DE1442248C - Verfahren zur biotechnischen Herstel lung von 5 Inosinsaure - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-Inosinsäure, wobei in einem wäßrigen Adenin enthaltenden Nährmedium Adeninauxotrophe Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen gezüchtet werden. ■

Die französische Patentschrift 1 274 137 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von 5'-Inosinsäure unter Verwendung eines Adenin benötigenden Stammes, der zu den Genera Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Saccharomyces, Torula, Aspergillus und Penicillium gehört. Die bei diesem Verfahren erzielte Ausbeute beträgt jedoch nur 5 bis 95 mg/100 ml (0,05 bis 0,95 mg/ml).

Die französische Patentschrift 1 307 352 hat die Verwendung eines Adenin benötigenden Stammes, der zu den Spezies Micrococcus glutamicus, Streptomyces griseus und Neurospora crassa gehört,, zur Herstellung von 5'-Inosinsäure zum Inhalt. Bei diesem Verfahren wird jedoch nur eine Ausbeute von 0,45 bis 2,3 mg/ml erzielt.

Die Erfindung hat sich daher die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zu entwickeln, bei dessen Durchführung beträchtlich höhere Ausbeuten erzielt werden.

Ausgehend vom aufgezeigten Stand der Technik ist das erfindungsgemäße Verfahren zur biotechnisehen Herstellung von 5'-Inosinsäure, wobei in einem wäßrigen Adenin enthaltenden Nährmedium Adeninauxotrophe Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen gezüchtet werden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adenin-auxotrophe Mikro-Organismen Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 187, -ATCC15 188, -ATCC 15 189 oder -ATCC 15 190 einsetzt.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden beträchtlich höhere Ausbeuten an 5'-Inosinsäure erzielt, beispielsweise 5,3 bis 5,5 mg/ml.

Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen sind Mutanten, die zum Wachstum Adenin erfordern und welche durch Behandlung von Brevibacterium ammoniagenes, z. B. ATCC 6871 und ATCC 6872, in an sich bekannter Weise mit einem oder mehreren die Mutation hervorrufenden Mitteln, wie z. B. CO₆₀, Röntgenstrahlen und Gammastrahlen, erhalten werden. Die Mutante Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 188 erfordert zwar außer Adenin noch Xanthin, dies ist jedoch für das erfindungsgemäße Verfahren ohne Belang.

Das wäßrige Nährmedium muß die erforderlichen Wachstumsfaktoren als solche oder ein dies enthaltendes Material, eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und Mineralien enthalten. Adenin gehört stets zu den erforderlichen Wachstumsfaktoren. Es kann als solches verwendet werden oder durch Stoffe, die Adenin enthalten, beispielsweise Hefeextrakt, Fischmehl und Ribonukleinsäure, geliefert werden, wobei auch Gemische von Adenin und einem oder mehreren Stoffen, die Adenin enthalten, verwendet werden können.

Als Kohlenstoffquelle kann ein Kohlenhydrat, z. B. Glukose oder irgendeine andere Kohlcnstoffquclle, die der Mikroorganismus in seinem Stoffwechsel verarbeiten kann, beispielsweise Stärkehydrolysate und Glutaminsäure, eingesetzt werden. Die Slickstoffquellc kann entweder in Form einer organischen Verbindung, beispielsweise Harnstoff, oder cinur an- f>5 organischen Verbindung, beispielsweise Ammoniumchlorid, vorliegen, soweit der Sticksloff in einer für dun Mikroorganismus zugänglichen Form zur Verfügung steht. Als Beispiele für Mineralien werden Kaliumphosphate, Magnesiumsulfat und Calciumchlorid genannt.

Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen, z. B. durch Schütteln oder durch Belüftung und Rühren, bei Temperaturen im Bereich von 20 bis 40° C durchgeführt. Der pH-Wert des wäßrigen Mediums wird mit Neutralisierungsmitteln, wie z. B. wäßrigem Ammoniak, wäßrigem Natriumhydroxyd oder Harnstoff (der durch Urease in Kulturen in NH₃ und CO₂ zersetzt werden kann), eingestellt.

In überraschender Weise sammeln sich große Mengen von 5'-Inosinsäure manchmal zusammen mit einer relativ geringen Menge Hypoxanthin sowohl in dem wäßrigen Medium als in den Zellen gewöhnlich innerhalb einer Fermentationszeit von 2 bis 8 Tagen an.

Nach Beendigung der Fermentation wird die Inosinsäure durch Ionenaustauschmittel gewonnen, wie später im Beispiel 1 beschrieben wird, oder durch ähnliche Verfahren unter Verwendung anderer bekannter Ionenaustauscher oder anderer bekannter Gewinnungsverfahren, wie z. B. Extraktion, Adsorption und Ausfällung.

Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung. Die Prozentangaben stellen, falls nicht anders angegeben, Gewichts-Gewichts-Prozent dar. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

Ein wäßriges Nährmedium für die Herstellung einer Impfkultur, bestehend aus

Bestundteile

Glukose

Pepton

Rindfleischextrakt (Adenin-haltig)

Natriumchlorid

Biotin

Wasser (destilliert)

Gehalt

2%
1%
1%
0,3% 20 mcg/1
Rest

dessen pH-Wert vorher mit 5 n-NaOH auf 7,2 eingestellt wurde, wurde sterilisiert. Eine 30-ml-Menge des sterilisierten wäßrigen Nährmediums wurde in jeden einer Anzahl 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Das Medium in jedem dieser Erlenmeyer-Kolben wurde mit einer Kultur aus Brevibacterium ammoniagenesATCC 15 187(eineAdenin benötigende Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30" auf einer Schüttelmaschine geschüttelt.

Die sich ergebende Impfkultur wurde in einer Menge von K) Volumprozent in ein sterilisierlcs wäßriges Fermentationsnährmedium gegeben.

Das wäßrige Fermentationsnährmedium bestand aus

licslaiullcilo

Glukose

NII₄CI

KIhIM)₄

K,HPO₄

Μαιμο

70 g

I J μ
IO μ
IO μ

Fortsetzung

Bestandteile

MgSO₄ ■ 7 H₂O

Maisquellwasser (Adenin - haltig)
Wasser (destilliert)

Menge

0,4 g

6g

ergänzend auf 1 1 Gesamtvolumen

Das Fermentationsnährmedium wurde vor dem Sterilisieren auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt.

Ein 30-ml-Anteil des sterilisierten wäßrigen Fermentationsnährmediums, zu dem 10 Volumprozent Impfkultur zugefügt waren, wurde in jeden einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens 10 g CaCO₃ zugefügt, das gesondert sterilisiert worden war. Das sich ergebende Medium wurde 96 Stunden bei 30⁰C auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Danach hatten sich 9,8 mg 5'-Inosinsäure pro Milliliter Fermentationsflüssigkeit gebildet.

Gewinnung der 5'-Inosinsäure

Die Fermentationsflüssigkeit wurde abfiltriert und der ρ H-Wert des Filtrats mit HCl auf 1,4 eingestellt. Das so behandelte Filtrat wurde durch eine Kolonne eines sulfonierten Polystyrolkationenharzaustauschers (Η-Form) geschickt. Sofort nachdem das Filtrat unter die Oberfläche der Kolonne abgesunken war, wurde destilliertes Wasser in die Kolonne eingeführt. Das Filtrat wurde mit den Fraktionen, die folgten und ebenso Inosinsäure enthielten, vereinigt. Der pH-Wert der kombinierten Fraktionen wurde mit Natriumhydroxyd auf 7,2 eingestellt. Die eingestellten Frak- 35: tionen wurden im Vakuum bei etwa 50 mm Hg und etwa 30° konzentriert und das konzentrierte Produkt auf etwa 0 bis 2° abgekühlt. Durch diese Arbeitsweise konnten 5,2 g kristallines Natrium-5'-inosinat gewonnen werden.

Als Kationenharzaustauscher kann irgendeines der im Handel erhältlichen Produkte verwendet werden, wie z. B. Diaion SK Nr. 1 (Mitsubishi Kasei Kogyo Co.) oder Amberlite IR-120 (Rohm & Haas). (Das Verfahren zur Herstellung ist in der USA.-Patentschrift 2 366 007 beschrieben.)

Beispiel 2

Ein wäßriges Fermentationsnährmedium, bestehend aus

Bestundteile

Glukose ,

(NHJ₂SO₄

KH₂PO₄ ,

K₂HPO₄

MgSO₄ · 7 H₂O....

NZ-Amin

Adenin

Wasser (destilliert)

Menge

In jeden Kolben einer Anzahl von 500-mI-Erlen-. meyer-Kolben wurde eine 30-ml-Menge des kombinierten Mediums gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens 10 g gesondert sterilisiertes CaCO₃ zugefügt. Das sich ergebende Medium wurde 103 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, während der pH-Wert durch absatzweise Zugabe von Harnstoff auf etwa 7,2 gehalten wurde.

Es wurden 8,5 mg/ml Inosinsäure und 0,2 mg/ml Hypoxanthin im Medium gebildet.

Beispiel 3

30-ml-Anteile des sterilisierten wäßrigen Nährmediums für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend Beispiel 1 und zusätzlich 10 mg/1 Xanthin enthaltend, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15 188 (eine Adenin und Xanthin benötigende Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6872) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes wäßriges Fermentationsnährmedium entsprechend Beispiel 2 gegeben.

Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums, wurde in jeden Kolben einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens 10 g getrennt sterilisiertes CaCO₃ zugefügt. Das erhaltene Medium wurde 96 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, wobei der ρ H-Wert auf etwa 7,2 durch absatzweise Zugabe von Harnstoff gehalten wurde.

Es wurden 10,2 mg/ml 5'-Inosinsäure und 0,8 mg/ml Hypoxanthin in dem Medium gebildet.

Beispiel 4

30-ml-Mengen sterilisiertes wäßriges Nährmedium für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend Beispiel 1, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC IS189 (eine Adenin benötigende Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes wäßriges Fermentationsnährmedium gebracht.
Das Fermentationsmedium bestand aus

10%
0,3%
0,3%
0,2%
0,025%
0,6%
4 mg/1
Rest

6ο

dessen pH-Wert vorher auf 7,2 eingestellt worden war, wurde sterilisiert. Die Impfkiiltur (hergestellt nach Beispiel I) wurde in einer Menge von IO Volumprozent in das sterilisierte wäßrige Fermentationsiiahrinedium gebracht.

Bestandteile

55

Glukose

(NHJ₂SO₄

KH₂PO₄

Maisquellwasser (Adenin-haltig)

NZ-Amin

Adenin

Wasser (destilliert)

Menge

10%

0,3%

0,3%

0,3%

0,5%

0,5%
10 mg/ml Rest

Sein pH-Wert wurde vor dem Sterilisieren auf 7.0 eiimeslellt.

Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums wurde in jeden Kolben einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach wurde zu dem Inhalt jedes Kolbens gesondert sterilisiertes CaCO₃ zugefügt. Das erhaltene Medium wurde 120 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt, während der pH-Wert durch absatzweises Zugeben von Harnstoff auf etwa 7,0 gehalten wurde.

Es wurden 11,5 mg/ml 5-Inosinsäure in dem Medium erzeugt.

Beispiel 5

30-ml-Mengen sterilisiertes wäßriges Nährmedium für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend Beispiel 1, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15190 (eine Adenin erfordernde Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes wäßriges Fermentationsnährmedium, entsprechend Beispiel 1, gebracht.

Eine 30-ml-Menge des mit der .Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums wurde in jeden Kolben¹ einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gebracht. Danach wurden zu dem sterilisierten Inhalt jedes Kolbens 10 g getrennt sterilisiertes CaCO₃ zugefügt. Dann wurde das erhaltene Medium 103 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt.

■Es wurden 5,3 mg/ml 5-Inosinsäure und 0,4mg/ml Hypoxanthin in dem Medium gebildet.

B e i s ρ i e 1 6

30-ml-Anteile sterilisiertes wäßriges Nährmedium für die Herstellung einer Impfkultur, entsprechend Beispiel 1, wurden in eine Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben und mit Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15190 (einer Adenin erfordernden Mutante von Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6871) beimpft. Das beimpfte Medium wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine geschüttelt. Die erhaltene Impfkultur wurde in einer Menge von 10 Volumprozent in sterilisiertes wäßriges Fermentationsmedium gebracht.
Das Fermentationsmedium bestand aus

Bestandteile

Glukose

Harnstoff .......

K₂HPO₄

KH₂PO₄

MgSO₄-7 H₂O .·.

Biotin

CaCl₂-2H₂O ....

Hefeextrakt

Wasser (destilliert)

Menge

10%

0,6%

0,7%

0,7%

0,6%
20 mcg/1

0,1%

0,5%

Rest

wobei der pH-Wert vor dem Sterilisieren auf 7,8 eingestellt wurde.

Eine 30-ml-Menge des mit der Impfkultur versetzten Fermentationsnährmediums wurde in jeden Kolben einer Anzahl von 500-ml-Erlenmeyer-Kolben gegeben. Danach wurde zu dem sterilisierten Inhalt jedes Kolbens 10 g getrennt sterilisiertes CaCO₃ zugefügt. Das erhaltene Medium wurde 96 Stunden bei einer Temperatur von 30° auf einer Schüttelmaschine ge-

30 schüttelt. Es wurden 6,2 mg/ml 5'-Inosinsäure und 0,3 mg/ml Hypoxanthin in dem Medium erzeugt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur biotechnischen Herstellung von 5'-Inosinsäure, wobei in einem wäßrigen Adenin enthaltenden Nährmedium Adenin - auxotrophe Mikroorganismen bei hierfür üblichen Bedingungen gezüchtet werden, dadurch gekennzeichnet, daß man als Adenin-auxotrophe Mikroorganismen Brevibacterium ammoniagenes ATCC 15187, -ATCC 15188, -ATCC 15 189 oder -ATCC 15190 einsetzt.