. Das Orotidin wurde durch UV-Spektrum, Elementaranalyse und den Nachweis der Bausteine — der Base und des Zuckers — identifiziert. Die 5'-Uridylsäure wurde durch UV-Spektrum, Elementaranalyse und den Nachweis der Bausteine — der Base, des Zuckers und der Phosphorsäure — identifiziert.

Beispiel 4

200 ecm einer Nährflüssigkeit mit der gleichen Zusammensetzung wie im Beispiel 1 werden mit Aspergillus niger NRRL 337 angeimpft und als Schüttelkultur bei 30° C bebrütet. Nach 3tägiger Kultivierung haben sich in der Fermentationsflüssigkeit Nucleotide in einer 1 g/l Uracil entsprechenden Menge gebildet.

Beispiel 5

Je 100 ecm des Nährmediums von Beispiel 3 werden mit den in der folgenden Tabelle angegebenen Mikroorganismen angeimpft und als Schüttelkultur bei 30° C bebrütet. Nach 48stündiger Bebrütung beträgt die in der Fermentationsflüssigkeit vorhandene Menge an Nucleinsäurebaustein (bestimmt als Uracil) wie folgt:

Tabelle II

Mikroorganismus	Nucleinsäure baustein
Alcaligenes faecalis IAM Bact. 3-8 Aerobacter aerogenes ATCC 8308 Bacillus subtilis IFO Nr. 3026 Corynebacterium michiganense ATCC 10 202 Escherichia coli 15-75(15) his~, ade~, IAM 2	0,5 g/l 0,8 g/l 1,0 g/i 0,5 g/l 0,5 g/l 0,5 g/l 0,8 g/l
Serratia marcescens Nr. 18 IAM Aspergillus candidus IAM A-14-1 ....

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Pyrimidin-Nucleinsäurebausteinen, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem Orotsäure oder Orotat enthaltenden Nährmedium Bacillus megaterium de Bary IAM Bact 1-12, Bacillus natto IAM-1-3, Bacillus cadaveris NCTC 6578, Bacillus succinicum IAM-B-5-1, die Bacillus subtilis-Stämme NRRL 558 IAM, PC 1219 Yoken, Nr.
2 IAM 3 (ATCC 15244), Nr.
3 IAM 3 (ATCC 19062), Nr.
4 IAM 3, Nr.
5 IAM 3, Nr. 6

IAM 3, IFO Nr. 3026, IFO Nr. 3027, IFO Nr. 3033, IFO Nr. 3035, IFO Nr. 3036,13 IAM, 14IAM und die threoninfreien Stämme 23 IAM-2 und 115 IAM-2, die Bacillus-firmus-Stämme B-206-6 IAM und Werner Nr. 3330IFO, Bacillus roseus B-206-10 IAM, die Brevibacterium-ammoniagenes-Stämme ATCC 6871 und ATCC 6872, die Bacillus-circulans-Stämme Jordans Nr. 3342 IFO, IAM B-206-3 und Jordans Nr. 3329 IFO, die Bacillus-coagulans-Stämme ATCC 7050 und Hammer Nr. 3557 IFO, die Bacillus-macerans-Stämme ATCC 3483, Schardinger IFO Nr. 3482, Schardinger IFO Nr. 3483 und Schardinger IFO Nr. 3490, die Bacilluspumilus-Stämme Gottheil IFO Nr. 3028, B-205-9 IAM und Gottheil IFO Nr. 3030, die Bacillussphaericus-Stämme B-205-8 IAM und Nieide IFO Nr. 3341, die Brevibacterium-acetylicum-Stämme ATCC 953 und ATCC 954, Corynebacterium michiganese ATCC 10202, Corynebacterium rathayi ATCC 13659, Brevibacterium helvolum ATCC 11822, Brevibacterium vitarumen ATCC 10234, die Escherichia-coli-Stämme 15-75(15) [his-, ade-] IAM-2 und 15-30(15) [his-] IAM-2, die Alcaligenes-faecalis-Stämme IAM-Bact 3-8, ACC-104 und ACC-105, die Azotobacter-indicus-Stämme Starkey et De ATCC 9037 und ATCC 9540, die Aerobacter-aerogenes-Stämme ATCC 8308, AGTU 108, AGTU 109, AGTU 100, AGTU 112, AGTU 530 und AGTU 531, die Bacilluscereus-Stämme ATCC 7483, ATCC 7004, ATCC

ίο 7039, ATCC 7064, ATCC 9139, ATCC 9592, ATCC 9620, ATCC 9634 und ATCC 9818, Serratia marcescens Nr. 18 IAM, Sarcina lutea IAM Bact 2-1, Micrococcus glutamicus 560 ATCC 13761, Sake-Hefe (Kiyokai Nr. 7) NFR-1011, Brothefe-Fleischman NFR-1071, Candida tropicalis Zatsu 6-10 IAM 4924, Streptomyces albogriseolus NRRL B-1305, Streptomyces lavendulae ATCC 8664, Streptomyces rimosus NRRL 2234, Rhizopus chungkuoensis var. isofermentaricus 16-29 IAM, Aspergillus niger NRRL-337 oder Aspergillus candidus IAM-A-14-1 züchtet.

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